Phân lập Promoter của Gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol Dehydrogenase (Cad) và thiết kế vector chuyển Gen mang đoạn gen mã hóa cho Enzyme cinnamoyl CoA reductase (CCR) từ cây bạch đàn Uro

Phân lập Promoter của Gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol Dehydrogenase (Cad) và thiết kế vector chuyển Gen mang đoạn gen mã hóa cho Enzyme cinnamoyl CoA reductase (CCR) từ cây bạch đàn Uro

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

LÊ PHƯƠNG DUNG

PHÂN LẬP PROMOTER CỦA GEN MÃ HÓA CHO ENZYME CINNAMYL ALCOHOL DEHYDROGENASE (CAD) VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN

GEN MANG ĐOẠN GEN MÃ HÓA CHO ENZYME CINNAMOYL CoA

REDUCTASE (CCR) TỪ CÂY BẠCH ĐÀN URO (EUCALYPTUS

UROPHYLLA S.T BLAKE)

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Thái Nguyên – 2009

THAI NGUYEN UNIVERSITY COLLEGE OF EDUCATION

LE PHUONG DUNG

CLONING PROMOTER REGION OF GENE ENCODING CINNAMYL ALCOHOL DEHYDROGENASE (CAD) AND CONSTRUCTING PLANT

TRANSFORMATION VECTOR CARRYING CINNAMOYL CoA

REDUCTASE GENE FROM EUCALYPTUS UROPHYLLA S.T BLAKE

Speciality: Genetics Code: 60.42.70

MASTER’S THESIS SUMMARY

Supervisor: Dr Nguyen Huu Cuong

Thai Nguyen, 2009

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chưa có ai công bố trong một công trình nào khác

Tác giả

Lê Phương Dung

1.3 Tình hình sinh trưởng của cây bạch đàn ở Việt Nam ………

1.4 Lignin và chu trình sinh tổng hợp lignin ở thực vật

1.4.1 Lignin

1.4.2 Chu trình sinh tổng hợp lignin ở thực vật

1.4.3 Giới thiệu về gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) 1.5 Tổng quan về promoter

1.5.1 Mô hình điều hoà biểu hiện gen ở sinh vật nhân chuẩn

1.5.2 Cấu trúc và chức năng của promoter

1.5.3 Các loại promoter sử dụng trong công nghệ sinh học

1.5.4 Promoter điểu khiển hoạt động gen ở tầng xylem Error! Bookmark not defined 1.5 Một số kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong nghiên cứu CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp tìm kiếm thông tin về trình tự gen mã hóa cho enzyme

CAD trên ngân hàng gen quốc tế

2.2.2 Thiết kế mồi đặc hiệu tách dòng gen/promoter

2.2.3 Tách chiết và tinh sạch DNA – RNA từ mô gỗ

2.3.4 Tổng hợp cDNA 2.2.5 Khuếch đại đoạn promoter EuCAD và đoạn gen CCR bằng phản ứng PCR

2.2.6 Phương pháp tách dòng

2.2.7 Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) Error! Bookmark not defined 2.2.8 Phương pháp xác định trình tự của gen

2.2.9 Phương pháp Gateway

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Tách chiết DNA bạch đàn

3.2 Khuếch đại promoter bằng PCR

3.3 Tách dòng và xác định trình tự đoạn promoter EuCAD

3.3.1 Tinh sạch sản phẩm PCR và tạo vector tái tổ hợp

3.3.2 Biến nạp sản phẩm ligation vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5

3.3.3 Chọn dòng tế bào E.coli mang vector tái tổ hợp

3.3.4 Tách chiết plasmid tái tổ hợp

3.3.5 Kết quả đọc trình tự nucleotide của hai đoạn promoter CAD1 và CAD2

3.3.6 Phân tích các nhân tố điều hòa dạng cis có mặt trong trình tự của promoter gen CAD tách dòng được từ bạch đàn nâu Eucalyptus urophylla S.T Blake

3.3.7 Kết quả đăng tải trình tự promoter của gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase tại ngân hàng gen quốc tế NCBI

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……… TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần dung dịch đệm tách chiết … 19 Bảng2.2 Thành phần dung dịch đệm tách chiết 21 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng khử DNA 22

Bảng 2.4A Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA 23 Bảng 2.4B Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA 23

Bảng 2.4C Chu trình nhiệt của phản ứng tổng hợp cDNA 24 Bảng 2.5: Thành phần phản ứng PCR 24

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng gắn gen/promoter vào vector tách dòng 26 Bảng 2.7 Thành phần hoá chất tách plasmid 28

Bảng 2.8 Thành phần phản ứng cắt 29

Bảng 2.9 Thành phần phản ứng colony-PCR 29 Bảng 2.10 Thành phần phản ứng ghép nối 31

Bảng 2.11 Thành phàn phản ứng cắt plasmid pENTR/CCR 32 Bảng 2.12 Thành phần phản ứng LR 33

Bảng 2.13 Thành phần phản ứng cắt plasmid pBENDER/CCR 34 Bảng 3.1 Trình tự và các thông số cần thiết của các mồi 35

Bảng 3.2 Trình tự và các thông số cần thiết của hai mồi CCR entr-F, CCR-R 52

Bảng 3.3 Kích thước các phân đoạn thu được khi cắt plasmid tái tổ hợp

pBENDER/CCR bằng XhoI 64

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Đơn vị cấu trúc cơ bản của lignin ……… 9

Hình 1.2: Sinh tổng hợp lignin trong thực vật 10

Hình 1.3.Lát cắt thân cây chuyển gen CCR.H (A) và cây không chuyển gen (B) 15

Hình 2.1 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 25

Hình 2.2 Sơ đồ vector pBT 26

Hình 2.3 Chu trình nhiệt của phản ứng colony – PCR 30

Hình 2.4 Sơ đồ vector pENTRTM/D-TOPO 31

Hình 2.5 Sơ đồ vector pBENDER 32

Hình 3.1 Kết quả điện di sản phẩm tách DNA từ gỗ bạch đàn 34

Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro1 35

Hình 3.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro2 36

Hình 3.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro1 sau tinh sạch 37

Hình 3.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro2 sau tinh sạch 37 Hình 3.6: Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến 39

Hình 3.7: Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR trực tiếp từ các khuẩn lạc 41

Hình 3.8: Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR trực tiếp từ các khuẩn lạc 41

Hình 3.9: Kết quả điện di plasmid tái tổ hợp tách từ tế bào E.coli DH5α …… 42

Hình 3.10: Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp mang đoạn promoter CAD1 43

Hình 3.11: Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp mang đoạn promoter CAD2 44

Hình 3.12: Kết quả điện di kiểm tra phản ứng nối hai đoạn promoter CAD1 và CAD2 45

Hình 3.13: Kết quả so sánh trình tự DNA với gen CAD của E gunnii 46

Hình 3.14: Kết quả phân tích promoter của gen CAD ……… 48

Hình 3.15: Kết quả điện di RNA tổng số trên gel agarose 1% 51

Hình 3.16: Kết quả điện di khử DNA 51 Hình 3.17 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR 53 Hình 3.18 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm thôi gel trên gel agarose 1% 54 Hình 3.19 Kết quả dựng cây phát sinh chủng loại của gen CCR 56 Hình 3.20 Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp pENTR/CCR vào tế bào khả

biến E.Coli DH5 56

Hình 3.21 Kết quả điện di plasmid pENTR/CCR 58

Hình 3.22 Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen CCR 59

Hình 3.23 Kết quả colony PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu CCR entr F và CCR R 61

Hình 3.24 Kết quả tách plasmid tái tổ hợp pBENDER/CCR 61

Hình 3.25 Kết quả cắt plasmid tái tổ hợp pBENDER/CCR bằng enzyme XhoI 62

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Hữu Cường – Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện công nghệ sinh học đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới GS TS Lê Trần Bình, TS Chu Hoàng Hà - Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện và đóng góp những ý kiến quý báu cho tôi trong thời gian thực tập tại Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban chủ nhiệm Khoa Sinh – KTNN cùng toàn thể cán bộ nhân viên trong khoa đã tạo mọi điều kiện và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn CN Hoàng Hà và tập thể cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học đã tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Cùng với lòng biết ơn sâu sắc gửi tới gia đình và bạn bè đã giúp đỡ, động viên và khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện thành công luận văn này

Thái Nguyên, ngày 09 tháng 9 năm 2009 Học viên

Lê Phương Dung

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

DNA Deoxyribonucleic Acid

EDTA Ethylen dimine tetra acetic acid

CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TRONG NƯỚC

1 Lê Mộng Chân, Lê Thị Huyên (2000), Thực vật rừng NXB Nông nghiệp, Hà

Nội, tr 311- 317

2 Hồ Huỳnh Thùy Dương (2005) Sinh học phân tử Nxb Giáo Dục, tr101-112 3 Trần Duy Hưng, Đỗ Ngọc, Nguyễn Thị Chương (1991), Cây rừng Trường

công nhân Kỹ thuật Lâm nghiệp 4, Bộ Lâm nghiệp, tr 96 – 100

4 Nguyễn Dương Tài (1994) Bước đầu khảo nghiệm xuất xứ bạch đàn

Eucalyptus urophylla S.T Blake tại vùng nguyên liệu giấy trung tâm Bắc Bộ, Việt Nam Luận án PTS khoa học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp

Việt Nam

5 Nguyễn Kim Thanh, Nguyễn Thuận Châu (2005), Giáo trình Sinh lý thực

vật NXB Hà Nội, tr 214 – 221

6 Hà Văn Tuế (1993), Nghiên cứu cấu trúc và năng suất của một số quần xã

rừng trồng nguyên liệu giấy tại vùng trung du Vĩnh Phú Tóm tắt luận án tiến

sĩ sinh học Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Hà Nội, 24trang

TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI

7 A Baghdady, A.-S Blervacq, L Jouanin, J Grima-Pettenati, P Sivadon, S

Hawkins (2006), Eucalyptus gunnii CCR and CAD2 promoters are active in

lignifying cells during primary and secondary xylem formation in Arabidopsis thaliana Plant Physiology and Biochemistry 44, pp 674–683

8 Aldwin M Anterola, Norman G Lewis (2002), Trends in lignin

modification: a comprehensive analysis of the effects of genetic

Phytochemistry 61 (2002) 221–294

9 Artem Evdokimov, DNA cloning for protein expression using Gateway©

technology

10 Barakat A., Bagniewska-Zadworna A., Choi A., Plakkat U., DiLoreto

D.S., Yellanki P., Carlson J.E (2009), The cinnamyl alcohol

dehydrogenase gene family in Populus: phylogeny, organization, and expression BMC Plant Biology 9(26): 1-15

11 Chiang, V L., (2006) Understanding Gene Function and Control in

Lignin Formation in Wood NABC Report

12 Ellen McCrady (1991), The Nature of Lignin Volume 4, number 4

13 Feuillet C., Lauvergeat V., Deswarte C., Pilate G., Boudet A., and Grima

P.J (1995), Tissue- and cell-specific expression of a cinnamyl alcohol

dehydrogenase promoter in transgenic poplar plants Plant Molecular

Biology 4(27): 651-667

14 Fiona S Poke1, René E Vaillancourt, Robert C Elliott and James B

Reid (2003), Sequence variation in two lignin biosynthesis genes,

cinnamoyl CoA reductase (CCR) and cinnamyl alcohol dehydrogenase 2 (CAD2) Molecular Breeding 12: 107–118, 2003

15 Gawel N J and Jarret R L (1991), A modified CTAB DNA extraction

procedure for Musa and Ipomoea Plant Molecular Biology Reporter

3(9): 262-266

16 Goicoechea M., Lacombe E., Legay S., Mihaljevic S., Rech P., Jauneau A., Lapierre C., Pollet B., Verhaegen D., Chaubet G.N., Grima P.J

(2005), EgMYB2, a new transcriptional activator from Eucalyptus xylem,

regulates secondary cell wall formation and lignin biosynthesis The Plant

Journal 43(4): 553-567

17 Hai L., Qingyin Z., Yan L.Z., Shasheng W and Xiangning J (2003),

Xylem specific expression of a GRP1.8 promoter: 4CL gene construct in transgenic tobacco Plant Growth Regulation 41: 279-286

18 Hawkins S., Samaj J., Lauvergeat V., Boudet A., and Pettenati J C

(1997), Cinnamyl alcohol dehydrogenase: Identification of new sites of

promoter activity in transgenic Poplar Plant Physiology 113: 321-325

19 Hu W.J., Harding S.A., Lung J., Popko J.L., Ralph J., Stokke D.D., Tsai

C.J & Chiang V.L (1999), Repression of lignin biosynthesis promotes

cellulose accumulation and growth in transgenic trees Nature

Biotechnology 17: 808-812

20 Johan Wadenback, Sara von Arnold, Ulrika Egertsdotter, Michael H Walter, Jacqueline Grima-Pettenati, Deborah Goffner, Goran Gellerstedt,

Terry Gullion, David Clapham (2008), Lignin biosynthesis in transgenic

Norway spruce plants harboring an antisense construct for cinnamoyl CoA reductase (CCR) Transgenic Res (2008) 17:379–392

21 Kim S.J., Kim M.R., Bedgar D.L., Moinuddin S.G., Cardenas C.L.,

Davin L.B., Kang C., Lewis N.G (2004), Functional reclassification of

the putative cinnamyl alcohol dehydrogenase multigene family in

Arabidopsis Proceedings of the National Academy of Sciences

101:1455-1460

22 Simon Hawkins, Jozef Samaj, Virginie Lauvergeat, Alain Boudet, and

Jacqueline Crima-Pettenati (1997), Cinnamyl Alcoholl Dehydrogenase:

Identification of New Sites of Promoter Activity in transgenic Poplar

Plant Physiol 113: 321-325

23 Lauvergeat V., Rech P., Jauneau A., Guez C., Coutos T.P and Grima P.J

(2002), The vascular expression pattern directed by the Eucalyptus gunnii

cinnamyl alcohol dehydrogenase EgCAD2 promoter is conserved among

woody and herbaceous plant species Plant molecular biology 50(3):

decrease in lignin content without significant alteration of plant development is induced by simultaneous down-regulation of cinnamoyl CoA reductase (CCR) and cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) in tobacco plants The Plant Journal (2001) 28(3), 257±270

25 pENTR™ Directional TOPO® Cloning Kits (6 April 2006) Invitrogen

26 Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T (1989) Molecular Cloning: A

Laboratory Manual Vol 1, 2, and 3 Cold Spring Harbor Laboratory

Press, Cold Spring Harbor, New York

27 Simon Hawkins, Jozef Samaj, Virginie Lauvergeat, Alain Boudet, and Jacqueline Crima-Pettenati (1997), Cinnamyl Alcoholl Dehydrogenase:

Plant Physiol 113: 321-325

28 Tsutomu Kawasaki, Hisako Koita, Tomoyuki Nakatsubo, Kana Hasegawa, Kenichi Wakabayashi, Hiroki Takahashi, Kenji Umemura, Toshiaki

Umezawa, and Ko Shimamoto (2005), Cinnamoyl-CoA reductase, a key

enzyme in lignin biosynthesis, is an effector of small GTPase Rac in

defense signaling in rice PNAS vol 103 no 1, pg 230–235

28 Whettena R and Sederoffa R (1995), Lignin Biosynthesis The Plant Cell

7: 1001-1013

29 Xu Q., Wen X.P., and Deng X.X (2004), A Simple Protocol for Isolating

Genomic DNA from Chestnut Rose (Rosa roxburghii Tratt) for RFLP and PCR Analyses Plant Molecular Biology Reporter 22: 301a-301g

TÀI LIỆU WEB

30 http://www.ncbi.nlm.nih.gov

31 http://www.community.h2vn.com/index.php?action=printpage%3Btopic=061.0

32 http://vi.wikipedia.org/wiki/Xylem

33 http://www.ebi.ac.uk/embl/Submission/webin.html.

Phụ lục 1 Kết quả phân tích độ tương đồng giữa 26 loài thực vật

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 1 Zea_mays

2 Arabidopsis_thaliana 0.49 3 Lycopersicon_esculentum 0.52 0.38 4 Hordeum_vulgare 0.17 0.42 0.49 5 Triticum_aestivum 0.18 0.43 0.51 0.05 6 Vitis_vinifera 1.00 0.94 0.86 0.91 0.96 7 Solanum_tuberosum 0.46 0.36 0.19 0.45 0.49 0.94 8 Saccharum_officinarum 0.07 0.48 0.53 0.15 0.19 0.98 0.47 9 Populus_trichocarpa 0.39 0.34 0.28 0.36 0.38 0.87 0.27 0.39 10 Prunus_persica 0.41 0.35 0.30 0.39 0.40 0.80 0.24 0.42 0.21 11 Capsicum_annuum 0.43 0.36 0.19 0.40 0.43 0.88 0.09 0.43 0.27 0.25 12 Fragaria_ananassa 0.39 0.34 0.32 0.38 0.41 0.89 0.25 0.41 0.25 0.16 0.25 13 Eucalyptus_globulus 1.34 1.31 1.24 1.25 1.24 1.63 1.28 1.40 1.28 1.33 1.22 1.33 14 Linum_album 0.39 0.36 0.33 0.39 0.41 0.87 0.31 0.41 0.27 0.29 0.30 0.28 1.27 15 Eucalyptus_gunnii 0.37 0.38 0.36 0.35 0.36 0.81 0.32 0.38 0.25 0.25 0.30 0.27 1.41 0.31 16 Eucalyptus_nudicaulis 1.34 1.29 1.24 1.23 1.24 1.61 1.28 1.38 1.25 1.35 1.21 1.34 0.03 1.28 1.41 17 Eucalyptus_chloroclada 1.37 1.32 1.25 1.26 1.25 1.63 1.28 1.40 1.29 1.38 1.21 1.37 0.04 1.31 1.44 0.02 18 Eucalyptus_brassiana 1.34 1.30 1.23 1.23 1.23 1.63 1.28 1.37 1.27 1.34 1.20 1.35 0.03 1.27 1.40 0.01 0.01 19 Eucalyptus_cordata 1.33 1.29 1.23 1.23 1.23 1.60 1.27 1.38 1.27 1.32 1.20 1.31 0.01 1.26 1.40 0.03 0.03 0.02 20 Eucalyptus_vicina 1.35 1.30 1.24 1.24 1.24 1.59 1.27 1.38 1.26 1.35 1.20 1.34 0.03 1.29 1.41 0.01 0.01 0.01 0.03 21 Eucalyptus_saligna 0.39 0.38 0.36 0.36 0.37 0.83 0.32 0.40 0.25 0.25 0.30 0.26 1.36 0.31 0.02 1.36 1.39 1.35 1.35 1.36 22 Eucalyptus_blakelyi 1.36 1.31 1.25 1.25 1.26 1.61 1.28 1.39 1.27 1.37 1.21 1.35 0.04 1.30 1.42 0.01 0.02 0.01 0.03 0.00 1.37 23 Eucalyptus_alba 1.32 1.29 1.23 1.21 1.22 1.67 1.31 1.36 1.27 1.34 1.23 1.32 0.03 1.28 1.40 0.02 0.03 0.02 0.03 0.02 1.35 0.03 24 Eucalyptus_punctata 1.32 1.26 1.22 1.21 1.21 1.57 1.26 1.35 1.24 1.32 1.20 1.30 0.03 1.25 1.38 0.03 0.03 0.02 0.02 0.03 1.33 0.03 0.02 25 Eucalyptus_grandis 1.36 1.29 1.23 1.23 1.25 1.59 1.28 1.39 1.28 1.35 1.21 1.34 0.03 1.27 1.39 0.01 0.02 0.02 0.03 0.02 1.35 0.02 0.02 0.02 26 Eucalyptus_urophylla 0.39 0.38 0.35 0.36 0.37 0.81 0.32 0.39 0.25 0.25 0.30 0.27 1.36 0.31 0.02 1.37 1.39 1.35 1.36 1.37 0.02 1.38 1.35 1.34 1.35

MỞ ĐẦU

1.1 Lý do chọn đề tài

Lignin là một trong hai loại polymer sinh học phổ biến trong cây, sau cellulose Nó chiếm khoảng 30% lượng cacbon hữu cơ trong sinh quyển và gần 35% lượng vật chất khô trong gỗ của các loài thực vật Quá trình tổng hợp lignin là một trong những cách thức thích nghi của thực vật trong quá trình tiến hóa khi thực vật thay đổi môi trường sống từ nước lên cạn Lignin giữ vai trò quan trọng trong việc hình thành cấu trúc thành tế bào và thân Thêm vào đó lignin tham gia vào quá trình vận chuyển nước, các chất dinh dưỡng thông qua hệ thống bao mạch và giữ vai trò quan trọng trong việc đảm bảo sự chắc chắn của cây trong không gian, cũng như bảo vệ cây khỏi các nhân tố gây bệnh [7] Hàm lượng lignin cao trong gỗ giúp gỗ bền Bởi vậy, nó là nguyên liệu thô tốt cho nhiều ứng dụng (trong xây dựng, nội thất, ) và là một loại nhiên liệu hoàn hảo

Tuy nhiên trong một số lĩnh vực như sản xuất sợi, sản xuất giấy thì hàm lượng lignin cao lại là một trở ngại Việc loại bỏ lignin trong quy trình sản xuất bột gỗ bằng cách xử lý hóa học là một trong những biện pháp tốn kém đối với điều kiện kinh tế và môi trường nước ta hiện nay [27] Vậy làm thế nào để điều chỉnh được hàm lượng lignin trong cây theo hướng có lợi cho bản thân sinh vật và con người, như: tăng hàm lượng lignin trong cây trồng làm nhiên liệu, trong xây dựng, trong cây nông nghiệp (cây lúa – chống đổ) hay giảm hàm lượng lignin trong cây bạch đàn nhằm tạo thuận lợi cho quá trình sản xuất giấy

Hiện nay đã có rất nhiều nghiên cứu (chủ yếu là ở nước ngoài) về lignin, quá trình sinh tổng hợp lignin, các enzyme tham gia vào quá trình này như enzyme cinnamoyl coenzymeA reductase (CCR) và enzyme cinnamyl alcohol

dehydrogenase (CAD), nhưng đa phần là trên các cây mô hình (Arabidopsis

thaliana, Populus trichocarpa) [7],[10],[18]

Nhằm mục đích điều khiển sự biểu hiện của một số enzyme tham gia vào quá trình sinh tổng hợp lignin ở mô phân sinh gỗ cho một số đối tượng cây

lâm nghiệp bằng phương pháp chuyển gen, chúng tôi tiến hành đề tài: “Phân

lập promoter của gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) và thiết kế vector chuyển gen mang gen mã hóa cho enzyme cinnamoyl coA reductase (CCR) từ cây bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla S.T Blake)” làm vật liệu để thiết kế các cấu trúc vector chuyển gen ở thực vật

1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

1.2.1 Mục tiêu

Tách dòng, phân tích trình tự promoter của gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) và thiết kế vector chuyển gen mang đoạn gen mã hóa cho enzyme cinnamoyl coA reductase (CCR) từ cây bạch đàn

urô (Eucalyptus urophylla S.T Blake)

1.2.2 Nội dung nghiên cứu

- Tập hợp thông tin về trình tự nucleotide đoạn promoter của gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) và trình tự nucleotide đoạn gen mã hóa cho enzyme cinnamoyl coA dehydrogenase (CCR) đã công bố trên ngân hàng gen quốc tế NCBI để thiết kế cặp mồi khuếch đại đoạn gen

này từ cây bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla S.T Blake)

- Tách dòng, phân tích trình tự đoạn promoter của gen mã hóa cho enzyme CAD và thiết kế vector chuyển gen mang đoạn gen mã hóa cho

enzyme CCR từ cây bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla S.T Blake)

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về cây bạch đàn

Chi Bạch đàn Eucalyptus thuộc họ Sim Myrtaceae có hơn 700 loài, hiện

đã được trồng ở hơn 30 nước trên thế giới từ vĩ độ 580

Bắc đến 460 Nam Bạch đàn mọc tự nhiên và có nguồn gốc từ châu Úc, chúng có thể sinh trưởng dưới một phổ sinh thái rộng như tập trung ở các vùng thấp ven biển, nhưng cũng có thể mọc ở những vùng cao (2000m so với mặt biển) hay vùng khô cạn (sa mạc hoặc bán sa mạc) [4]

Cây bạch đàn thuộc loại đại mộc, cao 25 – 50m, có cây cao tới 100m Đường kính thường đạt 120-180 cm Vỏ ngoài màu xám trắng hoặc nâu, đỏ nâu, xám xanh…, bong mảng hoặc nứt dọc, vỏ thân chứa tinh dầu Eucalyptone thơm mùi dầu tràm Lá đơn, khi cây còn non lá thường mọc đối, sau đó có dạng lá đơn mọc cách, không có lá kèm; mép lá nguyên, phiến lá dày, gân phụ thường nối với nhau ở đầu gân thành một đường song song với mép lá Hoa lưỡng tính, nụ hình thoi Khi hoa nở nửa trên hình chóp nón rụng đi, để lộ nhị và nhụy Nhị nhỏ, rời nhau, rất nhiều, màu trắng vàng Nhuỵ có bầu trung, một phần gắn liền với ống đài, một phần nhô lên Quả khô, khi chín nứt ở đỉnh Hạt nhiều, thường có góc cạnh, rất nhỏ

Ngày nay bạch đàn là một trong những loài cây gỗ lâm nghiệp rất quan trọng, được trồng phổ biến ở nhiều quốc gia trên thế giới đặc biệt là ở các vùng nhiệt đới và ôn đới, giữa các vĩ độ 45o

N và 40oB như: Braxin, Trung Quốc, Ấn Độ, … với diện tích canh tác khoảng 12 triệu hecta [4] Ở Việt Nam đã gây trồng bạch đàn từ những năm 1930 ở cả hai miền Nam, Bắc Hiện nay có 10 loài bạch đàn đang được trồng phổ biến là:

+ Bạch đàn urô Eucalyptus urophylla, thích hợp với vùng đất đồi

trung du

+ Bạch đàn trắng Eucalyptus camaldulensis, thích hợp với vùng

đồng bằng

+ Bạch đàn trắng Eucalyptus alba, thích hợp với vùng gần biển

+ Bạch đàn lá nhỏ Eucalyptus tereticornis, thích hợp với vùng đồi Thừa

tôi chọn nghiên cứu là loài cây gỗ lớn, sinh trưởng nhanh, chiều cao có thể đạt tới 20-25m, đường kính có thể đạt tới 100cm Thân thẳng, vỏ trơn nhẵn với nhiều vết đốm màu trắng hoặc hồng Tán hình tháp, phân cành thấp Cành và lá non có màu đỏ tía Lá đơn mọc cách hình ngọn giáo dài, phiến lá dài 16-19cm, rộng 3,5-4cm, cuống lá mảnh dài 1,5cm, hơi lõm ở mặt trên Hoa tự tán, thường gồm 4-7 hoa trong một cụm, cuống hoa rất ngắn Quả nang nứt ở đỉnh, nhiều hạt nhỏ Mùa quả chín từ tháng 4-5

Bạch đàn urô là cây ưa sáng, mọc nhanh, cho năng suất cao Cây ưa đất ẩm sâu, nhưng cũng có thể mọc được trên đất đồi trọc khô, nghèo dinh dưỡng Bạch đàn urô sinh trưởng ở độ cao 1200m so với mực nước biển, với nhiệt độ

trung bình năm khoảng 24-280C và lượng mưa trung bình từ 3000mm/năm Trên vùng đất đồi trung du Phú Thọ, bạch đàn urô 4 tuổi có chiều cao trung bình là 10,34m, đường kính trung bình của thân đạt 9,54cm và sinh khối gỗ đạt 34.108kg/ha [6]

2000-Cũng như nhiều loài bạch đàn khác, bạch đàn urô cho gỗ cứng làm nguyên liệu sản xuất giấy, đóng đồ dùng thông thường… Ngoài ra, nó còn được dùng làm cực truyền điện, các cột trụ lâu dài và cột xây dựng, trong kết cấu nặng hoặc nhẹ, đồ mỹ nghệ và làm gỗ dán boong tàu Nó có vai trò bảo vệ trên các bờ sông và tạo bóng mát Vì các loài này không có nhu cầu thổ nhưỡng lớn, nên nó thích hợp cho việc tái sinh rừng ở cả đất bị ngập nước và đất khô của vùng nhiệt đới thấp

Với sự phát triển của các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại, hiệu suất cao và tin sinh học, nhiều nghiên cứu về bộ gen của các loài cây đã được giải

mã thành công, như cây (Arabidopsis thaliana) và đặc biệt trong số này bao gồm cả những loài cây quan trọng trong nông nghiệp như lúa (Oryza sativa) và trong lâm nghiệp như cây dương (Populus trichocarpa) Thông tin về bộ

gen của những loài cây này đã trở thành những công cụ rất có giá trị trong các nghiên cứu về chức năng và sự tương tác giữa các gen, những nghiên cứu về tiến hoá và sự phân bố gen trong các quần thể thực vật Thực vật hạt kín được cho là có nhiều điểm tương đồng về bộ gene, các quá trình trao đổi chất với các loài cây mô hình, chính vì vậy mà những nghiên cứu trên các loài cây này là những thông tin và công cụ quan trọng cho các loài cây thuộc họ khác, ví

dụ chi Bạch đàn (Eucalyptus) của họ Sim (Myrtaceae) [10]

Những nghiên cứu về gen trên cây bạch đàn bao gồm nhiều khía cạnh về cấu trúc, chức năng và thành phần trong trình tự của bộ gen Đặc điểm của bộ gen, bao gồm trong nhân và ngoài nhân, được xác định dựa trên việc tạo ra bản đồ liên kết các vị trí chỉ thị phân tử và các locus tính trạng số lượng

Những nghiên cứu về chức năng của gen chủ yếu tập trung vào việc tách dòng và xác định các gen mới, phân tích sự biểu hiện của gen, định vị gen trên các locus quy định tính trạng số lượng, mối liên kết giữa tính đa hình DNA và hình thái cá thể, và cuối cùng là tạo ra các dòng cây chuyển gen mang các tính trạng mong muốn

1.2 Tình hình trồng bạch đàn ở Việt Nam

Bạch đàn được nhập vào Việt Nam từ những năm 1930, tuy nhiên đến đầu những năm 1960 mới được phát triển mở rộng và sau đó được xem như là một trong những loài cây chủ lực để phủ xanh đất trống đồi trọc và trồng cây phân tán Tính đến tháng 12/1999, cả nước đã trồng được 349.043 ha rừng bạch đàn Trong đó: rừng trồng bạch đàn thuần loài là 249.324 ha và rừng trồng hỗn giao với các loài cây khác là 69.719 ha Ở vùng Đông Bắc có diện tích trồng bạch đàn lớn nhất (88.341ha), tiếp theo là duyên hải Nam Trung Bộ (77.538 ha), Bắc Trung Bộ (67.910 ha), đồng bằng sông Cửu Long (58.643 ha), ít nhất là ở vùng Tây Nguyên (10.556 ha) Theo số liệu thống kê của Ban chỉ đạo kiểm kê rừng Trung ương (2001), thì diện tích rừng trồng các loài bạch đàn hiện nay lớn nhất so với các loài cây khác, đạt 349.043 ha và chiếm 24.03% so với tổng diện tích rừng trồng của cả nước (1.452.470 ha)

Vào những năm 1970, diện tích rừng trồng bạch đàn mới chỉ chiếm khoảng 10% so với tổng diện tích rừng trồng của toàn quốc Giai đoạn 1986-1992 diện tích rừng trồng bạch đàn cũng chỉ chiếm khoảng 11.75% Nhưng đến hết năm 1999, diện tích rừng trồng bạch đàn đã tăng lên 24.03% Từ năm 2000 đến 2003 tuy chưa tập hợp được số liệu kiểm kê cho từng loài cây, song kết quả điều tra khảo sát cục bộ ở một số địa phương đến tháng 9 năm 2003 cho thấy diện tích trồng bạch đàn tăng khá nhanh trong giai đoạn vừa qua Cụ thể ở Công ty Lâm nghiệp Đông Bắc đã trồng được 4.400 ha, chủ yếu là bạch

đàn uro (E urophylla) Thực hiện dự án 661 từ 1999 đến 2003, tỉnh Phú Thọ

đã trồng được 6.900 ha, trong đó phần lớn diện tích là bạch đàn uro và một số

loài keo Lâm trường sông Hậu (Cần Thơ) đã trồng được 5 triệu cây bạch đàn

(Eucalyptus – W5) phân tán trên các bờ kênh, tương đương với trên 3000 ha

(mật độ trồng quy đổi là 1660 cây/ha)

Như vậy, có thể thấy rừng trồng bạch đàn đã chiếm một tỷ lệ khá lớn trong diện tích rừng trồng của cả nước, đồng thời diện tích trồng bạch đàn đã tăng khá nhanh trong giai đoạn từ 1993-1999 và tiếp tục phát triển với tốc độ nhanh từ năm 2000 trở lại đây Điều đó cho thấy vai trò của cây bạch đàn rất quan trọng trong cơ cấu cây trồng rừng ở nước ta trong những năm qua, đồng thời loài cây này cũng là nguồn nguyên liệu chủ yếu phục vụ ngành công nghiệp giấy sợi và ván nhân tạo, đóng góp không nhỏ vào sự phát triển của nền kinh tế quốc dân

1.3 Lignin và chu trình sinh tổng hợp lignin ở thực vật

1.3.1 Lignin

Lignin được tìm thấy trong hầu hết những cây có mạch, chúng nằm xen kẽ giữa các tế bào, bên trong tế bào và trong thành tế bào Nó có chức năng điều khiển sự vận chuyển các chất trong thực vật (một phần tham gia vào việc giữ vững cho thành tế bào, mặt khác tham gia điều chỉnh sự vận chuyển của chất lỏng), cho phép cây lớn lên và cạnh tranh để giành ánh sáng mặt trời

Trong thiên nhiên, lignin có khả năng chống chịu lại sự thoái hóa và được gắn kết với nhau một cách phức tạp nhờ những liên kết hóa học bền vững Nó thực sự không chỉ là một hợp chất mà bao gồm rất nhiều hợp chất Đó là những polymer ba chiều, phức tạp và vô định hình Chúng có một cấu trúc chung là một vòng benzen với một đuôi gồm 3 cacbon Cấu trúc tự nhiên của lignin quá phức tạp đến nỗi không một cấu trúc nào có thể được mô tả một cách đầy đủ và ước tính trọng lượng phân tử của chúng khoảng 15.000 kDa hoặc nhiều hơn [12]

Lignin có cấu trúc phức tạp, là một polyphenol có mạng không gian mở Thành phần thay đổi theo từng loại gỗ, tuổi cây hoặc vị trí của nó trong cấu trúc gỗ Lignin là các phức hợp dị polymer thơm và hiếm, được tổng hợp từ

ba loại đơn phân hydroxycinnamyl alcohol Ba loại đơn phân này phân biệt với nhau tuỳ thuộc vào mức độ methoxyl hóa, với tên hóa học là: p-coumaryl M1H, coniferyl M1G và sinapyl M1S alcohol [28], [31] (Hình 1.1)

Hình 1.1: Đơn vị cấu trúc cơ bản của lignin

Từ ba loại đơn phân này, các chất p-hydroxyphenyl (H), guaiacyl (G) và syringyl (S) phenylpropanoid được tạo ra Các chất này sau đó sẽ kết hợp lại để tạo ra phân tử lingin

Mặc quá trình sinh tổng hợp các monolignol (đơn phân tạo ra lignin) đã được xây dựng lại nhiều lần nhưng đến nay nó vẫn còn là vấn đề bàn cãi trong các nhà khoa học Tương tự như vậy, thì các quá trình khử và polymer hóa các monolignol trong thành tế bào cũng vẫn là những chủ đề đang được nghiên cứu và thảo luận

1.3.2 Chu trình sinh tổng hợp lignin

Thành phần và hàm lượng lignin khác nhau giữa các loài, loại tế bào và các phân lớp của vách tế bào thực vật, và chúng thay đổi dưới các tác động của môi trường và các giai đoạn phát triển của cây Thông thường, lignin từ các loài thực vật hạt kín hai lá mầm (cây gỗ cứng) bao gồm ba thành phần (G), (S) và (H), trong khi đó các loài thực vật hạt trần (gỗ mềm) chỉ bao gồm (G) và (H) Lignin từ các loài cây một lá mầm thường bao gồm hai thành phần (G) và (S) với tỉ lệ thích hợp Thành phần (H) thường tồn tại nhiều hơn ở các loài cây hai lá mầm, thành phần này được hình thành do sự kết hợp của monolignol p-coumaryl alcohol M1H vào trong phân tử lignin và thường hay bị nhầm với p-coumarate Y3 ở các loại lignin đang bị acyl hóa tách chiết từ cỏ [11, 19]

1.3.3 Các loại promoter điều khiển biểu hiện gen ở tầng xylem

Mạch gỗ (xylem) là tổ chức dẫn truyền nhựa nguyên (khoáng và nước) trong thân cây, chỉ có ở cây gỗ lá rộng Mạch gỗ chiếm 20-30% thể tích thân cây Cấu tạo mạch gỗ là tập hợp của các tế bào mạch gỗ nối tiếp nhau thành ống dài theo chiều dọc của thân

cây Mạch gỗ là thành phần lớn nhất trong cấu tạo thô đại của gỗ nên dễ quan

sát nhất [32], ở thực vật tầng xylem là nơi quá trình sinh tổng hợp lignin diễn ra mạnh nhất [13], do vậy để điều khiển hoạt động của các gen trong tầng xylem với mục đích làm tăng hàm lượng và chất lượng lignin đòi hỏi phải sử dụng promoter mạnh có khả năng biểu hiện đặc hiệu các gen thuộc tầng xylem

Năm 1995, Feuillet và cộng sự lần đầu tiên phân lập thành công

promoter của gen CAD từ cây bạch đàn Eucalyptus gunii (EuCAD promoter)

Theo tác giả thì chiều dài của promoter này là khoảng 2,5 kb Để nghiên cứu hoạt động của promoter này, tác giả đã thiết kế cấu trúc chuyển gen vào cây bạch dương trong đó gen GUS chịu sự điều khiển của promoter này Sau khi phân tích cây chuyển gen mang cấu trúc này tác giả nhận thấy rằng gen GUS biểu hiện chủ yếu ở phần xylem và các tế bào bó mạch Đây là nơi mà sự lignin hóa diễn ra mạnh nhất [13] Các kết quả của nghiên cứu này là nguyên liệu rất tốt cho đề tài của chúng tôi

Cinnamyl alcohol dehydrogenase là enzyme xúc tác cuối cùng trong con đường sinh tổng hợp lignin Năm 2002, tác giả Lauvergeat cho rằng sự biểu hiện của promoter EuCAD trong các tế bào bó mạch là sự bảo tồn và phát

triển hệ mạch của những thực vật hạt kín (Vitis vinifera L.), cũng như trong một số loài cây thảo mộc (Nicotiana tabacum L.) Hơn nữa, việc loại bỏ một

vài đoạn trình tự promoter để phân tích sự biểu hiện của promoter này đã giúp xác định các vị trí cần thiết ảnh hưởng tới tầng phát sinh gỗ [23]

Năm 2003, tác giả Lu đã tiến hành nghiên cứu sự hoạt động của promoter GRP1.8 trong đối tượng cây thuốc lá, trong nghiên cứu này tác giả đã sử dụng cấu trúc promoter và gen chỉ thị GUS kết quả nghiên cứu cho thấy gen GUS biểu hiện rất mạnh trong tầng xylem của thân dựa trên những kết quả đã đạt được tác giả đã tiếp thực nghiên cứu sự biểu hiện đặc hiệu của promoter GRP1.8 bằng việc sử dụng cấu trúc promoter với gen mục tiêu

4CL1 và cấu trúc này được chuyển thành công vào cây thuốc lá Kết quả cho thấy gen 4CL1 biểu hiện rất mạnh ở trong thân theo tác giả lượng enzyme 4CL1 tồn tại trong thân đã ra tăng gấp từ 1 – 2 lần so với cây đối chứng chỉ chuyển gen 4CL1, tuy nhiên sự biểu hiện của gen 4CL1 lại hầu như không có tại các mô khác như lá Điều này càng khẳng định hơn nữa sự biểu hiện đặc hiệu của promoter GRP1.8 trong tầng xylem của thân [17]

1.3.4 Enzyme cinnamoyl CoA reductase và vai trò trong quá trình sinh tổng hợp lignin

Có thể nói rằng cinnamoyl CoA reductase là một trong hai enzyme quan trọng tới sự hình thành các phân tử monolignol, tiền chất của lignin, ở thực vật Trong quá trình này, các phân tử cinnamolyl CoA ester, là tiền chất của các phân tử monolignol, được hình thành từ chu trình sinh tổng hợp các phenylpropanoid sau đó được chuyển hóa thành các phân tử monolignol thông qua các phản ứng được xúc tác bởi hai enzyme là cinnamoyl CoA reductase (CCR) và cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) [28] Trong đó

CCR xúc tác cho các phản ứng tiêu thụ NAPDH chuyển hóa p-coumaroyl

CoA, feruloyl CoA và sinapoyl CoA thành các dạng aldehyde tương ứng Chính vì CCR xúc tác cho phản ứng chuyển hóa 3 dạng cơ chất khác nhau nên cho đến nay các nhà khoa học vẫn đang đặt ra câu hỏi rằng liệu trong cây CCR tồn tại ở các dạng isoform khác nhau hay chỉ duy nhất một dạng isoform có phổ xúc tác rộng với cả 3 loại cơ chất trên, ví dụ thực vật hạt kín là

sinapoyl CoA [8] Ở cây Arabidopsis các nhà khoa học đã phân lập được hai

isoform của CCR là AtCCR1 và AtCCR2, và tương tự như vậy ở cây ngô là ZmCCR1 và ZmCCR2, mặc dù khi thực hiện các nghiên cứu chức năng thì chỉ một trong hai dạng isoform này tham gia vào quá trình lignin Ngay cả ở

cây Arabidopsis cũng tồn tại khoảng 8 dạng protein có trình tự giống với

AtCCR1 với độ tương đồng khoảng 40 - 50% Ở các loài cây khác như bạch

đàn, bạch dương, thuốc lá, mía đường và cây thông, chỉ duy nhất một gen mã hóa cho enzyme CCR được xác định cho đến thời điểm hiện tại [8] Do đó nếu ở thực vật tồn tại các dạng isoform khác nhau đặc hiệu cho từng cơ chất ở các dạng tế bào khác nhau thì có thể các enzyme này được mã hóa bởi các gen có độ tương đồng rất thấp với CCR, và/hoặc các gen này chỉ được biểu hiện tạm thời và rất khó phát hiện [7]

Năm 1998, Piquemal và cộng sự đã chỉ ra rằng CCR giữ vai trò trong việc điều tiết nguồn cacbon trong chu trình tổng hợp các loại monolignol Chính vì lý do này mà CCR được coi là bước tổng hợp đặc hiệu lignin đầu tiên trong chu trình phenylpropanoid Tuy nhiên ở trong tế bào thực vật, các phân tử monolignol không chỉ dùng cho quá trình sinh tổng hợp lignin mà còn được dùng để tổng hợp các phân tử lignan và cinnamaldehyde và các sản phẩm có nguồn gốc monolignol Hơn nữa, nếu quá trình sinh tổng hợp các phân tử monolignol được thực hiện đầy đủ và liên tục như giả thiết, ví dụ như đối với các quá trình đường phân và pentose phosphate, thì CCR sẽ không giữ chức năng điều hòa Tuy nhiên, ở các dòng cây đột biến làm giảm tối đa hoạt động của CCR xuất hiện những dấu hiệu bất thường về sinh lý trong quá trình sinh trưởng và ngay cả hoạt tính enzyme của các bước trong chu trình sinh tổng hợp monolignol cũng bị giảm Ví dụ, nếu hoạt tính của CCR bị ức chế hoàn toàn thì sự tích lũy các phân tử cinnamoyl CoA ester tương ứng sẽ giảm xuống do nguồn CoA bị giới hạn Trong khi các phân tử cinnamoyl CoA ester này sẽ bị giới hạn để tổng hợp nên thành tế bào đang ở trong trạng thái lignin hóa, nguồn CoA giới hạn cũng sẽ kéo theo những ảnh hưởng đến các quá trình sinh tổng hợp khác trong tế bào (trừ khi chu trình phenylpropanoid được thay thế hoàn toàn) Vì vậy có thể xem rằng nguồn cacbon dùng cho chu trình phenylpropanoid sẽ được sử dụng, hoặc là để tổng hợp phân tử trung gian (bao gồm các phân tử CoA ester) hoặc là tổng hợp các sản phẩm cuối cùng

Khi nguồn các phân tử monolignol giảm sẽ dẫn đến sự thay đổi đáng kể bộ máy bó mạch, tuy nhiên những nhận định này vẫn còn đang được các nhà khoa học tìm lời giải đáp Khi chuyển đoạn đối mã (antisense) của gen CCR

vào cây thuốc lá thì các dòng cây chuyển CCR.H (p-coumaryl) gen xuất hiện

những thay đổi bất thường trong quá trình sinh trưởng và phát triển như lá nhỏ, tròn dạng thìa và màu sắc tối hơn so với cây không chuyển gen và các dạng chuyển gen khác Ở các dòng cây chuyển gen này thì hàm lượng lignin cũng giảm đáng kể Khi quan sát các lát cắt thân cho thấy nhiều yếu tố mạch bị đứt gẫy [7] (Hình 1.3)

Hình 1.3: Lát cắt thân cây chuyển gen CCR.H (A) và cây không chuyển gen (B)

Thực hiện các thí nghiệm liên quan đến độ bền của thân cũng bị ảnh hưởng do các thành phần bó mạch bị yếu bởi sự mất cân bằng hàm lượng lignin Những kết quả này cũng được khẳng định lại bởi các nghiên cứu trên

dạng đột biến irx4 (thiếu hụt enzyme CCR) Hàm lượng lignin ở các dạng đột

biến này giảm khoảng 50% Thân cây rất mẫn cảm dưới tác động của các yếu tố cơ học [24] Năm 2001, Chabannes và cộng sự chỉ ra rằng khi hoạt tính CCR giảm (khoảng 3% so với dạng ban đầu), thì sự hình thành monolignol

giảm dẫn đến hàm lượng lignin giảm tối đa 50% so với cây không chuyển gen Trong đó thành phần giảm chủ yếu là signapyl và coniferyl

Ở cây bạch đàn, đoạn gen mã hóa cho CCR mới chỉ được xác định đầy

đủ ở cây bạch đàn gunnii (Eucalyptus gunnii) và đã được đăng kí trên trên cơ

sở dữ liệu NCBI [30] Và đối với cây bạch đàn uro thì đây là công trình tách dòng đầu tiên ở Việt Nam cũng như trên thế giới Năm 2006, các nhà khoa học Pháp công bố tương đối chi tiết đến hoạt động và chức năng của promoter của gen mã hóa cho enzyme CCR ở cây bạch đàn Kết quả chỉ ra rằng gen chỉ thị được điều khiển bởi promoter này biểu hiện mạnh đặc biệt ở các tế bào đang trong giai đoạn lignin hóa Phân tích chi tiết hơn sự biểu hiện của gen

mã hóa cho enzyme CCR trên cây Arabidopsis cũng cho thấy quá trình lignin

hoá của các tế bào tần xylem diễn ra rất giống nhau ở cả mô xylem sơ cấp và thứ cấp [7]

Những bằng chứng khoa học về vai trò của enzyme CCR đến hàm lượng lignin và quá trình lignin hóa của các tế bào cho thấy đây là một enzyme quan trọng, tiềm năng và có ý nghĩa ứng dụng trong cải tạo giống cây lâm nghiệp theo hướng làm giảm thiểu lượng lignin trong cây

CHƯƠNG 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu

Vật liệu thực vật sử dụng trong nghiên cứu là các mẫu gỗ bạch đàn nâu

(Eucalyptus urophylla S.T Blake) do Viện khoa học Lâm nghiệp Việt Nam cung cấp

2.1.2 Hoá chất

Các loại hóa chất thông dụng: thang DNA 1 kb (Fermentas), kit tinh sạch DNA (QIAgen), TA cloning kit (Invitrogen), ampicillin, IPTG, X-gal, agarose của hãng Merck, Sigma, Amersham Pharmacia Biotech

Hóa chất dùng cho tách chiết RNA tổng số: nitơ lỏng, CTAB, EDTA, NaCl, ethanol, isopropanol, -mercaptoethanol, chloroform, isoamylalcohol, LiCl, Rnase

Hóa chất dùng cho tách dòng gen: enzyme cắt hạn chế BamHI; chủng

men, 1% NaCl), X-gal, vectơ tách dòng pBT, IPTG do Phòng Công nghệ tế bào thực vật cung cấp

Dung dịch điện di DNA: dung dịch đệm TAE 50X (Tris base, acid acetic, EDTA), agarose 1%, ethidium bromide (EtBr), đệm kiểm tra mẫu DNA 5X (Tris-HCl, EDTA, glycerol, bromphenol blue)

2.1.3 Máy móc, thiết bị

Máy PCR system 9700 (Applied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac 300 (Bio-Rad, Mỹ), máy soi DNA (Mini-transllumminatior, BioRad, Mỹ), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển), máy Vortex (Minishaker, IKA, Đức), máy ly tâm lạnh, Tủ lạnh sâu – 800

C và – 200C Sanyo – Nhật Bản, máy đọc trình tự tự động (3100-Avant Genetic analyser)

cùng các trang thiết bị khác của phòng Công nghệ Tế bào Thực vật và Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học

2.1.4 Địa điểm nghiên cứu

Luận văn được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp tìm kiếm thông tin về trình tự gen mã hóa cho enzyme CAD và CCR trên ngân hàng gen quốc tế

Thông tin về promoter của gen mã hóa cho enzyme CAD và trình tự nucleotide của gen mã hóa cho enzyme CCR được khai thác trên cơ sở dữ liệu NCBI có địa chỉ tại http://www.ncbi.nlm.nih.gov [30]

2.2.2 Phương pháp thiết kế mồi đặc hiệu tách dòng promoter của gen CAD và gen CCR

Dựa trên trình tự nucleotide của gen mã hóa cho enzyme CCR của cây

bạch đàn Eucalyptus gunnii (Genbank) có mã số X75480 và khai thác dữ liệu

trong ngân hàng gen để tìm ra các trình tự gen CCR của bạch đàn và các đối tượng có liên quan Sử dụng phần mềm DNAstar và BioEdit để so sánh các trình tự cDNA của gen CCR với nhau nhằm thiết kế mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn cDNA của gen CCR và trình tự promoter EuCAD Trên cơ sở đó đoạn cDNA của gen CCR và promoter của gen CAD được nhân bản sử dụng các cặp mồi như sau:

1 Cặp mồi nhân bản đoạn promoter CAD1 kích thước khoảng 987 bp

Trình tự mồi Kích thước

Mồi xuôi (Forward) 5’-ctgcagtgaacggttcgatctcaaca-3’ 26 nucleotide

2 Cặp mồi nhân bản đoạn promoter CAD2 kích thước khoảng 1149 bp

Trình tự mồi Kích thước

3 Cặp mồi nhân bản đoạn cDNA của gen CCR kích thước khoảng 1156 bp

Trình tự mồi Kích thước

Mồi xuôi (Forward) 5’-cacccacctcctgaacccctctc-3’ 23 nucleotide

2.2.3 Phương pháp tách chiết, tinh sạch DNA và RNA từ mô gỗ

2.2.3.1 Quy trình tách chiết DNA tổng số từ mô gỗ bạch đàn:

 Thêm 600µl dung dịch Chloroform: Isoamyl (24: 1) và đảo đều, để 5 phút ở nhiệt độ phòng

 Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 13000 v/p, ở 40C, Trong 5 phút Dùng pipette hút lấy 500µl dịch sang ống Eppendorf 1,5 ml, ủ vào đá

 Thêm 500µl isopropanol lạnh, ủ hỗn hợp trong đá 15 phút Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 13000 v/p, ở 40C, trong 10 phút

 Loại bỏ phần dịch nổi phía trên rửa DNA kết tủa dưới đáy ống bằng cồn 70% (1 lần) Ly tâm 13000 v/p và làm khô DNA kết tủa ở đáy ống eppendorf

 Thêm 50µl nước khử ion và 2µl RNAse, ủ ở 370C trong 30 phút

 Bảo quản DNA tổng số ở -200C

 Xác định hàm lượng và độ tinh sạch của DNA

Việc xác định hàm lượng và độ tinh sạch của DNA được thực hiện bằng cách đo độ hấp thụ tia UV ở các bước sóng 230, 260, 280 nm trên máy đo quang phổ Khi đó DNA có đỉnh hấp thụ cực đại ở bước sóng 260 nm Từ giá trị OD260 ta sẽ tính được hàm lượng của DNA thu được (giá trị OD = 1,0 tương ứng với hàm lượng DNA là 50 µg/l mẫu) Độ tinh sạch của DNA có thể được xác định bằng tỷ số OD260/280 và OD260/OD230 Các tỷ số này lần lượt chỉ ra sự có mặt của tạp chất là protein, các hợp chất polyphenol và cacbon hydrate Một mẫu DNA được coi là tinh sạch nếu tỷ số OD260/280 và OD260/OD230 đạt 1,8 – 2,0

 Các bước đo được tiến hành như sau:

 Chỉnh cân bằng máy: dùng nước cất 2 lần khử ion, vô trùng để làm chuẩn

 Kiểm tra máy: đo một mẫu DNA có nồng độ chuẩn đã biết trước (DNA của thực khuẩn thể λ)

 Đo mẫu ở bước sóng λ = 260 nm và λ = 280 nm

 DNA được pha loãng 200 lần theo công thức: lấy 995µl nước cất + 5µl DNA mẫu, lắc đều, cho vào cuvette, đặt vào máy đo

 Sau mỗi lần đo phải rửa sạch cuvette bằng nước cất

 In kết quả đo được

 Hàm lượng và độ sạch của DNA được tính theo công thức: o Hàm lượng DNA: E = 50 x HSPL x OD260

o Độ sạch của DNA: OD260/280 và OD260/OD230

Trong đó: E: Hàm lượng DNA (ng/µ) 50: Hằng số

HSPL: Hệ số pha loãng

OD230: Chỉ số đo được ở bước sóng 230 nm OD260: Chỉ số đo được ở bước sóng 260 nm OD280: Chỉ số đo được ở bước sóng 280 nm

2.2.3.2 Phương pháp tách chiết RNA tổng số

 Cân 200 mg mẫu và nghiền kĩ trong nitơ lỏng bằng cối chầy sứ cho đến khi thành dạng bột mịn

 Bổ sung thêm 700µl dung dịch đệm tách và trộn đều bằng cách đảo ngược nhẹ

 Thêm 150µl dung dịch muối LiCl 10M để ở 40C qua đêm Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 13000 v/p ở 40

C, trong 10 phút

 Loại bỏ phần dịch nổi phía trên sau đó rửa kết tủa dưới đáy ống bằng cồn 70% (1 đến 2 lần) Ly tâm 13000 v/p và làm khô kết tủa ở đáy ống eppendorf

 Thêm 50 µl nước khử ion và điện di kiểm tra sản phẩm

4oC30 giây

45 giây

1 phút 30 giây

10 phút

35 chu kỳ

5 phút94oC

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR:

Hình 2.1: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

2.2.6 Phương pháp tách dòng

2.2.6.1 Tinh sạch và gắn đoạn cDNA/promoter vào vector tách dòng pBT

 Tinh sạch sản phẩm PCR:

 Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% và cắt lấy băng quan tâm

 Bổ sung đệm hòa tan (QG) theo tỉ lệ: Vmẫu : V QG = 1 : 3 ( 1 µl tương ứng với 1 mg mẫu)

 Thêm 750µl đệm rửa PE vào cột, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút

 Ly tâm 13000 v/p trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột, ly tâm bổ sung 1 phút để loại hết PE

 Hòa tan DNA trong 30 – 50µl H20 khử ion đã được làm ấm đến 500C để ở nhiệt độ phòng 1 phút sau đó ly tâm 13000 v/p trong 1 phút