Nghiên cứu phân lập promoter của gen mã hóa cho glycine rich protein 1 8 GRP 1 8 biểu hiện đặc biệt ở xylem từ cây đậu cô ve phaseolus vulgaris l

ĐẶT VẤN ĐỀ Trên giới Việt Nam vài năm trở lại công nghệ chuyển gen vào tế bào thực vật quan tâm trọng đặc biệt lĩnh vực chuyển gen vào lâm nghiệp Đến có khoảng 20 nước trồng khảo nghiệm lâm nghiệp biến đổi gen [2] Trong tập trung chủ yếu vào gen như: gen chống chịu, gen tăng chất lượng gỗ, gen tăng khả sinh trưởng, gen kháng côn trùng… đặc biệt gen tăng chất lượng gỗ Tuy nhiên, để chuyển gen biểu thành tính trạng mong muốn cần thiết phải có promoter mạnh điều khiển biểu gen ngoại lai trồng biến đổi gen Các promoter sử dụng phổ biến bao gồm: CaMV 35S, CaMV 19S, GRP 1.8, NOS Promoter GRP 1.8 (Glycine- rich protein 1.8 promoter) có kích thước 614 bp, có khả tham gia điều khiển biểu đặc hiệu tầng xylem thực vật Tại Trung tâm Giống Công nghệ sinh học Trường Đại học Lâm Nghiệp thực đề tài cấp nhà nước "Nghiên cứu tạo giống Xoan ta (Melia azedarach L.) biến đổi gen có sức sinh trưởng nhanh, chất lượng gỗ tốt" Xoan ta sinh trưởng nhanh, đường kính đạt tới 100cm, chiều cao 30m Gỗ Xoan ta sử dụng nhiều đóng đồ mộc, đồ gia dụng, làm vật liệu xây dựng… Tuy nhiên, gỗ Xoan ta mềm nên khả chịu lực Để khắc phục nhược điểm này, hướng nghiên cứu chuyển gen tăng hàm lượng lignin vào Xoan ta để tăng chất lượng gỗ nhiều nhà khoa học đánh giá có tính khả thi cao Gen tăng chất lượng gỗ (gen 4CL1) sử dụng để chuyển vào Xoan ta, có hiệu cao gen biểu đặc hiệu tầng xylem Do đó, việc phân lập promoter biểu gen đặc hiệu tầng xylem có ý nghĩa Phân lập promoter biểu đặc hiệu tầng xylem nguyên liệu quan trọng phục vụ cho việc thiết kế cấu trúc vector chuyển gen, đặc biệt có ý nghĩa gen tăng chất lượng gỗ Xuất phát từ sở trên, tiến hành thực đề tài “Nghiên cứu phân lập promoter gen mã hóa cho glycine rich protein 1.8 (GRP 1.8) biểu đặc hiệu xylem từ Đậu cô ve (Phaseolus vulgaris L.)” Chƣơng I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Ứng dụng công nghệ gen thực vật Cơng nghệ sinh học chia làm thời kì là: Thời kỳ thứ công nghệ sinh học truyền thống: chế biến sản phẩm dân dã có từ lâu đời tương, chao, nước mắm theo phương pháp truyền thống Thời kỳ thứ hai công nghệ sinh học cận đại: có sử dụng cơng nghệ trình chế biến sản xuất sản phẩm việc sử dụng nồi lên men công nghiệp để sản xuất quy mô lớn sản phẩm hạt mì chính, acid amin, acid hữu cơ, chất kháng sinh, vitamin, enzym Thời kỳ thứ ba công nghệ sinh học đại: công nghệ gen, công nghệ tế bào, công nghệ enzym protein, công nghệ vi sinh, công nghệ lên men, công nghệ sinh học môi trường, công nghệ sinh học nano, công nghệ sinh học điện tốn [39] Trong lĩnh vực cơng nghệ sinh học đại, công nghệ gen (gene engineering) quan tâm trọng nhiều ứng dụng cho người ngày phủ nhận Sự thay đổi có mục đích gen (genom) thể sinh vật việc chuyển vào genom gen từ bên ngồi gọi cơng nghệ gen Cơ thể chuyển gen thực vật, động vật, vi sinh vật Tuy nhiên giới Việt Nam tập trung chủ yếu vào đối tượng thực vật Chuyển gen thực vật có ý nghĩa to lớn mặt khoa học Thơng qua chuyển gen, thấy vai trò gen thực vật, nghiên cứu trình điều khiển, biểu ảnh hưởng yếu tố di truyền ngoại cảnh lên hoạt động gen Đối với thực tiễn, cơng nghệ gen có nhiều ưu điểm so với phương pháp lai tạo: Lai tạo cho phép thể lồi có họ hàng gần mặt di truyền cịn cơng nghệ gen chuyển gen có nguồn khác vius, vi khuẩn, nấm men, động vật, thực vật Gen chuyển khơng làm ảnh hưởng tới kiểu hình phương pháp lai tạo truyền thống thường phải chuyển toàn genom cho vào nhận nên khó tách riêng gen có lợi khỏi gen không cần thiết, chúng liên kết với dẫn đến việc tạo kiểu hình khơng mong đợi Gen tách dịng chuyển vào giống trồng khác [14] Theo báo cáo tổng kết số 34 năm 2005 tổ chức ISAAA (International Service for the Acquisition of the Agribiotech Applications) tính đến năm 2005 tổng diện tích đất trồng biến đổi gen từ trước đến đạt 475 triệu hecta tăng 205 lần khoảng thời gian 10 năm (từ năm 1996 đến 2005) Tuy nhiên, trồng biến đổi gen trồng chủ yếu nước phát triển, tỷ lệ nhỏ nước phát triển lại nước phát triển Tổng doanh thu trồng biến đổi gen mang lại kể từ đưa vào thương mại hoá (1996- 2005) khoảng 30 tỷ USD Như vậy, bình diện tồn cầu lạc quan tin diện tích số người trồng biến đổi gen giới đặc biệt quốc gia phát triển tiếp tục tăng nhanh năm tới [2] Phần lớn nghiên cứu tập trung chủ yếu vào nông nghiệp thu nhiều thành tựu đáng kể như: chuyển gen kháng sâu bệnh vào Ngô, gen kháng thuốc diệt cỏ vào Bông, gen kháng vius vào Khoai tây… Bên cạnh đó, nghiên cứu cơng nghệ chuyển gen lâm nghiệp thực bắt đầu vào năm 2002 Trung Quốc nước trồng thương mại hoá lâm nghiệp biến đổi gen Bạch d ươ n g ( Po p u l u s n i g r a ) đ ượ c c h u yể n g e n Bt k h n g c ô n t r ù n g ă n l , c â y Po p l a r h y brid 741(P alba X [P.davidiana + P.simonii] X (P.tomentosa) chuyển gen Cry1A(c) API kháng côn trùng ăn Chuyển gen vào lâm nghiệp ch ủ y ế u đ ợ c t h ự c h i ệ n t h e o c c h n g chuyển gen kháng côn trùng, kháng sâu, kháng thuốc diệt cỏ, gen chống chịu với điều kiện bất lợi môi trường… Đặc biệt gen tăng khả sinh trưởng (gen GA20) gen tăng chất lượng gỗ (gen 4CL1) hai gen quan tâm trọng nhiều Theo báo cáo FAO (2004) nghiên cứu cải thiện chất lượng gỗ liên quan đến thành phần lignin chiếm 57%, nghiên cứu tăng tốc độ sinh trưởng chiếm 6% Các nghiên cứu tập trung vào đường sinh tổng hợp lignin thơng qua đặc tính enzym gen có liên quan đến đường tổng hợp thân cỏ trồng (Whetten et al, 1998) Tham gia vào đường trình tổng hợp lignin có enzym quan trọng là: 4CL (4 -courmarate CoA ligase), C AD ( c i n n a m y l a l c o h o l d e h y r o g e n a s a e ) , P AL ( p h e n y l a l a n i n e a m mo n i a l y a s e ) [ , , , ] Tuy nhiên, enzym 4CL enzym chìa khóa có vai trò quan trọng việc điều hòa sinh tổng hợp hợp chất thứ sinh, đặc biệt lignin thực vật [2] Lignin (C57H60O11) hợp chất phenol thơm, tự nhiên phổ biến sau cellulose [4,5] Lignin có đặc tính cứng, chất thấm vào vách tế bào m cho tế bào trở nên rắn [4] Vì vậy, để tăng cường khả tổng hợp lignin tế bào thực vật gỗ nhà nghiên cứu tiến hành chuyển gen 4CL1 Tuy nhiên phần lớn gen c huyển vào tế bào chuyển gen không hoạt động hoạt động yếu Nguyên nhân chủ yếu gen chưa có vùng điều khiển khởi đầu đặc hiệu Đối với nước ta điều kiện kinh tế cịn khó khăn, phủ quan tâm đầu tư cho phát triển công nghệ sinh học cịn hạn chế Cơng nghệ gen thực bắt đầu nước ta vài năm trở lại thu số thành tựu đáng kể, phần lớn thành tựu chủ yếu nông nghiệp như: Thuốc [18], Cà chua, Lúa [57], Khoai tây 1.2 Giới thiệu phân lập gen thơng qua PCR Phân lập (tách dịng) gen phương pháp thu nhận lượng lớn gen mong muốn từ nguồn DNA mang gen quan tâm Như ta biết hầu hết gen tế bào có với kích thước nhỏ bé hệ gen khổng lồ Trong nghiên cứu cơng nghệ gen lại cần gen dạng độc lập với số lượng lớn Vì vậy, phải tiến hành tách dòng gen nhằm tạo lượng lớn gen mong muốn để làm nguyên liệu cho nghiên cứu như: xác định trình tự gen, biểu gen chuyển gen [12] Hiện có nhiều phương pháp phân lập gen phân lập gen PCR, thiết kế sàng lọc thư viện cDNA, xác định gen thông qua nghiên cứu protemomic Phương pháp phân lập thông qua kỹ thuật PCR phương pháp đời sau tiện lợi, dễ thực hiện, dựa sở thông tin gen công bố Ngân hàng gen [13] Trên hình 1.1 có nhìn chung phân lập gen thông qua PCR Trước hết cần nghiên cứu, xác định gen quan tâm, dựa vào trình tự gen cơng bố Ngân hàng gen để thiết kế cặp mồi đặc hiệu Sau khi, tách chiết DNA tổng số từ vật liệu nghiên cứu, tiến hành PCR với cặp mồi đặc hiệu để nhân đoạn gen quan tâm, DNA ngoại lai nối vào vector tách dòng nhằm tạo plasmid tái tổ hợp Tiếp đó, vector tái tổ hợp biến nạp vào tế bào chủ tế bào chủ ni cấy mơi trường chọn lọc thích hợp Qua bước tách chiết plasmid, ta thu lượng lớn vector mang đoạn DNA ngoại lai Sau tiến hành giải trình tự gen thu để xác định so sánh với trình tự gen quan tâm công bố Ngân hàng gen Quốc tế (NCBI) Hình 1.1: Các bƣớc thực phân lập gen mục tiêu Gen quan tâm thu sau phân lập ứng dụng chuyển gen mục tiêu, lưu giữ bảo quản cho nghiên cứu 1.2.1 Thiết kế mồi Mồi đoạn oligonucleotid ngắn khoảng14- 35 nucleotid, có vai trị quan trọng định thành công phản ứng PCR Một cặp mồi dùng cho phản ứng PCR gồm mồi xuôi mồi ngược Mồi có vai trị tạo đầu 3’OH tự do, cần thiết cho phản ứng polyme hoá Mồi xi phải có trình tự bổ sung với trình mạch đơn DNA không mang mã (mạch antisense), mồi xuôi bắt cặp đầu 3’ mạch antisense Mồi ngược có trình tự bổ sung với trình tự mạch DNA mang mã di truyền (mạch sense), mồi ngược bắt cặp với mạch sense đầu 3’ mạch sense Điều kiện chủ yếu bảo đảm mồi hiệu quả: - Mồi không ngắn (nhỏ nucleotid) dài (lớn 50 nucleotid) Thiết kế mồi nên dư 1- nucleotid đầu 5’ mồi, giúp cho đoạn DNA nhân lên có trình tự ngun vẹn [9] Kích thước đoạn mồi khơng nên q dài Tối thiểu cần 18 nucleotid đoạn mồi bắt cặp xác với đoạn gen cần nhân Tất nhiên độ dài đoạn mồi thay đổi phụ thuộc vào tỷ lệ gốc A, T vị trí đoạn gen mà đoạn mồi cần bắt cặp [13] - Trình tự mồi có tính đặc hiệu cao, bắt cặp đầu ’ mạch khuôn Các mồi không bắt cặp với bắt cặp mạch khuôn Nucleotid dư đầu 5’ khơng nên nucleotid có khả bắt cặp tương đồng tốt với nucleotid tận đầu ’ đoạn mồi Khi tiến hành thiết kế mồi nên thiết kế thêm trình tự cắt enzym giới hạn tương ứng với trình tự enzym giới hạn có sẵn vector tách dịng Trình tự enzym giới hạn lựa chọn tốt trình tự gặp gen biểu Trình tự enzym giới hạn thêm vào mồi xi nên trình tự enzym giới hạn đứng sau đầu 5’ vùng MCS, cịn trình tự enzym giới hạn thêm vào mồi ngược trình tự đứng tận đầu ’ vùng MCS tính theo chiều promoter để đảm bảo đoạn gen đưa vào nằm xuôi chiều với promoter [19] - Nhiệt độ nóng chảy mồi khơng chênh lệch q lớn Cơng thức tính nhiệt độ nóng chảy mồi: + Mồi có chiều dài nhỏ 17 nucleotid Tm= 81,5+16,6x(log10)x[a]+0,41x(%GC)+ Mồi có chiều dài lớn 19 nucleotid Tm= 81,5+16,6x(log10)x[a]+0,41x(%GC)Trong đó: Tm : Nhiệt độ nóng chảy [a] : Nồng độ [Na+] [K+] phản ứng PCR thường 50mM %GC : Tỷ lệ G C thành phần loại mồi n : Tổng số nucleotid tương ứng có loại mồi - Nhiệt độ gắn mồi có ảnh hưởng lớn đến hiệu cao phản ứng PCR Nhiệt độ gắn mồi cần cao 50oC để đảm bảo tính hiệu phản ứng PCR [12] Nhiệt độ gắn mồi cần thấp nhiệt độ nóng chảy mồi 50oC, nhiệt độ gắn mồi cần đủ thấp cho việc bắt cặp mồi đủ cao cho việc ngăn chặn việc bắt mồi không đặc hiệu [19] + Cơng thức tính nhiệt độ gắn mồi: Ta = 0,3 x Tm (mồi) + 0,7 x Tm (sản phẩm) -14,9 Trong đó: Ta : Nhiệt độ gắn mồi Tm (mồi) : Nhiệt độ nóng chảy mồi Tm (sản phẩm): Nhiệt độ nóng chảy sản phẩm Mồi thiết kế phần lớn dựa trình tự gen quan tâm nghiên cứu công bố Ngân hàng gen Quốc tế coi mồi đặc hiệu cho gen quan tâm [13] Một số gen chưa biết trình tự, mồi thiết kế mồi ngẫu nhiên mồi suy biến 1.2.2 Tách chiết DNA tổng số DNA phân tử có kích thước lớn, q trình thao tác cần nhẹ nhàng tránh tác nhân đứt gãy DNA Quá trình tách chiết DNA tổng số gồm ba bước sau: Phá màng tế bào màng nhân (tế bào eucaryote) Thông thường người ta nghiền tế bào, mô hỗn hợp chất tẩy (như SDS, sarcosyl) proteinase K Hỗn hợp phá vỡ màng tế bào màng nhân, giải phóng DNA môi trường đồng thời phân huỷ protein liên kết với DNA Loại bỏ thành phần không muốn mẫu chủ yếu protein Mẫu lắc mạnh hỗn hợp phenol chloroform, dung dịch phenol: chloroform có tác dụng làm biến tính protein đồng thời khơng hồ tan acid nucleic Protein bị biến tính khơng cịn hồ tan pha nước có chứa acid nucleic sau li tâm tủa thành lớp nằm pha nước pha phenol: chloroform Pha nước có chứa acid nucleic thu nhận Tủa acid nucleic Mục đích việc tủa nhằm thu nhận acid nucleic dạng cô đặc, mặt nhằm bảo vệ chúng khỏi phân huỷ enzym, mặt khác để hồ tan chúng lại dung dịch theo nồng độ mong muốn [3] Thông thường người ta hay sử dụng isopropanol ethanol để thu nhận DNA 1.2.3 Phƣơng pháp PCR (Polymerase chain reaction) PCR chuỗi phản ứng liên tục gồm nhiều chu kỳ Karl Mullis cộng phát minh vào năm 1985 [31] Phương pháp PCR hình thành dựa vào đặc tính DNA polymerase Phản ứng gồm nhiều chu kỳ chu kỳ thường gồm ba giai đoạn: Giai đoạn biến tính: tác dụng nhiệt độ cao hai mạch phân tử DNA sợi kép tách thành hai mạch đơn Giai đoạn gắn mồi: nhiệt độ hạ thấp so với nhiệt độ biến tính cho phép mồi bắt cặp với khuôn Giai đoạn tổng hợp: nhiệt độ tăng lên cao so với nhiệt độ bắt mồi thích hợp cho hoạt động DNA polymerase Các enzym xúc tác hoạt động tổng hợp gắn thêm nucleotid vào cuối đoạn mồi, mồi kéo dài sở bắt cặp với mạch khuôn theo nguyên tắc bổ sung, tạo nên mạch đơn DNA [3, 7, 15] 1.2.4 Nguyên tắc tạo vector tái tổ hợp Tạo vector tái tổ hợp thực kỹ thuật gắn nối gen cần tách dòng vào vector tách dòng [7] Vector tách dòng DNA cần tạo dòng (thường sản phẩm PCR ) trộn theo tỷ lệ định xúc tác enzym T4 DNA ligase DNA gắn vào vector theo nguyên tắc bổ sung A- T vị trí mở vịng Nếu sản phẩm PCR có độ dài