Phân lập promoter của gen mã hóa cho enzyme cinnamyt alcohol dehydrogenase CAD biểu hiện đặc hiệu ở xylem từ cây bạch đàn urô eucalyptus urophylia s t blake

MỞ ĐẦU Lignin hai loại polymer sinh học phổ biến cây, sau cellulose, ƣớc tính lignin chiếm 30% lƣợng carbon hữu sinh [27] Quá trình tổng hợp lignin cách thức thích nghi thực vật q trình tiến hóa thực vật thay đổi mơi trƣờng sống từ nƣớc lên cạn Lignin giữ vai trò quan trọng việc hình thành cấu trúc thành tế bào thân Thêm vào lignin tham gia vào q trình vận chuyển nƣớc, chất dinh dƣỡng thông qua hệ thống bao mạch giữ vai trò quan trọng việc đảm bảo chắn không gian, nhƣ bảo vệ khỏi nhân tố gây bệnh Hàm lƣợng lignin cao gỗ giúp gỗ bền Bởi vậy, ngun liệu thơ tốt cho nhiều ứng dụng (trong xây dựng, nội thất, ) Nó cịn loại nhiên liệu hồn hảo, đốt lƣợng tỏa từ lignin cao từ cellulose Tuy nhiên số lĩnh vực nhƣ sản xuất sợi, sản xuất giấy hàm lƣợng lignin cao lại trở ngại Ví dụ nhƣ cơng nghiệp sản xuất giấy, lignin làm cho giấy chuyển mầu vàng theo thời gian Do lignin cần phải đƣợc loại bỏ trƣớc sử dụng để sản xuất giấy trắng chất lƣợng cao Vậy làm để điều chỉnh đƣợc hàm lƣợng lignin theo hƣớng có lợi cho thân sinh vật ngƣời, nhƣ: tăng hàm lƣợng lignin trồng làm nhiên liệu, xây dựng, nông nghiệp (cây lúa – chống đổ) hay giảm hàm lƣợng lignin bạch đàn nhằm tạo thuận lợi cho trình sản xuất giấy Đã có nhiều nghiên cứu (chủ yếu nƣớc ngồi) lignin, q trình sinh tổng hợp lignin, enzyme tham gia vào trình nhƣ enzyme cinnamoyl coenzymeA reductase (CCR) enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD), nhƣng đa phần mô hình (Arabidopsis thaliana, Populus trichocarpa) Nhằm mục đích điều khiển biểu số enzyme tham gia vào q trình sinh tổng hợp lignin mơ phân sinh gỗ cho số đối tƣợng lâm nghiệp phƣơng pháp chuyển gen, tiến hành đề tài: “Phân lập promoter gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) biểu đặc hiệu xylem từ bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla S.T Blake)” Làm vật liệu để thiết kế cấu trúc vector chuyển gen biểu đặc hiệu tầng xylem thực vật MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Tách dịng phân tích trình tự nucleotide đoạn promoter gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) từ bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla S.T Blake) trồng Việt Nam NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Tập hợp thơng tin trình tự nucleotide đoạn promoter gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) công bố ngân hàng gen quốc tế NCBI thiết kế cặp mồi để khuếch đại đoạn promoter từ bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla S.T Blake) Tách dòng đoạn promoter gen mã hóa cho enzyme CAD từ bạch đàn urơ (Eucalyptus urophylla S.T Blake) Phân tích trình tự nucleotide đoạn promoter gen mã hóa cho enzyme CAD phân lập đƣợc mục 2 CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan bạch đàn Bạch đàn chi thực vật thuộc họ Sim (Myrtaceae), Sim (Myrtaces), phân lớp Hoa Hồng (Rosidae), lớp Hai mầm (Dicotyledones) Tên bạch đàn Eucalyptus lần đƣợc nhà thực vật học ngƣời Pháp Charles Louis L’Heritier de Brutelle đặt cho vào năm 1788 Từ có tới 600 loài biến chủng đƣợc đặt tên mơ tả, gần chấp nhận 500 lồi [3] bạch đàn có xuất xứ từ Australia [3, 4, 23] có hai lồi bạch đàn phân bố Australia E.deglupta Blume E urophylla S.T Blake Cho đến nay, bạch đàn đƣợc gây trồng khắp nơi giới, đặc biệt vùng nhiệt đới ôn đới, vĩ độ 45oN 40oB nhƣ: Braxin, Trung Quốc, Ấn Độ,… [3] Bạch đàn urơ (Eucalyptus urophylla S.T Blake) có ngun sản Indonesia (tập trung số đảo Flores, Adona, Pantar, Alor Wetar Timor), phân bố từ 7o30 - 10o vĩ Nam 122o - 127o kinh Đông dốc núi thung lũng, loại đất bazan, diệp thạch phiến thạch, mọc vùng núi đá vôi Bạch đàn urô phân bố độ cao 300 – 2960 m so với mặt nƣớc biển Bạch đàn urơ cao 25 – 45 m, cá biệt cao 55 m, đƣờng kính đạt từ – m [2] Lần bạch đàn urơ có mặt Việt Nam chƣơng trình khảo nghiệm lồi xuất xứ bạch đàn năm 1979 vùng nguyện liệu giấy Trung tâm Bắc Bộ [5] Các vƣờn giống trồng hạt loài đƣợc xây dựng địa bàn tỉnh Phú Thọ Hà Tây Bạch đàn urơ đƣợc đánh giá lồi có dáng đẹp, chất lƣợng gỗ tốt Gỗ bạch đàn đƣợc sử dụng với nhiều mục đích nhƣ: gỗ xây dựng, làm đồ dùng gia đình, gỗ trụ mỏ,… Bạch đàn urơ đƣợc xem ngun liệu cho cơng nghiệp sản xuất giấy giới Việt Nam 1.2 Những nghiên cứu gen bạch đàn Với phát triển kỹ thuật sinh học phân tử đại, hiệu suất cao tin sinh học nhiều nghiên cứu gen nhiều lồi đƣợc giải mã thành cơng ví dụ Arabidopsis thaliana, đặc biệt số bao gồm lồi quan trọng nơng nghiệp nhƣ lúa (Oryza sativa) lâm nghiệp nhƣ dƣơng (Populus trichocarpa) Thông tin gen lồi trở thành cơng cụ có giá trị nghiên cứu chức tƣơng tác gen, nghiên cứu tiến hoá phân bố gen quần thể thực vật Thực vật hạt kín đƣợc cho có nhiều điểm tƣơng đồng gen, q trình trao đổi chất với lồi mơ hình, mà nghiên cứu lồi thơng tin cơng cụ quan trọng cho lồi thuộc họ khác ví dụ chi Eucalyptus [6] Những nghiên cứu gen bạch đàn bao gồm nhiều khía cạnh cấu trúc, chức thành phần trình tự gen Đặc điểm gen, bao gồm nhân nhân, đƣợc xác định dựa việc tạo đồ liên kết vị trí thị phân tử locus tính trạng số lƣợng Những nghiên cứu chức gen chủ yếu tập trung vào việc tách dòng xác định gen mới, phân tích biểu gen, định vị gen locus quy định tính trạng số lƣợng, mối liên kết tính đa hình DNA hình thái cá thể, cuối tạo dịng chuyển gen mang tính trạng mong muốn 1.3 Lignin chu trình sinh tổng hợp lignin thực vật 1.3.1 Lignin Lignin có cấu trúc phức tạp, polyphenol có mạng khơng gian mở Thành phần thay đổi theo loại gỗ, tuổi vị trí cấu trúc gỗ Lignin phức hợp dị polymer thơm đƣợc tổng hợp từ ba loại đơn phân hydroxycinnamyl alcohol Ba loại đơn phân phân biệt với tuỳ thuộc vào mức độ methoxyl hóa, với tên hóa học là: p-coumaryl M1H, coniferyl M1G sinapyl M1S alcohol [18, 21] (Hình 1.1) Hình 1: Đơn vị cấu trúc lignin Từ ba loại đơn phân này, chất p-hydroxyphenyl (H), guaiacyl (G)và syringyl (S) phenylpropanoid đƣợc tạo Các chất sau kết hợp lại để tạo phân tử lingin Mặc trình sinh tổng hợp monolignol (đơn phân tạo lignin) đƣợc xây dựng lại nhiều lần nhƣng đến vấn đề bàn cãi nhà khoa học Tƣơng tự nhƣ vậy, trình khử polymer hóa monolignol thành tế bào chủ đề đƣợc nghiên cứu thảo luận Hình 2: Sinh tổng hợp lignin thực vật 1.3.2 Chu trình sinh tổng hợp lignin Thành phần hàm lƣợng lignin khác loài, loại tế bào phân lớp vách tế bào thực vật, chúng thay đổi dƣới tác động môi trƣờng giai đoạn phát triển Thông thƣờng, lignin từ lồi thực vật hạt kín hai mầm (cây gỗ cứng) bao gồm ba thành phần (G), (S) (H), lồi thực vật hạt trần (gỗ mềm) bao gồm (G) (H) Lignin từ loài mầm thƣờng bao gồm hai thành phần (G) (S) với tỉ lệ thích hợp Thành phần (H) thƣờng tồn nhiều loài hai mầm, thành phần đƣợc hình thành kết hợp monolignol p-coumaryl alcohol M1H vào phân tử lignin thƣờng hay bị nhầm với p-coumarate Y3 loại lignin bị acyl hóa tách chiết từ cỏ [8, 14] 1.3.3 Giới thiệu gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) Cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) enzyme quan trọng đƣờng sinh tổng hợp lignin Gen mã hóa cho enzyme CAD có kích thƣớc 5265 bp mã số X75480 ngân hàng gen quốc tế NCBI Enzyme CAD enzyme xúc tác cuối đƣờng sinh tổng hợp lignin Gen mã hóa cho enzyme CAD đƣợc nghiên cứu nhiều loài thực vật nhƣ: Arabidopsis thaliana, Oryza sativa Bạch dƣơng (Populus) Năm 2009 Barakat cộng [6] tiến hành nghiên cứu đầy đủ họ gen CAD Bạch dƣơng Kết thấy họ gen CAD bạch đàn đƣợc phân làm ba lớp mà số đại diện trình tự gen CAD đƣợc phân lập từ thực vật hạt trần thực vật hạt kín Hai phân lớp khác đại diện trình tự gen CAD đƣợc phân lập từ thực vật hạt kín Gen CAD, ngoại trừ gen PoptrCAD hầu hết tồn hai phân lớp II III Nghiên cứu tiểu phần gen CAD tham gia vào trình phát triển hệ mạch gỗ thân nhƣ PoptrCAD PoptrCAD 10 thuộc lớp I lớp II Hầu hết gen CAD phân bố ngẫu nhiên khối mô thƣờng có vị trí tƣơng đồng khối mô lặp lại thực vật Đây đƣợc xem nghiên cứu tồn diện dịng Gen mã hóa cho enzyme CAD thực vật thân gỗ bao gồm nghiên cứu hệ gen, cấu trúc gen, hệ thống phát triển thực vật theo chiều ngang trình hình thành cấu trúc bên Dƣơng (Populus) [6] Kim cộng vào năm 2003 tiến hành nghiên cứu đối tƣợng Arabidopsis cho thấy gen CAD Arabidopsis gồm có 17 tiểu phân, Từ nhóm tác giả có phân tích tƣơng đồng tiểu phần gen CAD ảnh hƣởng chúng giai đoạn phát triển tới trình tổng hợp lignin Kết cho thấy tiểu phần AtCAD6 AtCAD9 không ảnh hƣởng nhiều tới hình thành tiểu phần lignin ngƣợc lại AtCAD5 lại tiểu phần quan trọng ảnh hƣởng tới trình sinh tổng hợp lignin thực vật [15] Sự biểu gen mã hóa cho enzyme CAD ảnh hƣởng trực tiếp tới hàm lƣợng chất lƣợng lignin tầng xylem thực vật Năm 1999, Baucher cộng tiến hành thí nghiệm làm giảm hàm lƣợng enzyme CAD Linh Lăng (alfalfa) kỹ thuật antisense, kết nghiên cứu cho thấy hàm lƣợng enzyme CAD thay đổi theo cơng thức thí nghiệm nhiên hàm lƣợng lignin lại hầu nhƣ không thay đổi, thay đổi hàm lƣợng tiểu phần cấu thành nên phân tử lignin Nghiên cứu cho thấy việc làm giảm lƣợng enzyme CAD dẫn tới tỷ số syringyl/guaiacyl (S/G) giảm, nghiên cứu tác giả hệ số S/G giảm ảnh hƣởng trực tiếp tới tạo thành liên kết sợi cellulose Nhƣ hàm lƣợng enzyme CAD ảnh hƣởng trực tiếp tới chất lƣợng lignin thực vật [7, 8] Do với mục đích tăng hàm lƣợng chất lƣợng lignin thực vật, từ kết nghiên cứu tiến hành phân lập promoter gen mã hóa cho enzyme CAD có hoạt tính mạnh xylem thực vật 1.4 Tổng quan promoter 1.4.1 Mơ hình điều hồ biểu gen sinh vật nhân chuẩn Điều hoà mức độ phiên mã sinh vật nhân chuẩn giống với điều hoà sinh vật nhân sơ dựa tƣơng tác protein điều hồ với trình tự DNA chun biệt, nhƣng phức tạp nhiều Các trình tự DNA chuyên biệt đƣợc gọi trình tự cis (cis elements ) protein điều hoà tƣơng tác với chúng đƣợc gọi nhân tố trans (trans factors) [1] 1.4.1.1 Các yếu tố tham gia vào trình điều hồ biểu gen Trình tự cis : trình tự DNA tham gia vào trình điều hòa biểu gen tế bào Trình tự cis thƣờng nằm cách xa điểm khởi đầu phiên mã hàng ngàn nucleotide Chính trình tự định biểu đặc trƣng gen, nghĩa gen đƣợc biểu loại tế bào nào, vào thời điểm nào, dƣới tác động nhân tố điều hoà ? Một đặc điểm chung cho trình tự chúng thƣờng có cấu trúc hai phần đối xứng Sở dĩ nhƣ trình tự thƣờng tiếp nhận protein điều hoà (nhân tố trans) dƣới dạng dimer (cấu tạo từ hai tiểu đơn vị) (Hình 1.4) Bên cạnh cịn nhóm trình tự khác tham gia vào q trình điều hồ biểu gen, nhóm trình tự tăng cƣờng (enhanncer) Các enhanncer có tách dụng làm tăng biểu gen tƣơng ứng Khác biệt nhóm so với trình tự cis hoạt tính tăng cƣờng biểu chúng khơng phụ thuộc vào : Vị trí, chúng không thiết phải nằm đầu 5’, đầu 3’ hay intron gen Hƣớng, đảo ngƣợc hƣớng chúng (từ đầu 5’ – 3’ sang 3’ – 5’) khơng làm hoạt tính khuếch đại Với đặc tính nhƣng có tác dụng ngƣợc lại nhóm trình tự kìm hãm (silencer) Cơ chế hoạt động hai nhóm chƣa đƣợc biết rõ [1] (Hình 1.3) Hình 3: Các trình tự cis trình tự tăng cƣờng (enhancer) 1.4.1.2 Các nhân tố tham gia vào trình điều hoà biểu gen - nhân tố trans Nhân tố trans protein điều khiển phiên mã nhờ gắn kết với đoạn trình tự nằm vùng điều hòa gen Đặc điểm chung nhân tố chúng bao gồm hai vùng cấu trúc - chức : Vùng chịu trách nhiệm gắn nhân tố trans vào DNA Vùng tác động lên phiên mã Các vùng cấu trúc - chức độc lập 10 Kết điện di nhƣ hình 3.11 cho thấy sản phẩm cắt phân thành hai băng rõ nét tƣơng ứng với phần vector pBT khoảng 2705 bp đoạn promoter CAD2 khoảng 1149 bp Nhƣ có thể bƣớc đầu khẳng định tạo đƣợc dịng khuẩn có chứa plasmid tái tổ hợp mang đoạn promoter CAD2 Để chắn có phải xác đọan promoter mong muốn dịng khuẩn số đƣợc sử dụng để đọc trình tự 3.3.5 Kết đọc trình tự nucleotide hai đoạn promoter CAD1 CAD2 Kết phân tích trình tự nucleotide hai đoạn promoter CAD1 CAD2 cho thấy, hai đoạn promoter tách dịng đƣợc có kích thƣớc so với dự tính thiết kế mồi Từ kết cho thấy trình tự promoter dự kiến Đoạn promter tách dịng đƣợc có chiều dài lần lƣợt 987 bp 1149 bp Nhƣ nghiên cứu bƣớc đầu thành công việc tách dịng xác định trình tự promter EuCAD Từ kết đọc trình tự so sánh với trình tự nucleotide gen CAD công bố ngân hàng gen quốc tế, khẳng định tách dòng đƣợc hai đoạn promoter từ gen CAD Từ kết kể thực phản ứng nối hai đoạn DNA sử dụng phản ứng PCR với cặp mồi sử dụng CADpro1-F CADpro2-R Kết phản ứng nối đƣợc kiểm tra gel agarose 0,8%; hình 3.12: 40 Hình 3.12: Ảnh điện di kiểm tra phản ứng nối hai đoạn promoter CAD1 CAD2 Giếng M: Thang DNA kb; Giếng 1: Đoạn CAD1; Giếng 2: Đoạn CAD2; Giếng 3: Sản phẩm nối Từ kết điện di cho thấy thu đƣợc băng kích thƣớc khoảng 2043 bp, phù hợp với kích thƣớc dự tính Nhƣ kết luận chúng tơi tách dịng thành cơng hồn chỉnh promoter EuCAD Đoạn promoter đƣợc dùng để thiết kết cấu trúc vector chuyển vào để kiểm tra hoạt động vị trí biểu gen tầng xylem promoter điều khiển 3.3.6 Phân tích nhân tố điều hịa dạng cis có mặt trình tự promoter gen CAD tách dòng đƣợc từ bạch đàn nâu Eucalyptus urophylla S.T Blake Sau có đƣợc trình tự đoạn DNA chúng tơi tiến hành so sánh trình tự với trình tự gen CAD bạch đàn gunnii kết đƣợc thể hình 3.13: 41 Hình 3.13: Kết so sánh trình tự DNA với gen CAD E gunnii Từ kết so sánh cho thấy đoạn trình tự promoter thu đƣợc nằm trùng với vị trí promoter gen CAD bạch đàn gunnii vị trí từ [2143] đến [- 382] bp, điều cho phép bƣớc đầu kết luận promoter gen CAD bạch đàn urô Và để khẳng định điều chúng tơi tiến hành phân tích trình tự DNA thu đƣợc nhằm tìm trình tự (motif) tham gia vào q trình điều hịa hoạt động gen điều kiện giai đoạn phát triển định Từ công bố trƣớc nhà khoa học phát đƣợc trình tự đặc trƣng promoter tham gia vào trình điều hòa sinh tổng hợp lignin thực vật nhƣ trình tự Myb hay Zinc finger [11] Để thực đƣợc công việc sử dụng sở liệu phân tích chuyên dụng PLACE (Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements) (Higo cộng sự, 1999) Kết phân tích thể hình 3.14: 42 43 Hình 3.14: Kết phân tích promoter gen CAD Từ kết phân tích này, nhận thấy promoter gen CAD tách dòng đƣợc từ bạch đàn nâu Eucalyptus urophylla S.T Blake có mang đầy đủ trình tự đặc trƣng promoter điển hình nhƣ CAATBOX, GATABOX, TATABOX Đặc biệt chúng tơi phát đƣợc trình tự có vai trị điều hòa hoạt động gen tầng xylem gen tham gia vào trình sinh tổng hợp lignin nhƣ đƣợc công bố nhà khoa học khác nhƣ MYB1AT, MYBPLANT [11] Những phân tích tin sinh học sở lý thuyết tốt cho nghiên cứu nhằm thiết kế vector chuyển gen có mang đoạn promoter mà chúng tơi tách dịng thành cơng nghiên cứu với mục đích cuối điều khiển q trình sinh tổng hợp lignin đối tƣợng rừng quan tâm 3.3.7 Kết đăng tải trình tự promoter gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase ngân hàng gen quốc tế NCBI Mặc dù có nhiều cơng trình nghiên cứu liên quan đến việc tách dịng giải trình tự nhiều gen promoter từ bạch đàn, nhƣng thông tin trình tự promoter gen CAD từ bạch đàn nâu Eucalyptus urophylla S.T Blake chƣa đƣợc công bố ngân hàng gen quốc tế Chính lý mà chúng tơi sử dụng trình tự mà chúng tơi tách dịng đƣợc để đăng kí lên ngân hàng gen quốc tế với mục đích chia sẻ kết thu đƣợc từ nghiên cứu với nhà khoa học khác nghiên cứu sinh học phân tử bạch đàn Ngoài DDBJ (DNA Data Bank of Japan), EMBL (European Molecular Biology Laboratory) ngân hàng gen quốc tế NCBI (National Center for Biotechnological Information) đặt Thƣ viện quốc gia Mỹ sở liệu lớn giới thông tin công nghệ sinh học Một ƣu điểm lớn sở liệu cho phép nhà khoa học đăng tải miễn phí kết nghiên cứu bao gồm ấn phẩm 44 khoa học, trình tự DNA, protein… Để làm đƣợc điều chúng tơi sử dụng chƣơng trình chun dụng từ sở liệu EMBL để đăng tải trình tự sinh học Webin [25] Kết chúng tơi cơng bố thành cơng trình tự promoter gen CAD với mã số (Accession number) FN393045 bao gồm thông tin liên quan đến tác giả, chiều dài promoter… Kết đƣợc thể hình 3.15 45 Hình 3.15: Thơng tin trình tự promoter gen CAD ngân hàng gen 46 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Tách dịng thành cơng đoạn promoter gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) từ bạch đàn nâu (Eucalyptus urophylla S.T Blake) Kết phân tích cho thấy promoter có chứa trình tự đặc trƣng promoter CAATBOX, GATABOX, TATABOX trình tự đặc trƣng biểu cho tầng xylem bao gồm MYBPLANT MYB1AT Xác định đƣợc đoạn trình tự promoter gen CAD có kích thƣớc khoảng 2043 bp đăng kí ngân hàng gen quốc tế NCBI với mã số FN393045 KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu hoạt động promoter CAD mơ hình (Thuốc lá, Arabidopsis,…) để khẳng định biểu đặc hiệu xylem promoter Từ kết thu đƣợc từ mơ hình thuốc sử dụng promoter cho nghiên cứu nhằm cải thiện chất lƣợng gỗ lâm nghiệp 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng (2005) Sinh học phân tử Nxb Giáo Dục.101112 Lê Đình Khả cộng tác viên (2003) Chọn tạo giống nhân giống cho số loài trồng rừng chủ yếu Việt Nam Nxb Nông nghiệp Nguyễn Dƣơng Tài (1994) Bƣớc đầu khảo nghiệm xuất xứ bạch đàn Eucalyptus urophylla S.T Blake vùng nguyện liệu giấy trung tâm Bắc Bộ, Việt Nam Luận án PTS khoa học Lâm nghiệp, Trƣờng Đại học Lâm nghiệp Việt Nam Nguyễn Hoàng Nghĩa (2000) Chọn gống bạch đàn Eucalyptus theo sinh trƣởng kháng bệnh Việt Nam Nxb Nông nghiệp Phạm Đình Sơn, Phạm Chiển (1990) Bạch đàn trồng rừng (bản dịch) Nxb Nông nghiệp TÀI LIỆU TIẾNG ANH Barakat A., Bagniewska-Zadworna A., Choi A., Plakkat U., DiLoreto D.S., Yellanki P., Carlson J.E (2009) The cinnamyl alcohol dehydrogenase gene family in Populus: phylogeny, organization, and expression BMC Plant Biology 9(26): 1-15 Baucher M., Andree B.V.M , Chabbert B., Michel B.J., Opsomer C., Van M.M and Botterman J (1999) Down-regulation of cinnamyl alcohol dehydrogenase in transgenic alfalfa (Medicago sativa L.) and the effect on lignin composition and digestibility Plant Molecular Biology 39: 437-447 Chiang, V L., (2006) Understanding Gene Function and Control in Lignin Formation In Wood NABC Report 48 Feuillet C., Lauvergeat V., Deswarte C., Pilate G., Boudet A., and Grima P.J (1995) Tissue- and cell-specific expression of a cinnamyl alcohol dehydrogenase promoter in transgenic poplar plants Plant Molecular Biology 4(27): 651-667 10 Gawel N J and Jarret R L (1991) A modified CTAB DNA extraction procedure for Musa and Ipomoea Plant Molecular Biology Reporter 3(9): 262-266 11 Goicoechea M., Lacombe E., Legay S., Mihaljevic S., Rech P., Jauneau A., Lapierre C., Pollet B., Verhaegen D., Chaubet G.N., Grima P.J (2005) EgMYB2, a new transcriptional activator from Eucalyptus xylem, regulates secondary cell wall formation and lignin biosynthesis The Plant Journal 43(4): 553-567 12 Hai L., Qingyin Z.,Yan L.Z., Shasheng W and Xiangning J (2003) Xylem specific expression of a GRP1.8 promoter: 4CL gene construct in transgenic tobacco Plant Growth Regulation 41: 279-286 13 Hawkins S., Samaj J., Lauvergeat V., Boudet A., and Pettenati J C (1997) Cinnamyl alcohol dehydrogenase: Identification of new sites of promoter activity in transgenic Poplar Plant Physiology 113: 321-325 14 Hu W.J., Harding S.A., Lung J., Popko J.L., Ralph J., Stokke D.D., Tsai C.J & Chiang V.L (1999) Repression of lignin biosynthesis promotes cellulose accumulation and growth in transgenic trees Nature Biotechnology 17: 808-812 15 Kim S.J., Kim M.R., Bedgar D.L., Moinuddin S.G., Cardenas C.L., Davin L.B., Kang C., Lewis N.G (2004) Functional reclassification of the putative cinnamyl alcohol dehydrogenase multigene family in Arabidopsis Proceedings of the National Academy of Sciences 101:1455-1460 49 16 Lauvergeat V., Rech P., Jauneau A., Guez C., Coutos T.P and Grima P.J (2002) The vascular expression pattern directed by the Eucalyptus gunnii cinnamyl alcohol dehydrogenase EgCAD2 promoter is conserved among woody and herbaceous plant species Plant molecular biology 50(3): 497-509 17 Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol 1, 2, and Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 18 Whettena R and Sederoffa R (1995) Lignin Biosynthesis The Plant Cell 7: 1001-1013 19 Xu Q., Wen X.P., and Deng X.X (2004) A Simple Protocol for Isolating Genomic DNA From Chestnut Rose (Rosa roxburghii Tratt ) for RFLP and PCR Analyses Plant Molecular Biology Reporter 22: 301a-301g TÀI LIỆU WEB 20 http://www.patentlens.net/daisy/promoters/768.html 21 http://www.community.h2vn.com/index.php?action=printpage%3Btopic =061.0 22 http://www.vi.wikipedia.org/wiki/Promoter 23 http://ww.kim-son.com/manbo/index 24 http://vi.wikipedia.org/wiki/Xylem 25 http://www.ebi.ac.uk/embl/Submission/webin.html 26 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 27 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10074466 50 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lịng cảm ơn sâu sắc tới TS Chu Hồng Hà – Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ Sinh học Ths Bùi Văn Thắng – Bộ môn Giống Công nghệ sinh học – Khoa Lâm học – Trƣờng Đại học Lâm nghiệp tận tình hƣớng dẫn, bảo giúp đỡ tơi q trình thực khóa luận Tơi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới GS TS Lê Trần Bình, TS Nguyễn Hữu Cƣờng, Viện Cơng nghệ sinh học ThS Hồ Văn Giảng Trung tâm Giống Công nghệ sinh học Trƣờng Đại học Lâm nghiệp tạo điều kiện đóng góp ý kiến quý báu cho tơi thời gian thực tập Phịng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học Tơi xin chân thành cảm ơn CN Hồng Hà tập thể cán Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Cơng nghệ Sinh học tận tình giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Cùng với lịng biết ơn sâu sắc gửi tới tồn thể thầy cô giáo Bộ môn Giống Công nghệ sinh học, gia đình, bạn bè, ngƣời giúp đỡ, động viện khích lệ tơi suốt trình học tập Hà Nội, tháng năm 2009 Sinh viên Trần Trung Thành 51 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism Bp Base pair CAD Cinnamyl alcohol dehydrogenase DNA Deoxyribonucleic Acid dNTP Deoxynucleotide triphosphate EtBr Ethidium Bromide Kb Kilobase LB Luria and Bertani PCR Polymerase chain reaction RAPD Random Amplified Polymorphic DNA RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism RNA Ribonucleic Acid RNase Ribonuclease SSR Simple Sequence Repeat Taq Thermus aquaticus v/p Vòng/Phút 52 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan bạch đàn 1.2 Những nghiên cứu gen bạch đàn 1.3 Lignin chu trình sinh tổng hợp lignin thực vật 1.3.1 Lignin 1.3.2 Chu trình sinh tổng hợp lignin 1.3.3 Giới thiệu gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) 1.4 Tổng quan promoter 1.4.1 Mơ hình điều hồ biểu gen sinh vật nhân chuẩn 1.4.2 Cấu trúc chức promoter 12 1.4.3 Các loại promoter sử dụng công nghệ sinh học 12 1.4.4 Promoter điểu khiển hoạt động gen tầng xylem 15 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Vật liệu nghiên cứu 17 2.1.1 Vật liệu sử dụng để phân lập promoter: 17 2.1.2 Hoá chất: 17 2.1.3 Máy móc, thiết bị 17 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 18 2.2.1 Phƣơng pháp tìm kiếm thơng tin trình tự gen mã hóa cho enzyme CAD ngân hàng gen quốc tế 18 2.2.2 Thiết kế mồi đặc hiệu tách dòng promoter 18 2.2.3 Tách chiết tinh DNA từ mô gỗ 19 2.2.4 Khuếch đại đoạn promoter EuCAD PCR 21 2.2.5 Tách dòng promoter 22 53 2.2.6 Biến nạp sản phẩm ligation vào tế bào khả biến E.coli DH5α 24 2.2.7 Chọn lọc dòng tế bào E coli mang vector tái tổ hợp 25 2.2.8 Tách chiết plasmid tái tổ hợp 26 2.2.9 Xác định trình tự nucleotide promoter 27 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Tách chiết DNA bạch đàn 29 3.2 Khuếch đại promoter PCR 30 3.3 Tách dòng xác định trình tự đoạn promoter EuCAD 32 3.3.1 Tinh sản phẩm PCR tạo vector tái tổ hợp 32 3.3.2 Biến nạp sản phẩm ligation vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5 34 3.3.3 Chọn dòng tế bào E.coli mang vector tái tổ hợp 35 3.3.4 Tách chiết plasmid tái tổ hợp 37 3.3.5 Kết đọc trình tự nucleotide hai đoạn promoter CAD1 CAD2 40 3.3.6 Phân tích nhân tố điều hịa dạng cis có mặt trình tự promoter gen CAD tách dịng đƣợc từ bạch đàn nâu Eucalyptus urophylla S.T Blake 41 3.3.7 Kết đăng tải trình tự promoter gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase ngân hàng gen quốc tế NCBI 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………………….47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 ... alcohol dehydrogenase (CAD) t? ?? bạch đàn nâu (Eucalyptus urophylla S. T Blake) K? ?t phân t? ?ch cho thấy promoter có chứa trình t? ?? đặc trƣng promoter CAATBOX, GATABOX, TATABOX trình t? ?? đặc trƣng biểu. .. t? ?i: ? ?Phân lập promoter gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) biểu đặc hiệu xylem t? ?? bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla S. T Blake) ” Làm v? ?t liệu để thi? ?t kế cấu trúc vector... t? ?? NCBI thi? ?t kế cặp mồi để khuếch đại đoạn promoter t? ?? bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla S. T Blake) T? ?ch dịng đoạn promoter gen mã hóa cho enzyme CAD t? ?? bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla S. T