Phân lập promoter của gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase và thiết kế vector chuyển gen mang đoạn gen mã hóa cho enzyme cinnamoyl CoA reductase từ cây bạch đàn uro

Phân lập promoter của gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase và thiết kế vector chuyển gen mang đoạn gen mã hóa cho enzyme cinnamoyl CoA reductase từ cây bạch đàn uro

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM LÊ PHƢƠNG DUNG PHÂN LẬP PROMOTER CỦA GEN MÃ HÓA CHO ENZYME CINNAMYL ALCOHOL DEHYDROGENASE (CAD) VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG ĐOẠN GEN MÃ HÓA CHO ENZYME CINNAMOYL CoA REDUCTASE (CCR) TỪ CÂY BẠCH ĐÀN URO (EUCALYPTUS UROPHYLLA S.T. BLAKE) LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Thái Nguyên – 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn THAI NGUYEN UNIVERSITY COLLEGE OF EDUCATION LE PHUONG DUNG CLONING PROMOTER REGION OF GENE ENCODING CINNAMYL ALCOHOL DEHYDROGENASE (CAD) AND CONSTRUCTING PLANT TRANSFORMATION VECTOR CARRYING CINNAMOYL CoA REDUCTASE GENE FROM EUCALYPTUS UROPHYLLA S.T. BLAKE Speciality: Genetics Code: 60.42.70 MASTER’S THESIS SUMMARY Supervisor: Dr. Nguyen Huu Cuong Thai Nguyen, 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chƣa có ai công bố trong một công trình nào khác. Tác giả Lê Phƣơng Dung Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 1.1. Tổng quan về cây bạch đàn . 1.2. Tình hình trồng bạch đàn ở Việt Nam 1.3. Tình hình sinh trƣởng của cây bạch đàn ở Việt Nam ……………………. 1.4. Lignin và chu trình sinh tổng hợp lignin ở thực vật . 1.4.1. Lignin 1.4.2. Chu trình sinh tổng hợp lignin ở thực vật . 1.4.3. Giới thiệu về gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) 1.5. Tổng quan về promoter . 1.5.1. Mô hình điều hoà biểu hiện gen ở sinh vật nhân chuẩn. . 1.5.2. Cấu trúc và chức năng của promoter 1.5.3. Các loại promoter sử dụng trong công nghệ sinh học . 1.5.4. Promoter điểu khiển hoạt động gen ở tầng xylem Error! Bookmark not defined. 1.5. Một số kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong nghiên cứu CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 2.1. Vật liệu nghiên cứu . 2.1.1. Vật liệu: . 2.1.2. Hoá chất: 2.1.3. Máy móc, thiết bị . 2.1.4. Địa điểm nghiên cứu 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu . Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 2.2.1. Phƣơng pháp tìm kiếm thông tin về trình tự gen mã hóa cho enzyme CAD trên ngân hàng gen quốc tế . 2.2.2. Thiết kế mồi đặc hiệu tách dòng gen/promoter. 2.2.3. Tách chiết và tinh sạch DNA – RNA từ mô gỗ 2.3.4. Tổng hợp cDNA 2.2.5. Khuếch đại đoạn promoter EuCAD và đoạn gen CCR bằng phản ứng PCR . 2.2.6. Phƣơng pháp tách dòng . 2.2.7. Phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) Error! Bookmark not defined. 2.2.8. Phƣơng pháp xác định trình tự của gen. . 2.2.9. Phƣơng pháp Gateway. CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tách chiết DNA bạch đàn . 3.2. Khuếch đại promoter bằng PCR . 3.3. Tách dòng và xác định trình tự đoạn promoter EuCAD 3.3.1. Tinh sạch sản phẩm PCR và tạo vector tái tổ hợp 3.3.2. Biến nạp sản phẩm ligation vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5. 3.3.3. Chọn dòng tế bào E.coli mang vector tái tổ hợp. . 3.3.4. Tách chiết plasmid tái tổ hợp . 3.3.5. Kết quả đọc trình tự nucleotide của hai đoạn promoter CAD1 và CAD2 3.3.6. Phân tích các nhân tố điều hòa dạng cis có mặt trong trình tự của promoter gen CAD tách dòng đƣợc từ bạch đàn nâu Eucalyptus urophylla S.T Blake . 3.3.7. Kết quả đăng tải trình tự promoter của gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase tại ngân hàng gen quốc tế NCBI . KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………………………………………………. TÀI LIỆU THAM KHẢO Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Thành phần dung dịch đệm tách chiết … 19 Bảng2.2. Thành phần dung dịch đệm tách chiết . 21 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng khử DNA . 22 Bảng 2.4A. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA . 23 Bảng 2.4B. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA . 23 Bảng 2.4C. Chu trình nhiệt của phản ứng tổng hợp cDNA . 24 Bảng 2.5: Thành phần phản ứng PCR . 24 Bảng 2.6. Thành phần phản ứng gắn gen/promoter vào vector tách dòng 26 Bảng 2.7. Thành phần hoá chất tách plasmid 28 Bảng 2.8. Thành phần phản ứng cắt . 29 Bảng 2.9. Thành phần phản ứng colony-PCR .29 Bảng 2.10. Thành phần phản ứng ghép nối . 31 Bảng 2.11. Thành phàn phản ứng cắt plasmid pENTR/CCR . 32 Bảng 2.12. Thành phần phản ứng LR . 33 Bảng 2.13. Thành phần phản ứng cắt plasmid pBENDER/CCR 34 Bảng 3.1. Trình tự và các thông số cần thiết của các mồi . 35 Bảng 3.2. Trình tự và các thông số cần thiết của hai mồi CCR entr-F, CCR-R . 52 Bảng 3.3. Kích thƣớc các phân đoạn thu đƣợc khi cắt plasmid tái tổ hợp pBENDER/CCR bằng XhoI . 64 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Đơn vị cấu trúc cơ bản của lignin ………………………………… . 9 Hình 1.2: Sinh tổng hợp lignin trong thực vật 10 Hình 1.3.Lát cắt thân cây chuyển gen CCR.H (A) và cây không chuyển gen (B) 15 Hình 2.1. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR . 25 Hình 2.2. Sơ đồ vector pBT . 26 Hình 2.3. Chu trình nhiệt của phản ứng colony – PCR . 30 Hình 2.4. Sơ đồ vector pENTR TM /D-TOPO  . 31 Hình 2.5. Sơ đồ vector pBENDER 32 Hình 3.1. Kết quả điện di sản phẩm tách DNA từ gỗ bạch đàn . 34 Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro1 35 Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro2 36 Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro1 sau tinh sạch .37 Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro2 sau tinh sạch .37 Hình 3.6: Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến 39 Hình 3.7: Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR trực tiếp từ các khuẩn lạc .41 Hình 3.8: Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR trực tiếp từ các khuẩn lạc 41 Hình 3.9: Kết quả điện di plasmid tái tổ hợp tách từ tế bào E.coli DH5α ……. 42 Hình 3.10: Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp mang đoạn promoter CAD1 43 Hình 3.11: Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp mang đoạn promoter CAD2 . 44 Hình 3.12: Kết quả điện di kiểm tra phản ứng nối hai đoạn promoter CAD1 và CAD2 . 45 Hình 3.13: Kết quả so sánh trình tự DNA với gen CAD của E. gunnii 46 Hình 3.14: Kết quả phân tích promoter của gen CAD ……………………… 48 Hình 3.15: Kết quả điện di RNA tổng số trên gel agarose 1% 51 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Hình 3.16: Kết quả điện di khử DNA 51 Hình 3.17. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR 53 Hình 3.18. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm thôi gel trên gel agarose 1% 54 Hình 3.19. Kết quả dựng cây phát sinh chủng loại của gen CCR . 56 Hình 3.20. Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp pENTR/CCR vào tế bào khả biến E.Coli DH5 56 Hình 3.21. Kết quả điện di plasmid pENTR/CCR 58 Hình 3.22. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen CCR . 59 Hình 3.23. Kết quả colony PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu CCR entr F và CCR R 61 Hình 3.24. Kết quả tách plasmid tái tổ hợp pBENDER/CCR 61 Hình 3.25. Kết quả cắt plasmid tái tổ hợp pBENDER/CCR bằng enzyme XhoI 62 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Hữu Cường – Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện công nghệ sinh học đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới GS. TS. Lê Trần Bình, TS. Chu Hoàng Hà - Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện và đóng góp những ý kiến quý báu cho tôi trong thời gian thực tập tại Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban chủ nhiệm Khoa Sinh – KTNN cùng toàn thể cán bộ nhân viên trong khoa đã tạo mọi điều kiện và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn CN. Hoàng Hà và tập thể cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học đã tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Cùng với lòng biết ơn sâu sắc gửi tới gia đình và bạn bè đã giúp đỡ, động viên và khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện thành công luận văn này. Thái Nguyên, ngày 09 tháng 9 năm 2009 Học viên Lê Phương Dung [...]... t promoter ca gen mó húa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) v thit k vector chuyn gen mang on gen mó húa cho enzyme cinnamoyl coA reductase (CCR) t cõy bch n urụ (Eucalyptus urophylla S.T Blake) 1.2.2 Ni dung nghiờn cu - Tp hp thụng tin v trỡnh t nucleotide on promoter ca gen mó húa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) v trỡnh t nucleotide on gen mó húa cho enzyme cinnamoyl coA. .. mt s enzyme tham gia vo quỏ trỡnh sinh tng hp lignin mụ phõn sinh g cho mt s i tng cõy lõm nghip bng phng phỏp chuyn gen, chỳng tụi tin hnh ti: Phõn lp promoter ca gen mó húa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) v thit k vector chuyn gen mang gen mó húa cho enzyme cinnamoyl coA reductase (CCR) t cõy bch n urụ (Eucalyptus urophylla S.T Blake) lm vt liu thit k cỏc cu trỳc vector chuyn gen. .. trỡnh t gen mó húa cho enzyme CAD v CCR trờn ngõn hng gen quc t Thụng tin v promoter ca gen mó húa cho enzyme CAD v trỡnh t nucleotide ca gen mó húa cho enzyme CCR c khai thỏc trờn c s d liu NCBI cú a ch ti http://www.ncbi.nlm.nih.gov [30] 2.2.2 Phng phỏp thit k mi c hiu tỏch dũng promoter ca gen CAD v gen CCR Da trờn trỡnh t nucleotide ca gen mó húa cho enzyme CCR ca cõy bch n Eucalyptus gunnii (Genbank)... t nucleotide on gen mó húa cho enzyme cinnamoyl coA dehydrogenase (CCR) ó cụng b trờn ngõn hng gen quc t NCBI thit k cp mi khuch i on gen ny t cõy bch n urụ (Eucalyptus urophylla S.T Blake) - Tỏch dũng, phõn tớch trỡnh t on promoter ca gen mó húa cho enzyme CAD v thit k vector chuyn gen mang on gen mó húa cho enzyme CCR t cõy bch n urụ (Eucalyptus urophylla S.T Blake) S húa bi Trung tõm Hc liu i hc... P.J (1995), Tissue- and cell-specific expression of a cinnamyl alcohol dehydrogenase promoter in transgenic poplar plants Plant Molecular Biology 4(27): 651-667 14 Fiona S Poke1, Renộ E Vaillancourt, Robert C Elliott and James B Reid (2003), Sequence variation in two lignin biosynthesis genes, cinnamoyl CoA reductase (CCR) and cinnamyl alcohol dehydrogenase 2 (CAD2) Molecular Breeding 12: 107118, 2003... phõn t cinnamolyl CoA ester, l tin cht ca cỏc phõn t monolignol, c hỡnh thnh t chu trỡnh sinh tng hp cỏc phenylpropanoid sau ú c chuyn húa thnh cỏc phõn t monolignol thụng qua cỏc phn ng c xỳc tỏc bi hai enzyme l cinnamoyl CoA reductase (CCR) v cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) [28] Trong ú CCR xỳc tỏc cho cỏc phn ng tiờu th NAPDH chuyn húa p-coumaroyl CoA, feruloyl CoA v sinapoyl CoA thnh cỏc dng... tỏc gi lng enzyme 4CL1 tn ti trong thõn ó ra tng gp t 1 2 ln so vi cõy i chng ch chuyn gen 4CL1, tuy nhiờn s biu hin ca gen 4CL1 li hu nh khụng cú ti cỏc mụ khỏc nh lỏ iu ny cng khng nh hn na s biu hin c hiu ca promoter GRP1.8 trong tng xylem ca thõn [17] 1.3.4 Enzyme cinnamoyl CoA reductase v vai trũ trong quỏ trỡnh sinh tng hp lignin Cú th núi rng cinnamoyl CoA reductase l mt trong hai enzyme quan... hm lng lignin trong cõy bch n nhm to thun li cho quỏ trỡnh sn xut giy Hin nay ó cú rt nhiu nghiờn cu (ch yu l nc ngoi) v lignin, quỏ trỡnh sinh tng hp lignin, cỏc enzyme tham gia vo quỏ trỡnh ny nh enzyme cinnamoyl coenzymeA reductase (CCR) v enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD), nhng a phn l trờn cỏc cõy mụ hỡnh (Arabidopsis thaliana, Populus trichocarpa) [7],[10],[18] S húa bi Trung tõm Hc... dng trong ú gen GUS chu s iu khin ca promoter ny Sau khi phõn tớch cõy chuyn gen mang cu trỳc ny tỏc gi nhn thy rng gen GUS biu hin ch yu phn xylem v cỏc t bo bú mch õy l ni m s lignin húa din ra mnh nht [13] Cỏc kt qu ca nghiờn cu ny l nguyờn liu rt tt cho ti ca chỳng tụi Cinnamyl alcohol dehydrogenase l enzyme xỳc tỏc cui cựng trong con ng sinh tng hp lignin Nm 2002, tỏc gi Lauvergeat cho rng s biu... Boudet, and Jacqueline Crima-Pettenati (1997), Cinnamyl Alcoholl Dehydrogenase: Identification of New Sites of Promoter Activity in transgenic Poplar Plant Physiol 113: 321-325 23 Lauvergeat V., Rech P., Jauneau A., Guez C., Coutos T.P and Grima P.J (2002), The vascular expression pattern directed by the Eucalyptus gunnii cinnamyl alcohol dehydrogenase EgCAD2 promoter is conserved among woody and herbaceous . PHÂN LẬP PROMOTER CỦA GEN MÃ HÓA CHO ENZYME CINNAMYL ALCOHOL DEHYDROGENASE (CAD) VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG ĐOẠN GEN MÃ HÓA CHO ENZYME CINNAMOYL. tài: Phân lập promoter của gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) và thiết kế vector chuyển gen mang gen mã hóa cho enzyme