Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase tăng cường sinh tổng hợp tinh bột (LV thạc sĩ)

Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase tăng cường sinh tổng hợp tinh bột (LV thạc sĩ)Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase tăng cường sinh tổng hợp tinh bột (LV thạc sĩ)Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase tăng cường sinh tổng hợp tinh bột (LV thạc sĩ)Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase tăng cường sinh tổng hợp tinh bột (LV thạc sĩ)Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase tăng cường sinh tổng hợp tinh bột (LV thạc sĩ)Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase tăng cường sinh tổng hợp tinh bột (LV thạc sĩ)Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase tăng cường sinh tổng hợp tinh bột (LV thạc sĩ)Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase tăng cường sinh tổng hợp tinh bột (LV thạc sĩ)Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase tăng cường sinh tổng hợp tinh bột (LV thạc sĩ)Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase tăng cường sinh tổng hợp tinh bột (LV thạc sĩ)

BỘ GIÁO DỤC

VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

LỜI CAM ĐOAN

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

- -

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN SSIV MÃ HÓA ENZYME STARCH SYNTHASE TĂNG

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan Luận văn này hoàn toàn được hoàn thiện bằng quá trình nghiên c ứu khoa học của bản thân dưới sự hướng dẫn trực tiếp của TS Phạm Bích Ngọc cùng với cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học Các số liệu hình ảnh, kết quả được trình bày, trong luận văn này

là trung thực, không sao chép bất cứ tài liệu, công trình nghiên cứu của người khác mà không chỉ rõ nguồn tham khảo Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan của mình trước hội đồng khoa học

Hà Nội, tháng 1 năm 2016

Học viên

Nguyễn Mậu Hƣng

PGS.TS Chu Hoàng Hà - Viện trưởng Viện công nghệ sinh học, Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học đã chỉ bảo tận tình về chuyên môn, luôn theo sát thí nghiệm của tôi để có những lời khuyên bổ ích và kịp thời

ThS Lê Thu Ngọc, CN Nguyễn Khắc Hưng, CN Phạm Thanh Tùng đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm luận văn

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô giáo tại Cơ sở đào tạo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong thời gian học tập vừa qua

Bằng tình cảm chân thành, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè

đã luôn ở bên, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn này

Hà Nội, tháng 1 năm 2016 Học viên

Nguyễn Mậu Hưng

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 11

1 Đặt vấn đề 11

2 Mục đích nghiên cứu 12

3 Nội dung nghiên cứu 12

4 Ý nghĩa khoa học 13

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 14

1.1 Tổng quan về tinh bột và sinh tổng hợp tinh bột 14

1.1.1 Giới thiệu về tinh bột 14

1.1.2 Cấu trúc của tinh bột 15

1.1.3 SỰ THỦY PHÂN TINH BỘT 16

1.1.4 HÌNH DẠNG TINH BỘT 17

1.1.5 Các loại hạt tinh bột hay gặp 17

1.1.6 Cơ chế sinh tổng hợp tinh bột và các gen liên quan 18

1.1.7 Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học nhằm cải biến quá trình trao đổi tinh bột 21

1.2 Cây sắn và tình hình sản xuất cây sắn trên thế giới và Việt Nam 22

1.3 Rễ tơ và ứng dụng nuôi cấy rễ tơ trong sản xuất protein tái tổ hợp 26

1.4 Giới thiệu về Agrobacterium rhizogenes – phương pháp tạo rễ tơ ở tế bào thực vật 28

1.5 Cơ chế chuyển các gen vùng T-DNA vào tế bào thực vật 29

1.6 Nuôi cấy sinh khối rễ tơ 30

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

2.1 Vật liệu , hóa chất và thiết bị 32

2.1.1 Thực vật 32

2.1.2 Chủng khuẩn, vector và cặp mồi sử dụng 32

2.1.3 Hóa chất 33

2.1.4 Thiết bị 33

2.2 Phương pháp nghiên cứu 34

2.2 Phương pháp thu thập mẫu, phân lập, xác định trình tự gen SSIV 34

2.2.1 Tách chiết RNA tổng số từ củ sắn giống KM140 34

2.2.2 Phản ứng RT-PCR 34

2.2.3 Tách dòng sản phẩm bằng vector pENTR™/D-TOPO 36

2.2.4 Kiểm tra các khuẩn lạc bằng phương pháp PCR từ khuẩn lạc 37

2.2.5 Tách chiết plasmid 38

2.2.6 Xác định trình tự và so sánh trình tự gen thu được với các trình tự tương ứng trên GenBank 39

2.2.7 Thiết kế vector pK7GWIWG2(II) mang đoạn gen SSIV bằng kỹ thuật Gateway 39

2.2.8 Phương pháp chuyển gen tạo rễ tơ ở khoai lang nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 42

2.2.9 Phương pháp đánh giá mô chuyển gen trên môi trường chọn lọc 43

2.2.10 Phương pháp xử lí số liệu 43

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44

3.1 Phân lập, giải trình tự gen SSIV mã hóa cho enzyme Starch Synthase ở sắn 44

3.1.1 Tách chiết RNA tổng số từ củ sắn giống KM140 44

3.1.2 Thiết kế mồi đặc hiệu nhân gen SSIV của sắn và tổng hợp cDNA 44

3.1.3 Phân lập, tách dòng, giải trình tự gen SSIV của sắn 45

3.2 Thiết kế vector chuyển gen thực vật pK7WG2D/SSIV và tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes tương ứng 46

3.2.1 Thiết kế vector chuyển gen thực vật pK7WG2D/SSIV bằng kỹ thuật Gateway 46

3.2.2 Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium mang cấu trúc vector chuyển gen đã thiết kế 47

3.3 Kết quả chuyển gen tạo rễ tơ khoai lang mang gen SSIV 48

3.5 Phân tích các dòng rễ tơ khoai lang chuyển gen SSIV bằng kỹ thuật PCR 50

3.6 Phân tích cây chuyển gen SSIV bằng kỹ thuật RT-PCR 51

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55

KẾT LUẬN: 55

ĐỀ NGHỊ: 55

Tài Liệu Tham Khảo 56

Phụ Lục: 1

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Cấu trúc phân tử của amylopectin và amylose 15 Hình 2 Quá trình sinh tổng hợp tinh bột và các enzyme liên quan 19 Hình 3 Cây Sắn 23

Hình 4 Sản lượng sắn theo châu lục, năm 2006-2011Error! Bookmark not

defined.

Hình 5 Tỷ lệ sản lượng sắn các nước trên thế giới, 2012Error! Bookmark not defined.

Hình 6 Vector pK7GWG2D 40 Hình 7 RNA tổng số tách chiết từ củ giống sắn KM140 44 Hình 8 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại gen SSIV từ cDNA sắn 45 Hình 9 Colony-PCR chọn lọc các dòng khuẩn mang vector pENTR/SSIV 46 Hình 10 Kết quả colony-PCR sử dụng mồi đặc hiệu SSIV-Frag_F/R và kiểm tra

sản phẩm cắt plasmid pK7WG2D/SSIV bằng EcoRI 47

Hình 11 Kết quả điện di colony-PCR các dòng khuẩn lạc 48

Hình 12 Hình ảnh các mảnh lá và thân mẫu khoai lang in vitro trên môi trường đồng nuôi cấy sau 2 ngày lây nhiễm A.rhizogenes 49 Hình 13 Hình ảnh các mảnh lá và thân mẫu khoai lang in vitro bắt đầu ra rễ

trên môi trường chọn lọc sau khi chuyển gen 30 ngày 49 Hình 14 Kết quả tách chiết DNA tổng số một số rễ tơ 50 Hình 15 Sản phẩm PCR nhân gen SSIV từ DNA tổng số tách chiết từ một số dòng rễ tơ chuyển gen và không chuyển gen 51 Hình 16 Điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR xác định hoạt động của gen actin trong các dòng rễ tơ chuyển gen M: thang chuẩn DNA 1kb; 1 - 15: sản phẩm RT-PCR các cây chuyển gen 52

Hình 17 Điện di đồ kiểm tra sản phẩm RT-PCR xác định hoạt động của gen 52

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Diện tích, năng suất và sản lượng sắn của thế giới từ năm 2000-2012

Error! Bookmark not defined

Bảng 2 Trình tự các cặp mồi sử dụng 32 Bảng 3 Kích thước các phân đoạn thu được khi cắt plasmid tái tổ hợp pK7GWG2D/SSIV bằng EcoRI 41 Bảng 4: Kết quả chuyển gen tạo rễ tơ mang cấu trúc gen tăng cường tổng hợp tinh bột SSIV ở cây khoai lang 53

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

1 A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens

18 MT-sHSP Mitochondrial small Heat shock protein

19 MUG 4-methyl-umBelliferyl-β -D-glucoronide

24 RT-PCR Reverse transcription polymerase chain

reaction

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Tinh bột là nguồn carbohydrate dự trữ chính của cây trồng, là hợp chất cao phân tử có hàm lượng lớn trong tự nhiên và có ý nghĩa quan trọng đối với đời sống nhân loại Tinh bột là chất rắn không hoà tan, có cấu trúc dạng polymer được tạo ra các monomer là glucose Tùy thuộc vào dạng liên kết của các phân tử glucose mà tạo thành dạng mạch thẳng amylose, hoặc dạng mạch nhánh amylopectin Tinh bột được tích lũy chủ yếu ở cơ quan củ của thực vật: củ sắn, củ khoai tây, củ khoai lang, củ rong giềng …

Tinh bột có vai trò quan trọng trong đời sống, đây là nguồn cung cấp cacbonhydrat hay năng lượng chính cho con người Ngoài ra, tinh bột còn được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp như thực phẩm, dược Trung bình trên thế giới sử dụng tới 60 triệu tấn tinh bột hàng năm bao gồm bột mỳ, bột ngô, bột khoai tây, bột gạo, bột sắn, bột khoai lang Hầu hết tinh bột được sử dụng cho các ngành công nghiệp chế biến như: sử dụng làm chất nền cho quá trình lên men của vi sinh vật (chủ yếu cho sản xuất mỳ chính), công nghiệp dệt vải sợi, công nghiệp giấy và nhiều ngành công nghiệp khác

Hàm lượng tinh bột, kích thước hạt tinh bột và hàm lượng amylose là những tính chất quan trọng của tinh bột có ảnh hưởng nhiều đến các sản phẩm trong các ngành công nghiệp thực phẩm (mì sợi, bánh bì và bánh cookies) và phi thực phẩm (dệt, giấy, và dược phẩm) Các tính chất này quyết định độ nở của bột mì và tinh bột lúa mì, đó là các chỉ số quan trọng liên quan đến các sản phẩm thực phẩm giàu tinh bột như mì sợi và mì ăn liền (McCormick et al., 1991; Konik et al., 1993; Sasaki & Matsuki 1998; Dennett

et al., 2009; Salman et al., 2009) Đặc tính tinh bột chịu ảnh hưởng của gen cũng như môi trường tăng trưởng (Rharrabti et al., 2001; Kindred et al., 2008; Weightman et al., 2008) Sự hiểu biến đổi của tính chất tinh bột được quyết định bởi hai yếu tố là giống và điều kiện môi trường xung quanh Cùng một điều kiện, tính chất tinh bột có thể thay đổi ở các giống khác nhau Tương tự,

cùng một giống trồng ở môi trường khác nhau tính chất tinh bột cũng thay đổi, từ đó sẽ gây khó khăn cho các nhà dinh dưỡng và nhà chế biến thực phẩm trong việc dự đoán thành phần hóa học và quá trình chế biến Các nghiên cứu về chọn lọc các giống cho hàm lượng tốt đã và đang được đẩy mạnh nghiên cứu Tuy nhiên, hầu hết chỉ dừng lại ở mức độ chọn lọc giống cho chất lượng tinh bột tốt và ổn định Các nghiên cứu sâu hơn về hoạt động của gen liên quan đến các giống tại Việt Nam đang còn ít và chưa cụ thể Xuất phát từ thực tiễn đó, cùng với sự phát triển công nghệ và các nghiên cứu lâu năm của Phòng Công nghệ tế bào thực vật, nhóm nghiên cứu tiến hành tập trung đánh giá cụ thể hoạt động của gen Starch Synthase IV Đây là một trong

5 gen quyết định lớn đến sinh tổng hợp và cấu trúc của tinh bột Để có được

Starch Synthase IV cũng như đánh giá gen này chúng tôi tiến hành: “Nghiên

cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase tăng cường sinh tổng hợp tinh bột”

2 Mục đích nghiên cứu

Mục tiêu tổng quát: Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase, đồng thời bước đầu đánh giá hoạt động của gen này đến khả năng tăng cường sinh tổng hợp tinh bột ở các dòng rễ tơ khoai lang

- Thiết kế vector chuyển gen thực vật pK7WG2D mang gen SSIV bằng kỹ thuật Gateway

- Tạo chủng Agrobacterium rhizogenes mang cấu trúc vector

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về tinh bột và sinh tổng hợp tinh bột

1.1.1 Giới thiệu về tinh bột

Tinh bột là một glucan không tan, được cấu thành từ hai chuỗi polymer (amylopectin và amylase) được cấu thành từ các tiểu phần là glucose Ở thực vật bậc cao, tinh bột được tổng hợp trong plastid (thể lạp) của cả tế bào quang hợp

và không quang hợp Là carbohydrate dự trữ chủ yếu, tinh bột đóng vai trò quan trọng trong suốt chu kỳ sống của thực vật Trong lá, một phần nhỏ carbon đồng hóa thông qua quang hợp được giữ lại trong các lục lạp ở dạng tinh bột chứ không được chuyển đổi thành sucrose để vận chuyển đến các bộ phận khác Dạng tinh bột tạm thời này sẽ được phân hủy vào ban đêm để cung cấp cơ chất cho quá trình hô hấp ở lá và tiếp tục tổng hợp sucrose cho việc phát triển khác của cây(McMaugh et al 2014) Tinh bột, công thức hóa học: (C6H10O5)n) là một polysacarit carbohydrate chứa hỗn hợp amyloza và amylopectin, tỷ lệ phần trăm amilose và amilopectin thay đổi tùy thuộc vào từng loại tinh bột, tỷ lệ này thường từ 20:80 đến 30:70 Tinh bột có nguồn gốc từ các loại cây khác nhau có tính chất vật lí và thành phần hóa học khác nhau Chúng đều là các polymer carbohydrat phức tạp của glucose (công thức phân tử là C6H12O6) Tinh bột được thực vật tạo ra trong tự nhiên trong các quả, củ như: ngũ cốc Tinh bột, cùng với protein và chất béo là một thành phần quan trọng bậc nhất trong chế độ dinh dưỡng của loài người cũng như nhiều loài động vật khác Ngoài sử dụng làm thực phẩm ra, tinh bột còn được dùng trong công nghiệp sản xuất giấy, rượu, băng bó xương Tinh bột được tách ra từ hạt như ngô và lúa mì, từ rễ

và củ như sắn, khoai tây, dong là những loại tinh bột chính dùng trong công nghiệp (Evans et al 2000)

Tinh bột lưu trữ được tái sử dụng để hỗ trợ giai đoạn phát triển khác của cây Các bộ phận thu hoạch của cây trồng chủ lực của loài người phần lớn là cơ quan lưu trữ tinh bột ở thực vật Có thể kể đến nhóm hạt ngũ cốc (gạo, ngô, lúa

mì, lúa mạch, lúa miến…) là nhóm quan trọng nhất, tiếp theo là các loại củ than

(khoai tây, khoai lang, khoai mỡ) và rễ củ (sắn, khoai môn), và hạt cây họ đậu Hầu hết tinh bột của cây trồng đều dùng trực tiếp làm thực phẩm hoặc thức ăn cho chăn nuôi Tuy nhiên nhu cầu dùng tinh bột cho công nghiệp đang ngày một tăng lên Đặc biệt tinh bột đang là nguồn vật liệu chủ yếu cho thế hệ nguyên liệu sinh học đầu tiên do đặc tính dễ lên men

Cấu trúc phân tử amylopectin Cấu trúc phân tử amylose

Hình 1 Cấu trúc phân tử của amylopectin và amylose

1.1.2 Cấu trúc của tinh bột

Tinh bột được cấu tạo bởi 2 loại polysaccharid được gọi là amylose và amylopectin

Amylose: phân tử amylose là một chuỗi hiện nay được biết đến hàng nghìn đơn vị β-D-glucose nối với nhau theo dây nối (1→ 4) Quan niệm trước đây cho rằng chỉ có từ 200-400 đơn vị vì do quá trình chiết xuất và phân tích, mạch bị đứt Phân tử amylose đa số là các chuỗi thẳng rất ít phân nhánh

Amylopectin: amylopectin có phân tử lượng lớn hơn khoảng 106-107 gồm 5000-50.000 đơn vị glucose và phân nhánh nhiều Các đơn vị α-D-glucose trong mạch cũng nối với nhau theo dây nối (1→ 4) còn chỗ phân nhánh thì theo dây nối (1→ 6) Để xét mức độ phân nhánh, người ta methyl hóa toàn bộ các nhóm

OH của amylopectin rồi sau đó thủy phân và suy ra từ lượng 2, 3 dimethylglucose Lượng 2, 3, 4, 6 tetramethylglucose ứng với những đơn vị tận cùng của mạch còn lượng 2, 3, 6 trimethylglucose ứng với những đơn vị glucose trong mạch (Evans et al 2000)

Ngoài ra còn có thể xác định lượng glucose cuối mạch dựa vào tính khử của amylopectin không methyl hóa Chú ý rằng ở đây là glucose ở cuối mạch có

OH bán acetal tự do Mạch bên trong (mạch giữa 2 điểm phân nhánh) của amylopectin có khoảng 5-9 đơn vị glucose, những mạch bên ngoài có từ 10-18 đơn vị Trong các loại tinh bột, trung bình tỉ lệ amylose là 25% còn amylopectin

là 75% Tuy nhiên người ta cũng tạo ra được những chủng có nhiều amylose, ví

dụ ngô, có tinh bột chứa 75% amylose

Amylose cho với thuốc thử iod màu xanh đậm có cực đại phổ hấp thu khoảng 660nm, còn amylopectin thì có màu tím đỏ và cực đại hấp thụ khoảng 540nm Màu tạo thành giữa tinh bột và iod được giải thích do sự hấp phụ Người

ta cho rằng iod bị hấp phụ vào phía trong hình xoắn ốc Ứng với một vòng xoắn

ốc thì có 1 phân tử iod Những phân tử chưa đủ 6 đơn vị glucose thì không phản ứng với iod(Mason-Gamer, Weil, and Kellogg 1998)

1.1.3 SỰ THỦY PHÂN TINH BỘT

Khi thủy phân tinh bột bằng acid thì sản phẩm cuối cùng là glucose

C6H12O6 (C6H10O5)n + nH2O -> (1+n) (C6H12O6)

Sự thủy phân qua các chặng: dextrin, erythrodextrin, achrodextrin, maltose, glucose Amylose dễ bị thủy phân hơn amylopectin vì dây nối (1-> 4)

dễ bị cắt hơn là dây nối (1-> 6)

Thủy phân bằng enzym

Enzym amylase Có 2 loại chính: a-amylase và β-amylase Enzym a phổ biến trong cây, nhiều nhất là các hạt ngũ cốc nẩy mầm, ngoài ra còn có trong nấm mốc, nước bọt, dịch tụy a-amylase chịu được nhiệt độ đến 70o, ở nhiệt độ này thì các enzym khác mất hoạt tính Enzymβ-amylase có trong khoai lang, đậu nành và một số hạt ngũ cốc, chịu được nhiệt độ đến 50onhưng chịu được môi trường acid cao hơn so với enzym a (pH = 3,3) Trong thực tế người ta dựa vào ảnh hưởng khác nhau đó về độ pH và nhiệt độ để tách 2 loại enzym trên

a) Enzym β cắt xen kẽ những dây nối α-(1->4)-glucosid của amylose để tạo thành các đường maltose, kết quả thu được là 100% đường maltose Đối với

amylopectin thì b-amylase chỉ cắt được các dây nối (1->4), khi gặp mạch nhánh thì dừng lại, kết quả tạo thành maltose và dextrin, lượng maltose chỉ đạt từ 50-60%

b) Enzym α cắt một cách ngẫu nhiên vào dây nối (1->4) Đối với amylose thì sản phẩm cuối cùng khoảng 90% là maltose ngoài ra có một ít là glucose Đối với amylopectin thì α-amylase cũng chỉ tác động đến dây nối (1->4) mà không cắt được dây nối(1->6) vì thực tế người ta tìm thấy các phân tử isomaltose (= 6-O-α-D-gluco-pyranosyl-D-glucopyranose) trong dịch thủy phân Enzym α-amylase tiếp tục cắt được những dextrin mà enzym b để lại để tạo thành các dextrin phân tử bé hơn Như vậy α-amylase tác dụng lên tinh bột thì sản phẩm thu được chủ yếu là maltose rồi đến glucose và dextrin phân tử bé Tinh bột nguồn gốc khác nhau, enzym nguồn gốc khác nhau thì khả năng thủy phân cũng khác nhau

1.1.4 HÌNH DẠNG TINH BỘT

Tinh bột tồn tại trong cây dưới dạng hạt có hình dạng và kích thước khác nhau, đây là một đặc điểm giúp ích cho việc kiểm nghiệm một dược liệu chứa tinh bột Tùy theo loài cây và tùy theo độ trưởng thành của cây mà hình dáng và kích thước thay đổi Về hình dáng thì có thể hình cầu, hình trứng, hình nhiều góc kích thước có thể từ 1-100mm đường kính Soi kính hiển vi thường thấy hạt tinh bột cấu tạo bởi nhiều lớp đồng tâm sắp xếp chung quanh một điểm gọi

là rốn hạt Các lớp này tạo nên là do hạt tinh bột lớn dần bằng cách tăng thêm các lớp ở phía ngoài Các lớp này khác nhau ở chỉ số chiết quang và hàm lượng nước Có tác giả cho rằng các lớp khác nhau đó là do những lớp được tăng thêm

về ban đêm và những lớp tăng thêm về ban ngày nên không hoàn toàn giống nhau

1.1.5 Các loại hạt tinh bột hay gặp

- Solanum tuberosumL , thuộc họ Cà - Solanaceae Hạt tinh bột hình trứng, rốn

hạt ở đầu hẹp, các vân đồng tâm dễ nhận Thỉnh thoảng có hạt kép 2 hoặc 3 Kích thước trung bình 50mm nhưng có hạt lớn đến 80-100mm

Tinh bột hoàng tinh chế từ củ cây dong - Maranta arundinacea L , thuộc họ dong - Marantaceae, (đừng nhầm với cây hoàng tinh - Polygonatum sp.) Hạt hình trứng kích thước 30-60mm

Tinh bột sen, chế từ hạt cây sen - Nelumbo nucifera Gaertn., họ Sen -

Nelumbonaceae Hạt tinh bột hình trứng hay hình thận, rốn hạt hình vạch kích thước hạt từ 3-25mm

Tinh bột sắn (= khoai mì) chế từ cây sắn (= khoai mì) - Manihot esculenta Crantz; họ Thầu Dầu- Euphorbiaceae Hạt hình cầu phần lớn một đầu

bị lẹm và hơi lõm trông như cái chuông Rốn hạt hình sao, kích thước 3-35mm

Tinh bột đậu, chế từ hạt của nhiều loại đậu - Phaseolus spp.; họ Đậu -

Fabaceae Hạt hình trứng hay hình thận Rốn hạt dài và phân nhánh, kích thước trung bình 35mm

Tinh bột hoài sơn, chế từ củ của cây củ mài - Dioscorea persimilis Prain

và Burkill, họ Củ nâu - Dioscoreaceae Hạt hình trứng hay hình thận Rốn hạt dài, kích thước trung bình 40mm

Hạt hình đĩa hay hình thấu kính dẹt: Tinh bột mì chế từ hạt của cây lúa

mì - Triticum vulgareL., họ Lúa - Poaceae, kích thước hạt lớn đến 30mm, hạt bé

6-7mm Tùy theo vị trí nhìn mà thấy hình tròn hoặc hình thấu kính lồi 2 mặt Rốn hạt là 1 điểm ở giữa hạt, không rõ

Hạt hình nhiều góc: Tinh bột gạo chế từ hạt cây lúa - Oriza sativa L.,

họ Lúa - Poaceae Hạt nhiều góc, nhỏ, kích thước từ 4-6mm, thường được kết thành đám Rốn hạt không rõ

Tinh bột ngô (= bắp), chế từ hạt cây ngô - Zea mays L ; họ Lúa -

Poaceae Hạt nhiều góc, rốn hạt ở giữa rất rõ, kích thước 15-30mm

1.1.6 Cơ chế sinh tổng hợp tinh bột và các gen liên quan

Quá trình tổng hợp tinh bột α-1,4 glucan bao gồm ba bước quan trọng xảy

ra trong lục lạp và thể vô sắc: i) cung cấp glucose-6-phosphate (Glc-6-P) vào

trong các thể lạp, ii) tổng hợp ADP-glucose (ADPG) từ Glc-1-P, và iii) tổng hợp tinh bột từ ADPG (Zeeman, Kossmann, and Smith 2010) Nói một cách ngắn gọn, bước đầu tiên không thể thiếu được là sự tổng hợp ADPG từ Glc-1-P và ATP được xúc tác bởi ADP-glucose pyrophosphorylase (AGPase) Một khi được hoạt hóa, starch synthase (SS) chuyển ADPG tới đầu không khử của α-1,4 glucan để tạo thành các sợi α-1,4 glucan Tiếp theo, các sợi α-1,4 glucan được dùng như là các cơ chất cho các enzyme phân nhánh của tinh bột (BE hoặc Q-enzyme) tạo ra các liên kết sợi α-1,6 là amylopectin Cuối cùng amylopectin được tinh thể hóa tạo thành tinh bột dưới tác động của các enzyme phân rã (DPE), phosphorylase (P-enzyme) và glucanotransferase (D-enzyme) Ngoài ra, UDP-glucose: protein glucosyltransferase hoặc amylogenin (38 hoặc 45 kDa) cũng được dự đoán tham gia vào bước đầu tiên trong quá trình tổng hợp tinh bột (Zeeman, Kossmann, and Smith 2010), (Egli et al 2010)

Hình 2 Quá trình sinh tổng hợp tinh bột và các enzyme liên quan

Các starch synthase (SS) của thực vật bậc cao mã hóa bởi 5 nhóm gen ký hiệu là GBSS (granule-bound starch synthase), SSI, SSII, SSIII, và SSIV GBSS gắn chặt với hạt tinh bột và chịu trách nhiệm tổng họp amylose Các biến thể khác nhau của SS (thường gọi là SS hòa tan) tạo ra các chuỗi amylopectin (1

dạng tinh bột đã polyme hóa) có thể tan hoặc trong các plastic hoặc một phần hòa tan một phần gắn với hạt tinh bột Số liệu di truyền và sinh hóa chỉ ra rằng mỗi biến thể enzyme SS có các cấu thành khác nhau và vai trò nhất định trong tổng hợp amylopectin Phân tích việc phân phối chiều dài chuỗi amylopectin trong các cây đột biến và cây chuyển gen mất các biến thể enzyme SS đặc trưng

đã dẫn tới kết luận rằng nhóm SSI, SSII, và SSIII đóng vai trò trong việc kéo dài các chuỗi ngắn, trung bình và dài tương ứng

Việc phân nhánh của amylopectin xảy ra đồng thời với quá trình kéo dài chuỗi Quá trình phân nhánh được xúc tác bởi enzyme phân nhánh (BE) Enzyme này cắt chuỗi α-l,4-glucan sẵn có và chuyển đoạn cắt mang 6 đơn vị glucose hoặc nhiều hơn tới vi trí C6 của gốc glucosyl ở chuỗi glucan khác BE của thực vật bậc cao bao gồm hai nhóm I và II Nhóm I vận chuyển các chuỗi dài hơn Phân tích di truyền chỉ ra rằng hai nhóm BE có vai trò đặc biệt trong tổng hợp amylopectin

Bên cạnh SS và BE còn có các enzyme khác nhau tham gia vào quá trình sinh tổng hợp tinh bột Các enzyme khừ phân nhánh - (debranching enzymes, DBE) làm mất các điểm phân nhánh và quan trọng trong việc quyết định cấu trúc của amylopectin Thực vật có hai loại DBE— isoamylase (ISA) và limitdextrinase (LDA, hay còn gọi là pullulanase) Hai loại này khác nhau bởi trình tự amino acid và cơ chất ISA có 3 nhóm - ISA1, ISA2, và ISA3 ISA1 và ISA2 liên quan chặt với tổng hợp amylopectin Vai trò cơ bản của LDA và ISA3

là phân hủy tinh bột ISA1 hoạt động mạnh nhất khi cơ chất là các chuỗi glucan tương đối dài như là các amylopectin bị hòa tan, trong khi đấy LDA và ISA3 có hoạt tính cao với các chuỗi glucan ngắn như β-limit dextrins ISA2 dường như không có hoạt tính xúc tác mà tác dụng điều tiết hoặc ổn định ISA1 chứ không tham gia trực tiếp vào quá trình hủy phân nhánh Trong các cây đột biến hoặc chuyển gen thiếu hụt ISA1, tinh bột dạng hạt bị giảm, thậm chí không có và thay thế một phần bởi các glucan tan trong nước Hiện tượng này quan sát được ở một số thực vật, ví dụ như ở nội nhũ non của ngũ cốc, lá Arabidopsis và củ

khoai tây Trong Arabidopsis và khoai tây việc mất hoạt tính ISA2 có ảnh hưởng giống như mất hoạt tính của ISA1 (McMaugh et al 2014) Đột biến thiếu hoạt tính DBE (tức là đột biến đồng thời 4 gen: isal, isa2, isa3, Ida) không phát hiện được các hạt tinh bột Kết quả này hoàn toàn đồng nhất với ý kiến cho rằng hoạt tính DBE là cần thiết cho việc sinh tổng hợp tinh bột Tuy nhiên các phân tích sâu hơn về sinh hóa và di truyền chỉ ra rằng việc mất hoàn toàn tinh bột trong đột biến này là kết quả của việc thay đổi và mất các glucan được phân nhánh nhờ các enzyme phân hủy tinh bột chứ không phải việc mất hoạt tính DBE (Wattebled et al 2008) Mặc dù có những phát hiện mới trong việc xác định các enzyme tổng hợp amylopectin synthesis, những vẫn chưa thể có những hiểu biết một cách chính xác cấu trúc SS và BE nào được tạo ra, làm thể nào DBE có thể khử phân nhánh một cách chọn lọc, hoạt động nào của 3 enzyme này được phối hợp như thế nào để tạo thành một phân tử amylopectin có khả năng tử hình thành hạt tinh bột Để giải quyết vấn đề này đòi hỏi phát triển về kỹ thuật trong phương pháp phân tích và phân tử

Thành phần amylose của tinh bột được tổng hợp bởi GBSS Các cây đột biến và chuyển gen thiếu enzyme này là cẩn thiết đế tạo ra cây không có amylose Các hạt tinh bột không có amylose vẫn có hình thái bình thường, điều

đó chứng tỏ rằng amylopectin là cần thiết cho việc hình thành hạt GBSS khác các biến thể khác nhau của enzyme SS ở chỗ vị trí đặc biệt đối với các hạt và kiểu phản ứng Không giống các biến the synthase của tinh bột, GBSS chuyển các gốc glucosyl từ thực vật bậc cao

1.1.7 Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học nhằm cải biến quá trình trao đổi tinh bột

Cho đến nay những cố gắng nhàm tăng khả năng tích lũy tinh bột tập trung vào việc tăng hoạt tính ADP-glucose pyrophosphorylase (AGPase) trong cây Đây là enyme cung cấp cơ chất cho SS Một loạt đột biến của gene AGPase

Escherichia coli (glgC16) mã hóa cho các dạng điều khiển khác nhau của

enzyme này đã được dùng để biểu hiện mạnh trong cây Khi glgC16 được biểu

hiện ở plastid của cây khoai tây chuyển gen, một vài dòng đã có khả năng tích luỹ tinh bột cao hơn dòng không chuyển gen là 60% Tuy nhiên với các cây khác như sắn, ngô và các loài khác việc tăng tinh bột không đạt được mức như vậy Vì thế việc biến đổi một mình AGPase có thể không có đạt được kết quả mong muốn tăng tinh bột trong các cơ quan dự trữ Ngoài ra, có một số bằng chứng về việc tăng nguồn cung cấp ATP cho các plastid có thể kích thích việc tạo ra ADP-glucose và dẫn đến việc tăng tốc độ sinh tổng hợp tinh bột Biểu hiện mạnh yếu tố dẫn truyền adenylate ở vỏ plastid của Arabidopsis trong khoai tây làm tăng ADP-glucose lên 2 lần và hàm lượng tinh bột tăng lên từ 16-36%

so với đối chứng Khi kìm hãm adenylate kinase của plastic (enzyme chuyển hóa hai chiều 2 phân từ ADP thành ATP và AMP) làm ADP-glucose tăng lên 10 lần

và tinh bột tăng lên gấp đôi trong củ khoai tây cả ở trong nhà kính và ngoài đồng ruộng (Ballicora, Iglesias, and Preiss 2003)

Tăng khả năng phân hủy tinh bột lại có tác dụng đối với cây trồng cung cấp nguyên liệu sản xuất ethanol Biểu hiện α-amylase chịu nhiệt trong cây ngô

đã được ứng dụng để tạo ra cây tự chế biến, giảm giá thành biến đổi từ tinh bột sang ethanol Amylase được biểu hiện trong gian bào nên không tham gia vào sinh tổng hợp tinh bột hay dự trữ vì thế việc có mặt của nó không ảnh hưởng đến việc tích tụ tinh bột trong quá trình phát triển của cây Khi hạt xay ra được làm nóng trong nước để dính hóa tinh bột thì amylase chịu nhiệt sẽ bắt đầu chuyển đổi tinh bột thành dạng có thể lên men (Zeeman, Kossmann, and Smith 2010)

1.2 Cây sắn và tình hình sản xuất cây sắn trên thế giới và Việt Nam

Sắn (Manihot esculenta Crantz) là cây lương thực hàng năm Củ sắn có tỷ lệ

chất khô 38 - 40%, tinh bột 16 - 32%, giàu vitamin C, calcium, vitamin B và các chất khoáng, nghèo chất béo, muối khoáng, vitamin và nghèo đạm

Hình 3 Cây Sắn

Cây sắn hiện được trồng trên 100 nước có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới thuộc ba châu lục: châu Á, châu Phi và châu Mỹ La tinh (Hình 3) Sắn được trồng chủ yếu ở các hộ nông dân nhỏ Sắn được sử dụng với nhiều mục đích đa dạng tùy vùng khác nhau trên thế giới Ở Châu Á và Châu Mỹ Latinh, củ sắn cung cấp nguyên liệu thô cho chế biến thức ăn cho gia súc và làm tinh bột ở quy

mô nhỏ và lớn Hiện nay, mặc dù được trồng bởi các hộ nông dân nhỏ, tại các vùng đất khó trồng trọt nhất, các sản phẩm từ sắn đang được chuyển đổi nhanh chóng từ sản phẩm mang tính truyền thống thành mặt hàng có tính thương mại

Ở Đông Nam Á, hầu hết sắn thu hoạch được bán cho các mục đích công nghiệp trong nước và xuất khẩu (Hoàng Kim và Phạm Văn Biên (1996)

Tình hình nghiên cứu chọn tạo và phát triển giống sắn tại Việt Nam

Hầu hết những nghiên cứu đối với cây sắn hiện nay tập trung chủ yếu vào việc chọn tạo các giống sắn có năng suất cao, thời gian sinh trưởng ngắn thông qua các phương pháp lai tạo truyền thống Một trong những yếu tố chính góp phần hiệu quả trong việc nâng cao năng suất và sản lượng sắn là sự tăng cường nghiên cứu, nhập nội, lai tạo, ứng dụng công nghệ mới trong việc chọn tạo và nhân giống sắn lai (Hoàng Kim et al., 2001) Trước năm 1990, Gòn, H34 và Xanh Vĩnh Phú là những giống sắn phổ biến ở Việt Nam Từ năm 1986 đến năm

1993, Trung tâm Hưng Lộc đã thu thập và tuyển chọn được 3 giống sắn mới là HL20, HL23 và HL24 được canh tác mỗi năm ở các tỉnh phía Nam khoảng 70

000 – 80 000 ha (Hoàng Kim et al., 1990) Giai đoạn 1991-2005, Viện Khoa học

Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam phối hợp với Chương trình sắn Việt Nam, Trung tâm Quốc tế Nông nghiệp Nhiệt đới (CIAT) đã nhập nội, tuyển chọn và giới thiệu cho sản xuất 5 giống sắn tốt: KM60, KM94, KM95, SM937-26, KM98-1 (Hoàng Kim et al., 2008; 2010) Tổng diện tích các giống sắn mới ở Việt Nam năm 2005 ước tính đạt 270.000 ha, chiếm 69,2% tổng diện tích sắn của cả nước Năm 2007, giống sắn lai KM140 được phát triển bởi các nhà khoa học tại Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam Ưu điểm của giống KM140 là thời gian sinh trưởng ngắn 7-10 tháng, năng suất bột tương đương KM94 (tỷ lệ tinh bột trong củ là ~ 28%), dạng củ đẹp, thịt củ màu trắng, ít đắng, dạng cây thẳng (Trần Công Khanh et al 2007, 2008) Ngoài ra, ưu điểm của các giống sắn ở Việt Nam là hầu như không nhiễm các bệnh virus thông thường ở cây sắn như virus bệnh khảm sắn, tuy nhiên hiện nay một số vùng trồng sắn đã

có hiện tượng sắn nhiễm bệnh chổi rồng có khả năng do nấm gây ra

Mặc dù những phương pháp lai tạo truyền thống và việc áp dụng chỉ thị phân tử đã thành công trong việc tạo ra những giống sắn mới có phẩm chất cao hơn, tuy nhiên trong thực tiễn sản xuất các phương pháp lai tạo truyền thống vẫn còn tồn tại những vấn đề khó giải quyết đối với việc phát triển và cải tạo cây sắn theo hướng mong muốn Không giống những cây trồng chủ yếu khác trên thế

giới, sắn đặc biệt không thể cải tạo về mặt di truyền qua lai hữu tính Nhiều giống sắn hiếm khi ra hoa và năng suất hạt thường rất là thấp Sắn thường được nhân lên bằng sinh sản sinh dưỡng dựa vào các đoạn thân Đặc điểm tự nhiên này gây hạn chế về mặt lai tạo nhưng đem lại thuận lợi đối với việc sử dụng sinh học phân tử để cải tạo giống, vì mỗi cây đều được nhân lên từ một dòng, phân ly hoặc di chuyển của gen qua lại giữa các loài là rất hạn chế Chính vì vậy mà áp dụng những tiến bộ của công nghệ gen đối với cây sắn trở nên cần thiết và là một trong những yêu cầu mà thực tiễn sản xuất đòi hỏi Công nghệ gen có thể tạo ra những giống sắn mới mang những tính trạng mong đợi Thêm vào đó công nghệ này có thể chuyển những tính trạng tốt từ các giống sắn dại vào giống sắn đang canh tác mà điều này thường gặp trở ngại rất lớn do các yếu tố về di truyền khi sử dụng phương pháp lai truyền thống Hơn nữa với công nghệ này các nhà khoa học có thể đưa vào cây sắn những nguyên liệu di truyền (gen) từ bên ngoài giúp cải thiện tính kháng của cây chủ với các yếu tố gây bệnh như virus, vi khuẩn…

- Trong kế hoạch 5 năm 2011-2015, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đưa ra chủ trương giảm diện tích trồng sắn và nâng cao năng suất trồng sắn Kế hoạch đề ra là diện tích trồng sắn duy trì ổn định khoảng 500.000 ha, năng suất đạt khoảng 178 tạ/ha Nếu đạt được theo kế hoạch thì với mức sản lượng 8,9 triệu tấn vẫn sẽ xảy ra tình trạng tranh mua nguyên liệu giữa các nhà máy sản xuất ethanol với các nhà máy thức ăn chăn nuôi, nhà máy sản xuất tinh bột sắn

và lượng sắn dùng cho xuất khẩu Như vậy, ứng dụng công nghệ sinh học nhằm cải tạo cây sắn theo hướng các tính trạng có lợi như năng suất cao, chất lượng phù hợp mục đích sử dụng nhằm phục vụ công nghiệp và xuất khẩu là một vấn

đề cấp thiết ở nước ta

- Phần lớn các nghiên cứu về sắn ở Việt Nam trong thời gian gần đây chủ yếu

sử dụng các phương pháp truyền thống để chọn tạo, lai tạo giống sắn mới từ các giống nhập nội và giống địa phương nhằm cải tiến năng suất Ứng dụng công nghệ sinh học hiện đại trong nghiên cứu về sắn đang ở giai đoạn khởi đầu và sử

dụng các phương pháp đơn giản như nuôi cấy mô để giữ giống, nhân nhanh in vitro một số giống mới Các hướng nghiên cứu sâu ở mức độ sinh học phân tử

và di truyền học chưa được quan tâm và phát triển Đặc biệt, chưa có nghiên cứu sâu ở mức độ sinh học phân tử nhằm khai thác nguồn gen quý sẵn có từ các giống sắn tại Việt Nam, phục vụ cho công tác cải tạo giống sắn bằng công nghệ gen

1.3 Rễ tơ và ứng dụng nuôi cấy rễ tơ trong sản xuất protein tái tổ hợp

Rễ tơ là một bệnh ở thực vật gây ra bởi quá trình tương tác giữa vi khuẩn

Agrobacterium rhizogenes - một loại vi khuẩn đất gram âm- với tế bào vật chủ

Trong quá trình xâm nhiễm, vùng T-DNA ở giữa đoạn biên phải (right border)

và đoạn biên trái (left border) trên Ri-plasmid trong vi khuẩn được chuyển và tích hợp vào genome của thực vật, kết quả là hình thành các rễ tơ tại hoặc gần vị trí xâm nhiễm

Giống như Ti-plasmid ở vi khuẩn A tumefaciens, Ri-plasmid ở vi khuẩn A.rhizogenes là phân tử DNA mạch vòng, sợi kép có trọng lượng phân tử lớn từ

200-800 kp gồm 2 vùng chính là T-DNA và vir (virulence) Dựa vào khả năng sinh tổng hợp các opine ở rễ tơ, Ri-plasmid được chia làm 2 nhóm chính: agropine và mannopine, và một số nhóm phụ được tìm thấy và phân loại sau này như cucumopine và mikimopine Trong đó các chủng thuộc nhóm agropine ( A4, 15834, LBA9402, 1855) được chứng minh là độc hơn so với chủng thuộc nhóm mannopine (8196, TR7, TR101) và các chủng này được sử dụng chủ yếu trong các nghiên cứu tạo rễ tơ ở thực vật (Sevón and Oksman-Caldentey 2002)

T-DNA ở Ri-plasmid của nhóm agropine bao gồm 2 vùng chính là vùng biên trái TL-DNA và biên phải TR-DNA Hai vùng này đều có kích thước khoảng 15 - 20 kb và được xen kẽ bởi 1 đoạn DNA, đoạn DNA này sẽ không được chuyển vào hệ gen của tế bào vật chủ Vùng TR-DNA mang các gen mã

hóa sinh tổng hợp auxin (tms1 and tms2), vùng TL-DNA bao gồm 18 khung đọc

(ORFs), trong đó có 4 loci 10, 11, 12 và 15 mã hóa cho rolA, B, C, and D (root locus) Các Ri-plasmid của các chủng A.rhizogenes thuộc nhóm mannopine,

cucumopine and mikimopine chứa vùng T-DNA đơn, có cấu trúc giống như vùng TL-DNA của các chủng thuộc nhóm agropine nhưng khuyết gen rolD (Britton et al 1991) Các gen rolA, rolB and rolC đóng vai trò quan trọng trong

quá trình cảm ứng tạo rễ tơ ở mô tế bào thực vật Sự biểu hiện đồng thời của ba gen này gây nên kiểu hình rễ tơ ở mô tế bào thực vật bị xâm nhiễm Các rễ tơ này có khả năng sinh trưởng và phát triển nhanh hơn rất nhiều so với rễ bình thường Trong 3 gen rol trên, gen rolB đóng vai trò quan trọng hơn cả, khi gen rolB được biểu hiện, mô tế bào thực vật đã cảm ứng tạo kiểu hình rễ tơ, trong khi đó khi bất hoạt gen rolB không tạo được kiểu hình rễ tơ (Alpizar et al 2008) Nuôi cấy rễ tơ có nhiều ưu điểm do rễ tơ có thể sinh trưởng nhanh, phân nhánh mạnh trên môi trường không cần bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng,

vì thế loại bỏ được dư lượng của các chất này trong sản phẩm tạo ra Hơn nữa,

rễ tơ có thể được nuôi cấy tạo sinh khối liên tục, điều này có ý nghĩa trong dây chuyền sản xuất các chất thứ cấp hay các dược phẩm sinh học tái tổ hợp Không giống với các dạng tế bào thực vật khác như tế bào huyền phù và mô sẹo thường

có xu hướng không ổn định về mặt di truyền và hóa sinh, rễ tơ là cơ quan biệt hóa nên có sự di truyền ổn định hơn và có thể sản xuất một lượng lớn các hợp chất thứ cấp và protein tái tổ hợp (Kittipongpatana and Sirithunyalug 2006)

Hiện nay, nuôi cấy rễ tơ thực vật đã được sử dụng cho quá trình sản xuất protein tái tổ hợp và các dược phẩm sinh học tái tổ hợp như SEAP (human secreted alkaline phosphatase), protein huỳnh quang kết hợp với protein ricin B (GFP-ricin B) và đặc biệt hơn cả là các kháng thể và các chuỗi nặng, chuỗi nhẹ của kháng thể Bên cạnh đó, các protein tái tổ hợp tạo vị ngọt như thaumatin, miraculin cũng đã được biểu hiện thành công ở hệ thống rễ tơ thuốc lá Ngoài

ra, trong các nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp từ nuôi cây sinh khối rễ

tơ cần kể đến rễ tơ cây đậu tương được sử dụng làm hệ thống biểu hiện một số loại protein tái tổ hợp, enzyme tham gia quá trình trao đổi chất ở cây đậu tương nhằm đánh giá mức độ biểu hiện của gen hay các ứng dụng trong nghiên cứu sự

biểu hiện của promoter qua mức độ biểu hiện của gen chỉ thị như gen gus, GFP

Các nghiên cứu chủ yếu sử dụng nguồn mẫu là lá mầm và chủng khuẩn K599 để chuyển gen, sau 10 – 15 ngày sau diệt khuẩn các mẫu lá bắt đầu xuất hiện rễ tơ với tỷ lệ biểu hiện rễ tơ cao 54- 90 % tùy vào từng giống đậu tương được sử dụng

1.4 Giới thiệu về Agrobacterium rhizogenes – phương pháp tạo rễ tơ ở tế bào

bởi vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes cảm ứng và phát triển mạnh mẽ các rễ

Do đó Agrobacterium rhizogenes là một yếu tố cần được quan tâm đến trong việc cảm ứng tạo rễ bất định từ tế bào thực vật in vitro

Agrobacterium được biết đến từ rất lâu trong nông nghiệp với vai trò là các vi

khuẩn cố định đạm, cung cấp nguồn nitơ cho cây trồng Trong những thập kỉ gần đây thì các nhà khoa học đã chú ý đến vai trò của hai loài vi khuẩn

Agrobacterium rhizogenes và Agrobacterium tumefaciens trong mục đích

chuyển gen vào thực vật Chúng được xem như là các ―kĩ sư trao đổi chất‖, được

áp dụng để chuyển gene vào tế bào thực vật nhằm mục đích đẩy mạnh quá trình

sinh tổng hợp ra các hợp chất thứ cấp cần thiết Trong đó, Agrobacterium tumefaciens được biết đến với vai trò cảm ứng tạo ra các khối u (mô sẹo) và Agrobacterium rhizogenes thì được biết đến với vai trò cảm ứng tạo ra các rễ

bất định ở thực vật hai lá mầm

Hình 2 Khuẩn Agrobacterium rhizogenes

1.5 Cơ chế chuyển các gen vùng T-DNA vào tế bào thực vật

Khi các vi khuẩn A.rhizogenes nhiễm vào vết thương của thực vật thì chúng sẽ

chuyển gen của chúng vào các tế bào thực vật tại vị trí đó Các gen được chuyển từ

A.rhizogenes vào trong bộ gen của tế bào thực vật được gọi tên là T-DNA (transfer

DNA) T-DNA sau khi chuyển vào thì sẽ được gắn ổn định vào bộ gen của thực vật Tuy các gen mã hóa T-DNA có nguồn gốc từ vi khuẩn nhưng nó có mang các trình tự điều tiết ở Eukaryote nên có thể biểu hiện được trong tế bào thực vật Vùng T-DNA

này nằm trong một plasmid lớn của A rhizogenes và plasmid này được đặt tên là Ri- plasmid (root inducing plasmid) do A.rhizogenes có khả năng cảm ứng tạo rễ bất

định

Ri-plasmid được chia thành 2 nhóm chính là agropine and mannopine, vi khuẩn

A rhizogenes chứa Ri-plasmid thuộc loại agropine được sử dụng chủ yếu cho quá

trình chuyển gen vào tế bào thực vật để cảm ứng tạo rễ tơ Ri-plasmid được chia thành nhiều vùng như vùng gây độc (gọi tắt là vùng vir), vùng chuyển gene (T-DNA), vùng ori, vùng phiên mã Chỉ có đoạn T-DNA của plasmid mới được chuyển vào bộ gen của thực vật và việc chuyển gen này thông qua sự hỗ trợ bởi các đoạn gen trong vùng vir của Ri-plasmid Vùng vir chiếm khoảng 35 kb trong Ri-plasmid và mã hóa sáu locus phiên mã (vir A, B, C, D, E, G), có chức năng quan trọng trong quá trình chuyển gen Sự phiên mã của vùng vir được cảm ứng với nhiều hợp chất thuộc nhóm phenol, điển hình là acetosyringone - hợp chất liên quan được xác định là có vai trò

làm tăng tần số của quá trình chuyển gen thông qua Agrobacterium ở nhiều loài thực

vật Nhiều loại đường cũng đóng vai trò như chất bổ trợ hoạt động cho acetosyringone

để cảm ứng sự biểu hiện của gene vir ở mức độ cao

Nhìn chung cơ chế quá trình xâm nhiễm và cơ chế phân tử của quá trình vận

chuyển T-DNA vào tế bào vật chủ của vi khuẩn A tumefaciens và A.rhizogenes được

chứng minh là tương tự nhau Tuy nhiên, sự hình thành khối u ở vi khuẩn

A.tumefaciens do gen mã hóa sinh tổng hợp auxin quy định Trong khi đó, các gen mã

hóa sinh tổng hợp auxin ở vi khuẩn A rhizogenes có vai trò rất nhỏ trong quá trình

12 và 15 mã hóa cho rolA, B, C và D (root locus) Các Ri-plasmid của các chủng

A.rhizogenes thuộc nhóm mannopine, cucumopine and mikimopine chứa vùng T-DNA

đơn, có cấu trúc giống như vùng TL-DNA của các chủng thuộc nhóm agropine nhưng

khuyết gen rolD Các gen rolA, rolB và rolC đóng vai trò quan trọng trong quá trình

cảm ứng tạo rễ tơ ở mô tế bào thực vật Sự biểu hiện đồng thời của ba gen này gây nên kiểu hình rễ tơ ở mô tế bào thực vật bị xâm nhiễm Các rễ tơ này có khả năng sinh

trưởng và phát triển nhanh hơn rất nhiều so với rễ bình thường Trong 3 gen rol trên, gen rolB đóng vai trò quan trọng hơn cả, khi gen rolB được biểu hiện, mô tế bào thực vật đã cảm ứng tạo kiểu hình rễ tơ, trong khi đó khi bất hoạt gen rolB không tạo được

kiểu hình rễ tơ

1.6 Nuôi cấy sinh khối rễ tơ

Rễ tơ là tên gọi dùng để chỉ các lông rễ được sản sinh ra mạnh mẽ tại vị trí

bị nhiễm bởi vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes T-DNA từ A rhizogenes sau khi

chuyển vào tế bào thực vật thì chúng sẽ được gắn vào bộ gene của thực vật, từ đó tế

bào thực vật sẽ làm nhiệm vụ biểu hiện các gene rol và gen aux (tổng hợp ra IAA)

làm tăng khả năng tạo các lông rễ một cách mạnh mẽ ngay tại vị trí bị tổn thương ở

mô thực vật đó Số lượng các lông rễ được tạo ra khá nhiều, phát triển thành một hệ thống lông rễ, hay còn gọi là hệ thống rễ tơ

1.7 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG BIỂU HIỆN CỦA GEN Ở CÁC MƯC ĐỘ KHÁC NHAU

Trong từng giống, loài, mỗi loại tế bào, tại các giai đoạn phát triển, sinh trưởng khác nhau, dưới tác động của các điều kiện ngoại cảnh, và đặc điểm di truyền của từng giống các nhóm gen đặc hiệu sẽ được biểu hiện để tạo ra các sản phẩm của gen (dịch

mã ra protein) thông qua ARN thông tin (quá trình phiên mã) Sinh tổng họp tinh bột

là quá trình phức tạp, có sự tham gia biểu hiện của nhiều gen Việc so sánh hoạt động biểu hiện của những gen tham gia vào quá trình tổng họp tinh bột được hoạt hóa ở

những giống, dòng nhất định dưới tác động của ngoại cảnh sẽ cho phép tìm hiểu được vai trò của từng gen hoặc nhóm gen có tính quyết định trong các quá trình sinh tổng hợp tinh bột ở sắn Việc biểu hiện mạnh, yếu hoặc không biểu hiện của gen được thể hiện trước hết qua RNA thông tin, dùng làm khuôn mẫu tổng hợp nên các enzyme chức năng, xúc tác cho chủ trình sinh tổng hợp tinh bột Với khuôn mẫu là ARN tổng

số tách chiết từ các mẫu sắn thông qua bước tổng hợp cDNA, phương pháp PCR định lượng (quantitative realtime PCR hay qRT-PCR) sẽ được sử dụng để đánh giá mức độ biểu hiện của các gen quan tâm tại các mô cơ quan khác nhau hay ở những giai đoạn phát triển Đây là phương pháp nhanh, nhạy, hiệu quả để xác định sự biểu hiện của các gen trong quá trình phát triển đặc thù của thực vật

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu , hóa chất và thiết bị

2.1.1 Thực vật

- Giống sắn KM140 được thu thập tại Trung tâm nghiên cứu thực nghiệm

nông nghiệp Hưng Lộc, Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam

- Mẫu cây khoai lang KB1 nuôi cấy trong điều kiện in vitro do Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp

2.1.2 Chủng khuẩn, vector và cặp mồi sử dụng

- Chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes K599, Escherichia coli

DH5(α) do Phòng công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ sinh học cung cấp

- Vector tách dòng pBT để tách dòng đoạn gen SSIV mã hóa cho enzym

stacrch synthase IV được phân lập từ giống sắn KM140, Vector chuyển gen pK7GWIWG2 (II) (Ghent Uni Belgium); vector nhân dòng pENTRTM

TOPO®

2.1.3 Hóa chất

Dung dịch tách chiết plasmid: Dung dịch 1 (25 nM Tris HCl, pH 8,0; 10

mM EDTA, pH 8,0; 50 mM Glucose); Dung dịch 2 (0,2 M NaOH; 1% SDS); Dung dịch 3 (3M CH3COOK; 11,5% CH3COOH); Isopropanol, Ehtanol 70%; dung dịch Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1)

Dung dịch TAE 1X (40 mM Tris, 20mM acetic acid và 1 mM EDTA); Agarose 0,8%; Ethidium bromide 0,5 µg/ml, thang ADN 1kb (Thermo); kit tinh sạch ADN Gene JET gel extraction (Thermo)

Kit tách chiết plasmid (QIAprep Spin Miniprep Kit) của hãng QIAGEN (Đức); Gateway® LR ClonaseTM II Enzyme mix Kit (Invitrogen, Cat No: 911791 – 020)

Các hóa chất đa lượng, vi lượng, vitamin, chất điều hòa sinh trưởng BAP, kinetin, IBA, NAA, Yeast extract, Bacto pepton, Trypton, NaCl, Agarose, Sucrose, Tris HCL, EDTA, MgSO4, Glycerol, Glycine betaine, Proline, Kanamycin, Rifamycin, Cefotaxime, X-gluc và các loại hóa chất thông dụng khác được cung cấp bởi các hãng như Sigma (Mỹ), Merck (Đức) và Wako (Nhật Bản)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2 Phương pháp thu thập mẫu, phân lập, xác định trình tự gen SSIV

2.2.1 Tách chiết RNA tổng số từ củ sắn giống KM140

Quy trình tách chiết RNA được thực hiện theo hướng dẫn của bộ kit PureLink Plant RNA Reagent, Invitrogen Đầu tiên nghiền 0,1 g mẫu trong nitro lỏng Sau đó bổ sung 0,5 ml PureLink®Plant RNA Reagent lạnh, đảo đều Ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng Rồi ly tâm 12000 vòng trong 2 phút ở nhiệt độ phòng Chuyển phần dịch nổi qua ống ly tâm mới Bổ sung 0,1 mL NaCl 5 M, trộn đều

Bổ sung thêm 0,3 mL Chloroform, trộn đều Ly tâm 12000 vòng trong 10 phút

ở 4°C, chuyển pha trên qua ống ly tâm mới Thêm 1 lần thể tích isopropanol, trộn đều và ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút Ly tâm 12000 vòng trong 10 phút

ở 4°C, bỏ phần dịch Tiếp tục bổ sung 1 ml cồn 75%, trộn đều Ly tâm 12000 vòng trong 1 phút ở nhiệt độ phòng, bỏ dịch, dùng pipet cẩn thận hút hết dịch vẫn còn trong ống ly tâm Bổ sung 30 μL nước khử RNase, trộn đều, mẫu được bảo quản ở -80°C

Thành phần Thể tích

Ribolock Rnase Inhibitor (20u/µl) 1

M-MuLV Reverse Transcriptase (20u/µl)

Pfu Buffer with MgSO4 10X 2,5

Bước Phản ứng Nhiệt độ (°C) Thời gian Chu kỳ

Kéo dài chuỗi

Hoàn tất kéo dài

trên đá và thực hiện quá trình biến nạp vào tế bào E.coli One Shot Competent

Bổ sung 2 µl phản ứng TOPO Cloning vào tế bào khả biến và trộn nhẹ Ủ trong

đá 10 phút Sốc nhiệt tế bào 30s,ở 42o

C rồi chuyển ngay ống vào đá Bổ sung

250 µl môi trường S.O.C ở nhiệt độ phòng Nuôi lắc 200v/p, 37o

C, 1h Cấy trải 50-200 µl dịch biến nạp lên đĩa môi trường LB đặc chứa 100 µg/ml Kanamycin

và ủ qua đêm ở 37o

C

2.2.4 Kiểm tra các khuẩn lạc bằng phương pháp PCR từ khuẩn lạc

Sau khi nuôi khuẩn đã biến nạp trên môi trường chọn lọc, tiến hành chọn

ra các khuẩn lạc trắng để chạy PCR từ khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu trên vector để xác định khuẩn lạc có plasmid mang gen mong muốn Thành phần phản ứng PCR từ khuẩn lạc và chu kì nhiệt như sau:

Khuẩn lạc M13F M13R

Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR từ khuẩn lạc

Kéo dài chuỗi

Hoàn tất kéo dài

Điện di kiểm tra sản phẩm PCR từ khuẩn lạc trên gel agarose 0,8% để chọn

ra các khuẩn lạc mang gen có kích thước như mong muốn Đồng thời, nuôi những khuẩn lạc dương tính vào 3ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh thích hợp

để tách plasmid

2.2.5 Tách chiết plasmid

Các dòng khuẩn lạc dương tính được nuôi trong 3 ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh thích hợp để tiến hành tách plasmid Đây là phương pháp tách

plasmid lượng bé từ 1-1,5 ml dịch khuẩn E coli, có số bản copy plasmid cao

Chuyển 1,5 ml dịch nuôi cấy vào eppendorf, ly tâm 10000 vòng/ phút trong 1 phút, loại dịch trên Bổ sung 200 µl dung dịch I dùng máy Voltex hòa tan tế bào

Từ bước này các thao tác phải được thực hiện trong đá Bổ sung 400 µl dung dịch II đảo nhẹ nhàng Dung dịch II có tác dụng phá vỡ thành tế bào Bổ sung

300 µl dung dịch III để kết tủa protein, đảo đều Bổ sung 900 µl Chloroform : isoamin (24:1), lắc đều Ly tâm 13000 vòng/ phút trong 10 phút Dưới tác dụng của lực ly tâm, mẫu chia thành ba pha: pha trên chứa DNA plasmid, pha giữa là protein tủa và pha dưới cùng là tạp chất Dùng pipet hút nhẹ nhàng pha trên cùng chứa DNA plasmid sang ống eppendorf mới Bổ sung thể tích tương đương

isopropanol để tủa plasmid, ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút Ly tâm thu DNA plasmid ở 13000 vòng/ phút trong 10 phút Bỏ dịch thu cặn Thêm 500 µl Ethanol 70%, đảo đều Ly tâm 7000 vòng/ phút trong 10 phút, bỏ dịch thu cặn Làm khô mẫu ở nhiệt độ phòng 15 phút Hòa tan DNA thu được trong 30 µl

H2O deion Điện di kiểm ta plasmid trên gel agarose 0,8%

2.2.6 Xác định trình tự và so sánh trình tự gen thu được với các trình tự tương ứng trên GenBank

Xác định trình tự nucleotide: Các mẫu plasmid tái tổ được xác định trình tự trên

máy đọc trình tự tự động ABI PRISM® 3100 Avant Gentic Analyzer

Phân tích trình tự: Sử dụng các phần mềm DNAstar, BioEdit, BLAST để so

sánh các trình tự gen

2.2.7 Thiết kế vector pK7GWIWG2(II) mang đoạn gen SSIV bằng kỹ thuật Gateway

Phản ứng LR: Khi đoạn gen cần quan tâm đã đưa vào entry vector

pENTRTM/D-TOPO là vector mang gen kháng Kanamycin, ở bên sườn đoạn gen quan tâm có hai điểm tái tổ hợp (attL1 và attL2) Tiến hành phản ứng tái tổ hợp

LR để chuyển đoạn gen quan tâm vào destination vector pK7GWG2D Vector này chứa tất cả trình tự cần biểu hiện như các điểm tái tổ hợp (attR1 và attR2) ở giữa hai điểm có đoạn gen chọn lọc âm tính ccdB, các gen chọn lọc (Spectinomicin hay Streptomycin, Kanamycin) Hai sự tái tổ hợp: một là giữa attL1 và attR1, hai là attL2 và attR2 tạo ra dòng biểu hiện

attL1-gene-attL2 x attR1-ccdB-attR2 attB1-gene-attB2 x attP1-ccdB-attP2

(entry clone) (destination vector) (expression clone)

Phản ứng được thực hiện dưới sự hướng dẫn của bộ kit Gateway® LR ClonaseTM II Enzyme mix Kit (Invitrogen) có cải tiến cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm Bổ sung các thành phần sau vào ống ly tâm 1,5 ml ở nhiệt độ phòng và trộn nhẹ:

Thành phần phản ứng LR