Tách dòng đoạn gen mã hóa kháng nguyên neuraminidase của chủng vi rút cúm a h5n1 tạo nguồn nguyên liệu sản xuất vắc xin cúm gia cầm

TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP -o0o KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP TÁCH DỊNG ĐOẠN GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN NEURAMINIDASE CỦA CHỦNG VI-RÚT CÚM A/H5N1 TẠO NGUỒN NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT VẮC – XIN CÚM GIA CẦM NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH: D420201 Giảng viên hƣớng :TS Nguyễn Trung Nam dẫn : ThS Nguyễn Hùng Chí Sinh viên thực : Hồ Thị Ngọc Mã sinh viên : 1453070137 Lớp : 59B-CNSH Khóa học : 2014 -2018 Hà Nội, 2018 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận này, trƣớc tiên xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Trung Nam - Trƣởng phịng Cơng Nghệ ADN ứng dụng,Viện công nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa Học Công Nghệ Việt Nam - Ngƣời tạo điều kiện tốt cho đƣợc nghiên cứu thực khóa luận phịng Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Ths.Nguyễn Hùng Chí – ngƣời ln tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình thực khóa luận Trong thời gian thực tập lãnh đạo cán phòng giúp trƣởng thành nhiều Tôi xin gửi lời biết ơn đến tồn thể q Thầy, Cơ giáo Viện Công nghệ sinh học Lâm Nghiệp truyền đạt kiến thức cho suốt năm học vừa qua Đồng thời tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới Ths.Nguyễn Thị Thu Hằng thầy cô giáo trực tiếp tham gia giảng dạy, giúp đỡ suốt q trình học tập trƣờng Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn ngƣời thân, bạn bè, ngƣời sát cánh tôi, động viên, khích lệ tơi tạo điều kiện tốt giúp tơi hồn thành đƣợc khóa luận Cuối tơi xin kính chúc q Thầy, Cơ, gia đình bạn bè dồi sức khỏe thành công sống Một lần xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 13 tháng năm 2018 Sinh viên thực Hồ Thị Ngọc i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan vi-rút cúm A 1.1.1 Khái quát phân loại vi-rút cúm A 1.1.2 Danh pháp vi-rút cúm 1.1.3 Cấu trúc vi-rút cúm A 1.1.4 Cơ chế xâm nhiễm vi-rút cúm A/H5N1 tế bào chủ 1.1.5 Khả gây bệnh vi-rút cúm A 1.2 Kháng nguyên NA vi-rút cúm 10 1.2.1 Cấu trúc chế hoạt động kháng nguyên NA 10 1.2.2 Vai trò kháng nguyên NA 12 1.3 Giới thiệu vắc -xin phòng chống cúm A/H5N1 13 1.3.1 Nguyên tắc chung việc phát triển chủng dự tuyển vắc-xin phòng chống cúm A/H5N1 13 1.3.2 Các chủng vi-rút vắc-xin dự tuyển 13 1.3.3 Khuyến cáo cho việc sử dụng chủng dự tuyển vắc-xin 14 1.3.4 Điều trị dự phòng 14 1.4 Các phƣơng pháp giải trình tự gen 15 1.4.1 Giải trình tự gen theo phƣơng pháp Maxam Gilbert 15 1.4.2 Giải trình tự gen theo phƣơng pháp dideoxy Sanger 15 1.4.3 Xác định trình tự gen máy giải trình tự tự động 15 ii CHƢƠNG MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 17 2.2 Nội dung nghiên cứu 17 2.3 Đối tƣợng, vật liệu nghiên cứu 17 2.3.1.Đối tƣợng 17 2.3.2 Vật liệu 17 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 2.4.1 Phƣơng pháp biến nạp DNA plasmid vào tế bào E.coli DH5 20 2.4.2 Phƣơng pháp điện di gel agarose 1% 20 2.4.3 Phƣơng pháp gắn sản phẩm PCR vào vector pHW2000 21 2.4.4 Phƣơng pháp PCR khuếch đại đoạn gen NA 22 2.4.5 Tách chiết DNA plasmid 23 2.4.6 Tinh plasmid tái tổ hợp 23 2.4.7 Phƣơng pháp giải trình tự gen máy giải trình tự gen tự động 24 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 Kết thiết kế gen NA-N1 chủng vi-rút cúm A H5/N1 clade 2.3.2.1C clade 1.1 26 3.2 Kết nhân dòng đoạn gen NA – N1 chủng vi-rút cúm H5N1 clade 2.3.2.1C vào vector tách dòng 28 3.2.1 Nhân gen NA clade 2.3.2.1C 28 3.2.2 Biến nạp vector tái tổ hợp pHW 2000 –NA clade 2.3.2.1C vào tế bào khả biến E.Coli chủng DH5 29 3.3 Kết kiểm tra có mặt gen NA –N1 vector pHW2000 30 3.3.1 Thực phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen NA 30 3.3.2 Kiểm tra phản ứng cắt vector tái tổ hợp với enzym giới hạn 31 3.4 Kết giải trình tự đoạn gen NA – N1 vector pHW2000 32 iii CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34 4.1 Kết luận 34 4.2 Kiến nghị 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO iv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên Tiếng Anh đầy đủ Amp Ampiciline BLAST Basic Local Alignment Search Tool Bp Base pair cDNA Complementary DNA Da Dalton DNA Deoxyribonucleotide acid dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate E.Coli Escherichia Coli HA Hemagglutinin Kb Kilo base LB Luria Bertani NA Neuraminidase ng nanogam OD Optical Density v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các phân đoạn RNA chức vi-rút cúm A Bảng 2.1 Thành phần phản ứng ligation 22 Bảng 2.2 Trình tự cặp mồi [10] 22 ảng 2.3 Thành phần phản ứng để xác định trình tự 24 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc vi-rút cúm A [25] Hình 1.2 Các phân đoạn gen protein vi-rút cúm A Hình 1.3 Mơ hình chế xâm nhiễm nhân lên vi-rút cúm A tế bào chủ 13 Hình 1.4: NA bị bao vây chất ức chế 13 Hình1.5: Liên kết NA kháng thể 13 Hình 3.1 Trình tự nucleotide (A) amino acid (B) gen NA clade 2.3.2.1C so với clade 1.1 để tổng hợp nhân tạo 27 Hình 3.2 Kiểm tra sản phẩm conoly-PCR dòng E coli DH5α biến nạp pJET1.2-NA clade 2.3.2.1C 28 Hình 3.3 Kết biến nạp plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn E.coli DH5α 30 Hình 3.4 Kiểm tra kết tách dòng gen PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu gen cặp mồi đặc hiệu vector 31 Hình 3.5 Kiểm tra kết tách dòng gen cắt cặp enzyme NheI SmaI 32 vii ĐẶT VẤN ĐỀ Vi-rút cúm A/H5N1 đƣợc phát lần gà Scotland vào năm 1959, coi chủng vi-rút cổ điển Chủng vi-rút lần đƣợc phát xâm nhiễm ngƣời Hồng Kơng năm 1997 Tính đến năm 2008, giới có 369 trƣờng hợp ngƣời nhiễm vi-rút cúm A/H5N1 234 ngƣời tử vong Theo thống kê tổ chức Y tế giới ((World Health Organization- WHO) từ tháng năm 2004 đến tổng số ngƣời Việt Nam tử vong vi-rút cúm 21 ngƣời Dịch cúm gia cầm diễn biến ngày phức tạp nguồn tàng trữ lây lan bệnh chim di cƣ thủy cầm khó kiểm sốt khống chế Đứng trƣớc hiểm họa bùng phát dịch cúm mới, cơng tác phịng chống bệnh cúm ngày đƣợc đẩy mạnh Hiện nay, bên cạnh biện pháp phòng dịch nhƣ tiêu độc, xử lý gia cầm bị bệnh, nhiễm gia cầm nhiễm nguy nhiễm biện pháp sử dụng vắc-xin giải pháp hữu ích để hạn chế nhiễm bệnh Công nghệ ADN tái tổ hợp di truyền ngƣợc đƣợc ứng dụng rộng rãi ngƣời ta sử dụng công nghệ để sản xuất vắc-xin Theo quy trình chuẩn Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization- WHO) sản xuất vắc-xin dựa kỹ thuật di truyền ngƣợc, chủng vi-rút gốc cho sản xuất vắc-xin đƣợc tái tạo phƣơng pháp tạo dòng vector tái tổ hợp mang phân đoạn cDNA genome vi-rút, sau biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào động vật để tái tạo hạt vi-rút hoàn chỉnh [17] Hai protein bề mặt vi-rút, NA (neuraminidase) HA (hemagglutinin), kháng nguyên có vai trị định q trình xâm nhiễm, lây truyền nhân lên vi-rút cúm A/H5N1 tế bào động vật nhƣ ngƣời Trong đó, NA (đối với chủng vi-rút cúm A/H5N1, NA kháng nguyên N1) kháng nguyên có hoạt tính neuraminidase, có vai trị phá bỏ thụ thể để giải phóng vi-rút khỏi tế bào nhiễm, có ý nghĩa quan trọng kích thích hệ thống miễn dịch thể vật chủ sinh đáp ứng miễn dịch chống lại vi-rút Do đó, cơng nghệ tạo giống gốc cho sản xuất vắc-xin phòng chống vi-rút cúm A/H5N1 ứng dụng kỹ thuật di truyền ngƣợc đòi hỏi phải có bƣớc tạo vector tái tổ hợp mang phân đoạn gen vi-rút Trong số nghiên cứu cơng bố [1],[2] nhóm nghiên cứu trình bày thành cơng việc tách dịng phân đoạn gen khung phân đoạn gen mã hóa kháng nguyên HA vi-rút cúm vào vector pHW2000 Do việc tạo nguồn vật liệu vector pHW2000 tái tổ hợp mang phân đoạn gen N1 NA chuẩn bị cho kết hợp với vector mang phân đoạn gen lại genome vi-rút cúm A/H5N1 để tái tạo chủng vi-rút tái tổ hợp làm giống gốc cho sản xuất vắc-xin phòng chống cúm A/H5N1 gia cầm điều cần thiết Trên sở đó, tơi tiến hành đề tài: “ Tách dịng đoạn gen mã hóa kháng nguyên neuraminidase chủng vi-rút cúm A/H5N1 tạo nguồn nguyên liệu sản xuất vắc – xin cúm gia cầm” Khóa luận đƣợc thực phịng Cơng Nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng Nghệ Việt Nam, hồn thành kinh phí đề tài cấp Nhà nƣớc “Nghiên cứu tạo giống gốc để sản xuất vắc-xin cúm A/H5N1” (Mã số SPQG.05b.03) 2.4.5 Tách chiết DNA plasmid Lựa chọn khuẩn lạc màu trắng tiến hành nuôi cấy lọ penicillin chứa 2ml mơi trƣờng LB lỏng có chứa Amp (nồng độ 100µg/ml) Ni lắc qua đêm 37oC, 200v/p - Lấy 1,5ml dịch nuôi vào ống Eppendorf - Ly tâm 12000v/p, phút loại dịch, thu tế bào - Bổ sung 150µl Sol I (Tris - HCl 50mM, pH 8,0 + EDTA 10mM, pH 8,0), trộn máy vortex - Bổ sung 150µl Sol II (200mM NaOH + SDS ), đảo nhẹ - Bổ sung 150µl Sol III (Kac - Potasium Acetat 3M, pH 5,5), đảo nhẹ - Bổ sung 450µl chloroform: isoamylalcohol (24:1), đảo nhẹ - Ly tâm 12000v/p, 20 phút - Hút dịch chuyển sang Eppendorf mới, bổ sung 40µl NaOAc 3M, pH=5,2 1000µl ethanol 100 Để -20oC tủa DNA plasmid - Ly tâm 12000v/p, 30 phút, loại dịch thu cặn - Rửa cặn 500µl ethanol 70% - Ly tâm 12000v/p, 15 phút - Làm khô DNA - Hịa cặn DNA 40 µl TE - RNAase (100µg/ml) - Ủ bể ổn nhiệt 37oC 1h loại RNA - Điện di kiểm tra gel agarose 1% 2.4.6 Tinh plasmid tái tổ hợp - Bổ sung 100µl Binding Buffer vào 100µl plasmid, trộn - Bổ sung tiếp 100µl isopropanol 100% vào hỗn hợp trên, trộn - Chuyển 300µl hỗn hợp lên cột A/B, ly tâm với tốc độ 10.000 v/p Loại dịch cột B - Bổ sung dung dịch Wash buffer 100µl lên cột, ly tâm 10.000v/p 23 - Đổ hết phần dịch, ly tâm tiếp 12.000v/p - Chuyển cột A sang cột B - Bổ sung 50 µl nƣớc giữ nhiệt độ phòng 10 phút để thu plasmid - Điện di kiểm tra sản phẩm tinh gel agarose 1% 2.4.7 Phƣơn pháp iải trình tự gen máy giải trình tự gen tự động Qui trình xác định trình tự gen máy đọc trình tự tự động ABI PRISM® 3100- Avant™ Genetic Analyzer (Applied iosystems), sử dụng kit BigDye® Terminater v3.1 Cycle Sequencing Kit hãng Applied Biosystems ƣớc 1: Thực phản ứng tổng hợp với thành phần nhƣ bảng 2.3 ản 2.3 Thành phần phản ứn để xác định trình tự Thành phần Thể t ch l) Nƣớc khử ion vô trùng 5,725 Bigdye DNA (200 ng) Mồi (3,2 pmol) 1,275 Đệm 2.5X Tổng thể tích 15 Chu trình nhiệt đƣợc thực nhƣ sau: 960C phút, 960C 10 giây, 500C giây, 600C phút, 25 chu kỳ , 600C phút, kết thúc 40C - ƣớc 2: Tinh sản phẩm sau tổng hợp + ổ sung 5l EDTA 125mM, pH=8 24 + ổ sung 60l Ethanol 100 Ủ nhiệt độ phòng 15 phút + Ly tâm 12000 v/p 20 phút, thu cặn + Rửa cặn 60l Ethanol 70% Ly tâm 12.000 v/p 10 phút, thu + Làm khô cặn 10 phút máy Speed vac + Hòa cặn 10 l Hidiformamide + iến tính 950C phút - ƣớc 3: Xác định trình tự máy tự động A I 3100 Avant 25 cặn CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết thiết kế gen NA-N1 chủng vi-rút cúm A H5/N1 clade 2.3.2.1C clade 1.1 Trình tự nucleotide gen NA-N1 clade 2.3.2.1C clade 1.1 (Hình 3.1) đƣợc thiết kế dựa trình tự nucleotide gen NA phân lập từ chủng A/duck/Vietnam/ST0970/2009(H5N1) (clade 1.1) A/duck/Vietnam/HT02/2014(H5N1) (clade 2.3.2.1C) tƣơng ứng, có kích thƣớc cấu trúc gồm 1453 bp với: vùng mã hóa (ở giữa) kích thƣớc 1350 bp, 1347 bp (bắt đầu ba khởi đầu dịch mã - ATG) mã hóa 449 amino acid, bp tƣơng ứng với ba kết thúc khơng mã hóa; vùng khơng mã hóa nằm hai đầu với kích thƣớc trình tự tƣơng ứng 46 bp - 5’ tagtactaagcatattggtctcagggagcaaaagcaggagttcaaa 3’ 57 bp - 5’tttgttcaaaaaactccttgtttctactaatacgagaccatattagtactaagcata 3’, nucleotide in nghiêng vị trí gắn đặc hiệu mồi xi ngƣợc phản ứng PCR nhân gen, vị trí nucleotide gạch chân điểm nhận biết enzyme BsaI Với cấu trúc gen NA thiết kế clade, thực phản ứng PCR nhân gen NA s tạo sản phẩm đặc hiệu có kích thƣớc gồm vùng mã hóa hai đoạn nucleotide khơng mã hóa hai đầu gen, bắt đầu vị trí gắn mồi đặc hiệu, với tổng số nucleotide 1434 bp (1350 bp + 84 bp) Khi so sánh tƣơng đồng trình tự amino acid gen NA clade 1.1 clade 2.3.2.1C mã hóa chƣơng trình ClustalW LAST độ tƣơng đồng hai trình tự 92 Đặc biệt, protein gen NA clade 1.1 clade 2.3.2.1C mã hóa gồm 449 amino acid (Hình 3.1B) với đầy đủ vị trí quan trọng đảm bảo chức tính kháng nguyên protein NA nhƣ: Vị trí thực chức xúc tác (catalytic site) neuraminidase: Ở clade đƣợc hợp thành từ amino acid nằm vị trí, phân bố bề mặt tiểu đơn vị hợp thành đầu tetramer dạng cầu NA, gồm: Arg (R) - 98, Asp (D) - 131, Glu (E) - 258, Arg (R) - 273, Arg (R) - 348, Tyr (Y) - 382, Glu (E) - 405 Các cơng bố trình tự gen NA vi-rút H5N1 clade 1.1 clade 2.3.2.1C ngân hàng NCBI (National Center for 26 iotechnology Information) khẳng định vai trò vị trí việc đảm bảo chức thực hoạt tính enzyme NA [22] (A) (B) Hình 3.1 Trình tự nucleotide (A) amino acid (B) gen NA clade 2.3.2.1C so với clade 1.1 để tổng hợp nhân tạo 27 3.2 Kết nhân dòn đoạn gen NA – N1 chủng vi-rút cúm H5N1 clade 2.3.2.1C vào vector tách dòng 3.2.1 Nhân gen NA clade 2.3.2.1C Kết chọn dòng E coli DH5α chứa plasmid tái tổ hợp mang gen NA clade 2.3.2.1C cho thấy: biến nạp thành công vector tái tổ hợp pJET1.2NA clade 2.3.2.1C vào E coli DH5α, với phần kết đƣợc thể Hình 3.2 (sản phẩm phản ứng conoly-PCR xuất băng vạch đặc hiệu có kích thƣớc tƣơng ứng với kích thƣớc tính tốn theo lý thuyết gen NA thiết kế - 1434 bp) Hình 3.2 Kiểm tra sản phẩm conoly-PCR dòng E coli DH5α biến nạp pJET1.2-NA clade 2.3.2.1C M: Marker 1kb; 1: dòng khuẩn lạc dƣơng tính với pJET1.2-NA clade 2.3.2.1C DNA plasmid dịng khuẩn lạc dƣơng tính với phản ứng conolyPCR đƣợc tách, tinh đọc trình tự nucleotide gen NA theo chiều xuôi chiều ngƣợc Tƣơng ứng với gen lựa chọn có kết đọc trình tự nucleotide gen đích đƣợc xác định có độ xác 100% so với trình tự gen thiết kế để tiếp tục dịng hóa vào vector pHW2000, sử dụng enzyme cắt BsaI enzyme nối T4 DNA ligase 28 3.2.2 Biến nạp vector tái tổ hợp pHW 2000 –NA clade 2.3.2.1C vào tế bào khả biến E.Coli chủng DH5 Cùng với việc thực cắt phân lập gen NA-clade 2.3.2.1Ctừ vector tái tổ hợp pJET1.2, tiến hành cắt mở vòng vector pHW2000 enzym BsaI Thực phản ứng ghép nối gen NA clade 2.3.2.1C vào vector pHW2000 để tạo vector tái tổ hợp sử dụng emzym nối T4 ligase Sản phẩm PCR sau đƣợc gắn vào vector pHW2000 đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.Coli chủng DH5 Sau biến nạp, dịch tế bào đem cấy trải lên đĩa petri có sẵn mơi trƣờng L đặc bổ sung Amp, X-gal nuôi cấy điều kiện 37 độ C để qua đêm Với môi trƣờng chọn lọc này, có tế bào mang vector tách dịng có gen kháng sinh sống sót tạo thành khuẩn lạc Các khuẩn lạc mang vector tách dịng ( khơng đính thêm sản phẩm PCR mà tự đóng vịng) s có màu xanh gen Lac –Z không bị phá vỡ cấu trúc gen nên hoạt động bình thƣờng tổng hợp đƣợc enzyme β-galactosidase, chất thủy phân chất X-gal thành sản phẩm có khả kết hợp với oxi để tạo thành chất có màu xanh da trời có tên 5,5 dibrom-4,4 dichloro indigo Trong khuẩn lạc chứa vector tái tổ hợp s có màu trắng chứa đoạn gen mã hóa cho NA chèn vào Lac-promotor gen cấu trúc Lac-Z nên gen Lac-Z bị hỏng không tổng hợp đƣợc β-galactosidase (hình 3.3) 29 Hình 3.3 Kết biến nạp plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn E.coli DH5α Chọn dòng plasmid tái tổ hợp theo phƣơng pháp conoly – PCR.Các dịng dƣơng tính với plasmid tái tổ hợp đƣợc nhân dòng, tách chiết DNA plasmid, tinh kit 3.3 Kết kiểm tra có mặt gen NA –N1 vector pHW2000 3.3.1 Thực phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen NA Sau tách dịng kiểm tra có mặt gen NA vector pHW2000 PCR với hai loại mồi mồi đặc hiệu gen mồi đặc hiệu vector, kết biến nạp thành công gen NA-clade 2.3.2.1C vào vector pHW2000: sản phẩm PCR phân đoạn gen nhân lên với mồi đặc hiệu gen hay mồi bắt cặp vector xuất băng đặc hiệu có kích thƣớc theo lý thuyết: khoảng 1430 bp (mồi đặc hiệu gen), khoảng 1600 bp (mồi pHW2000) (Hình 3.4) 30 Hình 3.4 Kiểm tra kết tách dòng gen PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu gen cặp mồi đặc hiệu vector 1, 2: sản phẩm PCR gen NA clade 2.3.2.1.C ; M: marker HighRanger 1kb DNA Ladder 3.3.2 Kiểm tra phản ứng cắt vector tái tổ hợp với enzym giới hạn Kết tạo dòng đƣợc kiểm tra phản ứng cắt vector tái tổ hợp với enzyme giới hạn: cắt cặp enzyme NheI SmaI Sản phẩm phản ứng cắt đƣợc điện di kiểm tra gel agarose cho thấy: sản phẩm cắt pHW2000-NA clade 2.3.2.1C cặp enzyme NheI SmaI (Hình 3.5) xuất băng vạch: băng có kích thƣớc lớn tƣơng ứng với kích thƣớc vector pHW2000, băng kích thƣớc nhỏ tƣơng ứng với kích thƣớc gen NA 31 Hình 3.5 Kiểm tra kết tách dòng gen cắt cặp enzyme NheI SmaI 5: vector pHW2000-NA clade 2.3.2.1C cắt NheI SmaI M1: marker HighRanger 1kb DNA Ladder 3.4 Kết giải trình tự đoạn gen NA – N1 vector pHW2000 Kết xác định trình tự nucleotide gen đích vetor tái tổ hợp khẳng định clade 2.3.2.1C đƣợc tách dịng thành cơng vào vector pHW2000, với kích thƣớc gen 1434 bp, trình tự nucleotide gen so sánh với trình tự thiết kế đạt độ xác 100% TAGTACTAAGCATATTGGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGAGTTCAAAATG AATCCAAACCAGAAAATAGTAACCATTGGATCAATCTGTATGGTAATTG GAATAATTAGCTTGATGTTACAGATTGGGAACATAATATCAATATGGGT CAGTCATTCAATTCAAACAGGGAATCAACACCAAACTGAACCAGTCAGA AATACCAATTTTCTTACTGAGAACGCTGTAGCTTCAGTAACATTAGCTGG CAATTCATCTCTTTGCCCCATTAAAGGATGGGCTGTACACAGTAAAGAC AACAGTATAAGGATTGGGTCCAAAGGGGATGTGTTTGTAATTAGAGAGC CGTTCATATCATGCTCCCATCTGGAATGCAGAACTTTCTTTTTGACTCAG GGAGCTTTACTGAATGACAAGCACTCCAACGGGACTGTCAAAGATAGG AGCCCTCACAGAACGCTAATGAGTTGCCCTATAGGTGAGGCTCCCTCCC CATATAACTCAAGGTTTGAGTCTGTTGCTTGGTCGGCAAGTGCTTGCCAT GATGGCACCAGTTGGTTGATAATTGGAATTTCTGGTCCAGACAATGGGG CTGTGGCGGTACTGAAATACAATGGCATAATAACAGACACTATCAAGAG TTGGAGGAATAACATACTGAGGACCCAAGAGTCTGAATGTGCATGTGTA AATGGCTCTTGCTTTGCTGTTATGACAGATGGACCAAGTAATGGGCAGG 32 CATCATATAAGATTTTCAAAATAGACAAAGGGAAAGTAGTTAAGTCGGT CGAATTGAATGCCCCTAATTATCACTATGAGGAATGTTCCTGTTATCCTG ATGCTGGCGAAATCATATGTGTGTGCAGGGATAATTGGCATGGCTCAAA CAGGCCATGGGTATCTTTCAATCAGAATTTGGAGTATCAAATAGGATAT ATTTGTAGTGGAATTTTCGGTGACAATCCGCGGCCAAATGACGGTACAG GTAGTTGTGGTCCAGTGTCCTCTAACGGGGCATATGGGGTAAAAGGGTT CTCATTTAAATATGGCAATGGTGTCTGGATCGGGAGGACCAAAAGCACT CATTCCAGGAGCGGCTTTGAAATGATTTGGGATCCAAACGGGTGGACTG GAACGGACAGTGAATTTTCGATGAAACAAGATATAGTAGCAATAACTG ATTGGTCAGGATATAGCGGGAGTTTTGTCCAGCACCCAGAACTGACAGG ATTAGATTGCATAAGACCTTGCTTCTGGGTTGAGTTAATCAGAGGGCGG CCCAAAGAGAGCACCATTTGGACTAGTGGGAGCAGCATATCTTTTTGTG GTGTAAATAGTGACACTGTCAGTTGGTCTTGGCCAGACGGTGCTGAGTT GCCATTCACCATTGACAAGTAGTTTGTTCAAAAAACTCCTTGTTTCTACT AATACGAGACCATATTAGTACTAAGCATA Đoạn gen NA-N1 clade 2.3.2.1C sau giải trình tự đƣợc so sánh NCBI cho kết độ tƣơng đồng 100% so với trình tự đƣợc cơng bố 33 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Đã thiết kế đƣợc gen NA-N1 vi-rút cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1C - Đã tách dịng thành cơng phân đoạn gen mã hóa kháng nguyên NA vi-rút A/H5N1 clade 2.3.2.1C vào vector pHW2000 4.2 Kiến nghị - Tách chiết tinh lƣợng lớn plasmid pHW2000-NA clade 2.3.2.1C làm gen kháng nguyên cho mục đích sản xuất vắc-xin tái tổ hợp kĩ thuật di truyền ngƣợc 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Nguyễn Thị Thu Hằng, Hoàng Thị Thu Hằng, Nguyễn Hùng Chí, Chu Hồng Hà, Nguyễn Trung Nam (2017), Nhân dịng vector pHW2000 tái tổ hợp mang gen HA làm nguyên liệu tạo chủng gốc ứng dụng sản xuất vắc-xin cúm A/H5N1 Tạp chí Khoa học, 33(1S): 159-167 Nguyễn Thị Thu Hằng, Nguyễn Hùng Chí, Hồng Thị Thu Hằng, Vũ Huyền Trang, Chu Hoàng Hà, Nguyễn Trung Nam ( 2017) Tách dòng sáu gen khung vi-rút cúm vào vector pHW2000phục vụ tạo chủng gốc vắc-xin cúm A/H5N1 kỹ thuật di truyền ngƣợc Văn Hải Vân, Lê Thị Thanh Thủy, Cao Thị Ngọc Phƣợng, Vũ Thị Bích, Trần Linh Phƣớc, “Xác định vùng bảo tồn chức dự đoán epitope tế bào T vi-rút cúm A”, Sicience& Technology Development; 12(09)2009 Tài liệu nƣớc Alexander, D.J (2007), Summary of avian influenza activity in Europe, Asia, Africa and Australia, 2002 -2006 Avian Dis, 51(1 Suppl): p.161-6 Chen W., Zhong Y., Qin S., Sun S., Li Z., 2012 The evolutionary pattern of glycosylation sites in influenza virus (H5N1) hemagglutinin and neuraminidase Plos One, (11): 1-14 De Wit, E and R.A.M Foucher (2008), Emerging influenza, J Clin Virol, 41: p.1 -6 Doherty, P., S Turner, R Webby, and P Thomas (2006), Influenza and the challenge for immunology Nat Immunol, 7(5): p 449 -55 Ferhangi A., Goliaei B., Kavousi K., Ashtari A., Bayatzadeh M A., Pourbakhsh A., 2015 Bioinformatics study of complete amino acid sequences of neuraminidase (NA) antigen of H1N1 influenza viruses from 2006 to 2013 in Iran Vaccine research, 2(5): 123-129 Gamblin S J., Skehel J J., 2010 Influenza hemagglutinin and neuraminidase membrane glycoprotein The Journal of Biologycal Chemistry, 285(37): 28403-28409 10 Hoffmann E., Stech J., Guan Y., Webster R G., Perez D R., 2001 Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses Archives of Virology, 146: 2275–2289 11 Horimoto, T and Y Kawaoka (2001), Pandemic threat posed by avian infuenza A viruses Clin Microbiol Rev, 14: p 129 -149 12 Keawcharoen, J., Theamboonlers, A., Jantaradsamee, P., Rungsipipat, A., Poovorawan, Y & Oraveerakul, K (2005) Nucleotide sequence analysis of nucleocapsid protein gene of canine distemper virus isolates in Thailand Veterinary Microbiology 105, 137-142 13 Kelly, T.R., M.G Hawkins, C E Sandrock, and W M Boyce (2008), A review of hightly pathogenic avian influenza in birds, with an emphasis on Asian H5N1 and recommendations for prevention and control J Avian Meg Surg, 22(1): p.1-16 14 Munster,V.J.C Bass,P.Lexmond, T M Bestebroer J Guldemeester, W E Beyer, E de Wit, M Schutten, G.F Rimmelzwaan, A.D Osrerhaus, and R.A Fouchier (2009), Practical considerations for high – throughput influenza A virus surveillance studies of wild birds by use of molecular diagnostic tests J Clin Microbiol, 47 (3): p.666 – 73 15 Murphy R, Webster R.G (1996), “Orthomyxoviruses”, In Flields BN, Knipe DM, Howley PM et al (eds), Fields virology; 3rd ed, Lippincott- Raven Publishers, Philadenphia, PA, 1397-1445 16 Nicholson, K J Wood, and M Zambon (2003) Influenza Lancet 362: p 1733 -1745 17.Ping J., Lopes T J., Nidom C A., Ghedin E., Macken C A., Fitch A., Imai M., Maher E A., Neumann G., Kawaoka Y., 2015 Development of highyield influenza A virus vaccine viruses Nature Communications, 6: 1-15 18 Taubenberger JK, Morens DM (2006) 1918 influenza: the mother of all pandemics Emerg Infect Dis 12: 15-22 19 Webster, R.G (1998), Influenza: an emerging disease Emerg Infect Dis, 4(3): p 436 – 441 20 Yano T., Nobusawa E., Nagy A., Nakajima S., Nakajima K., 2008 Effects of single-point amino acid subtitutions on the structure and function neuraminidase proteins in influenza A virus Microbiol Immunology, 52: 216223 21 Zhu Q, Yang H, Chen W, Cao W, Zhong G, Jiao P, Deng G, Yu K, Yang C, u Z, Kawaoka Y, Chen H (2008), “A naturally occurring deletion in its NS gen contributes to the attenuation of an H5N1 swine influenza virus in chickens” J Virol 82(1), 220-228 Một số trang web tham khảo: 22.http://khoahoc.tv/amp/viet-nam-nghien-cuu-thanh-cong-vac-xin-cum-ah5n1-va-cum-a-h1n1-3803 23 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/408717469 24 http://mactech.com.vn/tim-hieu-ve-virus-cum-gia-cam 25.http://thefutureofthings.com/news/6684/human-antibodies-neutralizeavian-flu.html 26 http://tusach.thuvienkhoahoc.com/wiki/Virus cúm bệnh cúm gia cầm ... TAGTACTAAGCATATTGGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGAGTTCAAAATG AATCCAAACCAGAAAATAGTAACCATTGGATCAATCTGTATGGTAATTG GAATAATTAGCTTGATGTTACAGATTGGGAACATAATATCAATATGGGT CAGTCATTCAATTCAAACAGGGAATCAACACCAAACTGAACCAGTCAGA... CATCATATAAGATTTTCAAAATAGACAAAGGGAAAGTAGTTAAGTCGGT CGAATTGAATGCCCCTAATTATCACTATGAGGAATGTTCCTGTTATCCTG ATGCTGGCGAAATCATATGTGTGTGCAGGGATAATTGGCATGGCTCAAA CAGGCCATGGGTATCTTTCAATCAGAATTTGGAGTATCAAATAGGATAT ATTTGTAGTGGAATTTTCGGTGACAATCCGCGGCCAAATGACGGTACAG... GATGGCACCAGTTGGTTGATAATTGGAATTTCTGGTCCAGACAATGGGG CTGTGGCGGTACTGAAATACAATGGCATAATAACAGACACTATCAAGAG TTGGAGGAATAACATACTGAGGACCCAAGAGTCTGAATGTGCATGTGTA AATGGCTCTTGCTTTGCTGTTATGACAGATGGACCAAGTAATGGGCAGG 32 CATCATATAAGATTTTCAAAATAGACAAAGGGAAAGTAGTTAAGTCGGT