Luận án Nghiên cứu nhân dòng và biểu hiện trên bề mặt bào tử Bacillus subtilis gen mã hóa kháng nguyên VP28 của virus gây bệnh đốm trắng ở tôm để tạo ra bào tử Bacillus subtilis biểu hiện kháng nguyên VP28 của virus gây bệnh đốm trắng làm cơ sở cho việc sản xuất vaccine dạng probiotic bền nhiệt giúp phòng bệnh virus đốm trắng trên tôm. Mời các bạn cùng tham khảo.
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Phạm Kiên Cường NHÂN DÒNG VÀ BIỂU HIỆN TRÊN BỀ MẶT BÀO TỬ BACILLUS SUBTILIS GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN VP28 CỦA VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TƠM Chun ngành: Hóa sinh học Mã số: 62 42 01 16 DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI - 2014 Cơng trình hoàn thành tại: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Phan Tuấn Nghĩa PGS.TS Nguyễn Thị Vân Anh Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ Hội đồng chấm luận án cấp Đại học Quốc gia họp tại: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên vào hồi ., ngày .tháng .năm 2015 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam, - Trung tâm thông tin - Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Ni tôm Việt Nam phát triển mạnh năm gần trở thành ngành kinh tế quan trọng Tuy nhiên, ngành nuôi trồng tôm Việt Nam đứng trước nhiều khó khăn dịch bệnh, chất lượng tôm giống sa sút Sự bùng nổ dịch bệnh nghiêm trọng virus tr ng ó viru gây hội hứng đốm tr ng (WSSV), làm giảm đáng kể sản lượng tôm, gây thiệt hại lớn kinh tế ngành nuôi tôm Nhiều nghiên cứu giới tiến hành để tìm giải pháp hiệu chống lại WSSV kết thu hạn chế Một hướng nghiên cứu nhiều nhà khoa học giới hướng đến tạo vaccine dựa protein cấu trúc WSSV để kí h thí h đáp ứng miễn dịch tơm chống lại bệnh đốm tr ng VP28 loại protein vỏ WSSV, đóng vai trị hủ đạo giúp virus g n đặc hiệu lên tế bào tôm, bước khởi đầu cho q trình lây nhiễm Chính vậy, VP28 pr tein lựa chọn để tạo kháng thể chẩn đ án WSSV ũng tạo vaccine cho tơm phịng bệnh đốm tr ng (Rout tập thể, 2007; Witteveldt tập thể, 2004) Tuy nhiên, kết nghiên cứu tạo vaccine phòng bệnh đốm tr ng WSSV ũng hỉ dừng lại mức thử nghiệm nhỏ lẻ, hưa tạ vaccine thức, hiệu Xuất phát từ thự tế trên, húng tiến hành đề tài “Nghiên cứu nhân dòng biểu bề mặt bào tử Bacillus subtilis gen mã hóa kháng nguyên VP28 virus gây bệnh đốm trắng tôm” để tạ bào tử Bacillus subtilis biểu kháng nguyên VP28 virus gây bệnh đốm tr ng làm cho việc sản xuất vaccine dạng probiotic bền nhiệt giúp phòng bệnh viru đốm tr ng tôm Mục tiêu nghiên cứu đề tài - Nhân dòng, xá định trình tự số đặ trưng gen VP28 từ mẫu WSSV phân lập địa bàn nuôi tôm chủ yếu Việt Nam - Tạ chủng Bacillus subtilis tái tổ hợp biểu gen mã hóa protein kháng nguyên VP28 WSSV bề mặt bào tử - Bướ đầu đánh giá khả phịng bệnh đốm tr ng tơm thẻ chân tr ng chế phẩm bào tử B subtilis biểu VP28 bề mặt Đối tượng nội dung nghiên cứu đề tài Đối tượng nghiên cứu đề tài: Gen mã hóa protein VP28 virus gây bệnh đốm tr ng tôm Nội dung nghiên cứu đề tài: - Nhân dịng, xá định trình tự số đặ trưng gen vp28 từ mẫu WSSV phân lập Việt Nam - Xây dựng quy trình biểu gen mã hóa cho VP28 bề mặt bào tử Bacillus subtilis - Nghiên cứu thử nghiệm khả phòng bệnh đốm tr ng tôm thẻ chân tr ng h tôm ăn thứ ăn trộn bào tử Bacillus subtilis biểu VP28 Địa điểm thực đề tài Các nghiên cứu luận án thực chủ yếu Phòng Thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ Enzym Pr tein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Phần thử nghiệm khả bảo hộ tơm thẻ chân tr ng phịng bệnh viru đốm tr ng thực với hỗ trợ, hợp tác Viện Nghiên cứu nuôi trồng Thủy sản I Đóng góp đề tài - Cơng trình nghiên cứu có tính hệ thống từ việc nhân bản, nhân dịng biểu gen mã hóa protein VP28 tái tổ hợp E coli Bacillus subtilis Đề tài xá định trình tự số đặ trưng gen VP28 từ mẫu WSSV phân lập Việt Nam - Nghiên cứu biểu thành cơng gen mã hóa protein VP28 WSSV bề mặt bào tử B subtilis dạng cấu trúc protein dung hợp CotB-VP28 CotB-GST-VP28, tr ng đó, CotB protein vỏ B subtilis GST (Glutathione S Transferase) protein trung gian nhằm hạn chế cản trở không gian VP28 - Đã tối ưu đượ điều kiện thu nhận bào tử tái tổ hợp B subtilis biểu tốt kháng nguyên VP28 WSSV bề mặt bào tử nghiên cứu tính chất bào tử tái tổ hợp B subtilis CotB-VP28, CotB-GSTVP28 số điều kiện môi trường khác - Đã đánh giá ự tăng hoạt độ enzyme phenoloxidase (PO), superoxide dismutase (SOD) phản ánh đáp ứng miễn dịch tôm thẻ hân tr ng đánh giá khả phịng bệnh đốm tr ng tơm thẻ hân tr ng với mứ bả hộ 70% bào tử B subtilis biểu VP28 bề mặt Ứng dụng thực tiễn đề tài - Kết nghiên cứu đề tài để tạo chế phẩm probiotic dạng bào tử B subtilis tái tổ hợp bền nhiệt, biểu VP28 bền mặt, có khả tăng ường miễn dịch bảo vệ tơm khỏi nhiễm bệnh đốm tr ng, giúp góp phần kiểm sốt dịch bệnh tơm - Thành cơng đề tài tiền đề cho việc phát triển vaccine tái tổ hợp dạng bào tử B subtilis tái tổ hợp có khả phịng bệnh vi sinh vật khác gây tôm Bố cục luận án Luận án gồm 120 trang bao gồm: Phần mở đầu (3 trang); Tổng quan tài liệu (40 trang); Đối tượng phương pháp nghiên ứu (19 trang); Kết thảo luận (39 trang); Kết luận kiến nghị (1 trang), Các cơng trình khoa học tác giả liên quan đến luận án (1 trang), Tài liệu tham khảo (16 trang ,với 122 tài liệu gồm thứ tiếng tiếng Việt (8 tài liệu) tiếng Anh (11 tài liệu) Luận án có 15 bảng, 43 hình CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung virus gây bệnh đốm trắng tôm Virus gây bệnh đốm tr ng (White Spot Syndrome Virus, đượ viết t t WSSV) thuộc họ Nimaviridae chi Whispovirus (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTV/) VP28, đượ mã hóa đ ạn gen hay khung đọ mở(ORF) 421 bp (wsv421), protein vỏ quan trọng, đóng vai trị quan trọng bướ trình nhiễm WSSV vào tơm (Van Hulten tập thể, 2001) Ch đến hưa ó giải pháp hiệu để ngằn ngừa công loại virus tôm 1.2 Nghiên cứu tạo vaccine dựa kháng ngun vỏ WSSV Tơm thuộ nhóm động vật giáp xá , ó hệ miễn dịch ịn khai, số nghiên cứu gần h thấy có khả phịng ngừa đặc hiệu WSSV kích thích dạng kháng nguyên VP28 Vì protein VP28 đượ họn làm kháng nguyên đí h tr ng việ tạ hế phẩm dạng va ine để phòng ngừa bệnh đốm tr ng tôm VP28 biểu thành công E coli (Zhang tập thể, 2002; Sathish tập thể, 2004; Witteveldt tập thể 2004; Jha tập thể, 2005; Caipang tập thể, 2008; Hou tập thể, 2011; Syed-Musthaq tập thể, 2011; Mu tập thể, 2012) Sử dụng VP28 tái tổ hợp biện pháp giúp tăng khả ống sót tơm WSSV Tuy vậy, phương pháp có hạn hế khó áp dụng thực tế protein VP28 không bền vững cho trực tiếp đầm nuôi tôm, việ dụng h tiêm thể nhiều thời gian, ơng ứ hi phí để sản xuất VP28 ũng cao D đó, gần ó ố nghiên cứu tập trung vào việc phát triển dạng vaccine vi khuẩn sống tái tổ hợp biểu VP28 ết thu đượ cho thấy loại bào tử tái tổ hợp VP28 giúp bảo vệ tăng tỷ lệ sống tôm thử nghiệm với WSSV so với tôm hưa dùng bào tử tái tổ hợp VP28 (Fu tập thể, 2010; Ning tập thể, 2011) Tuy kết nghiên cứu bướ đầu, hưa ó loại vaccine thứ nà tạo Vì việc tiếp tục nghiên cứu để tạ vaccine phòng bệnh đốm tr ng cần thiết CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nguyên liệu 2.1.1 Đối tượng 23 mẫu tơm có biểu nhiễm WSSV thu thập từ đầm nuôi tôm địa phương khác (Hải Phòng; Huế; Khánh Hòa; Thành phố Hồ Chí Minh; Só Trăng; Ninh Thuận; Bến Tre; Bình Định, Kiên Giang; Trà Vinh), bảo quản -80oC cồn 95oC Tôm thẻ chân tr ng (2-5g/con) dùng thử nghiệm thử thách khả bảo hộ phòng ngừa WSSV lấy từ Phân viên nghiên cứu nuôi trồng Thủy sản B c Trung thuộc Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 2.1.2 Nguyên liệu Chủng vi khuẩn B subtilis PY79 vector pDG364, pDG364-CotB; pDG364-CotB-GST quà tặng GS Simon Cutting, Đại học Hoàng gia Holloway, London, Vương quố Anh Các chủng vi khuẩn E coli DH5α; E coli BL21 (DE3 RIL mua từ hãng Novagen Vector pET28b hãng Novagen (Mỹ); oligonucleotide hãng Life Technology, kit nhân dòng trực tiếp sản DNA liga e mua từ hãng phẩm PCR pGEM TA easy vàT Promega; thang chuẩn protein, thang chuẩn DNA 1kb 100 bp, hỗn hợp dNTP mua từ hãng Fermentas; Hot-Taq DNA p lymera e mua từ hãng Enzynomics; kit gel mua từ Bioneer; MagPure viral DNA/RNA nan kit mua từ ANABIO R&D; Qiaprep-miniprep kit mua hang Qiagen; lyz zyme mua từ hãng Biobasic Các cặp mồi thiết kế đặc hiệu h đ ạn gen mã hóa cho VP28 virus gây bệnh đốm tr ng WSSV, cotB; cặp mồi đặc hiệu cho vị trí amyE front, amyE back vector pDG 364, cặp mồi vector pGEM T cặp mồi T7 promoter Fw/T7 terminator Rv hãng Life Technology 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Thu nhận virus gây bệnh đốm tr ng từ mẫu tơm nhiễm bệnh 2.2.2 iểm tra ự ó mặt WSSV PCR định lượng WSSV real-time PCR 2.2.3 Nuôi cấy tạo bào tử B subtilis the phương pháp Nicholson Setlow (1990) 2.2.4 Tách chiết DNA kit Qiagen, ANABIO R&D, Định lượng DNA đ độ hấp thụ ánh tử ng ại bướ óng 260 nm 2.2.5 Nhân kiểm tra ự ó mặt gen vp28 PCR 2.2.6 Định lượng pr tein the phương pháp Brad rd (1976) tinh proteinVP28 k lự qua ột Hisbind 2.2 iểm tra độ h pr tein điện di gel p la rylamide ó SDS (SDS-PGAGE) theo Laemmli (1970) 2.2.8 iểm tra ự biểu gen SDS-PA E, thẩm tá h miễn dị h miễn dị h hu nh quang 2.2.9 Thử nghiệm khả phòng bệnh đốm tr ng bào tử B subtilis tái tổ hợp thông qua đánh giá mứ độ ống ót tơm qua thời gian au h nhiễm WSSV hỉ ố h ạt độ phen l xida e, superoxide dismutase Các nghiên cứu Wang tập thể (2008) cho thấy vị trí định kháng nguyên VP28 vị trí từ a id amin 28 đến 93 171đến 20 D A125 , đến dẫn đến thay aspartatic glycine (D42G) T517C dẫn đến thay cysteine arginine (C173R) mẫu thu từ Bến Tre, Bình Định (1), Huế Cần Giờ (2) thành phố Hồ Chí Minh sai khác vị trí định kháng nguyên VP28 cần quan tâm nghiên cứu số 23 trình tự gen vp28 có khác biệt đáng lưu với ký hiệu 05VN.VP28.HCM2.12, VN.VP28.BD2.12 đượ đăng k 06VN.VP28.BD1.11, enBank với mã số (accession number) tương ứng JX444992.1, JX444993.1 JX444994.1 3.2 NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA VP28 3.2.1 Biểu P28 b ng hệ thống vector pET28b E coli Ve t r tái tổ hợp đượ k hiệu pGEM – VP28 đượ tá h dạng tinh h đượ dùng làm khuôn h phản ứng PCR Cặp mồi đặc hiệu (VP28.2 Fw/Rv thiết kế dựa trình tự nu le tide hai đầu gen vp28 ó đưa thêm trình tự nhận biết BamHI đầu HindIII cuối để thuận tiện cho ghép gen vào vector pET28b sau Đ ạn gen vp28 nhân ặp mồi VP28.2 Fw/Rv đượ xử lý HindIII BamHI g n pET28b ũng đượ xử l ùng hai enzyme, dụng enzyme g n T DNA liga e Sản phẩm g n đượ biến nạp vào chủng E coli BL21-RIL Vector tái tổ hợp pET28b-VP28 au đ tách ra, tinh giải trình tự đ ạn gen vp28, sử dụng cặp mồi T7Fw/Rv Kết đọc trình tự khẳng định ch c ch n gen vp28 đưa g n ve t r pET28b trình tự vị trí khung đọ D đó, đủ để khẳng định nhân dịng thành ông gen vp28 vào vector pET28b 11 Kết biểu gen vp28 kiểm tra SDS-PAGE thẩm tách miễn dịch (Hình 3.6) cho thấy dịch chiết tế bào BL21-RIL mang vector pET28b-VP28 có chứa băng pr tein 28 kDa, (Đường chạy 7, 8, 9, Hình A Tr ng đó, mẫu đối chứng âm (tế bào BL21-RIL khơng mang vector pET28b-VP28) khơng ó băng pr tein Kết thẩm tách miễn 925 dịch, sử dụng kháng thể đặc hiệu kháng VP28 ũng h thấy có bp mặt băng pr tein 28 kDa mẫu tương ứng với mẫu SDSPA E (Đường chạy 7, 8, 9, Hình 3.6B) Từ đó, húng tơi kết luận biểu VP28 E coli Hình 3.6: SDS-PAGE (A) thẩm tách miễn dịch (B) kiểm tra biểu VP28 E coli - 1: Dịch đồng tủa tế bào - 7: Dịch đồng tủa tế bào BL21BL21-RIL RI mang pET28b-VP28 - 2: Dịch chiết protein tổng số tế - 8: Dịch chiết protein tổng số tế bào bào BL21-RIL BL21-RIL mang pET28b-VP28 - 3: Dịch hòa phân đoạn tủa tế - 9: Dịch hòa phân đoạn tủa tế bào bào BL21-RIL BL21-RIL mang pET28b-VP28 - 4, 6: không tra mẫu - 5: Protein marker 12 Dịch chiết tế bào có chứa pr tein VP28 (dưới dạng g n với Hi tag) au tinh cách cho s c ký qua cột His-bind Kết kiểm tra độ tinh protein VP28 (Hình 3.7A) cho thấy việc sử dụng cột His-bind tinh sạ h pr tein VP28 thu hiệu tốt hầu hết thành phần protein phức tạp bị loại bỏ hết Tr ng phân đ ạn rửa chiết imidaz l, húng thu băng pr tein ó kí h thước khoảng 28 kDa, tương ứng với kí h thước protein VP28 tái tổ hợp So sánh kết thẩm tách miễn dịch (Hình 3.7B) với kết SDSPAGE cho thấy băng pr tein xuất màng PDVF có kí h thước 28 kDa với phân đ ạn tinh sạ h điện di SDS-PAGE cho phép khẳng định húng tinh ạch thành công protein VP28 Kết định lượng protein cho thấy từ 100 ml dịch nuôi cấy, húng thu tổng số 1,26 mg protein VP28-Histag Protein VP28 tinh sạ h sử dụng làm đối chứng dương tr ng nghiên ứu biểu bề mặt bào tử Hình 3.7: Kết qu SDS-PAGE (A) thẩm tách miễn dịch (B) kiểm tra độ tinh VP28 1: Dịch chiết tế bào có chứa protein VP28lên cột His-bind 2: Dịch rửa cột His-bind đệm A có imidazol mM 3: Dịch rửa cột His-bind đệm A có imidazol 80 mM 13 4: Dịch rửa cột His-bind đệm A có imidazol 100 mM 5: Thang chuẩn p otein 6-9 Dịch rửa chiết cột His-bind đệm A có Imidazol 250 mM 3.2.2 Biểu VP28 dạng dung hợp với protein CotB bề mặt bào tử B subtilis Plasmid pDG364-cotB, pDG364-cotB- ST đượ plasmid pD ó g n thềm gen tB, tạ thành từ tB- ST vị trí enzyme giới hạn BamHI, HindIII Việ dung hợp thêm pr tein ST (26 kDa) ó thể làm tăng khả lộ pr tein ng ại lai bề mặt bà tử B subtilis (Li tập thể, 2008) Vector pDG364-cotB, pDG364-cotB-GST đượ lựa họn để biểu VP28 bề mặt bà tử B subtilis Trong ve t r tái tổ hợp pDG364cotB-VP28, pDG364cotB-GST-VP28 tạ đượ ba gồm vùng pr m ter tB (P tB đ ạn gen ó kí h thướ 825 bp, 1325 bp tương ứng mã hóa h CotB ải biến C tB ó g n ST Đ ạn gen vp28 đượ nhân lên từ p E -VP28 PCR dụng ặp mồi VP28.3 Fw VP28.3 Rv có hứa trình tự HindIII đầu Fw EcoRI đầu Rv để thuận tiện cho việ đưa vector pDG364-cotB, pDG364-cotB-GST au Để đưa đượ đ ạn gen vp28 vào vector pDG364-cotB, pDG364-cotB-GST đ ạn gen VP28 nhân PCR pDG364-cotB pDG364-cotB- ST xử lý HindIII EcoRI để tạ đầu g n tương thí h en ve t r tương ứng đượ g n T4 DNA ligase đượ biến nạp tế bà E coli DH5α Các khuẩn lạc thu sau trình biến nạp kiểm tra phương pháp PCR, với cặp mồi vp28 vector pDG364 ết phân tí h PCR, đọc trình tự cho thấy gen mã hóa VP28 đượ đưa vào vector pDG364-cotB pDG364-cotB- ST trình tự vị trí khung đọ Như vậy, ó thể kết 14 luận húng tạo thành công vector tái tổ hợp pDG364-cotBvp28 pDG364-cotB-GST-vp28 Để dung hợp đ ạn gen cotB-vp28, cotB-GST-vp28 vào hệ gen B subtilis PY79 dựa hế tra đổi chéo kép tương đồng, húng sử dụng enzyme XhoI t mở vòng ve t r au tiến hành biến nạp vào tế bào B subtilis PY79 Kết kiểm tra h ni vi khuẩn đĩa thạch có hứa 1% tinh bột chloramphenicol 5µg/ml cho thấy khuẩn lạ kiểm tra khơng ịn khả tổng hợp amylase thủy phân tinh bột, hứng tỏ đ ạn gen cotB-vp28, cotB-GST-vp28 dung hợp vào hệ gen B subtilis PY79 (Hình 3.10) A B Hình 3.10: Kiểm tra có mặt gen dung hợp DNA hệ gen B subtilis A) Đĩa thạch LB chứa khuẩn lạc B.subtilis mọ mơi trường có kháng sinh CM B) Đĩa (A au lựa chọn cấy chuyển ang đĩa LB+ tinh bột , gạt bỏ khuẩn lạ để kiểm tra vòng phân giải tinh bột 1-30: khuẩn lạc kiểm tra 1-30 ĐC(-): B subtilis PY79 dạng thể dại không chứa đ ạn gen dung hợp Để kiểm tra ch c ch n có mặt gen cotB-vp28, CotB-GSTvp28 hệ gen B subtilis, tiến hành nuôi tách DNA 02 khuẩn lạ dương tính mồi vp28, tB, pD ết phản ứng PCR với cặp , thu kết hoàn toàn phù hợp với tính tốn lý thuyết 15 Từ kết này, kết luận dung hợp thành cơng gen cotB-vp28, CotB-GST-vp28 vào hệ gen B subtilis chủng tái tổ hợp đượ k hiệu B subtilis CotB-VP28 B subtilis CotB-GST-VP28 Một số khuẩn lạc chủng tái tổ hợp CotB-VP28 CotB-GST-VP28 chọn nuôi, tạo bào tử để kiểm tra biểu VP28 So sánh bào tử chủng chuẩn B subtilis PY79 với bào tử chủng CotB-VP28 CotB-GST-VP28, chúng tơi nhận thấy khơng có khác biệt mặt hình thái Bào tử tạo thành chủng đạt 95 Với mụ đí h xá định VP28 có biểu lớp áo bào tử dung hợp với CotB CotB-GST hay không, chúng tơi thu dịch chiết tổng số từ 5× 109 bào tử chủng B subtilis PY79, CotB-VP28 CotBGST-VP28 phân tích ự ó mặt VP28 SDS-PA E thẩm tá h miễn dị h dụng kháng thể đa dịng kháng VP28 Theo tính tốn lý thuyết, protein dung hợp CotB-VP28 có KLPT khoảng 63 kDa (CotB khoảng 35 kDa VP28 kh ảng 28 kDa), tr ng pr tein dung hợp CotB-GST-VP28 ó kí h thước khoảng 89 kDa d ó thêm GST (26 kDa) Hình 13: Kết qu SDS-PAGE (A) thẩm tách miễn dịch (B) kiểm tra biểu VP28 bào tử B subtilis 16 (+ : Đối chứng dương, pr tein VP28 tinh ạch M: Thang chuẩn protein 1: Bào tử B subtilis cotB-vp28 biểu protein CotB-VP28 2: Bào tử B subtilis PY79 chủng chuẩn 3: Bào tử B subtilis cotB-GSTvp28 biểu CotB-GST-VP28 Kết SDS-PAGE thẩm tách miễn dịch (hình 3.13) cho thấy ó xuất băng pr tein với KLPT khoảng 63 kDa dịch chiết bào tử CotB-VP28 (đường chạy băng pr tein với khối lượng phân tử khoảng 89 kDa dịch chiết áo bào tử tương ứng với kí h thước CotB-GST-VP28 (đường chạy Tr ng đó, đường chạy số mẫu bào tử hình thành từ tế bào B subtilis chủng PY79 không xuất băng protein Áp dụng phương pháp dùng phần mềm SCION IMAGE (Nguyễn Thị Vân Anh tập thể, 2013), với lượng VP28 chiết xuất từ 5x109 bào tử CotB-VP28 CotB-GST-VP28 vào khoảng 225 ng, ứ vào KLPT VP28 (27,5 kDa), tính tốn đượ ó khoảng 1000 phân tử VP28 tái tổ hợp đượ biểu bà tử B subtilis Kết này, bướ đầu khẳng định bào tử B subtilis chủng tái tổ hợp biểu protein dung hợp CotB-VP28, CotB-GST-VP28 ết kiểm tra khả biểu protein VP28 GST-VP28 bề mặt bào tử phương pháp miễn dịch hu nh quang (hình 3.14 h thấy, mẫu đối chứng âm mẫu bào tử PY79 thể dại, tín hiệu màu đỏ quan át yếu, khơng rõ Tr ng đó, điều kiện kích thích, mẫu bào tử CotB-VP28, CotB-GST-VP28 cho thấy tín hiệu màu đỏ sáng nét, rõ ràng, chứng tỏ bào tử tái tổ hợp biểu VP28 mạnh nhiều so với dạng bào tử PY79 Như vậy, protein dung 17 hợp CotB-VP28, CotB-GST-VP28 đượ biểu thành ông bề mặt bào tử B subtilis Hình 3.14: Ảnh chụp ết u ph n tích miễn dịch huỳnh quang kiểm tra biểu CotB-VP28 cotB-GST-VP28 bề mặt bào tử B subtilis Ning tập thể (2011) biểu protein VP28 bề mặt bào tử B subtilis sử dụng đ ạn DNA 825 bp mã hóa cho 275 acid amin CotB làm yếu tố dung hợp Mặc dù, mứ độ biểu protein VP28 tr ng nghiên ứu nhóm tá giả kiểm tra điện di gel p lya rylamide không rõ nét, kết thử nghiệm ban đầu khẳng định chế phẩm tạo có khả giúp tôm kháng lại công viru đốm tr ng Các chủng CotB-VP28, CotB-GST-VP28 lấy nuôi cấy tạo bào tử nghiên cứu số tính chất bào tử cho thấy bào tử tái tổ hợp B subtilis cotB-VP28 cotB-GST-VP28 tạo thành tối ưu tr ng môi 18 trường DSM sau 48 đạt mật độ tương ứng 3,1 x 109, 4,2 x 109, bền nhiệt độ 80oC, nồng độ muối 4% chịu pH khoảng từ 2-10, bảo quản điều kiện khơ nhiệt độ ngồi trời (25-37o C) vịng tháng 3.3 HẢ NĂN PHỊN BỆNH ĐỐ TRẮN TRÊN TƠ THẺ CHÂN TRẮN CỦA BÀO TỬ TÁI TỔ HỢP 3.3.1 Sự tồn bào tử B subtilis biểu VP28 ruột tôm thẻ chân trắng Thứ ăn au trộn với bào tử dầu bao áo (chất kết dính) có cảm quan màu s khơng thay đổi, khơng bị dính bết dạng hạt nhỏ riêng rẽ Kết đếm thể hiển mẫu thứ ăn trộn bào kiểm tra chủng vi khuẩn ghi nhãn ản phẩm có nồng độ gần với nồng độ dự kiến ban đầu trộn, khoảng x 109 CFU/gam Kết đánh giá mứ độ sống ót bà tử nồng độ pha lỗng 10-2, ruột tơm (hình 3.22) h thấy h tôm ăn thứ ăn trộn bào tử B subtilis CotBVP28 C tB-GST-V28, mật độ bào tử tr ng ruột tôm tăng dần the thời gian, chứng tỏ tồn bào tử ruột tơm Hình 3.22: Sự tồn bào tử B subtils biểu vp28 ruột tôm thẻ chân trắng 19 3.3.2 Đánh giá h ích thích miễn dịch tơm thẻ chân trắng bào tử tái tổ hợp Để đánh giá khả kí h thí h miễn dịch bào tử tái tổ hợp, h ạt độ enzyme superoxide dismutase (SOD) h ạt độ phenoloxidase (PO) tr ng dị h huyết tương định mẫu tơm thí nghiệm đượ xá ết thu đượ (hình 3.25) h thấy hoạt độ PO tất mẫu tôm cho thứ ăn không bổ sung hay có bổ sung bào tử thể dại PY79, bào tử B subtillis CotB-GST-VP28 CotB-VP28 thấp thời điểm ngày, tăng lên sau 14 ngày tùy theo lô Đáng hú mẫu tôm ăn B subtilis C tB-VP28 ó h ạt độ PO a đáng kể (30%) với mẫu đối hứng Hình 3.25 Hoạt độ phenoloxidase (PO) hemolymph tôm thẻ chân trắng ăn tử tái tổ hợp Kết phân tí h h ạt độ SOD (hình 3.26) mơ thịt tơm cho thấy có tăng h ạt độ SOD the thời gian, hế phẩm B subtilis dạng dại hay tái tổ hợp ó tá dụng làm tăng h ạt độ SOD tôm Đặ biêt, hế phẩm B subtilis C tB- ST-VP28 làm tăng h ạt độ SOD rõ rệt nhất, 20 a ngày tăng 84,3% với đối hứng Tuy nhiên, hưa thấy ó ự biệt rõ rệt mứ tăng h ạt SOD hế phẩm B subtilis CotB-VP28 B subtilis PY79 Hình 3.26 Hoạt độ enzyme SOD mô thịt tôm thẻ chân trắng 3.3.3 Đánh giá h o hộ tôm thẻ chân trắng bào tử tái tổ hợp WSSV đượ phân lập từ nguồn tôm bệnh trang trại nuôi tôm Điền Hương, Ph ng Điền, Huế ẫu tôm bệnh đượ kiểm tra PCR để khẳng định nhiễm WSSV trướ tiến hành hiết viru Bằng phương pháp Real-time PCR húng xá định số copy WSSV dịch nghiên ứu khoảng 7,73 x108 copy/ml Tôm đượ h nhiễm WSSV để xá định liều gây chết 75% (LD75) Kết thu từ thí nghiệm h thấy liều LD75 1,3x104 a /lít Nhằm xá định khả phòng bệnh đốm tr ng tôm thẻ chân tr ng bào tử B subtilis CotB-VP28 C tB- ST-VP28, tôm đượ thứ ăn the h ăn ông thứ : lô đối chứng âm, lô đối chứng dương ăn thức ăn công nghiệp, cịn lơ PY79, cotB-VP28 cotB-GST-VP28 ăn thức 21 ăn ông nghiệp bổ xung loại bào tử tương ứng với độ 109 Các lô lặp lại lần lần thử nghiệm Sau ngày, trừ lơ đối chứng âm tất ả lơ tơm cịn lại đượ ông ường độc WSSV với nồng độ 1,3x104 a /lít Tơm tiếp tụ h ăn thứ ăn thử nghiệm tương ứng theo dõi số lượng tơm ịn ống 14 Kết theo dõi q trình ni tơm đánh giá ố tơm ống ót qua thí nghiệm (hình 3.32) cho thấy tơm lơ đối hứng dương ó biểu ăn b t đầu hết au ngày Tỷ lệ hết tăng nhanh từ ngày thứ đến ngày thứ 100% tôm hết ngày 11 au ường độ Tại lô thử nghiệm cho tơm ăn thứ ăn ó bổ sung bà tử PY 9, tơm ó tượng ăn ngày thứ Tỷ lệ tôm hết tăng nhanh từ ngày thứ đến ngày thứ 11, tỷ lệ hết lên tới 94,5% sau 14 ngày Tại lô h ăn thứ ăn trộn bào tử cotBVP28, cotB-GST-VP28 lô đối chứng âm tỷ lệ chết sau 14 ngày theo ghi nhận đượ tương ứng 19,23%, 26,67% 25,81% Hình 3.32 Tỷ lệ chết tích lũy lơ tơm đánh giá h hộ bào tử B subtilis tái tổ hợp 22 o Như vậy, ó thể thấy rằng, mứ độ bảo hộ tôm thẻ chân tr ng hống lại WSSV dạng bảo tử CotB-VP28 CotB-GST-VP28 (ở mật độ bào tử x 109 CFU/g thứ ăn) tương ứng 81% 73,3% Các giá trị cao mức hiệu quy ướ (RPP≥ kiểm định hiểu bảo vệ vaccine thủy sản thỏa mãn điều kiện đánh giá hiệu vaccine dùng cho thủy sản Ủy ban châu Âu D hế phẩm thử nghiệm có tiềm bảo vệ tơm chống lại bệnh đốm tr ng WSSV gây Nhìn lại, húng thấy hế phẩm bà tử B subtilis C tB-VP28 C tB-GST-VP28 tạ tr ng nghiên ứu thể tính bền với nhiệt, ổn định tr ng dải pH rộng (2-10), hịu đượ nồng độ muối a (4%) Cá hế phẩm ó khả kí h thí h đáp ứng miễn dị h tôm thẻ hân tr ng đượ trộn thứ ăn nuôi tôm thể khả bả hộ tôm hống lại viru gây bênh đốm tr ng mứ độ tốt (trên 70 Những tính hất hế phẩm B subtilis C tB-VP28 C tB- ST-VP28 tạ để phát triển va ine dạng pr bi ti dùng phòng bệnh đốm tr ng h tôm 23 KẾT LUẬN Đã nhân bản, nhân dịng xá định trình tự gen mã hóa cho protein VP28 (615 bp) từ 23 mẫu tôm bị bệnh đốm tr ng địa phương Việt Nam phát sai khác nucleotide (A125G, A183G, A226G, A403G, T517C) so với trình tự gen ơng bố (AY168644) Trong số sai khác nucleotide, có sai khác dẫn đến sai khác acid amin Đã biểu thành cơng gen mã hóa VP28 E coli dạng VP28-His-tag tạ chế phẩm bào tử Bacillus subtilis tái tổ hợp với biểu VP28, GST-VP28 bề mặt bào tử dạng dung hợp với CotB B subtilis Bào tử tái tổ hợp B subtilis cotB-VP28 cotB-GST-VP28 tạo thành tối ưu tr ng môi trường DSM sau 48 đạt mật độ tương ứng 3,1 x 109, 4,2 x 109, bền nhiệt độ 80oC, nồng độ muối 4% chịu pH khoảng từ 2-10, bảo quản điều kiện khô nhiệt độ ngồi trời (25-37o C) vịng tháng Đã xá định dạng thứ ăn, h thứ h tôm ăn thứ ăn trộn bào tử B subtilis tái tổ hợp chứng minh tồn bào tử ruột tôm Thử nghiệm bướ đầu cho thấy bào tử B subtilis dạng mang CotBVP28 CotB-GST-VP28 có khả làm tăng h ạt độ phenoloxidase superoxide dismutase tôm thẻ chân tr ng có khả bảo vệ tơm chống lại WSSV mức bảo hộ tương ứng 81% 73,3% KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu khả phòng bệnh đốm tr ng tôm chế phẩm bào tử Bacillus subtilis cotB-VP28 cotB-GST-VP28 24 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Pham Kien Cuong, Bui Thu Thuy, Nguyen Viet Dung, Bui Thi Ngoc Anh, Nguyen Thi Van Anh, Simon Cutting, Phan Tuan Nghia (2012), "Polymorphism analysis of capsid protein VP28 encoding gene of white spot syndrome virus isolated from Penaeus monodon shrimp in Viet Nam", VNU Journal of Science 28(2S), pp 88-95 Anh Thi Van Nguyen, Cuong Kien Pham, Huong Thi Thu Pham, Hang Luong Pham, Anh Hoa Nguyen, Lua Thi Dang, Hong Huynh Anh, Simon Cutting, Tuan-Nghia Phan (2014), "Bacillus subtilis Spores Expressing the VP28 Antigen:A Potential Oral Treatment to Protect Litopenaeus vannamei Against White Spot Syndrome", FEMS Microbiology Letters 358, pp 202–208 Phạm Kiên Cường, Bùi Thị Ngọc Ánh, Trần Thi Thanh Qu nh, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Thị Việt Hà, Phạm Thị Lương Hằng, Nguyễn Thị Hồng Loan, Nguyễn Hòa Anh, Phan Tuấn Nghĩa (201 , "Nhân dòng biểu gen mã hóa kháng nguyên VP28 virus đốm tr ng lớp áo ngồi bào tử B subtilis", Tạp chí Công nghệ Sinh học 12(2), pp 247-253 Báo cáo hội nghị đ đăng Phan Tuan Nghia, Pham Kien Cuong, Bui Ngoc Anh, Tran Thi Thanh Quynh, Pham Thi Nga, Nguyen Thi Van Anh, Nguyen Hoa Anh (2013), "Genetically engineered Bacillus spores expressing VP28 as vaccine-probiotics against white spot syndrome virus in shrimps", International Conference on Probiotics and their Applications, May 31 -June 2013, in Hanoi, pp 12 Pham Kien Cuong, Nguyen Thi Hong Loan, Pham Thi Thu Huong, Pham Luong Hang, Nguyen Hoa Anh, Dang Thi Lua, Nguyen Thi Van Anh, Simon Cutting, Phan Tuan Nghia (2014), "Cloning and expression of VP28 on Bacillus subtilis spores for application as probiotics to induce protection of Penaeus vannamei against white spot syndrome virus", 6th European Spore Conference, April 9-11, in London, pp 59 Tran Thi Tuyet Hoa, Hong Mong Huyen, Pham Kien Cuong, Phan Tuan Nghia (2014), "Protection against white spot syndrome virus infection in Penaeus monodon by oral administration of VP28-Bacillus subtilis", The 9th Symposium on Diseases in Asian Aquaculture (DAA9), 24 - 28 November 2014, in Ho Chi Minh , pp 218 25 ... nhân dòng biểu bề mặt bào tử Bacillus subtilis gen mã hóa kháng nguyên VP28 virus gây bệnh đốm trắng tôm? ?? để tạ bào tử Bacillus subtilis biểu kháng nguyên VP28 virus gây bệnh đốm tr ng làm cho... Bacillus subtilis tái tổ hợp biểu gen mã hóa protein kháng nguyên VP28 WSSV bề mặt bào tử - Bướ đầu đánh giá khả phòng bệnh đốm tr ng tôm thẻ chân tr ng chế phẩm bào tử B subtilis biểu VP28 bề mặt. .. Xây dựng quy trình biểu gen mã hóa cho VP28 bề mặt bào tử Bacillus subtilis - Nghiên cứu thử nghiệm khả phòng bệnh đốm tr ng tôm thẻ chân tr ng h tôm ăn thứ ăn trộn bào tử Bacillus subtilis biểu