tóm tắt luận án tiến sĩ nghiên cứu nhân dòng và biểu hiện trên bề mặt bào tử bacillus subtilis gen mã hóa kháng nguyên VP28 của virus gây bệnh đốm trắng ở tôm”
Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống
1
/ 27 trang
THÔNG TIN TÀI LIỆU
Thông tin cơ bản
Định dạng
Số trang
27
Dung lượng
651,68 KB
Nội dung
I HC QUC GIA HÀ NI I HC KHOA HC T NHIÊN Phng NHÂN DÒNG VÀ BIU HIN TRÊN B MT BÀO T BACILLUS SUBTILIS GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN VP28 CA VIRUS GÂY BM TRNG TÔM Chuyên ngành: Hóa sinh hc Mã s: 62 42 01 16 D THO TÓM TT LUN ÁN TIC HÀ NI - 2014 2 c hoàn thành ti: i hc Khoa hc T i hc Quc gia Hà Ni ng dn khoa hc: GS.TS. Phan Tu PGS.TS. Nguyn Th Vân Anh Phn bin 1: Phn bin 2: Phn bin 3: Lun án s c bo v ti Hng chm lun án ci hc Quc gia hp ti: i hc Khoa hc T nhiên vào hi gi5 Có th tìm hiu lun án ti: - n Quc gia Vit Nam, - Trung tâm thông tin - i hc Quc gia Hà Ni 1 M U 1. Tính cp thit c tài Nuôi tôm Vin mnh trong nh và tr thành ngành kinh t quan trng. Tuy nhiên, ngành nuôi trng tôm Vit Nam hi c nhi ch bnh, cht ng tôm ging sa sút. S bùng n ca các dch bnh nghiêm trng do virus (WSSV), m sng tôm, gây thit hi ln v kinh t. Nhiu nghiên cu trên th gic ti tìm ra gii pháp hiu qu chng l t qu c còn hn ch. Mt ng nghiên cc nhiu nhà khoa hc trên th gin là to các vaccine da trên protein cu trúc c ng min dch tôm chng li bm trng. VP28 là mt loi protein v chính ca WSSV, o giúp virus gc hiu lên t bào c khu cho quá trình lây nhim. Chính vì vy, VP28 là c la ch to kháng th cho vaccine cho tôm phòng b m trng (Rout và tp th, 2007; Witteveldt và tp th, 2004). Tuy nhiên, nhng kt qu nghiên cu to vaccine phòng bm trng do WSSV mi dng li mc th nghim nh lc mt vaccine chính thc, hiu qu. i “Nghiên cứu nhân dòng và biểu hiện trên bề mặt bào tử Bacillus subtilis gen mã hóa kháng nguyên VP28 của virus gây bệnh đốm trắng ở tôm” bào t Bacillus subtilis biu hin kháng nguyên VP28 ca virus gây bm trng làm cho vic sn xut vaccine dng probiotic bn nhit giúp phòng bm trng trên tôm. 2 2. Mc tiêu nghiên cu c tài - nh c trình t và mt s a gen VP28 t các mu WSSV phân lc a bàn nuôi tôm ch yu ca Vit Nam. - T c chng Bacillus subtilis tái t hp biu hin gen mã hóa protein kháng nguyên VP28 ca WSSV trên b mt bào t. - c kh m trng trên tôm th chân trng ca ch phm bào t B. subtilis biu hin VP28 trên b mt. ng và ni dung nghiên cu c tài ng nghiên cu c tài: Gen mã hóa protein VP28 ca virus gây bm trng tôm. Ni dung nghiên cu c tài: - nh trình t và mt s a gen vp28 t các mu WSSV phân lc Vit Nam. - Xây dng quy trình biu hin gen mã hóa cho VP28 trên b mt bào t Bacillus subtilis. - Nghiên cu th nghim kh m trng trên tôm th chân tr n bào t Bacillus subtilis biu hin VP28. m thc hi tài Các nghiên cu ca luc thc hin ch yu ti Phòng Thí nghim trm Công ngh i hc Khoa hc T i hc Quc gia Hà Ni. Phn th nghim kh o h tôm th chân trng phòng bnh m trc thc hin vi s h tr, hp tác ca Vin Nghiên cu nuôi trng Thy sn I. 3 i c tài - Công trình nghiên cu có tính h thng t vic nhân bn, nhân dòng và biu hin gen mã hóa protein VP28 tái t hp E. coli và Bacillus subtilis nh trình t và mt s a gen VP28 t các mu WSSV phân lc Vit Nam. - Nghiên cu biu hin thành công gen mã hóa protein VP28 ca WSSV trên b mt bào t B. subtilis i dng các cu trúc protein dung hp CotB-VP28 và CotB-GST-, CotB là protein v ca B. subtilis và GST (Glutathione S Transferase) là protein trung gian nhm hn ch cn tr i vi VP28. - tu kin thu nhn bào t tái t hp B. subtilis biu hin tt kháng nguyên VP28 ca WSSV trên b mt bào t và nghiên cu các tính cht ca bào t tái t hp B. subtilis CotB-VP28, CotB-GST- VP28 trong mt s u king khác nhau. - c ho ca các enzyme phenoloxidase (PO), superoxide dismutase (SOD) phn ánh min dch ca tôm th m trng trên tôm 70% ca bào t B. subtilis biu hin VP28 trên b mt. 6. ng dng thc tin c tài - Kt qu nghiên cu c to ch phm probiotic dng bào t B. subtilis tái t hp bn nhit, biu hin VP28 trên bn mt, có kh ng min dch và bo v tôm khi nhim bm trng, giúp góp phn kim soát dch bnh trên tôm. - Thành công c tài s là ti cho vic phát trin các vaccine tái t hp dng bào t B. subtilis tái t hp có kh nh do các vi sinh vt khác gây ra tôm. 4 7. B cc ca lun án Lun án gm 120 trang bao gm: Phn m u (3 trang); Tng quan tài liu (40 trang); u (19 trang); Kt qu và tho lun (39 trang); Kt lun và kin ngh (1 trang), Các công trình khoa hc ca tác gi n lun án (1 trang), Tài liu tham kho (16 trang122 tài liu gm 2 th ting ting Vit () và ting Anh (). Lun án có 15 bng, 43 hình. 5 NG QUAN TÀI LIU 1.1. Gii thiu chung v virus gây bm trng tôm Virus gây bm trng (White Spot Syndrome Virus ) thuc h Nimaviridae và chi Whispovirus (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTV/). VP28, mã hóa (ORF) 421 bp (wsv421), là mt protein v quan trng, t quan trng trong nhu tiên ca quá trình nhim WSSV vào tôm (Van Hulten và tp th, 2001). i pháp hiu qu ngn nga s tn công ca loi virus này tôm. 1.2. Nghiên cu to vaccine da trên kháng nguyên v WSSV Tôm thu min dch , t s nghiên cu gy có kh c hic kích thích bi các dng kháng nguyên VP28. protein VP28 . c biu hin thành công E. coli (Zhang và tp th, 2002; Sathish và tp th, 2004; Witteveldt và tp th 2004; Jha và tp th, 2005; Caipang và tp th, 2008; Hou và tp th, 2011; Syed-Musthaq và tp th, 2011; Mu và tp th, 2012). S dng VP28 là mt bi ng sót ci vi WSSV. , y có là khó áp dng trên thc t do protein VP28 không bn vng nc cho trc tim nuôi tôm sn xut cao. nghiên cu tp trung vào vic phát trin các dng vaccine vi khun sng tái t hp biu hin VP28. cho thy rng các loi bào t tái t hp VP28 giúp bo v l 6 sng ca tôm khi th nghim vi WSSV so vc dùng bào t tái t hp VP28 (Fu và tp th, 2010; Ning và tp th, 2011). Tuy vy các kt qu nghiên cu mi ch t loi vaccine chính thc to ra. Vì vy vic tip tc nghiên c tc vaccine phòng bm trng là ht sc cn thit. 7 NG, NGUYÊN LIU VÀ U ng và nguyên liu 2.1.1. Đối tượng 23 mu tôm có biu hin nhim WSSV c thu thp t các m nuôi tôm ti các c nhau (Hi Phòng; Hu; Khánh Hòa; Thành ph H Chí Minh; ; Ninh Thun; Bn Tre; nh, Kiên Giang; Trà Vinh), c bo qun -80 o C hoc trong cn 95 o C. Tôm th chân trng (2-5g/con) dùng trong th nghim th thách kh o h phòng nga WSSV c Phân viên nghiên cu nuôi trng Thy sn Bc Trung b thuc Vin nghiên cu nuôi trng thy sn 1. 2.1.2. Nguyên liệu Chng vi khun B. subtilis PY79 và vector pDG364, pDG364-CotB; pDG364-CotB-GST là quà tng ca GS. Simon Cutting, i hc Hoàng gia Holloway, London, Anh. Các chng vi khun E. coli E. coli c mua t hãng Novagen. Vector pET28b ca hãng Novagen (M); các oligonucleotide ca hãng Life Technology, kit nhân dòng trc tip sn phm PCR pGEM TA easy và c mua t hãng Promega; thang chun protein, thang chun DNA 1kb và 100 bp, hn hp c mua t hãng Fermentas; Hot- c mua t hãng Enzynomics; kit thôi gel c mua t Bioneer; MagPure viral DNA/RNc mua t ANABIO R&D; Qiaprep-miniprep c mua cc mua t hãng Biobasic. Các cp m c thit k c hi n gen mã hóa cho VP28 ca virus gây bm trng WSSV, cotB; cp mc hiu cho v 8 trí amyE front, amyE back ca vector pDG 364, cp mi ca vector pGEM T và cp mi T7 promoter Fw/T7 terminator Rv ca hãng Life Technology. u 2.2.1. Thu nhn virus gây bm trng t mu tôm nhim bnh 2.2 -time PCR 2.2.3. Nuôi cy to bào t B. subtilis Nicholson và Setlow (1990) 2.2.4. Tách chit, ANABIO R&D, ng DNA 260 nm 2.2.5. vp28 2.2.6. ng (1976) và tinh sch proteinVP28t Hisbind 2.2 (SDS-PGAGE) theo Laemmli (1970) 2.2 - 2.2.9. Th nghim kh m trng ca bào t B. subtilis tái t hp , superoxide dismutase. [...]... 5x109 bào tử CotB -VP28 và CotB-GST -VP28 vào khoảng 225 ng, căn ứ vào KLPT của VP28 (27,5 kDa), có thể tính toán đượ rằng ó khoảng 1000 phân tử VP28 tái tổ hợp đượ biểu hiện trên một bà tử B subtilis Kết quả này, bướ đầu khẳng định bào tử B subtilis của 2 chủng tái tổ hợp đã biểu hiện protein dung hợp CotB -VP28, CotB-GST -VP28 ết quả kiểm tra khả năng biểu hiện protein VP28 và GST -VP28 trên bề mặt bào tử. .. CotB-GST -VP28 Một số khuẩn lạc của 2 chủng tái tổ hợp CotB -VP28 và CotB-GST -VP28 được chọn nuôi, tạo bào tử để kiểm tra sự biểu hiện của VP28 So sánh bào tử của chủng chuẩn B subtilis PY79 với bào tử của chủng CotB -VP28 và CotB-GST -VP28, chúng tôi nhận thấy không có sự khác biệt về mặt hình thái Bào tử tạo thành bởi 3 chủng đều đạt hơn 95 Với mụ đí h xá định VP28 có biểu hiện trên lớp áo của bào tử và dung... ông trên bề mặt bào tử B subtilis Hình 3.14: Ảnh chụp ết u ph n tích miễn dịch huỳnh quang kiểm tra biểu hiện CotB -VP28 và cotB-GST -VP28 trên bề mặt bào tử B subtilis Ning và tập thể (2011) đã biểu hiện protein VP28 trên bề mặt của bào tử B subtilis sử dụng một đ ạn DNA 825 bp mã hóa cho 275 acid amin đầu tiên của CotB làm yếu tố dung hợp Mặc dù, mứ độ biểu hiện của protein VP28 tr ng nghiên ứu ủa... amin 2 Đã biểu hiện thành công gen mã hóa VP28 ở E coli dưới dạng VP28- His-tag và tạ được chế phẩm bào tử Bacillus subtilis tái tổ hợp với sự biểu hiện VP28, GST -VP28 trên bề mặt bào tử dưới dạng dung hợp với CotB của B subtilis 3 Bào tử tái tổ hợp B subtilis cotB -VP28 và cotB-GST -VP28 được tạo thành tối ưu tr ng môi trường DSM sau 48 giờ và đạt mật độ tương ứng là 3,1 x 109, 4,2 x 109, bền ở nhiệt độ... qu SDS-PAGE (A) và thẩm tách miễn dịch (B) kiểm tra sự biểu hiện VP28 trên bào tử B subtilis 16 (+ : Đối chứng dương, pr tein VP28 tinh ạch M: Thang chuẩn protein 1: Bào tử B subtilis cotB -vp28 biểu hiện protein CotB -VP28 2: Bào tử B subtilis PY79 chủng chuẩn 3: Bào tử B subtilis cotB-GSTvp28 biểu hiện CotB-GST -VP28 Kết quả SDS-PAGE và thẩm tách miễn dịch (hình 3.13) cho thấy ó sự xuất hiện băng pr tein... rằng húng tôi đã nhân bản thành ông đ ạn gen mã hóa cho VP28 từ DNA hệ gen của tôm nhiễm viru đốm tr ng 3.1.2 Xác định trình tự và nghiên cứu tính đa hình của gen mã hóa VP28 Đ ạn gen nhân bản bằng PCR ủa á mẫu nghiên ứu đã đượ nhân dòng vào ve t r p E T tạ ra dạng ve t r tái tổ hợp p E -VP28 và au 9 đó á gen vp28 tr ng ve t r tái tổ hợp đã đượ xá định trình tự hi ánh trình nu le tide và trình tự a id... vị trí quyết định kháng nguyên của VP28 và rất cần được quan tâm trong các nghiên cứu tiếp theo 3 trong số 23 trình tự gen vp28 có những khác biệt đáng lưu với các ký hiệu 05VN .VP28. HCM2.12, 0 VN .VP28. BD2.12 đã đượ đăng k trên 06VN .VP28. BD1.11, enBank với các mã số (accession number) tương ứng là JX444992.1, JX444993.1 và JX444994.1 3.2 NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA VP28 3.2.1 Biểu hiện P28 b ng hệ... có khả năng giúp tôm kháng lại sự tấn công của viru đốm tr ng Các chủng CotB -VP28, CotB-GST -VP28 được lấy ra và nuôi cấy tạo bào tử và nghiên cứu một số tính chất của bào tử cho thấy bào tử tái tổ hợp B subtilis cotB -VP28 và cotB-GST -VP28 được tạo thành tối ưu tr ng môi 18 trường DSM sau 48 giờ và đạt mật độ tương ứng là 3,1 x 109, 4,2 x 109, bền ở nhiệt độ 80oC, nồng độ muối 4% và chịu được pH trong... đượ lựa họn để biểu hiện VP28 trên bề mặt bà tử B subtilis Trong ve t r tái tổ hợp pDG364cotB -VP28, pDG364cotB-GST -VP28 tạ đượ đã ba gồm những vùng pr m ter tB (P tB và đ ạn gen ó kí h thướ 825 bp, 1325 bp tương ứng mã hóa h CotB ải biến và C tB ó g n ST Đ ạn gen vp28 đượ nhân lên từ p E -VP28 bằng PCR ử dụng ặp mồi VP28. 3 Fw và VP28. 3 Rv có hứa trình tự ủa HindIII ở đầu Fw và EcoRI ở đầu Rv để thuận... PCR, với cặp mồi của vp28 và của vector pDG364 ết quả phân tí h PCR, đọc trình tự cho thấy gen mã hóa VP28 đã đượ đưa vào vector pDG364-cotB và pDG364-cotB- ST đúng trình tự và vị trí khung đọ Như vậy, ó thể kết 14 luận rằng húng tôi đã tạo thành công vector tái tổ hợp pDG364-cotBvp28 và pDG364-cotB-GST -vp28 Để dung hợp đ ạn gen cotB -vp28, cotB-GST -vp28 vào hệ gen của B subtilis PY79 dựa trên ơ hế tra . Nghiên cứu nhân dòng và biểu hiện trên bề mặt bào tử Bacillus subtilis gen mã hóa kháng nguyên VP28 của virus gây bệnh đốm trắng ở tôm” bào t Bacillus subtilis biu hin kháng nguyên. Phng NHÂN DÒNG VÀ BIU HIN TRÊN B MT BÀO T BACILLUS SUBTILIS GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN VP28 CA VIRUS GÂY BM TRNG TÔM Chuyên ngành: Hóa sinh hc Mã s: 62 42 01. vi VP28. - tu kin thu nhn bào t tái t hp B. subtilis biu hin tt kháng nguyên VP28 ca WSSV trên b mt bào t và nghiên cu các tính cht ca bào t tái t hp B. subtilis