Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây đậu xanh (vigna radiata (l ) wilczek) phục vụ cho chuyển gene (LV00409)

1 LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn TS Lê Xuân Đắc, Viện Công nghệ sinh học, Viện khoa học Công nghệ Việt Nam tận tình giúp đỡ, hướng dẫn trình thực luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn GS.TS Lê Trần Bình, TS Chu Hoàng Hà, toàn thể cán phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho hoàn thành luận văn Tôi xin cảm ơn PSG.TS Đinh Thị Kim Nhung, TS Điêu Mai Hoa thầy cô giáo trường Đại học sư phạm Hà Nội truyền đạt kiến thức kinh nghiệm nghiên cứu khoa học cho suốt thời gian học làm đề tài luận văn Cuối xin cảm ơn gia đình bạn bè động viên, khích lệ, giúp đỡ trình học tập Tác giả Hoàng Thị Thúy Lời cam đoan Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu kết nghiên cứu luận văn hoàn toàn trung thực chưa công bố công trình khác Hà Nội, ngày tháng Tác giả Hoàng Thị Thúy năm 2010 MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình vẽ, đồ thị MỞ ĐẦU Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY ĐẬU XANH 1.1.1 Nguồn gốc, phân loại đặc điểm sinh học đậu xanh 1.1.2 Đặc điểm sinh hoá đậu xanh 1.1.3 Tình hình sản xuất đậu xanh giới Việt Nam 1.2 ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG CẢI TIẾN GIỐNG CÂY TRỒNG 1.2.1 Lịch sử phát triển nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.2.2 Cơ sở khoa học kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật 1.2.3 Điều kiện môi trường nuôi cấy tế bào thực vật 11 1.2.4 Hệ thống nuôi cấy tái sinh 18 1.2.5 Những tồn kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào phương hướng 20 giải 1.3 TÌNH HÌNH SẢN XUẤT VÀ NGHIÊN CỨU HỆ THỐNG TÁI SINH ĐẬU XANH TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 21 1.3.1 Một số thành tựu nuôi cấy mô, tế bào thực vật nước 21 1.3.2 Nghiên cứu hệ thống tái sinh đậu xanh 23 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 25 2.1 VẬT LIỆU 25 2.1.1 Vật liệu thực vật 25 2.1.2 Hoá chất thiết bị 25 2.2 PHƯƠNG PHÁP 26 2.2.1 Khử trùng hạt, tạo nuôi in vitro 27 2.2.2 Tái sinh đậu xanh thông qua mô sẹo 27 2.2.3 Tạo đa chồi đậu xanh 29 2.2.4 Môi trường kéo dài chồi 30 2.2.5 Môi trường tạo hoàn chỉnh 31 2.2.6 Phương pháp 31 2.2.7 Phương pháp xử lý kết tính toán số liệu 32 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH CÂY ĐẬU XANH THÔNG QUA MÔ SẸO 33 3.1.1 Tạo mẫu đậu xanh in vitro 33 3.1.2 Cảm ứng tạo mô sẹo đậu xanh 35 3.2 TẠO ĐA CHỒI IN VITRO 40 3.2.1 Tạo đa chồi từ mầm 40 3.2.2 Tạo đa chồi từ chồi 42 3.2.3 Tạo đa chồi từ đốt thân 44 3.3 MÔI TRƯỜNG KÉO DÀI CHỒI 45 3.4 NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA IBA VÀ NAA ĐẾN KHẢ NĂNG TẠO RỄ 47 3.5 NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN RA RỄ TỚI SỨC SỐNG CỦA CÂY 49 3.6 NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA GIÁ THỂ TỚI SỨC SỐNG CỦA CÂY 51 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC 60 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Danh mục bảng Trang 2.1 Đặc điểm giống đậu xanh nghiên cứu 25 2.2 Nồng độ 2,4D công thức môi trường tạo mô sẹo 28 2.3 Môi trường tạo đa chồi 30 2.4 Môi trường kéo dài chồi 31 2.5 Công thức môi trường rễ đậu xanh 31 3.1 34 Kết tạo vật liệu vô trùng sau ngày nuôi cấy 3.2 Ảnh hưởng 2,4-D đến khả tạo mô sẹo từ mảnh sau tuần nuôi cấy 36 3.3 38 Ảnh hưởng 2,4-D đến khả tạo mô sẹo từ thân sau tuần nuôi cấy 3.4 Ảnh hưởng chất KTST đến khả tạo đa chồi từ nốt mầm 41 3.5 44 Ảnh hưởng chất KTST đến khả tạo đa chồi đốt thân đậu xanh 3.6 Ảnh hưởng GA3 tới khả kéo dài chồi 45 3.7 Ảnh hưởng IBA NAA tới khả hình thành rễ 47 3.8 50 Ảnh hưởng thời gian rễ tới tỷ lệ sống (%) 3.9 Ảnh hưởng giá thể tới sức sống đậu xanh 51 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Danh mục hình vẽ, đồ thị Trang 2.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 26 3.1 Cây mầm đậu xanh môi trường CT3 35 3.2 Tạo mô sẹo từ mảnh môi trường H3 37 3.3 Mô sẹo từ thân mầm môi trường H3 38 3.4 Ảnh hưởng 2,4D đến khả tạo mô sẹo từ thân 38 3.5 Mô sẹo từ mảnh môi trường tái sinh 3.6 Mô sẹo từ thân môi trường tái sinh tuần 40 40 3.7 Tạo đa chồi từ nốt mầm môi trường T5 3.8 Hệ số tạo chồi từ nốt mầm 41 41 3.9 Ảnh hưởng chất KTST đến khả tạo đa chồi từ chồi 3.10 Tạo đa chồi môi trường T5 3.11 Tạo đa chồi môi trường T8 42 43 43 3.12 Tạo đa chồi từ đốt thân môi trường T5 45 3.13 Hệ số tạo chồi từ đốt thân 45 3.14 Ảnh hưởng GA3 tới khả kéo dài chồi 3.15 Kéo dài chồi đậu xanh từ nốt mầm môi trường K2 46 46 3.16 Tạo rễ môi trường R1 3.17 Tạo hoàn chỉnh 48 48 3.18 Tạo rễ môi trường R4 (12 ngày) 49 3.19 Tạo rễ môi trường R4 (12 ngày) 49 3.20 Tạo rễ môi trường R4 (17 ngày) 3.21 Tạo rễ môi trường R1 (17 ngày) 49 49 3.22 Ảnh hưởng thời gian rễ tới sức sống 3.23 Cây đậu xanh tái sinh trồng trấu hun 3.24 Cây tái sinh trồng cát 50 50 52 3.25 Cây tái sinh trồng cát + trấu hun 52 3.26 Cây tái sinh trồng trấu hun 52 3.27 Cây đậu xanh tái sinh hoa kết 52 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,4 - D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid BAP 6-benzylaminopurine CS Cộng CTMT Công thức môi trường GA3 Gibberellin acid Kinetin 6-furfurylaminopurine KTST Kích thích sinh trưởng MS Môi trường MS NAA α-Naphthaleneacetic acid MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Cây đậu xanh Vigna radiata (L.) Wilczek họ đậu ngắn ngày có giá trị kinh tế dinh dưỡng cao Trong hệ thống sản xuất lương thực thực phẩm nước ta nay, đậu xanh có vị trí quan trọng cấu luân canh, xen canh gối vụ Đặc biệt tỉnh Bắc Trung bộ, Đông Nam Tây Nguyên, đậu xanh trở thành trồng sản xuất vụ Hè Tình hình sản xuất, tiêu thụ chế biến đậu xanh nước ta có chiều hướng gia tăng, nhờ khai thác số ưu điểm quan trọng đậu xanh Đó khả cung cấp dinh dưỡng cao, dễ tiêu hoá Ngoài đậu xanh dùng để chữa bệnh, theo sách Nam dược thần hiệu đại danh y Tuệ Tĩnh đậu xanh có vị ngọt, tính hàn, không độc, bổ nguyên khí, nhiệt Thân đậu xanh dùng làm phân hữu góp phần cải tạo đất, tăng độ phì điều kiện xen canh, luân canh Khả cải tạo bồi dưỡng đất nhờ cộng sinh vi khuẩn nốt sần với hệ rễ [7] Tuy nhiên, suất đậu xanh nước ta thấp, giống đậu xanh nghèo nàn, đồng thời biện pháp kỹ thuật chưa nông dân áp dụng đầu tư Chính nghiên cứu chọn tạo giống đậu xanh có suất cao, kháng bệnh, chống chịu tốt với điều kiện bất lợi, thời gian chín tập trung… vấn đề có ý nghĩa thực tiễn quan trọng Trong công tác chọn giống trồng nói chung chọn giống đậu xanh nói riêng nhà khoa học sử dụng phương pháp đột biến thực nghiệm [7], [8] để tạo nguồn biến dị làm nguyên liệu cho trình chọn lọc Hiện nay, kỹ thuật quan tâm ứng dụng vào chọn tạo giống đậu xanh sử dụng công nghệ tế bào thực vật xây dựng hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gene nhằm cải tiến, nâng cao khả chống chịu đậu xanh [21], [22], [24], [33], [34], [35], [38] … Đến nhà khoa học khẳng định mức độ thành công chuyển gene vào trồng phụ thuộc nhiều vào hệ thống nuôi cấy tái sinh tế bào thành in vitro sau chuyển gene Mặc dù vậy, Việt Nam việc xây dựng hệ thống tái sinh đậu xanh vấn đề cần tiếp tục nghiên cứu Chính tiến hành thực đề tài “Nghiên cứu hệ thống tái sinh đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek) phục vụ cho chuyển gene” Mục đích nghiên cứu - Xây dựng hệ thống tái sinh đậu xanh phục vụ cho chuyển gene Nhiệm vụ nghiên cứu - Nghiên cứu điều kiện khử trùng hạt đậu xanh - Nghiên cứu hệ thống tái sinh đậu xanh thông qua mô sẹo - Nghiên cứu ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng (KTST) tới khả tạo đa chồi từ nốt mầm, chồi ngọn, đốt thân, khả kéo dài chồi - Xác định ảnh hưởng IBA NAA tới khả rễ chồi đậu xanh - Xác định giá thể phù hợp cho sinh trưởng phát triển đậu xanh nuôi cấy mô giai đoạn vườn ươm Đối tượng phạm vi nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: Hai giống đậu xanh ĐX11 V123 - Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu hệ thống tái sinh đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek) phục vụ cho chuyển gene Phương pháp nghiên cứu Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Giả thuyết khoa học Xây dựng quy trình nuôi cấy in vitro đậu xanh phục vụ chuyển gene nghiên cứu khác Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY ĐẬU XANH 1.1.1 Nguồn gốc, phân loại đặc điểm sinh học đậu xanh Cây đậu xanh Vigna radiata (L.) Wilczek Ngành Lớp Bộ Họ Chi Loài Magnoliopyta Magnoliopsida Fabales Fabaceae Vigna V radiata 10 Chi Vigna chi lớn họ đậu, bao gồm chi phụ là: Vigna, Haydonia, Plectropic, Macrohynchus, Ceratotropic, Lasionspron, Sigmoidotrotopis Đậu xanh theo quan điểm lấy hạt bao gồm loại thuộc hai chi phụ Vigna Ceratotropic Chi phụ Ceratotropic gọi nhóm đậu châu Á mang mức độ điển hình thể mức độ cao cho Vigna Năm 1970, Vercourt công bố 16 loài Ceratotropic hoá là: Đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek), đậu gạo (Vigna Umbellata (thumb)), đậu adzukia (Vigna anguilaris (Willd)), đậu ván (Vigna aconiti folia (Jacp)), Vigna trilobata (L) Wilczek Thân đậu xanh thuộc loại thân thảo, cao khoảng 40-70cm, thân yếu, có lớp lông mịn màu nâu sáng Đường kính thân trung bình từ 8-12mm tăng trưởng với tỷ lệ thuận với tốc độ tăng trưởng chiều cao Cây đậu xanh phân cành thường phân cành muộn, trung bình có 1-5 cành Toàn thân chia thành 7-15 đốt Thân có màu xanh màu tím phụ thuộc vào giống Lá kép mọc cách, chét có thuỳ với nhiều hình dạng ovan, thuôn dài, lưỡi mác Cây đậu xanh có 7-8 thân chính, có thứ nụ hoa hình thành Diện tích tăng dần từ lên đến thân lại giảm dần phía Chỉ số diện tích có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất quang hợp suất thu hoạch Số hình dạng thay đổi tuỳ giống, đất trồng thời vụ [11] Hoa đậu xanh hoa lưỡng tính, mọc thành chùm trục hoa Đậu xanh loại sinh trưởng vô hạn, hoa có màu tím vàng nhạt với công thức hoa mẫu Hoa đậu xanh thường nở rải rác nên chín rải rác không thuận lợi cho việc thu hái Quả đậu xanh thuộc loại giáp, hình trụ, dạng tròn, dẹp, dài từ 810cm, đường kính từ 4-6mm, có hai gân rõ theo hai bên cạnh Quả 53 Chiều dài chồi ( cm) ĐX11 V123 0 0.5 1.5 2.5 Nồng độ GA3 ( mg/l) Hình 3.14: Ảnh hưởng GA3 tới Hình 3.15: Kéo dài chồi đậu xanh từ khả kéo dài chồi nốt mầm môi trường K2 Qua số liệu ta thấy với môi trường MS môi trường có bổ sung GA3 chiều dài chồi có thay đổi rõ rệt Với môi trường MS sau 15 ngày nuôi cấy chiều dài chồi khoảng 1,5cm, chồi mập xanh Khi chiều dài chồi khoảng 4-5cm chồi có tượng héo không đủ điều kiện để Với nồng độ GA3 tăng dần từ 0,5mg/l đến 3,0mg/l chiều dài chồi tăng dần từ 1,5 đến 6,7cm giống ĐX11 từ 1,4 đến 6,5cm giống V123 Nhưng nồng độ chiều cao tính chất chồi khác nhau; Bổ sung GA3 với nồng độ 1mg/l phù hợp để sử dụng làm nguyên liệu tạo hoàn chỉnh, nồng độ chiều cao chồi đạt từ 4-5cm, chồi mập, xanh đạm thời gian ngắn hai giống Ở nồng độ GA3 lớn 1,5mg/l chồi mảnh, xanh nhạt héo ngọn, để thời gian 30 ngày môi trường kéo dài chồi Điều không xuất môi trường bổ xung 1mg/l GA3 54 Chính thí nghiệm này, chọn môi trường K2 có GA3 1mg/l để kéo dài chồi 3.4 NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA IBA VÀ NAA ĐẾN KHẢ NĂNG TẠO RỄ Giai đoạn rễ cho chồi công đoạn cuối quy trình tái sinh Kết thúc giai đoạn thu hoàn chỉnh (đầy đủ rễ thân, lá) Trong giai đoạn này, người ta thường sử dụng chất KTST thuộc nhóm auxin để kích thích rễ chồi Nghiên cứu sử dụng IBA NAA để xác định ảnh hưởng chúng đến hình thành rễ chồi đậu xanh Các chồi mập có chiều cao 4-5cm, xanh đậm cấy chuyển sang môi trường rễ bổ sung IBA NAA với nồng độ khác Sau 12 ngày nuôi cấy, kết thu bảng 3.7 Bảng 3.7: Ảnh hưởng IBA NAA tới khả hình thành rễ CTMT Chất KTST Sau 12 ngày MS - ĐX11 Số rễ/ Chiều dài rễ 19±0,81 1,9±0,33 Tỷ lệ rễ (%) 66,6% Số rễ/ 18±0,81 V123 Chiều dài rễ 2±0,12 Tỷ lệ rễ (%) 60% R1 0,1mg/l IBA 24±0,81 3,9±0,28 100% 24±0,81 4±0,12 96,6% R2 0,2mg/l IBA 35±0,81 4,4±0,28 90% 34±0,81 4,6±0,07 90% R3 0,3mg/l IBA 40±0,81 0,9±0,07 86,6% 42±0,81 1,1±0,07 87% R4 0,1mg/l NAA 53±0,81 0,7±0,07 90% 58±0,81 0,9±0,07 90% R5 0,2mg/l NAA 49±0,81 0,6±0,07 86,6% 51±0,81 0,7±0,07 96% R6 0,3mg/l NAA 34±0,81 1.2±0,07 93,3% 32±0,81 1,5±0,07 93,3% Kết thu bảng 3.7 cho thấy, tất công thức thí nghiệm rễ đạt tỷ lệ cao từ 60 - 96,6% Chứng tỏ rằng: chồi đậu xanh rễ môi trường môi trường có bổ sung IBA NAA 55 nồng từ 0,1mg/l đến 0,3mg/l Mặc dù tỷ lệ rễ, số rễ/cây chiều dài rễ/cây có khác biệt Cụ thể là: Ở môi trường đối chứng MS không chất KTST chồi đậu xanh rễ xong với tỷ lệ thấp 66,6 % giống ĐX11 60 % giống V123 với số lượng rễ dao động khoảng 18-19, giống có chiều dài rễ khoảng 2cm Với nồng độ 0,1mg/l IBA có rễ khỏe, số lượng rễ phù hợp, chiều dài rễ khoảng 4cm, xanh, mập tốt cho Đối với nồng độ 0,2 0,3mg/l IBA kích mạnh tạo số lượng rễ nhiều lại ngắn khoảng 1cm không tốt cho phát triển Nghiên cứu ảnh hưởng NAA tới phát triển rễ chồi đậu xanh cho thấy nồng độ từ 0,1 đến 0,3mg/l NAA số lượng rễ đậu xanh nhiều, nhiều rễ phụ ngắn, rễ có màu nâu, để lâu rễ bị mùn mà chiều dài rễ không tăng nhiều không tốt cho phát triển Chính vậy, thí nghiệm chọn 0,1mg/l IBA nồng độ thích hợp để rễ tạo hoàn chỉnh cho đậu xanh Hình 3.16: Tạo rễ môi trường R1 Hình 3.17: Tạo hoàn chỉnh 56 Hình 3.18: Tạo rễ môi trường R4 (12 ngày) Hình 3.19: Tạo rễ môi trường R4 (17 ngày) Hình 3.20: Tạo rễ Hình 3.21: Tạo rễ môi trường R4 (17 ngày) môi trường R1 (17 ngày) 3.5 NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN RA RỄ TỚI SỨC SỐNG CỦA CÂY Thí nghiệm tiến hành nuôi ống nghiệm với thời gian rễ 12 ngày, 17 ngày, 20 ngày Sau tiến hành đưa trồng trấu hun để 57 nghiên cứu thời gian rễ có ảnh hưởng tới sức sống Sau tuần trồng thu kết bảng 3.8 Bảng 3.8: Ảnh hưởng thời gian rễ tới tỷ lệ sống (%) Thời gian 12 ngày 17 ngày 20 ngày ĐX11 83,3% 50% 20,3% V123 80% 46,6% 20% Giống 90 80 70 60 Tỷ lệ 50 sống (%) 40 30 ĐX11 20 V123 10 12 ngày 17 ngày 20 ngày Thời gian TN Hình 3.22: Ảnh hưởng thời gian rễ tới sức sống Hình 3.23: Cây đậu xanh tái sinh trồng trấu hun Qua bảng ta thấy, sức sống bị ảnh hưởng lớn thời gian rễ nuôi cấy in vitro Nếu rễ thời gian, rễ khỏe tỷ lệ sống cao giống ĐX11 83,3% giống V123 80% thời gian nuôi cấy 12 ngày Tỷ lệ sống giảm dần thời gian sinh trưởng ống nghiệm tăng, sau 17 ngày tỷ lệ sống 46,6% giống V123 50% giống ĐX11, sau 20 ngày tỷ lệ sống 20,3% giống ĐX11 20% giống V123 Nguyên nhân 58 rễ sinh trưởng môi trường có chất KTST IBA rễ phát triển nhanh dẫn đến từ 17 ngày trở rễ bị già hóa có bị mục thực tốt việc hút nước muối khoáng cung cấp đem trồng thời gian 17 ngày trở tỷ lệ sống không cao Vì vậy, nghiên cứu sử dụng thời gian rễ đậu xanh 12 ngày tuổi 3.6 NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA GIÁ THỂ TỚI SỨC SỐNG CỦA CÂY Cây in vitro nuôi cấy điều kiện ổn định dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ điều kiện vô khuẩn Khi chuyển in vitro trồng vườn ươm có điều kiện khác hẳn với môi trường ống nghiệm phải tự thích nghi với điều kiện tự nhiên Chính vậy, trước đưa vườn ươm, cần phải huấn luyện cho thích nghi dần với điều kiện ánh sáng, nhiệt độ môi trường tự nhiên Cây trồng vào khay, sau dùng dung dịch MS pha loãng 10 lần tưới nhẹ Cây để nơi có đủ ánh sáng tránh nắng tránh mưa trực tiếp Những ngày đầu ngày tưới nước lần sau giảm dần Khi rễ mới, đưa vườn ươm Nghiên cứu sử dụng loại giá thể khác để xác định giá thể phù hợp cho sinh trưởng phát triển đậu xanh sau nuôi cấy in vitro, kết thu bảng 3.9 Bảng 3.9: Ảnh hưởng giá thể tới sức sống đậu xanh Công thức TN Tỷ lệ sống Cát đen 83,3% Trấu hun 80% Cát + trấu hun (1:1) 100% 59 Hình 3.24: Cây tái sinh trồng cát Hình 3.25: Cây tái sinh trồng cát + trấu hun Hình 3.26: Cây tái sinh trồng trấu hun Qua kết thí nghiệm cho thấy đậu xanh tỏ thích hợp với nhiều loại giá thể khác nhau, tỷ lệ sống thấp 80% giá thể trấu hun Đặc biệt, loại giá thể cát trộn trấu hun với tỷ lệ 1:1, tỷ lệ sống cao đạt 100% Do đó, sử dụng cát + trấu hun tỷ lệ 1:1 giá thể để trồng đậu xanh sau nuôi cấy in vitro Hình 3.27: Cây đậu xanh tái sinh hoa kết 60 TÓM TẮT QUI TRÌNH TẠO ĐA CHỒI ĐẬU XANH Phôi hạt chín Cây mầm (MS+20g/l sucrose+9g/l agar) ngày Tạo đa chồi từ nốt mầm ngày Tạo đa chồi từ đoạn chồi, đốt thân 15 ngày 30 ngày Môi trường kéo dài chồi MS+20g/l sucrose+9g/l agar+1g/l GA3 15 ngày Môi trường tạo hoàn chỉnh MS+20g/lsucrose+9g/l agar+0,1mg/l IBA 12 ngày Huấn luyện, chăm sóc 15 ngày Vườn ươm Giá thể cát + trấu hun (1:1) 61 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Bước đầu xây dựng hệ thống nuôi cấy in vitro đậu xanh phục vụ mục đích chuyển gene thông qua tạo đa chồi từ nốt mầm, đốt thân chồi Môi trường tạo đa chồi T2 (2mg/l BAP + 10% nước dừa) Hệ số tạo chồi từ đốt thân ĐX11là 3,41, V123 3,1; từ nốt mầm ĐX11là 3,83, V123 3,66 từ chồi ĐX11 6,63, V123 6,08 Đã xác định môi trường kéo dài chồi đậu xanh MS có bổ sung 1mg/l GA3 Đã xác đinh môi trường tạo hoàn chỉnh MS có bổ sung 0,1mg/l IBA thời gian nuôi cấy 12 ngày Đã xác định giá thể phù hợp cát + trấu hun tỷ lệ 1:1 để trồng in vitro, với tỷ lệ sống 100% Cây đậu xanh nuôi cấy in vitro sinh trưởng phát triển bình thường điều kiện tự nhiên Đề nghị Tiếp tục ứng dụng hệ thống nuôi cấy in vitro để chuyển gene có giá trị kinh tế vào đậu xanh 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi lúa, NXB Đại học Quốc Gia, Hà Nội Trịnh Đình Đạt (2006), Công nghệ di truyền, NXB Giáo dục Bùi Bảo Hoàn (1993), Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào bảo quản, nhân giống chọn dòng chịu lạnh khoai lang (Ipomoea batatas L.), Luận văn thạc sĩ sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Hà Nội Đào Hữu Hồ (1999), Xác suất thống kê, NXB Đại học Quốc Gia, Hà Nội Nguyễn Hoàng Lộc (1992), Chọn dòng chịu muối NaCl chịu nước thuốc (Nicotiana tabacum L.), Luận án phó tiến sĩ sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Hà Nội Trần Đình Long, Lê Khả Tường (1998), Cây đậu xanh, NXB Nông nghiệp Chu Hoàng Mậu (2001), Sử dụng phương pháp đột biến thực nghiệm để tạo dòng đậu tương đậu xanh đột biến thích hợp cho vùng núi Đông Bắc Việt Nam, Luận án tiến Sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Hà Nội Đinh Thị Phòng (2001), Nghiên cứu khả chịu hạn chọn dòng chịu hạn lúa công nghệ tế bào thực vật, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện công nghệ sinh học, Hà Nội 10 Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật - nghiên cứu ứng dụng, NXB Nông nghiệp 11 Phạm Văn Thiều (1997), Cây đậu xanh kỹ thuật gieo trồng chế biến sản phẩm, NXB Nông nghiệp 12 Đỗ Năng Vịnh (2006), Công nghệ tế bào thực vật ứng dụng, NXB Nông nghiệp 13 Vũ Văn Vụ (2009), Sinh lí học thực vật, NXB Giáo dục 63 Tài liệu tiếng Anh 14 Abdul B, Frinch RP, Cocking EC (1999), "Plant regeneration from protoplast of wild rice (Oryza rufipogon Griff)”, Plant cell Rep, 10, 200203 15 Collin HA, Dix PJ (1990), “Culture systems and selection procedure”, in: Plant cell line selection, VCH Verlagsgesellschaft 16 Dix PJ (1986), Plant cell culture technology, Yeoman M.M (sds), Oxford, Blackwell Scientific Publication, 143-201 17 Gill PK, Sharma AD, Singh P, Bhullar SS (2001), “Effect of various abiotic stresses on the growth, soluble sugars and water relations of sorghum seedlings grown in light and darkness”, Bulgarian Journal of Plant Physiology, 27(1-2), 72-84 18 Gulati A, Jaiwal PK (1994), “Plant regeneration from cotyledonary node explants of mungbean (Vigna radiata (L.) Wilczek)”, Plant Cell Rep, 13, 523-527 19 Hoque MI, Mosfeqa MZ, Sarker RH (2007), “In vitro Plant Regeneration in Mungbean (Vigna radiata (L.) Wilczek)”, Plant Tissue Cult & Biotech, 17(2), 209-216 20 Huang N, Stebbins GL, Rodriguez RL (1992), “Classification and evolution of alpha-amylase genes in plants”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 89(16), 7526-7530 21 Ignacimuthu S, Franklin G (1999), “Regeneration of plantlets from cotyledon and embryonal axis explants of Vigna mungo L Hepper”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 55, 75-78 22 Jayanti S, Mukherjee SG (1998), “In vitro introduction of multiple shoot and plant regeneration in Vigna”, In vitro Cellular & Developmental Biology Plant, 34, 276-280 23 Josefina ON, Yuso F, Kazumi H, Tomikichi W (1997), “Effect of seed preconditioning and culture under different light intensities on callus 64 induction and regeneration in excised cotyledon cultures of Mungbean (Vigna radiata (L.) Wilczek)”, Jpn J Crop Sci, 66(1), 67-75 24 Kaviraj CP, Kiran G, Venugopal RB, Kavi Kishor PB, Srinath R (2006), “Somatic embryogenesis and plant regeneration from cotyledonery explants of Green Gram (Vigna radiata (L.) Wilczek): A recalcitrant grain legume”, In vitro Cellular & Developmental Biology Plant, 42(2), 134-138 25 Konzak CK (2001), Breeding in Crop Plant - Mutations and In Vitro Mutation Breeding, Crop Science, 41, 253-256 26 Mamadou SD, Aliou N, Maurice S, Yaye KG (2008), “Plants regeneration from African cowpea variety (Vignaunguiculata L Walp.)", African Journal of Biotechnology, 7(16), 2828-2833 27 Murashige T, Skoog FC (1962), “A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture”, Physiologia Plantarum, 15, 473-497 28 Muruganantham M, Amutha S, Selvaraj N, Vengadesan G, Ganapathi A (2007), “Efficient Agrobacterium - mediated transformation of Vigna mungo using immature cotyledonary-node explants and phosphinothricin as the selection agent”, In vitro Cellular & Developmental Biology Plant, 43, 550-557 29 Norbor MW (1990), "Environmental stress resistance", In: Plant Cell line Selection, Weihein, New York, Basel, Cambridge, VCH, 167 - 186 30 Poddar K, Vishnoi RK, Kothari SL (1985), “Plant regeneration from embryogenesis callus”, Rice Bio Quar, 35, 31 Rahman M, Malik TA, Iqbal MJ, Zafar Y, Alam K, Perveen Z, Rehman S (1998), "Salt impact on somaclonal variation in rice", Rice Bio Quar, 35, 13-14 32 Ramakrishnan K, Gnanam R, Sivakumar P, Manickam A (2005), “In vitro somatic embryogenesis from cell suspension cultures of cowpea (Vigna unguiculata (L.) Walp)”, Plant Cell Rep, 24, 449-461 33 Renato A, Kazumi H (1999), “Differences in shoot regeneration response from cotyledonary node explants in Asiatic Vigna species support genomic 65 grouping within subgenus Ceratotropis (Piper) Verdc”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 58, 99-110 34 Renato A, Motoda J, Kazumi H (2001), “Direct shoot regeneration from cotyledonary nodes as a marker for genomic groupings within the Asiatic Vigna (subgenus Ceratotropis {Piper} Verdc.) species”, Plant Growth Regulation, 35, 59-67 35 Rudrabhatla S, Siva C, Madasamy P, Shulu Z, Diaa A, Wissam A, Stephen G (2005), “OPBC Symposium: Maize 2004 & Beyond - Plant regeneration, Gene discovery and genetic engineering of plants for crop improvement”, In vitro Cellular & Developmental Biology Plant, 41, 411-423 36 Singh J, Tiwari KN (2010), Evaluation of cotyledonary node of Clitoria ternatea L for high frequency in vitro axillary shoot proliferation, Asian Journal of Plant Sciences, 9(6), 351-357 37 Sita ML, Leela T, Kiran KB, Naresh B, Devi P (2006a), “In vitro plant regeneration from the petioles of primary leaves of mungbean (Vigna radiata L.)” Plant Biotechnology, 23, 409-411 38 Sita ML, Leela T, Manoj KS, Kiran KB, Naresh B, Devi P (2006b) “Enhanced genetic transformation efficiency of mungbean by use of primary leaf explants”, Current Science, 91(1), 93-99 39 Sivakumar P, Gnanam R, Ramakrishnan K, Manickam A (2010), Somatic embryogenesis and regeneration of Vigna radiata, Biologia Plantarum, 54(2), 245-251 40 Srinath R, Prabhavati P, Kaviraj CP (2005), “Callus induction and organogenesis from various explants in Vigna radiata (L.) Wilczek”, Indian Journal of Biotechnology, 556-560 41 Sonia, Raman S, Rana PS, Pawan KJ (2007), “Agrobacterium tumefaciens mediated transfer of Phaseolus vulgaris α- amylase inhibitor-1 gene into mungbean (Vigna radiata (L.) Wilczek) using bar as selectable marker”, Plant Cell Rep, 26(2), 187-198 66 42 Thind SK, Chanpreet, Mridula (1997) “Effect of fluridone on free sugar level in heat stressed mungbean seedlings”, Plant Growth Regulation, 22(1), 19-22 43 Varalaxmi Y, Vijayalakshmi A, Yadav SK, Venkateswarlu B, Maheswari M (2007), “Efficient plant regeneration from cotyledons of Black Gram (Vigna mungo (L.) Hepper”, Indian Journal of Biotechnology, 6, 414-417 67 PHỤ LỤC Thành phần môi trường MS (Murashige Skoog, 1962) Thành phần khoáng đa lượng Nồng độ (mg) NH4NO3 1650 KNO3 1900 CaCl2.2H2O 440 MgSO4.7H2O 370 KH2PO4 170 Thành phần khoáng vi lượng Nồng độ (mg) MgSO4.4H2O 22,3 ZnSO4.4H2O 8,6 H3BO3 6,2 KI 0,83 Na2MoO4.2H2O 0,25 CoCl2.6H2O 0,025 CuSO4.5H2O 0,025 Vitamin Nồng độ (mg) Glycine 2,0 Nicotinic Acid 0,5 Pyridoxine HCl 0,5 Thiamine HCl 0,1 [...]... nốt lá mầm của cây Vigna unguiculata (L. ) Walp .) có tỉ lệ tái sinh là 100% [32] Trên thế giới đã có nhiều công trình về nuôi cấy mô cây đậu xanh từ phôi soma và từ nốt lá mầm, thân, lá… phục vụ chuyển gene đã đươc công bố bởi nghiên cứu tái sinh từ nốt lá mầm của [19], [22], [23], [24], [33], [35], [37], [39], [41] Nghiên cứu chuyển gene mã hóa protein ức chế enzyme αamylase vào cây đậu tương nhờ vi... của chuyển gene vào cây trồng phụ thuộc rất nhiều vào hệ thống nuôi cấy và tái sinh tế bào thành cây in vitro sau chuyển gene Sự tái sinh trong nuôi cấy in vitro từ phôi soma hoặc từ một bộ phận khác độc lập của cây còn phụ thuộc vào kiểu gene của giống [26], [35] Đối với cây ngô, sự tái sinh cây có thể thực hiện từ mô sẹo hoặc tạo đa chồi; Sự phát sinh phôi vô tính và tái sinh chồi trực tiếp của cây. .. L .) có thể bằng phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào mô phân sinh đỉnh Nghiên cứu khả năng tái sinh của 27 giống thuộc loài Vigna có nguồn gốc từ nhiều nước trên thế giới, Renato & CS (200 1) đã cho thấy kỹ thuật tái sinh từ nốt lá mầm của hạt nảy mầm 4 ngày tuổi đạt hiệu quả tái sinh từ 80%-100% và tái sinh chồi trực tiếp từ nốt lá mầm như là chỉ thị cho hệ gene của loài đậu 31 Vigna châu Á Tái sinh. .. nước Các kết quả về dung hợp tạo cây lai tế bào chất, cây chuyển gene lục lạp cũng thu được kết quả lý thú [2], [10] 1.3.2 Nghiên cứu hệ thống tái sinh ở cây đậu xanh Những nghiên cứu chọn tạo giống đậu xanh có năng suất cao, kháng bệnh, chống chịu tốt với các điều kiện bất lợi, thời gian chín tập trung… là những vấn đề có ý nghĩa thực tiễn rất quan trọng Và việc chuyển gene để tạo nên những tính trạng... của cây họ đậu chủ yếu là globulin (60 %), albumin (12 %), glutein (21 %), prolamin(1 %) - Lipid: Hạt đậu xanh có hàm lượng lipid thấp hơn so với cây họ đậu khác Hàm lượng lipid thay đổi tuỳ thuộc vào giống và bộ gene Hàm lượng lipid của đậu xanh trung bình có khoảng 2 - 3% Lipid trung tính chiếm phần chính Ngoài ra trong đậu xanh còn có glucolipid, phospholipid… - Một số enzyme chủ yếu trong cây đậu xanh. .. rẽ cho phép loại bỏ mối tương tác với các tế bào bên cạnh và những thay đổi di truyền có điều kiện biểu hiện rõ ràng hơn [2], [12] Ngoài ra, hệ thống tái sinh cây thông qua đa chồi từ mảnh lá hoặc đoạn thân cũng được sử dụng để chuyển gene 26 1.2.4.2 Tái sinh cây Tái sinh cây in vitro với hiệu suất cao được xem là mấu chốt quyết định đến sự thành công trong quy trình tạo cây chuyển gene Nhiều nhà nghiên. .. đỉnh sinh trưởng ở trạng thái hoạt động (chồi đỉnh ngọn, đầu r ) hay ở trạng thái ngủ nghỉ (chồi nách) Cũng rất gần phôi là các tế bào sinh dục như noãn bào và tế bào hạt phấn ở giai đoạn non Các tế bào của mô tượng tầng (cambium) cũng là nguồn mẫu vật nuôi cấy rất lý tưởng [2] 25 1.2.4 Hệ thống nuôi cấy và tái sinh cây 1.2.4.1 Hệ thống nuôi cấy in vitro Xây dựng hệ thống nuôi cấy và tái sinh cây hoàn... pH… Nghiên cứu này được tiến hành tại phòng Công nghệ tế bào thực vật và Trại Thực nghiệm sinh học, thuộc Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam Thời gian thực hiện: từ tháng 7/2009 - 9/2010 2.2 PHƯƠNG PHÁP Các bước nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ tổng quát sau [19], [38], [40]: Hạt đậu xanh Khử trùng hạt, Tạo cây con nuôi in vitro Tạo mô sẹo Tạo đa chồi Tái sinh cây Tạo cây. .. trong quá trình tái sinh cây Mô sẹo đơn bội từ đoạn thân hay mảnh lá của cây Dautura innoxia tái sinh chồi nhanh hơn mô sẹo cùng loài của cây lưỡng bội Ở cây khoai lang tỷ lệ tái sinh cây từ mô sẹo có nguồn gốc từ lá, thân, rễ, cuống lá là rất thấp Mô sẹo có nguồn gốc từ củ khoai lang bị lục hóa mạnh, tạo nhiều rễ và hầu như không có khả năng tái sinh [4], [9], [18], [30] Khả năng tái sinh chịu ảnh hưởng... do rễ cây đậu xanh có vi khuẩn cố định đạm Rhizobium sống cộng sinh nên cây đậu xanh còn có tác dụng trong cải tạo và bồi dưỡng đất [7] 1.1.2 Đặc điểm sinh hoá của cây đậu xanh - Protein dự trữ trong hạt: Hàm lượng protein dự trữ trong hạt đậu xanh trung bình khoảng 24% Kiểu gene, điều kiện canh tác ảnh hưởng đến hàm lượng protein Chức năng của protein dự trữ là cung cấp nguồn amino acid và nitơ cho ... nghiên cứu Chính tiến hành thực đề tài Nghiên cứu hệ thống tái sinh đậu xanh (Vigna radiata (L. ) Wilczek) phục vụ cho chuyển gene Mục đích nghiên cứu - Xây dựng hệ thống tái sinh đậu xanh phục vụ. .. vi nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: Hai giống đậu xanh ĐX11 V123 - Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu hệ thống tái sinh đậu xanh (Vigna radiata (L. ) Wilczek) phục vụ cho chuyển gene Phương pháp nghiên. .. là: Đậu xanh (Vigna radiata (L. ) Wilczek), đậu gạo (Vigna Umbellata (thumb )) , đậu adzukia (Vigna anguilaris (Willd )) , đậu ván (Vigna aconiti folia (Jacp )) , Vigna trilobata (L) Wilczek Thân đậu xanh