2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Vật liệu thực vật
Hai giống đậu xanh ĐX11 và V123 do Trung tâm Tài nguyên di truyền thực vật thuộc Viện khoa học Nông nghiệp Việt Nam cung cấp. Đặc điểm của các giống đậu xanh được trình bày trong bảng 2.1.
Bảng 2.1: Đặc điểm của giống đậu xanh nghiên cứu STT Tên giống Nguồn gốc Màu sắc hạt Hình dạng hạt
1 V123 Việt Nam Xanh bóng Tròn
2 ĐX11 Thái Lan Xanh mốc Tròn
2.1.2. Hoá chất và thiết bị
- Hoá chất: Môi trường được sử dụng để nuôi cấy mô, tế bào cây đậu
xanh là môi trường MS cơ bản [27]; Các chất kích thích sinh trưởng: BAP (6-benzylaminopurine), IBA (Indolbutyric acid),
Kinetin (6-furfurylaminopurine), NAA (α-naphthaleneacetic acid),
TDZ - Thidiazuron (N-phenyl-N-1,2,3-thiadiazol-5-ylurea), 2,4D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid).
GA3 (Gibberellin acid)…
Agar, glucose và các hoá chất thông dụng khác,
Được cung cấp bởi các hãng uy tín và chất lượng trên thế giới như Sigma, Research Oganic, Wako...
33
- Thiết bị: Cân điện tử, buồng cấy vô trùng, nồi khử trùng, máy đo pH…
Nghiên cứu này được tiến hành tại phòng Công nghệ tế bào thực vật và Trại Thực nghiệm sinh học, thuộc Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Thời gian thực hiện: từ tháng 7/2009 - 9/2010. 2.2. PHƯƠNG PHÁP
Các bước nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ tổng quát sau [19], [38], [40]:
Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát Hạt đậu xanh
Khử trùng hạt,
Tạo cây con nuôi in vitro
Tạo mô sẹo Tạo đa chồi
Tái sinh cây
Tạo cây hoàn chỉnh
34
2.2.1. Khử trùng hạt, tạo cây con nuôi in vitro
Hạt đậu xanh được loại bỏ những hạt kém chất lượng (mốc, lép, vỡ, mọt…), rửa bằng nước máy, sau đó rửa lại bằng nước xà phòng loãng, cuối cùng lại bằng nước cất.
Khử trùng hạt bằng cồn 700 trong thời gian 1 phút, loại bỏ cồn, rửa sạch cồn bằng nước cất vô trùng 3 lần. Sau đó khử trùng bằng bằng dung dịch javen pha loãng với các mức nồng độ và thời gian như sau:
- javen 50%, trong thời gian 10 phút, 15 phút, 20 phút, 25 phút; - javen 60%, trong thời gian 10 phút, 15 phút, 20 phút, 25 phút; - javen 70% trong thời gian 10 phút, 15 phút, 20 phút, 25 phút; Loại bỏ javen, rửa hạt 3 lần bằng nước cất khử trùng.
+ Môi trường hạt nảy mầm: Hạt sau khi khử trùng được cấy vào môi
trường dinh dưỡng MS cơ bản có bổ sung thêm 20g/l đường và 9 g/l agar (cấy 20 hạt/bình). Sau 4 ngày xác định hạt nảy mầm thành cây, và tỷ lệ mẫu nhiễm. 2.2.2. Tái sinh cây đậu xanh thông qua mô sẹo
2.2.2.1. Cảm ứng tạo mô sẹo từ mảnh lá
Lá đậu xanh 6 ngày tuổi được cắt thành các mảnh nhỏ có kích thước khoảng 0,5 x 0,5cm, (cấy 10 mẫu/bình) lên môi trường nuôi cấy H(1-11) với thành phần môi trường là MS + 20g/l đường + 9g/l agar + 2,4D. Trong đó nồng độ 2,4D thay đổi theo bảng 2.2.
Mẫu được chia thành hai lô
- Lô thứ nhất: Mẫu nuôi cấy dưới ánh sáng đèn neon với cường độ chiếu sáng 2.500lux;
- Lô thứ hai để trong buồng tối;
Sau 4 tuần nuôi, xác định tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo, đánh giá chất lượng mô sẹo trên các công thức thí nghiệm.
35
Bảng 2.2: Nồng độ 2,4D trong các công thức môi trường tạo mô sẹo
Điều kiện nuôi cấy in vitro: trong nghiên cứu này, tất cả mẫu nuôi cấy in vitro
trong cùng một điều kiện là: nuôi cấy trong bình tam giác 250 ml; ánh sáng đèn neon có cường độ 2.500lux, thời gian chiếu sáng 14 giờ/ngày, nhiệt độ phòng nuôi cấy 27±20 C; hoặc nuôi trong buồng tối.
2.2.2.2. Cảm ứng tạo mô sẹo từ đoạn thân
Thân cây đậu xanh 6 ngày tuổi được cắt thành các đoạn nhỏ có chiều dài từ 0,5cm. Cấy các đoạn thân mầm lên môi trường tạo mô sẹo (cấy 12 mẫu/bình). Thành phần môi trường và điều kiện thí nghiệm như mục 2.2.2.1.
Công thức môi trường CTMT Nồng độ 2,4D (mg/l)
Đối chứng (ĐC) 0 H1 1 H2 2 H3 3 H4 4 H5 5 H6 6 H7 7 H8 8 H9 9 H10 10 H11 11
36 2.2.2.3. Tái sinh cây từ mô sẹo
Mô sẹo tạo ra từ lá và đoạn thân mầm được cấy chuyển sang môi trường tái sinh cây trên nền MS cơ bản bổ sung:
- BAP ở các nồng độ: 1,0mg/l; 1,5mg/l; 2,0mg/l; 2,5mg/l; 3,0mg/l; 3,5mg/l; 4,0mg/l.
- Kinetin ở các nồng độ: 0,5mg/l, 1,0mg/l; 2,0mg/l; 3,0mg/l; 4mg/l. - TDZ ở nồng độ: 0,5mg/l, 1,0mg/l; 2mg/l; 3,0mg/l; 4mg/l.
- BAP ở các nồng độ: 1mg/l; 2mg/l kết hợp lần lượt với TDZ ở nồng độ là 0,5mg/l, 1,0mg/l; 2mg/l; 3,0mg/l; 4mg/l.
Mỗi công thức thí nghiệm được tiến hành trên 30 mẫu, thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Kết quả được đánh giá sau 30 ngày cấy chuyển.
Đánh giá tỷ lệ tái sinh theo công thức: Rc = (%)
sv r
NN N
Trong đó: Rc : là khả năng tái sinh cây (%); Nr: là tổng số mô tái sinh cây; Nsv: là tổng số mô nuôi cấy; 2.2.3. Tạo đa chồi cây đậu xanh
2.2.3.1. Tạo đa chồi từ nốt lá mầm
Sau khi hạt nảy mầm 3 ngày, dùng dao cắt bỏ phần trụ rễ cách nốt lá mầm khoảng 3 - 4mm. Tách đôi lá mầm thành 2 mẫu cấy, cắt bỏ lá, đặt úp lá mầm lên môi trường nuôi cấy T(1-9) (cấy 8 mẫu/bình), với thành phần môi trường là MS + 20g/l glucose + 9 g/l agar + BAP + Kinetin + nước dừa. Trong đó nồng độ BAP và kinetin thay đổi theo bảng 2.3. Sau 2 tuần nuôi cấy, đánh giá tỷ lệ tạo đa chồi.
37
Bảng 2.3: Môi trường tạo đa chồi
CTMT BAP (mg/l) BAP (mg/l) + nước dừa Kinetin (mg/l)
ĐC 0 0 0 T1 1 0 0 T2 2 0 0 T3 3 0 0 T4 0 1 + 10% nước dừa 0 T5 0 2 + 10% nước dừa 0 T6 0 3 + 10% nước dừa 0 T7 0 0 1 T8 0 0 2 T9 0 0 3
2.2.3.2. Tạo đa chồi từ chồi ngọn
Chồi ngọn 6 ngày tuổi, cắt từ ngọn xuống thân khoảng 1cm, loại bỏ hết lá và lá mầm. Cấy các đoạn chồi trên môi trường tạo đa chồi (cấy 8 mẫu/bình).
2.2.3.3. Tạo đa chôi từ đốt thân
Cắt trụ dưới lá mầm cách điểm nốt lá mầm khoảng 0,5cm và cắt trụ trên lá mầm cách điểm nốt lá mầm khoảng 0,5cm, loại bỏ lá mầm. Sau đó đặt đoạn có đốt thân trên môi trường tạo đa chồi như mục 2.2.3.1.
2.2.4. Môi trường kéo dài chồi
Cắt các cụm chồi đậu xanh được tạo ra từ lá mầm, thân và chồi, cấy các cụm chồi lên môi trường kéo dài chồi K(1-6), với công thức môi trường: MS + 20g/l glucose + 9 g/l agar + GA3. Trong đó nồng độ GA3
38
Bảng 2.4: Môi trường kéo dài chồi CTMT Nồng độ GA3 (mg/l) ĐC 0 K1 0,5 K2 1,0 K3 1,5 K4 2,0 K5 2,5 K6 3,0
2.2.5. Môi trường tạo cây hoàn chỉnh
Các chồi có kích thước 4 - 5cm, tách riêng biệt từng chồi, cấy chuyển sang môi trường ra rễ: MS + 20g/l đường + 9 g/l agar + (NAA hoặc IBA); trong đó nồng độ của NAA và IBA thay đổi theo bảng 2.5.
Bảng 2.5: Công thức môi trường ra rễ cây đậu xanh
CTMT IBA (mg/l) CTMT NAA (mg/l) ĐC 0 ĐC 0 R1 0,1 R4 0,1 R2 0,2 R5 0,2 R3 0,3 R6 0,3 2.2.6. Phương pháp ra cây
Cây đậu xanh in vitro có bộ rễ khỏe, lá xanh, đẹp thì có thể đưa ra trồng
ở môi trường tự nhiên. Nên để các bình cây ra ánh sáng mặt trời 2-3 ngày trước khi lấy cây non ra khỏi bình.
39
Các bình cây được mở nút, cho nước vào ngâm 15 - 20 phút, sau đó lắc nhẹ cho agar rời ra khỏi rễ cây, dùng panh nhẹ nhàng gắp cây ra khỏi bình, giữ nguyên vẹn, không bị dập nát.
- Ngâm cây trong chậu nước sạch sau đó rửa dưới vòi nước chảy cho sạch agar bám vào bộ rễ của cây.
* Chuẩn bị giá thể trồng cây: Cây con được trồng trong bầu là các chậu nhựa với công thức giá thể sau:
- Công thức I: Trấu hun 100%; - Công thức II: Cát đen 100%;
- Công thức III: Trấu hun pha cát đen với tỷ lệ 1: 1;
Đặt các chậu cây vào khay, sau đó dùng dung dịch MS cơ bản pha loãng 10 lần phun nhẹ vào gốc.
* Chăm sóc cây
Cây đậu xanh trồng trong khay để nơi có đủ ánh sáng nhưng tránh nắng và tránh mưa trực tiếp. Sau khi cây sống ra rễ và lá mới có thể đưa ra trồng trong nhà lưới, vườn vươm.
2.2.7. Phương pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu
Mỗi thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần. Sử dụng toán thống kê để xác định các trị số như trung bình mẫu (x), phương sai (σ2), độ lệch chuẩn (σ), và sai số trung bình (Sx), với n ≥ 30, α = 0,05. Các số liệu được xử lý trên máy vi tính bằng chương trình Excel [5].
40 Chương 3