Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học Đậu khấu chín cánh {Amomum maximum Roxb., Zingiberaceae) Phan Minh Giang', Nguyễn Hoàng Duyên’, Đỗ Ngọc Cương^ Phan Tống Sơn' 'TrườngĐại tìọcKhoahọc Tựnhiên, Đợi học Quốc gia Hà Nội, ^Trường Đại học Dược Hờ Nội SUMMARY Chromatographic isolation afforded two sterols, p-sitosterol and 6p-hydroxystigmast-4-en-3-one, as the main constituents of the methanol extract of the rhizomes ofAmomum maximum Roxb (Zingiberaceae) Their chemical structures were determined by means of spectroscopic methods GC-MS analysis revealed the presence of monoterpenoids in the hydrodistilled essential oil of A maximum Từ khóa: Đậu khấu chín cánh; Zingiberaceae; monoterpenoid; steroid; 6P-hyclroxystigmast-4-en-3-on Đặt vấn đề Amomum chi lớn họ thực vật Zingiberaceae mọc chủ yếu vùng nhiệt đới Đông Nam Nam Á Một số loài Amomum ghi chép thuốc truyền thống Việt Nam Thảo (A tsao-ko), Đậu khấu (A cardamomum), Dương xuân sa {A villosum) Sa nhân (A xanthioìdes) [2], Nhiểu nghiên cứu hóa học loài Amomum thực với tinh dắu [2 ] số nghiên cứu phân lập cho cấu trúc lý thú nonan hai vòng từ A tsơo-ko [5], dioxa-dispiroketal từ A aculeatum [4] eicosenon từ/A koenigii [3] Nghiên cứu hóa học loài Amomum Việt Nam hạn chế; nghiên cứu gán vể A muricarpum cho diarylheptanoid [6, 7], Cây/A maximum Roxb chưa nghiên cứu thành phán hóa học Nghiên cứu thực nhằm mục tiêu xác định thành phần hóa học thăm dò hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định phần chiết từ thân rễ Đậu khấu chín cách A maximum Nguyên vật liệu, phương pháp nghiên cứu Nguyên liệu Thân rễ Amomum maximum Roxb (Zingiberaceae) TS Nguyễn Quốc Bình, Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, thu thập giám định vào tháng năm 2006 Tam Đảo tỉnh Vĩnh Phúc Hóa chất Cácdungm ôisửdụnglàn-hexan,diclorom ethan (CH^CI^) ethỵl acetat (EtOAc) dùng cho sắc ký (Hàn Quốc) methanol (MeOH) làm khan chưng cất lại trước sử dụng Silica gel (Merck, Darmstadt, Đức) với cỡ hạt 63-200 |am Thuốc thử màu dung dịch vanilin HjSO^ đặc % Phương pháp nghiên cứu Phổ hồng ngoại (IR) ghi thiết bị Nicolet Impact 410 FT-IR spectrophotometer Phổ khối lượng va chạm điện tử (EI-MS) ghi thiết bị Hewlett Packard HP-5890 Series II spectrometer Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ('H-NMR) carbon-13 C^C-NMR) với chương trình DEPT ghi thiết bị Brucker Avance 500 spectrometer Độ chuyển dịch hoá học (ổ) đo theo ppm Tetrametylsilan (TMS) chất chuẩn nội zero (ỗ = 0,00) ppm Sác ký khí-khối phổ liên hợp (GC-MS) đo thiết bị Hewlett Packard 19091 s-433, cột HP5 -MS (dài 30 m, đường kính 0,25 mm, lớp phim dày 0,25 (xm) liên hợp với MSD HP 6890 với chế độ chạy: chương trình nhiệt độ 60 - 260°c, 5°c/ phút, nhiệt độ detector 280°c, nhiệt độ buồng tiêm 250°c, khí mang: He Điểm nóng chảy đo thiết bị Boetius Sắc kí cột thường (CC) thực silica gel Sắc kí lớp mỏng (TLC) thực mỏng tráng sẵn silica gel có chiểu dày 0,2 mm nhôm Merck 60 Thuốc thử màu dung dịch vanilin H so đặc 1% ề Phương pháp GC-MS Để xác định thêm chất dễ bay tinh dầu thân rễ tươi Đậu khấu chín cánh điểu chế phương pháp chưng cất lôi nước Tinh dầu phân tích phương pháp GC-MS Các thành phẩn tinh dầu nhận biết cách so sánh với thư viện phổ Wiley GC-MS Thửhoợt tính kháng vi sinh vật kiểm định Các chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm vi sinh vật thuộc nhóm: Hai chủng vi khuẩn gram âm: Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 25923 Hai chủng vi khuẩn gram dương: Bacillus subtilis ATCC 272M,Staphylococus oureus ATCC 12222 Hai chủng mốc: Aspergillus niger 439, Fusarium oxysporum M42 Hai chủng nấm men: Candida albicans ATCC 7754, Saccharomyces cerevisioe SH 20 Các chất kháng sinh kiểm định bao gồm ampicilin (50 mM), tetracylin (10 mM) nystatin (0,04 mM) pha DMSO Đối chứng âm vi sinh vật không trộn với thuốc kháng sinh chất thử Bước 1: Thử theo phương pháp khuyếch tán môi trường đặc (thạch) Hoà tan phẩn chiết vào dung môi thích hợp với nồng độ 20 mg/ ml Tẩm toàn dung dịch thu lên khoanh giấy lọc có đường kính mm Để bay hết dung môi nhiệt độ phòng thí nghiệm rổi đặt khoang giấy lọc mặt đĩa thạch dinh dưỡng trộn với nhũ dịch vi sinh Các đĩa petri (đĩa thạch) giữ 37°c vòng 24 Sau lấy đĩa đánh giá khả kháng vi sinh vật cách xác định đường kính vùng ức chế phát triển vỉ sinh vật (vòng vô khuẩn) Các mẫu thử có tác dụng dương tính bước tiến hành thử theo bước Bước 2: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) nhọn 96 giếng Các vi nấm vi khuẩn trì môi trường dinh dưỡng Trypcase soya broth (TSB) cho vi khuẩn Sabouraud dextrose broth (SDB) cho vi nấm Các chủng kiểm định hoạt hóa trước thử nghiệm môi trường dinh dưỡng dịch thể (24 vi khuẩn 48 vi nấm) Vi sinh vật kiểm định sau khỉ hoạt hoá hoà loãng môi trường dinh dưỡng có nồng độ 0,5 đơn vị Mc Land (khoảng 10^ vi sinh vật/ml) rổi ủ tủ ấm 37°c 24 cho vi khuẩn 30°c 48 cho vỉ nấm Mẩu thử có hoạt tính sàng lọc ban đầu hoà tan hoàn toàn dung dịch DMSO 100 pha loãng theo thang nồng độ thấp dẩn, từ 5-10 thang nồng độ để tính giá trị nồng độ tối thiểu mà vi sinh vật bị ức chế phát triển gắn hoàn toàn Các giá trị MIC đối chứng: ampicilin 21,83 ỊLig/ml, tetracylin 6,87 Ịig/m l nystatin 1,44 |Lig/nnl với nấm men 2,89 |Lig/ml với nấm mốc K ết q u ả n g h iê n cứu Thân rễ tươi đậu khấu chín cánh thái lát mỏng, hong khô nhiệt độ phòng, sau sấy khô 40 - 50°c rổi xay thành bột mịn Bột khô (3 kg) chiết với methanol (cho methanol ngập phán bột) ngày nhiệt độ phòng Sau ngày lọc lấy dịch methanol, bã lại ngâm chiết tiếp methanol Lặp lại trình ngâm chiết mẫu lẩn Các dịch lọc methanol gộp lại, sau cất loại bớt methanol áp suất giảm 1/10 thể tích Pha thêm nước cất vào dịch methanol thu chiết với n-hexan, dicloromethan ethyl acetat Làm khan dịch chiết Na^so^ cất loại kiệt dung môi cho phần chiết n-hexan (5,0 gam), dicloromethan (3 gam) ethyl acetat (2,4 gam) gam phần chiết n-hexan phân tách sắc ký cột c c silica gel với hệ dung môi gradient n-hexan/EtOAc cho 135 phân đoạn (20 ml/ phân đoạn), gộp lại thành 11 nhóm phân đoạn theo TLC Kết tinh phân đoạn 11 hệ dung môi chạy cột cho ß-sitosterol ( ) (10 mg) 6/3-hydroxystignnast-4-en-3-on (2) (5 mg) j3-sitosterol (1): Tinh thể hình kim màu trắng, điểm nóng chảy 141-142°c, = 0,34 (n-hexan/ EtOAc 5:1, v/v), màu tím với thuốc vanilin/ H^SO^ đặc 1% IR (KBr): V cm-^ 3427, 1657, 1462, 1376J 053 6/3-hydroxystigmast-4-en-3-on (2): Bột vô định hình màu trắng R^= 0,21 (n-hexan/EtOAc 5:1, v/v), màu tím với thuốc vanilin/H^SO^ đặc 1% IR (KBr): V cm-' 3404, 1673, 1465, 1377, 1231, 1197, 1042 Er-MS: m/z 428 M^-) ^H-NMR (500 MHz, CDCI3): ỗ (ppm) 0,74 (3H, s, H3- I 8), 0,82 (3H,Ố J = 7,0 Hz, H3-26 ) ,0,84(3H,d j= ,0 Hz, H3-27 ), 0,85 (3H, t j = 7,5 Hz, H3-29), 0,90 ( H, m, H-9), 0,92 (3H, d j = 6,5 Hz, H3-2 I ), 0,95 (1H, m, H-24), 1,02 (1H, m, H-22a), 1,03 (1H, m, H-17), 1,16(1 H, m, H-14), u (3H, m, H-15a, 2H-23)' 1,18 ( H, m, H-12a), 1,24 ( H, m, H-7a), 1,25 (2H, m, 2H-28), 1,30 (1H, m, H-16a), 13 (1H, m, H-22b), 13 (1H, m' H-20), 1,38 (3H, s' H3- 9), 1,52 (2H, m, 2H-11), 1,62 (1H, m, H-12b), 1,66 (1H, m, H-25), 1,70 (1H, m, H-1 a), 1,88 (1H, m, H-16b), 1,93 (IH , dd, J = u , Hz, 3,0 Hz, H-8), 2,02 (IH , m’ H-7b), 2,04 ( H, m, H-1b), 2,05 (IH , m, H-12b), 2,37 ( H, d t J = 17,0 Hz, 3,0 Hz' H-2a), 2,51 (IH , ddd, J = 17,0 Hz, 15,0 Hz, 5,0 Hz, H-2b), 4,35 (IH , dd, J = 2,5 Hz, 2,0 Hz, H-6), 5,81 (1H, s, H-4) '^C-NMR (125 MHz, CDCI3): ổ (ppm) 11,9 (q, C-18), 12,0 (q, C-29), 18,7 (q, C-21), 19,1 (q, C-26), 19,5 (q, C-27), 19,8 (q, C-19), 20,9 (t, C-1 ), 23,1 (t, C-28), 24,2 (t, C-15), 26,1 (t, C-23), 28,2 (t, C-16), 29,2 (d, C-25), 29,8 (d, C-8), 33.9 (t, C-22 ), 34,3 (t, C-2 ), 36,1 (d, C-20), 37,1 (t, C-1 ), 38,0 (s, C-1 0), 38,6 (t, C-7), 39,6 (t, C-1 ), 42,5 (s, C-13), 45.9 (d, C-24), 53,7 (d, C-9), 55,9 (d, C-17), 56,1 (d, C-14), 73,3 (d, C-6), 126,3 (d, C-4), 168,6 (s, C-5), 200,5 (s,C-3) Trong thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật phẩn chiết theo phương pháp mô tả Vanden Berghe Vlietinck [8] có phẩn chiết ethyl acetat cho hoạt tính kháng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa (100 (ag/ml) chủng vi nấm Candidơ albicans (200 |jg/ml) Saccharomyces cerevisiae (100 (xg/ml); phẩn chiết khác hoạt tính mạnh Kết phân tích GC-MS cho thấy tinh dầu thân rễ tươi Đậu khấu chín cánh có chứa monoterpenoid với a-pinen (5,1%) j8-pinen (10,8%) thành phẩn (Bảng 1) Bàn luận Chất nhận dạng j8-sitosterol phương pháp co-TLC so sánh với phổ IR mẫu chuẩn jß-sitosterol Phổ IR cho đỉnh hấp thụ V 3427 cm“' (nhóm OH), 1657 cm ' (liên kết C=C), 1462 cm“' (nhóm methylen), 1376 cm“' (nhóm methyl), 1053 cm“' (liên kết C -0) Phân tích TLC cho thấy jß-sitosterol chiếm chủ yếu phán chiết n-hexan có từ nhóm phân đoạn đến 10 Phổ IR chất cho đỉnh hấp thụ V 3404 em ' (nhóm OH) 1673 cm"' (nhóm cacbonyl a, ß không no) Phổ EI-MS cho pic ion phân tử m/z 428 Phổ ’^C-NMR DEPT cho tín hiệu nhóm methyl (6 q), 10 nhóm methylen (101), nhóm metin (9 d) carbon (4 s) Trong số tín hiệu carbon-13 có tín hiệu nhóm carbonyl a, ß không no [ổ^ 200,5 (s), 168,6 (s) 126,3 (d)] nhóm oxymetin [ỗ^ 73,3 (d)] Các tín hiệu phù hợp với tín hiệu proton 5,81 (1H, s) 4,35 ( H, dd, J - 2,5 Hz, 2,0 Hz) Sáu tín hiệu nhóm methyl xuất phổ 'H-NMR 0,74 (s), 0,82 (d), 0,84 (d), 0,85 (d), 0,92 (d) 1,38 (s) Từ kiện phổ EI-MS, ’H-NMR, '^C-NMR DEPT, công Báng l Phân tích 6C-MS thành phân monoterpenoid atíd béo tình dâu thân rễ tươi SIT Thời gian lưu (phút) Hợp chất Hàm lượng (%)“’ 7,84 a-pinen 5,1 9,14 ß-pinen 10,8 10,54 p-cymen 3,3 10,82 1,8-cineol 1,3 15,36 1,4-terpineol 2,9 15,78 a-terpinyl axetat 2,6 % TICtrên cột 6C m o quỏn HP-5 thức phân tử giả thiết C^gH^gO^ cấu trúc khung stigmastan xác định Từ giả thiết này, so sánh tín hiệu cộng hưởng carbon-13 với ]8-sitosterol cho thấy khả liên kết nhóm hydroxy vào C-6 định vị nhóm carbonyl a, /3 không no 4-en-3on Điều hoàn toàn phù hợp với giá trị ỗ J H-2 [ổ^ 237 (1H, d t J = 17,0 Hz, 3,0 Hz) 2,51 (1H, ddd, J = 17,0 Hz, 15,0 Hz, 5,0 Hz)] H-6 (ỗ^ 4,35) Hằng số tương tác H-6 (dd, J = 2,5 Hz, 2,0 Hz) cho thấy H-6 định hướng a, nhóm hydroxy phải định hướng p Hóa lập thể tâm lập thể lại xác định tương tự p-sitosterol dựa so sánh giá trị độ chuyển dịch carbon-13 Trên sở phân tích phổ, cấu trúc xác định 6j8-hydroxystigmast-4-erì-3-on [ ] Các tương tác quan sát phổ ^H-^H c o s x HSQC va HMBC (Hình 1) khẳng định cho cấu trúc Kết luận Để nghiên cứu thành phần hóa học thân rễ Đậu khấu chín cánh phương pháp phân tích GC-MS kết hợp với phân tách sắc ký xác định cấu trúc phương pháp phổ (IR, MS, 1D 2D NMR) sử dụng GC-MS xác định thành phần monoterpenoid a -pinen Ị3-pinen tinh dầu thân rễ tươi Sắc ký cột silica gel phân lập /3-sitosterol 6j8-hỵdroxystigmast-4-en-3-on Đây lẩn chất thông báo từ Amomum moximum /3-sitosterol chiếm chủ yếu phẩn chiết n-hexan Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định phần chiết cho thấy có phần chiết ethỵl acetat có hoạt tính kháng khuẩn Pseudomonơs oeruginosa kháng nấm Cơndida albicans Soccharomyces cerevìsioe TÀI LIỆU THAM KHẢO Arai Y, Nakagawa T., Hitosugi M., Shiojima K., Ageta H., Basher o (1998), "Chemical constituents of aquatic fern Azolla nilotico", Phytochemistry, 48,471-474 ĐỖ Tất Lợi (2001), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học, Hà Nội Dong H., Gou Y.L, Cao S.G., Chen S.X., Sim K.Y., Goh S.H., Kini R.M (1999), "Eicosenones and methylated flavonols from Amomum koenigii", Phytochemistry, 50,899-902 Heilmann J., Brun R., Mayr s., Rali T., Sticher (2001), "Minor cytotoxic and antibacterial compounds from the rhizomes of Amomum aculeatum", Phytochemistry, 57,1281 -1285 Moon S.S., Lee J.Y., Cho s.c (2004), "Isotsaokonin, an antifungal agent from Amomum tsơo-ko", Not Prod, 67,889-891 Phan M.G., Phan T.S., Matsunami K., Otsuka H (2006), "New diarylheptanoids from Amomum muricarpum Elmer", Chem Pharm Bull., 54,139-140 Phan M.G., Phan T.S., Matsunami K., Otsuka H (2012),"One new and several minor diarylheptanoids from Amomum muricarpum" Nat Prod Res., 26,1195-1200 Vanden Berghe D.A., Vlietinck AJ (1991), Methods in Plant Biochemistry, 6,47-69, Academic Press, London SỐ 3/2014: Nghiên CÚU duợcĩhông tin thuốc ... (3H, s' H3- 9 ), 1,5 2 (2H, m, 2H-11 ), 1,6 2 (1H, m, H-12b ), 1,6 6 (1H, m, H-25 ), 1,7 0 (1H, m, H-1 a ), 1,8 8 (1H, m, H-16b ), 1,9 3 (IH , dd, J = u , Hz, 3,0 Hz, H-8 ), 2,0 2 (IH , m’ H-7b ), 2,0 4 ( H, m,... H-22a ), 1,0 3 (1H, m, H-17 ), 1,1 6(1 H, m, H-14 ), u (3H, m, H-15a, 2H-23)' 1,1 8 ( H, m, H-12a ), 1,2 4 ( H, m, H-7a ), 1,2 5 (2H, m, 2H-28 ), 1,3 0 (1H, m, H-16a ), 13 (1H, m, H-22b ), 13 (1H, m' H-20 ), 1,3 8... C-16 ), 2 9,2 (d, C-25 ), 2 9,8 (d, C-8 ), 33.9 (t, C-22 ), 3 4,3 (t, C-2 ), 3 6,1 (d, C-20 ), 3 7,1 (t, C-1 ), 3 8,0 (s, C-1 0 ), 3 8,6 (t, C-7 ), 3 9,6 (t, C-1 ), 4 2,5 (s, C-13 ), 45.9 (d, C-24 ), 5 3,7 (d, C-9),