Nghiên cứu môi trường tái sinh cây dừa cạn (catharanthus roseus (l ) g don) phục vụ chuyển gen

3 Nghiên cứu ảnh hưởng tổ hợp các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin và cytokinin đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng chồi từ nách lá mầm, đoạn thân mang mắt chồi bên.. 5 N

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

TRẦN THỊ ANH

NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG TÁI SINH

CÂY DỪA CẠN (CATHARANTHUS ROSEUS (L.) G DON)

PHỤC VỤ CHUYỂN GEN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2015

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

TRẦN THỊ ANH

NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG TÁI SINH

CÂY DỪA CẠN (CATHARANTHUS ROSEUS (L.) G DON)

PHỤC VỤ CHUYỂN GEN

Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC

Mã số: 62.42.01.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN THỊ TÂM

THÁI NGUYÊN - 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Thị Tâm Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố

Thái Nguyên, tháng 5 năm 2015

Tác giả

Trần Thị Anh

Xác nhận của khoa chuyên môn Người hướng dẫn khoa học

PGS.TS Nguyễn Thị Tâm

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi nhận được sự quan tâm giúp đỡ của nhiều cá nhân và cơ quan đơn vị Nay luận văn đã hoàn thành, tôi xin bày

tỏ lòng biết ơn chân thành, sâu sắc tới:

PGS.TS Nguyễn Thị Tâm, GS.TS Chu Hoàng Mậu đã tận tình hướng

dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Trong quá trình nghiên cứu, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của kĩ thuật viên Trần Thị Hồng (Phòng Công nghệ tế bào, Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên) Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó

Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô Bộ môn Di truyền và Sinh học hiện đại, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện quá trình nghiên cứu

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn Ban chủ nhiệm khoa, các thầy cô giáo, cán bộ khoa, các thầy cô giáo thuộc khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã nhiệt tình giảng dạy, tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn

Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập

Thái Nguyên, tháng 5 năm 2015

Tác giả

Trần Thị Anh

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vi

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu chung về cây dừa cạn 3

1.1.1 Nguồn gốc, phân loại 3

1.1.2 Đặc điểm hình thái của cây dừa cạn 3

1.1.3 Phân bố sinh thái 5

1.1.4 Kỹ thuật trồng dừa cạn 5

1.1.5 Ứng dụng của cây dừa cạn trong y học 7

1.2 Nhân giống in vitro bằng công nghệ tế bào thực vật 9

1.2.1 Ưu thế và các phương thức nhân giống in vitro 9

1.2.2 Quy trình nhân giống in vitro 13

1.3 Chất điều hòa sinh trưởng sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật 14

1.3.1 Auxin 14

1.3.2 Cytokinin 16

1.4 Một số nghiên cứu nuôi cấy dừa cạn bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro 17

1.4.1 Tình hình nuôi cấy in vitro dừa cạn trên thế giới 17

1.4.2 Tình hình nuôi cấy in vitro cây dừa cạn ở Việt Nam 20

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Vật liệu, hoá chất 22

2.1.1 Vật liệu thực vật 22

2.1.2 Hóa chất, thiết bị 22

2.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 22

2.2 Phương pháp nghiên cứu 22

2.2.1 Pha môi trường 22

2.2.2 Khử trùng hạt 23

2.2.3 Nghiên cứu môi trường phát sinh chồi và sinh trưởng 23

2.2.4 Phương pháp gây tổn thương tạo chồi 24

2.2.5 Nghiên cứu môi trường tạo rễ 24

2.2.6 Nghiên cứu giá thể đưa cây ra tự nhiên 25

2.2.7 Xử lí và tính toán số liệu 26

2.3 Điều kiện thí nghiệm 26

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Kết quả khử trùng hạt 27

3.2 Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên, nách lá mầm 29

3.2.1 Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi và sinh trưởng của chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên 30

3.2.2 Ảnh hưởng của kinetin đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên 32

3.2.3 Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng chồi từ nách lá mầm 34

3.3 Ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và NAA, BAP và IBA đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên, nách lá mầm

dừa cạn 36

3.3.1 Ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và NAA đến phát sinh chồi và sự sinh trưởng của chồi tái sinh từ đoạn thân mang mắt chồi bên 37

3.3.2 Ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và IBA đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng của chồi tái sinh từ đoạn thân mang mắt chồi bên 39

3.3.3 Ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và IBA đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng của chồi dừa từ nách lá mầm 41

3.4 Kết quả tạo đa chồi bằng phương pháp gây tổn thương 44

3.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA, IBA đến khả năng ra rễ của chồi dừa cạn trong ống nghiệm 46

3.5.1 Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của chồi dừa cạn trên môi trường MS 46

3.5.2 Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của chồi dừa cạn trên môi trường MS 47

3.5.3 Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của chồi dừa cạn trên môi trường ½ MS 50

3.6 Kết quả ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống và sự sinh trưởng của cây con trong vườn ươm 51

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

PHỤ LỤC

DNA : Deoxyribonucleic acid

HPLC : Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng IAA : Indole-3-acetic acid

IBA : Indole-3-butyric acid

KIN : Kinetin

MS : Murashige và Skoog, 1962

NAA : Naphthalene acetic acid

WHO : Tổ chức y tế thế giới

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả khử trùng hạt (sau 10 ngày) 27

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng của chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên 30

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của kinetin đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên 33

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của BAP đến phát sinh chồi và sự sinh trưởng của chồi từ nách lá mầm 35

Bảng 3.5 Ảnh hưởng kết hợp của BAP 1,0mg/l và NAA đến sự phát sinh chồi và sinh trưởng của chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên 38

Bảng 3.6 Ảnh hưởng kết hợp của BAP 1,0mg/l và IBA đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng của chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên 40

Bảng 3.7 Ảnh hưởng kết hợp của BAP 0,5mg/l và IBA đến sự phát sinh chồi sự sinh trưởng của chồi từ nách lá mầm 42

Bảng 3.8 Kết quả tạo đa chồi sau khi gây tổn thương 44

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ 47

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ 48

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ của dừa cạn (sau 8 tuần) 50

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống và sinh trưởng của dừa cạn (sau 45 ngày) 51

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cây dừa cạn 4Hình 1.2 Hoa của ba giống Catharanthus roseus 5Hình 3.1 Ảnh hưởng thời gian khử trùng đến sự nảy mầm của hạt dừa cạn 28Hình 3.2 Ảnh hưởng của BAP 1,0mg/l đến phát sinh chồi và sự sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên (sau 8 tuần) 31Hình 3.3 Ảnh hưởng của kinetin 1,0mg/l đến phát sinh chồi và sự sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên (sau 8 tuần) 34Hình 3.4 Ảnh hưởng của BAP 0,5 mg/l đến phát sinh chồi và sự sinh trưởng chồi từ nách lá mầm 36Hình 3.5 Ảnh hưởng kết hợp của BAP 1,0mg/l và NAA 0,4mg/l đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng của chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên

(sau 8 tuần) 39Hình 3.6 Ảnh hưởng kết hợp của BAP 1,0mg/l và IBA 0,6mg/l đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên 40Hình 3.7 Ảnh hưởng kết hợp của BAP 0,5mg/l và IBA 0,4mg/l

đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng chồi từ nách lá mầm 43Hình 3.8 Kết quả tạo đa chồi sau khi gây tổn thương 45Hình 3.9 Rễ dừa cạn trong môi trường bổ sung NAA 0,2mg/l (sau 8 tuần) 47Hình 3.10 Rễ dừa cạn trong môi trường bổ sung IBA 0,2mg/l

trên môi trường MS (sau 8 tuần) 49Hình 3.11 Rễ dừa cạn trong môi trường bổ sung IBA 0,2mg/l

trên môi trường ½ MS (sau 8 tuần) 51Hình 3.12 Ảnh hưởng của giá thể đất hỗn hợp đất thịt + phù sa +cát

đến sự sinh trưởng của dừa cạn 52

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Hiện nay, tỉ lệ ung thư trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng gia tăng rất nhanh, đặc biệt ung thư có tỉ lệ rất cao ở các nước đang phát triển Theo thống kê tổ chức y tế thế giới WHO, tính đến năm 2012 mỗi năm có khoảng 14 triệu người mắc mới, 8,2 triệu người tử vong do ung thư, còn ở Việt Nam tính đến thời điểm hiện tại có khoảng 250.000 người mắc ung thư, hàng năm có

thêm khoảng 150000 bệnh nhân mắc mới, số người tử vong mỗi năm 75.000

người Hiện nay nhu cầu thuốc chưa ung thư nói riêng và các loại bệnh khác nói chung rất cao đặc biệt các chế phẩm thuốc từ cây dược liệu [27]

Tại “Chiến lược quốc gia phát triển ngành dược Việt Nam giai đoạn đến năm 2020 và tầm nhìn đến năm 2030” (được ban hành theo quyết định số 68/QĐ -TTg ngày 10/01/2014 của Thủ tướng Chính phủ), đưa ra mục tiêu cụ thể đến năm 2020 Việt Nam phấn đấu sản xuất được 20% nhu cầu nguyên liệu cho sản xuất thuốc trong nước Thuốc sản xuất trong nước chiếm 80% tổng giá trị thuốc tiêu thụ trong năm, trong đó thuốc từ dược liệu chiếm 30% Vì thế, cần tích cực trồng, bảo tồn bảo tồn cây dược liệu Đẩy mạnh nghiên cứu, ứng dụng các tiến bộ khoa học kỹ thuật để tạo ra các loại giống dược liệu có năng suất, chất lượng đáp ứng yêu cầu sản xuất Dừa cạn là đối tượng cây dược liệu được nhà nước quan tâm để đưa vào sản xuất trên diện rộng [23]

Cây dừa cạn (Catharanthus roseu (L.) G.Don) thuộc họ Trúc Đào

(Apocyinaceae) là một loại cây cảnh phổ biến đồng thời cũng là một loại thảo dược dân gian Kinh nghiệm dùng dừa cạn chữa bệnh được ghi nhận ở Ấn Ðộ, Châu Úc, Nam Châu Phi, quần đảo Antilles [12] Các nhà nghiên cứu khoa học

đã khám phá ra khả năng chữa bệnh của dừa cạn nhờ nó chứa nhiều hợp chất alkaloid Tất cả các alkaloid có trong dừa cạn thì vinblastine và vincritine là 2 chất có tác dụng tốt trong chữa một số loại ung thư, còn ajmalicine và serpentine là thuốc điều trị tim mạch rất tốt, đặc biệt rối loạn thần kinh tim

Vinblastine và vincristine là thuốc lựa chọn hàng đầu trong điều trị ung thư máu [28] Hàm lượng 2 loại alkaloid này trong dừa cạn tự nhiên rất thấp khoảng một phần vạn trong lá đối với vinblastine, đối với vincristine thì ít hơn

10 lần nữa [4] Một trong những biện pháp tăng lượng alkaloid trong dừa cạn là phương pháp chuyển gen tăng hoạt tính của enzyme xúc tác các phản ứng tạo alkaloid Tuy nhiên, để chuyển gen thành công điều kiện tiên quyết là phải xây dựng hệ thống tái sinh phù hợp

Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi lựa chọn đề tài luận văn:

“Nghiên cứu môi trường tái sinh cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don) phục vụ chuyển gen”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Tìm được môi trường thích hợp cho tái sinh cây dừa cạn (Catharanthus

roseus (L.) G Don) phục vụ chuyển gen

3 Nội dung nghiên cứu

(1) Nghiên cứu khử trùng hạt tạo vật liệu ban đầu cho các bước nghiên cứu tiếp theo

(2) Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng chồi từ nách lá mầm, đoạn thân mang mắt chồi bên

(3) Nghiên cứu ảnh hưởng tổ hợp các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin và cytokinin đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng chồi từ nách

lá mầm, đoạn thân mang mắt chồi bên

(4) Nghiên cứu phương pháp gây tổn thương tạo đa chồi

(5) Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin đến khả năng tạo rễ ở cây dừa cạn

(6) Xác định loại giá thể thích hợp để đưa cây ra ngoài tự nhiên

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về cây dừa cạn

1.1.1 Nguồn gốc, phân loại

Tên gọi:

Dừa cạn có tên khoa học là Catharanthus roseus (L.) G Don Ngoài ra

còn có các tên khác: Bông dừa, Hải đằng, Trường xuân hoa, Phjắc pót đông (Tày) Dừa cạn có tên nước ngoài là: Madagasca periwinkle, red periwinkle, pink periwinkle, rosy-flower Indian periwinkle, cape periwinkle, old maid (Anh); Pervenche malgache, Pervenche-tropicale (Pháp) [8], [26]

Phân loại:

Dừa cạn thuộc giới thực vật (Plantae) Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida) Bộ Ngọc Lan (Apocynales) Họ Trúc đào (Apocynaceae) Chi Cantharanthus [8], [26]

Chi Catharanthus thuộc họ trúc đào (Apocynaceae), gồm 8 loài, hầu hết

là cây thân thảo sống lâu năm, trong đó chỉ có 1 loài có nguồn gốc Ấn Độ còn lại có nguồn gốc Madagascar Bộ nhiễm sắc thể của tất cả các loài là 2n = 16 [3], [12]

(1) Catharanthus coriaceus Markgr

(2) Catharanthus lanceus (Bojer ex A DC.) Pichon

(3) Catharanthus longgifolius (Pichon) Pichon

(4) Catharanthus ovalis Markgr Madagascar

(5) Catharanthus pusillus (Murray) G Don

(6) Catharanthus roseus (L.) G Don

(7) Catharanthus scitulus (Pichon) Pichon

(8) Catharanthus trichophyllus (Baker) Pichon

Dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don) Madagascar, có nguồn gốc

Madagascar đã di nhập sang khu vực Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam

1.1.2 Đặc điểm hình thái của cây dừa cạn

Dừa cạn là cây thân thảo sống lâu năm, cao 40 - 60cm, phân nhiều cành,

cây có bộ rễ phát triển, thân ở phía gốc hóa gỗ

Lá mọc đối, thuôn dài, đầu lá hơi nhọn, cuống lá hẹp Kích thước lá dài 4 -6cm, rộng 2 - 3cm, hai mặt lá nhẵn, mặt trên sẫm bóng, mặt dưới nhạt

Hoa có màu trắng hoặc hồng tím, có mùi thơm Hoa mọc riêng lẻ ở kẽ lá gần ngọn Hoa có 3 loại: hoa có màu trắng, màu tím hồng, và loại hoa phía ngoài cánh hoa màu trắng phần tâm màu đỏ Ống tràng dài 2,5 - 3cm, tràng hoa có đường kính 2cm - 4cm có 5 thùy tương tự như cánh hoa

Quả là một cặp quả đại dài 2 - 4 cm, rộng 3mm, hơi ngả sang hai bên, trên vỏ có vạch dọc, đầu quả hơi tù chứa 12 - 20 hạt nhỏ màu nâu nhạt, hình trứng trên mặt quả có các hạt nổi thành đường chạy dọc Mùa hoa, quả gần như quanh năm [8], [26]

Hình 1.1 Cây dừa cạn

Dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don) là nguồn giàu alkaloid thuộc

chủng loại alkaloid terpenoid indole được phát hiện từ 3 giống cây khác nhau:

(i) Catharanthus roseus var roseus với hoa màu tím hồng; (ii)

Catharanthus roseus var ocellatus với hoa màu trắng; (iii) Catharanthus

roseus var albus với hoa màu trắng nhụy đỏ

A B C

Hình 1.2 Hoa của ba giống Catharanthus roseus

(A: Catharanthus roseus var roseus; B: Catharanthus roseus var ocellatus C: Catharanthus roseus var albus)

1.1.3 Phân bố sinh thái

Dừa cạn mọc hoang dại và được trồng ở nhiều nước trên thế giới như Việt Nam, Ấn Độ, Trung Quốc, Indonexya, Braxin, Châu phi, Châu Úc… Tại Châu Âu và Châu Mỹ những nơi nóng dừa cạn được trồng quanh năm, những nơi lạnh cây được trồng theo mùa [8]

Ở Việt Nam, cây dừa cạn mọc tự nhiên nhiều ở vùng bãi cát ven biển từ Hải Phòng đến Kiên Giang Nơi tập trung nhiều nhất thuộc các tỉnh Nghệ An,

Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên, Khánh Hòa Ngoài ra, dừa cạn còn có ở Côn Đảo và Phú Quốc Ở những vùng ven biển dừa cạn mọc thuần trên các bãi cát dưới rừng phi lao, trảng cây bụi thấp,

có khả năng chịu đựng điều kiện đất đai khô cằn của vùng cát ven biển Dừa cạn còn được trồng khắp nơi trong nước để làm cảnh và làm thuốc [8]

1.1.4 Kỹ thuật trồng dừa cạn

Dừa cạn là loại cây ưa sáng, ưa ẩm, có khả năng chịu được hạn Trong điều kiện trồng trọt, khi được cung cấp các điều kiện cần thiết, cây sinh trưởng phát triển mạnh, khối lượng tươi thu được có thể cao gấp đôi cây mọc

từ tự nhiên

Trong tự nhiên, hạt nảy mầm đạt khoảng 40%, nếu được xử lí có thể tăng lên 90% Cây trồng từ hạt ra hoa sau 4 - 5 tháng Trong thời kì sinh trưởng, nếu

bị cắt cây tái sinh chồi khỏe

Nguồn cây dừa cạn mọc tự nhiên ở Việt Nam tương đối dồi dào Trước năm 1975, miền Bắc đã từng xuất khẩu sang Đông Âu 1 - 3 tấn/năm Những năm gần đây, lượng xuất khẩu sang Pháp (khoảng trên 10 tấn/năm) thường xuyên hơn, nhưng chủ yếu từ cây trồng tại Phú Yên [8]

Vào năm 1970, Viện Dược Liệu tiến hành nghiên cứu kỹ thuật trồng dừa cạn trên quy mô sản xuất lớn Cây được nhân giống bằng hạt, mỗi hecta cần gieo 500 - 700gr hạt trong vườn ươm Thời vụ gieo hạt vào tháng 9, 10 hoặc tháng 1, 2 Ngâm hạt 3 - 4 giờ, vớt ra để ráo rồi gieo lên luống của vườn ươm

đã được chuẩn bị kỹ, sau đó phủ rơm rồi tưới nước Sau khoảng một tuần, hạt nảy mầm, cần tháo bỏ rơm rạ Khi cây có 3 - 4 lá thật (khoảng 45 ngày sau khi gieo) đánh đi trồng Có thể gieo thẳng nhưng cách này tốn công chăm sóc [11]

Dừa cạn ưa đất pha cát, đất phù sa, chịu hạn, kém chịu úng Đất cần làm

kỹ, lên luống 20cm, mặt luống rộng 50 - 60cm, dùng 10-15 tấn phân chuồng (đã hoại mục) và 120-150kg super lân để bón lót Trồng với khoảng cách 30x30cm, sau khi trồng cần tưới ngay để cây mau bén rễ Tưới thúc cho mỗi hecta 100-200kg urê, tưới 2 lần, cách nhau 1 tháng Mặc dù cây chịu được hạn nhưng phải giữ đủ ẩm thường xuyên [11]

Sau khi trồng 3-4 tháng cây cho thu hoạch, cành mang lá 10-15cm được cắt về phơi sấy khô Ở đất thoát nước và chăm bón tốt có thể thu hoạch nhiều lứa, trung bình 1 hecta thu được 1-1,2 tấn cây khô mỗi lứa [11]

Dừa cạn là một giống cây có khả năng chịu hạn cao và có thời gian canh tác ngắn Các kết quả thử nghiệm của Trung tâm Nghiên cứu trồng và chế biến cây thuốc Đà Lạt cho thấy, cây dừa cạn có thể phát triển tốt trên đất cát khô hạn ven biển các tỉnh miền Trung, chỉ sau 5 tháng cây đã trưởng thành và tích lũy đủ hàm lượng alkaloid đạt tiêu chuẩn xuất khẩu [11]

1.1.5 Ứng dụng của cây dừa cạn trong y học

1.1.5.1 Thành phần alkaloid trong cây dừa cạn

Alkaloid là những chất hữu cơ có chứa dị vòng nitơ, có tính base, thường gặp trong nhiều loại thực vật và đôi khi còn tìm thấy trong một vài loài động vật Trong cây dừa cạn, có trên 70 loại alkaloid, trong đó 2 alkaloid là vinblastine và vincristine là hai hợp chất quan trọng nhất Alkaloid có trong tất

cả các bộ phận của cây, nhiều nhất trong lá và rễ Dừa cạn có tỷ lệ alkaloid toàn phần là 0,1- 0,2% Rễ chính chứa hoạt chất 0,7 - 2,4%; thân 0,46%; lá: 0,37 - 1,15%; rễ phụ: 0,9 - 3,7%; hoa: 0,14 - 0,84%; vỏ quả 1,14; hạt 0,18% Các chất chủ yếu là: vinblastine, vincristine, tetrahydroalstonine, prinine, vindoline, catharanthine, vindolinine, ajmalicine [24], [26]

Căn cứ vào cấu tạo hóa học, alkaloid trong cây dừa cạn được chia làm ba nhóm chính [26]:

Nhóm alkaloid nhân indol: Perivine, peviridine, perosine, catharanthine, cavicine, ajmalicine

Nhóm alkaloid nhân indolin: vindoline, ajmaline, lochnericine, lochneridine, lochrovine

Nhóm alkaloid có 2 vòng indol hoặc một vòng indol và một vòng indolin như leurosine, leubcosidine đặc biệt các alkaloid có tác dụng chữa bệnh ung thư nhưng có hàm lượng rất thấp như: Vinblastine (vincaleucoblastine) 0,005 - 0,015% trong lá, vincristine (leucocristine) 0,003 - 0,005% trong lá

1.1.5.2 Tác dụng dược lý của alkaloid chứa trong dừa cạn

Năm 1952, y học đã phát hiện ra dược tính của dừa cạn Đến năm 1958 bác sĩ Clark Noble Canada đã nghiên cứu và chiết xuất được alkaloid vinblastine Sau đó vài năm người ta cũng tìm ra được vincristine từ lá dừa cạn [8] Đây là những chất có tác dụng điều trị bệnh ung thư khi chuyển về dạng muối sunfat Alkaloid vinblastine và vincristine, là những chất ức chế sự phân bào Các alkaloid này liên kết đặc hiệu với tubulin, phong bế sự tạo thành các

vi ống và gây ngừng phân chia tế bào Ở nồng độ cao vinblastine và vincristine diệt được tế bào, còn ở nồng độ thấp làm ngừng phân chia tế bào Trên thị trường, thuốc Vinblastine (có tên Velban) là thành phẩm độc bảng A, thường đóng ống 5-10mg chế phẩm khô kèm theo 1 ống dung môi Riêng vinblastine ít

ảnh hưởng đến hồng cầu và tiểu cầu [28]

Ngoài ra, dừa cạn có vị hơi đắng, tính mát, có tác dụng kháng ung thư, trấn tĩnh, an thần, hạ huyết áp, thanh nhiệt, giải độc, hoạt huyết, tiêu thũng Dừa cạn được nghiên cứu làm thuốc kìm hãm sự phát triển tế bào và được chỉ định trong điều trị bệnh Hodgkin (một loại ung thư hệ bạch huyết), bệnh bạch cầu lymphô cấp và một số loại ung thư khác Trong dân gian, dùng dừa cạn trị cao huyết áp, trị bệnh đái đường, điều kinh, chữa tiêu hóa kém và chữa lỵ, thông tiểu tiện, chữa bệnh đi tiểu đỏ và ít Có người dùng dừa cạn trị ung thư máu, ung thư phổi, ngăn cản sự phát triển của thai trên động vật mang thai và kháng một số chủng nấm gây bệnh [3]

1.1.5.3 Một số bài thuốc dân gian từ cây dừa cạn

Theo kinh nghiệm sử dụng trong y học dân tộc của một số nước trên thế giới như Ấn Độ, Trung Quốc và theo y học dân tộc Việt Nam, rễ dừa cạn

có tác dụng tẩy giun, chữa sốt Thân và lá có tác dụng làm săn da, lọc máu, dùng chữa một số bệnh ngoài da và nhất là chữa đái đường [8] Dừa cạn còn có tác dụng chữa nhiều loại bệnh [25]:

Bệnh máu trắng: Lấy thân và lá cây dừa cạn sắc uống khoảng 15g

khô/ngày

Tăng huyết áp: Lấy 20g thân lá dừa cạn khô sao vàng và 20g lá dâu, sắc

lấy nước, chia uống từ 2 - 3 lần mỗi ngày Cách khác, lấy 6g hoa dừa cạn, 10g

nụ hoa hoè (hoặc 10g cúc hoa), hãm với nước sôi trong bình kín khoảng 20 phút Uống thay nước trà mỗi ngày

Ung thư máu, viêm đại tràng: Lấy từ 15 - 20g thân lá dừa cạn khô sao

vàng, sắc, chia từ 2 - 3 lần uống trong ngày

Mất ngủ: Lấy 20g thân lá dừa cạn khô sao vàng, 12g lá vông nem, 12g

hạt muồng sao đen, sắc uống trước khi đi ngủ

Rong kinh: Lấy từ 20 - 30g dừa cạn sao vàng (toàn cây có cả hoa và rễ),

sắc lấy nước, uống liên tục từ 3 - 5 ngày

Chữa bỏng nước sôi: Lá dừa cạn tươi lượng vừa đủ, giã nát, nhuyễn với

chút gạo, đắp lên tổn thương bỏng

Điều trị Zôna thần kinh: Dừa cạn (sao vàng hạ thổ) 16g, thổ linh 16g,

bạch linh 10g, kinh giới 12g, chi tử 10g, nam tục đoạn 16g, cam thảo đất 16g,

hạ khô thảo 16g Sắc uống ngày 1 thang, sắc 3 lần, uống 3 lần Thuốc đắp: lá dừa cạn, lá cây hòe Hai thứ lượng bằng nhau, giã nhỏ đắp lên các tổn thương,

băng lại Tác dụng: làm giảm đau nhức

Điều trị lị trực trùng: Đi ngoài nhiều lần, bụng đau từng cơn, phân có chất

nhầy, có máu mũi, sút cân nhanh Bài thuốc: dừa cạn (sao vàng hạ thổ) 20g, cỏ sữa 20g, cỏ mực 20g, chi tử 10g, lá khổ sâm 20g, hoàng liên 10g, rau má 20g, đinh lăng 20g Đổ 3 bát nước sắc lấy 1,5 bát, chia 3 lần uống trong ngày

U xơ tuyến tiền liệt: Dừa cạn 12g, huyền sâm 12g, xuyên sơn 10g, chè

khô 12g, hoàng cung trinh nữ 5g, cát căn 16g, bối mẫu 10g, đinh lăng 16g Sắc

uống ngày 1 thang, chia 3 lần

1.2 Nhân giống in vitro bằng công nghệ tế bào thực vật

1.2.1 Ưu thế và các phương thức nhân giống in vitro

1.2.1.1 Ưu thế nhân giống in vitro

Kĩ thuật nhân giống in vitro phát triển và mở rộng trong những năm gần

đây do nhu cầu về lượng giống cây trồng tăng cao Các giống cây trồng cần lượng lớn nhằm phục vụ dự án trồng lại rừng, sản xuất lương thực, thực phẩm,

dược liệu, thức ăn gia súc và bảo vệ môi trường Nhân giống in vitro có những

ưu điểm nổi bật mà các loại hình nhân giống khác không có được, đó là:

(1) Đưa ra sản phẩm nhanh hơn: Từ một cây ưu việt bất kì có thể tạo ra một quần thể có độ đồng đều cao với số lượng không hạn chế, phục vụ sản xuất thương mại, dù cây đó là dị hợp về mặt di truyền[1], [2], [6], [14]

(2) Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: Trong hầu hết các trường hợp, công nghệ vi nhân giống đáp ứng tốc độ nhân nhanh cao, từ một cây trong vòng

1 - 2 năm có thể tạo thành hàng triệu cây [1], [2], [6]

(3) Sản phẩm cây giống đồng nhất: Vi nhân giống về cơ bản là công nghệ nhân dòng, tạo ra quần thể có độ đồng đều cao dù xuất phát từ cây mẹ có kiểu gen dị hợp hay đồng hợp [1], [2], [14]

(4) Tiết kiệm không gian: Vì hệ thống sản xuất hoàn toàn trong phòng thí nghiệm, không phụ thuộc vào thời tiết và các vật liệu khởi đầu có kích thước nhỏ Mật độ cây tạo ra trên một đơn vị diện tích lớn hơn rất nhiều so với sản xuất trên đồng ruộng và trong nhà kính theo phương pháp truyền thống [1], [2], [14]

(5) Nâng cao chất lượng cây giống: Nuôi cấy mô là một phương pháp hữu hiệu để loại trừ virut, nấm khuẩn khỏi các cây giống đã nhiễm bệnh Cây giống sạch bệnh tạo ra bằng cấy mô thường tăng năng suất 15 - 30% so với giống gốc [1], [14]

(6) Khả năng tiếp thị sản phẩm tốt hơn và nhanh hơn: Các dạng sản

phẩm khác nhau có thể tạo ra từ hệ thống vi nhân giống như cây con in vitro

(trong ống nghiệm) hoặc trong bầu đất Các cây giống có thể được bán ở dạng cây, củ bi hay thân củ [1], [6], [9]

(7) Lợi thế về vận chuyển: Các cây con kích thước nhỏ có thể vận chuyển đi xa dễ dàng và thuận lợi, đồng thời cây con tạo ra trong điều kiện vô trùng được xác nhận là sạch bệnh Do vậy, bảo đảm an toàn, đáp ứng các quy định về vệ sinh thực vật quốc tế [6], [9], [14]

(8) Sản xuất quanh năm: Quá trình sản xuất có thể tiến hành vào bất kì thời gian nào, không phụ thuộc mùa vụ [6], [9], [14]

1.2.1.2 Các phương thức nhân giống in vitro

* Nuôi cấy mô phân sinh (đỉnh sinh trưởng)

Khái niệm mô phân sinh chỉ đúng khi mẫu vật nuôi cấy được tách từ

trưởng Trong thực tế thường gặp khó khăn lớn trong việc nuôi thành công các đỉnh sinh trưởng riêng rẽ như vậy nên người ta chỉ áp dụng hình thức nuôi cấy

mô phân sinh với mục đích làm sạch virus cho cây trồng [1], [2], [6]

Độ lớn của mô nuôi cấy có mối tương quan chặt chẽ với tỉ lệ sống, khả năng cảm ứng và mức độ ổn định về mặt di truyền Nếu độ lớn mô tăng thì tỉ lệ sống và tính ổn định tăng, nhưng có thể làm giảm khả năng cảm ứng của số chồi/mô nuôi cấy và ngược lại Tuy nhiên, nếu xét về hiệu quả kinh tế (thể tích bình nuôi, lượng dung dịch môi trường dinh dưỡng…), nếu độ lớn tăng thì hiệu quả kinh tế giảm, nếu độ lớn giảm thì hiệu quả kinh tế tăng Do đó, phải có sự kết hợp hài hòa giữa các yếu tố trên để tìm ra kích thước mẫu tối ưu [6]

Một đỉnh sinh trưởng nuôi cấy ở điều kiện thích hợp sẽ tạo ra một hay nhiều chồi và mỗi chồi sẽ phát triển thành một cây hoàn chỉnh Xét về nguồn gốc của các cây đó có ba khả năng: (i) cây phát triển từ chồi đỉnh (chồi ngọn), (ii) cây phát triển từ chồi nách phá ngủ, (iii) cây phát triển từ chồi mới phát sinh Tuy nhiên, trong thực tế rất khó phân biệt được chồi phá ngủ và chồi mới phát sinh [14]

Có hai phương thức phát triển cây hoàn chỉnh từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

đó là: (1) Phát triển cây trực tiếp, thường gặp chủ yếu ở các đối tượng cây hai lá mầm như: hoa cúc, cẩm chướng, khoai tây, thuốc lá…(2) Phát triển cây thông qua giai đoạn protocorm, thường gặp chủ yếu ở các đối tượng cây một lá mầm như phong lan, dứa, huệ… Từ một đỉnh sinh trưởng ban đầu cùng lúc tạo ra hàng loạt protocorm và các protocorm này có thể tiếp tục phân chia thành các protocorm mới hoặc phát triển thành cây hoàn chỉnh Bằng phương thức này chỉ trong một thời gian ngắn người ta có thể thu được hàng triệu cá thể [6]

* Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây

Ngoài đỉnh sinh trưởng là bộ phận nuôi cấy dễ thành công thì các bộ phận còn lại của cơ thể thực vật (ngoại trừ các mô đã hóa gỗ) cũng đều có thể

sử dụng cho việc nhân giống in vitro, chẳng hạn như đoạn thân, mảnh lá, các bộ

phận của hoa, vảy củ [1], [6], [14]

Sự phát sinh hình thái trực tiếp từ mẫu nuôi cấy bắt đầu từ các tế bào nhu

mô nằm ở trong biểu bì hoặc ngay phía dưới bề mặt của thân Một số tế bào này trở thành mô phân sinh và các túi nhỏ gọi là thể phân sinh phát triển Khả năng cảm ứng của mô thực vật cũng tùy thuộc vào nồng độ của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, chủ yếu phụ thuộc vào tỉ lệ nồng độ giữa auxin và cytokinin Tỉ lệ này lớn hơn 1 thì thường có khuynh hướng tạo rễ, tỉ lệ này nhỏ hơn 1 thường có khuynh hướng tạo chồi, nếu tỉ lệ này bằng 1 thì mô nuôi cấy thường phát sinh callus [1], [6], [14]

* Nhân giống in vitro qua giai đoạn mô sẹo (callus)

Nếu tái sinh cây hoàn chỉnh trực tiếp từ mẫu vật cấy ban đầu thì thu được nhanh chóng các cây khá đồng nhất về mặt di truyền, tuy nhiên trong nhiều trường hợp mô nuôi cấy không tái sinh cây ngay mà phát triển thành khối mô sẹo Tế bào mô sẹo khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền, để tránh tình trạng đó cần sử dụng mô sẹo vừa phát sinh để thu được cây tái sinh đồng nhất về di truyền Thông thường, người ta chỉ tiến hành nhân giống qua giai đoạn mô sẹo đối với những đối tượng khó tái sinh cây trực tiếp [1], [2], [6], [9], [14]

* Nhân giống thông qua phát sinh phôi vô tính - công nghệ hạt nhân tạo

Phôi vô tính là các cá thể nhân giống có cực tính bắt nguồn từ các tế bào soma Chúng rất giống phôi hữu tính ở hình thái, quá trình phát triển và sinh lí, nhưng do không phải là sản phẩm của quá trình thụ tinh giữa giao tử đực và giao tử cái, vì vậy không có quá trình tái tổ hợp di truyền, do đó các phôi vô tính có nội dung di truyền giống hệt với các tế bào soma đã sinh ra chúng [6]

Khả năng tạo phôi vô tính trong nuôi cấy mô thực vật, ngoài các điều kiện môi trường, điều kiện nuôi cấy, còn phụ thuộc rất lớn vào loài, vào các giống, dòng trong cùng một loài Khả năng này đã được chứng minh là do một hoặc vài gene phụ trách Vì vậy, bằng biện pháp lai tạo có thể chuyển khả năng tạo phôi vô tính cao từ cây này qua cây khác [6]

Hạt nhân tạo là phôi vô tính bọc trong một lớp vỏ polymer như agar, agarose, alginatc… Trong cấu trúc lưới của lớp vỏ đó, nước, chất dinh dưỡng được cung cấp thay cho nội nhũ, giúp cho phôi vô tính có thể nảy mầm trở thành cây hoàn chỉnh [6]

1.2.2 Quy trình nhân giống in vitro

Theo tác giả Nguyễn Đức Thành (2000) quy trình nhân giống gồm những bước sau:

(1) Chuẩn bị vật liệu gốc

Trong quá trình nuôi cấy in vitro cây con sẽ mang những đặc tính và tính

trạng của cây mẹ ban đầu, nên trong giai đoạn này cần chọn lọc cây mẹ cẩn thận, có nhiều đặc tính ưu việt Sau đó, chọn cơ quan để lấy mẫu Mô chọn để nuôi cấy thường là mô có khả năng tái sinh cao trong môi trường nuôi cấy sạch bệnh, giữ được đặc tính sinh học quý của cây mẹ, ít nguy cơ bị biến dị.Tùy theo điều kiện giai đoạn này có thể kéo dài 3 đến 6 tháng [9]

(2) Thiết lập hệ thống cấy vô trùng

Đây là giai đoạn chuyển mẫu vật từ ngoài vào môi trường nuôi cấy để tạo nguyên liệu sạch bệnh cho nhân giống, giai đoạn này được tiến hành theo các bước: (i) Khử trùng bề mặt mẫu vật và môi trường nuôi cấy: (ii) Cấy mẫu vật vào ống nghiệm hoặc bình nuôi cấy có sẵn môi trường nhân Các mẫu nuôi cấy nếu không bị nhiễm khuẩn, nấm, virus sẽ được nuôi trong môi trường nuôi cấy với điều kiện nhiệt độ ánh sáng phù hợp Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào các đối tượng nhân giống, thông thường kéo dài từ 2 đến 12 tháng, hoặc ít nhất 4 lần cấy chuyển [9]

(3) Nhân nhanh chồi

Đối với môi trường nhân chồi người ta sử dụng các kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokin (BAP, kinetin) với nồng độ khác nhau tùy đối tượng cây Quy trình cấy chuyển, nhân nhanh chồi thường trong 1-2 tháng tùy loài cây Giai đoạn này thường kéo dài 10 đến 36 tháng Giai đoạn nhân

nhanh từ một vài chồi ban đầu không nên kéo dài quá lâu để tránh sự hình thành biến dị soma [9]

(4) Tạo rễ (tạo cây hoàn chỉnh)

Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát triển rễ tự sinh, nhưng thông thường các chồi này phải cấy chuyển sang một môi trường khác

để kích thích tạo rễ Đối với môi trường tạo rễ, người ta thường sử dụng chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin (NAA, IAA, IBA) Thông thường giai đoạn này kéo dài 2 đến 8 tuần tùy đối tượng [9]

(5) Chuyển cây ra đất trồng

Đây là giai đoạn đầu cây chuyển từ điều kiện vô trùng trong ống nghiệm

ra ngoài môi trường tự nhiên Cây nuôi cấy in vitro được sinh trưởng và phát

triển trong những điều kiện tối ưu về nhiệt độ, độ ẩm, pH, dinh dưỡng… Vì vậy, trước khi đưa ra trồng người ta cần huấn luyện cây để thích nghi với điều kiện tự nhiên Cây được chuyển từ môi trường bão hòa hơi nước sang vườn ươm với các điều kiện khó khăn hơn nên vườn ươm phải đáp ứng cần phải đáp ứng các yêu cầu: che cây bằng nilon, có hệ thống phun sương cung cấp độ ẩm

và làm mát cây, giá thể trồng cây phải là đất hoặc các hỗn hợp nhân tạo không chứa đất như mùn cưa và bọt biển Giai đoạn này đòi hỏi từ 4 đến 16 tuần [9]

1.3 Chất điều hòa sinh trưởng sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật

Ngoài các chất cung cấp dinh dưỡng cho mô nuôi cấy, việc bổ sung một hoặc nhiều chất điều hòa sinh trưởng như auxin, cytokinin và gibberellin là rất cần thiết để kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hóa cơ quan Tuy vậy, yêu cầu đối với những chất này thay đổi tùy theo loài thực vật, loại mô, hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng nội sinh của chúng Các chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng nhiều trong nuôi cấy mô thực vật thuộc nhóm auxin và nhóm cytokinin [14]

1.3.1 Auxin

Bản chất hóa học của auxin tự nhiên trong tế bào thực vật là axit indol axetic (IAA) và là dạng auxin đầu tiên, chủ yếu và quan trọng Trong thực vật

auxin không chỉ tồn tại ở dạng tự do mà còn ở dạng liên kết không có hoạt tính sinh học như IAA-glucose, IAA-myoinositol, IAA-glucan, IAA-aspartate… Các dẫn xuất khác của indol cũng thể hiện hoạt tính của auxin là indol tryptamine, indol acetaldehyde, indol pyruvate, indol ethanol [5]

Auxin được tổng hợp ở tất cả các thực vật bậc cao, tảo, nấm, vi khuẩn và chủ yếu ở đỉnh chồi ngọn rồi di chuyển xuống các bộ phận non của cơ thể thực vật như lá, rễ và các mô dự trữ…Auxin gồm có auxin tự nhiên và auxin tổng hợp (IBA, NAA, 2,4-D…) [5]

Auxin có nhiều vai trò khác nhau trong đời sống thực vật, liên quan tới hàng loạt các quá trình sinh lý như: Kích thích phân chia và kéo dài tế bào, kích thích sự mọc rễ ở cành giâm và kích thích sự phát sinh chồi phụ, auxin có các ảnh hưởng khác nhau đối với sự rụng lá, quả, sự đậu quả, sự phát triển và chín của quả, sự ra hoa… Do hoocmon thực vật tác động đến sinh trưởng thông qua mối tương quan nồng độ giữa các loại hoocmon nên các quá trình trên đây không chỉ ảnh hưởng của auxin mà còn của các hoocmon khác Tùy thuộc vào nồng độ hoocmon mà các mô thực vật có các kiểu phản ứng khác nhau đối với auxin Phản ứng nhanh nhất khi xử lý auxin là tăng độ kéo dài của tế bào thông qua tác dụng trực tiếp lên sự giãn nở của vách tế bào [1], [5]

Các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin gồm một vài chất đã được sử dụng từ rất lâu trong nông nghiệp Chỉ một thời gian ngắn sau khi IAA được tìm thấy trong tự nhiên, nó đã được tổng hợp và trở thành một hợp chất có giá trị Nhưng IAA không có lợi để dùng trong nông nghiệp bởi nó dễ dàng bị phân hủy thành các chất mất hoạt tính dưới ảnh hưởng của ánh sáng và vi sinh vật Một trong những tác dụng của auxin là kích thích sự hình thành rễ của những lát cắt thân Một số chất tổng hợp nhân tạo có vai trò tương tự như IAA, trong đó có IBA IBA là hợp chất có hoạt tính auxin yếu nhưng nó có khả năng

ổn định và vô hiệu hệ enzyme làm mất hoạt tính của auxin [5], [14]

Auxin thường được dùng trong nuôi cấy mô và tế bào để kích thích sự phân bào và sinh trưởng của mô sẹo, tạo phôi vô tính, tạo rễ… Những auxin

dùng rộng rãi trong nuôi cấy mô là IBA, IAA, NAA, 2,4-D Trong số các auxin, IBA và NAA chủ yếu sử dụng cho môi trường ra rễ, auxin phối hợp với cytokinin sử dụng cho môi trường ra chồi Auxin tan trong ethanol hoặc NaOH pha loãng [5], [14]

Chứng minh về khả năng ngăn cản sự vàng lá của benzyladenin (BA) là một phát hiện thu hút nhiều nhà sinh lý học từ những năm 1950 Những năm

1960, các nhà nghiên cứu thấy rằng BA có thể kích thích nhiều quá trình, BA được sử dụng trong nuôi cấy mô để kéo dài chồi và phát sinh phôi với các nồng

độ khác nhau tùy theo đối tượng thực vật nuôi cấy và mục đích nuôi cấy [5]

Cytokinin có mặt trong mọi thực vật, với hàm lượng cao nhất trong phôi

và trong quả đang phát triển Hoạt tính của chúng được tăng cường khi chúng tương tác với myo-inositol, nhưng có thể bị mất khi kết hợp trong thành phần của các glycoside [14]

Cũng như auxin, cytokinin tham gia điều hòa các phản ứng trong cây, đồng thời làm tăng các quá trình trao đổi axit nucleic và protein Cytokinin điều chỉnh sinh trưởng bằng nhiều cách như điều chỉnh tốc độ tổng hợp ADN khi phân chia tế bào, làm chậm sự lão hóa của lá, góp phần phá vỡ trạng thái ngủ của hạt, kích thích hạt nảy mầm, kích thích ra hoa và sinh trưởng của quả, gây nên sự hình thành chồi mầm trong nhiều mô, làm tăng diện tích phiến lá do kích thích sự lớn lên của tế bào [1], [14]

Trong môi trường nuôi cấy mô, cytokinin cần cho sự phân chia tế bào, tạo và nhân mô sẹo, phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc từ các cơ quan, gây tạo phôi

vô tính, kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thế của chồi đỉnh, tăng cường phát sinh chồi phụ Các loại cytokinin thường được dùng là:

kinetin, BAP… Cytokinin hòa tan trong dung dịch HCl pha loãng [5]

1.4 Một số nghiên cứu nuôi cấy dừa cạn bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro 1.4.1 Tình hình nuôi cấy in vitro dừa cạn trên thế giới

Dừa cạn là loại cây thuốc quý, chứa hợp chất alkaloid có giá trị về mặt y

dược nên đã được quan tâm nghiên cứu từ lâu trên thế giới Những năm gần đây, nhiều công trình nghiên cứu hướng sản xuất ra các loại alkaloid trong điều

kiện nuôi cấy in vitro

Agnieszka Pietrosiuk và CS (2007) đã nghiên cứu phương pháp nuôi cấy

Catharanthus roseus trong điền kiện in vitro, cung cấp nguồn nguyên liệu thực

vật để sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp từ alkaloid Dưới sự tác động của enzyme, alkaloid monomerice, vindoline và catharanthine hình thành

vinblastine trong tế bào nuôi cấy in vitro Kết quả quan trọng của nghiên cứu

này là, ajmalicine tổng hợp với lượng lớn từ mô sẹo, catharanthine thu được trong lá và tế bào nuôi cấy trong bình bioreactor Rễ tơ được tạo ra bằng cách

nhiễm vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes vào mô sẹo Các chất chuyển hóa

thứ cấp mức thu được từ rễ tơ cao hơn so với các cây ngoài tự nhiên Các alkaloid chiếm ưu thế trong rễ tơ là ajmalicine, serpentine, vindoline và catharanthine hàm lượng cao hơn trong rễ chưa chuyển gen [15]

Felipe Vázquez-Flota (2008), nghiên cứu ảnh hưởng cường độ và thời gian chiếu sáng tới quá trình tổng hợp vindoline của dừa cạn trong điều kiện

nuôi cấy in vitro Nuôi cấy dừa cạn trong ống nghiệm, thời gian chiếu sáng 16

giờ/ngày, hàm lượng vindoline đạt tối đa, kết quả đó trùng hợp với hoạt động tối đa của deacetylvindoline acetyl CoA acetyltransferase (enzyme xúc tác bước cuối cùng trong sinh tổng hợp vindoline) Như vậy, khả năng tổng hợp vindoline phụ thuộc vào hoạt động của của deacetylvindoline acetyl CoA acetyltransferase (DAT) trong thời gian chiếu sang tối ưu 16 giờ/ngày [16]

Taha và CS (2009) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các amino acid đến sự

tổng hợp ankaloid của dừa cạn trong điều kiện nuôi cấy in vitro Ở Ai Cập,

vinblastine và vincristine là 2 alkaloid được quan tâm để sản xuất thuốc chống ung thư Nuôi cấy dừa cạn trên môi trường MS có bổ sung kinetin 1,0mg/l, trong điều kiện ánh sang 16 giờ/ngày Bổ sung các amino acid: L-tryptophane, L-glutamine, L-asparagine, L-cystine, L-arginine với các nồng độ 100mg/l; 300mg/l; 500mg/l Sau đó theo dõi sự tăng trưởng tế bào và đánh giá khả năng tổng hợp alkaloid trong tế bào, so sánh với đối chứng Kết quả cho thấy, tế bào sinh trưởng tốt nhất, hàm lượng vinblastine và vincristine đạt cao nhất trong môi trường MS bổ sung: L-glutamin 300mg/l, L-tryptophane 300mg/l Kết quả

bổ sung từng loại amino acid theo thứ tự: L-glutamine; L-asparagin; L-cystine; L-tryptophane; L-arginine nồng độ 300 mg/l, số lượng tế bào tối đa/bình tương ứng giảm dần: 5,2 105; 4,82.105; 4,75.105; 3,77.105; 3,65.105 Trọng lượng tươi (g/bình) tương ứng đạt 2,93; 2,74; 2,65; 2,43 2,35 Trọng lượng khô (g/bình) tương ứng đạt 0,21; 0,19; 0,17; 0,16; và 0,14 Đối với hàm lượng alkaloid cây

tự nhiên là 1,002%, khi bổ sung lần lượt từng loại amino acid: L-tryptophane; L-glutamine; L-asparagine; L-cystine và L-arginine ở nồng độ 300mg/l, tỉ lệ phần trăm alkaloid tổng số cao hơn trong trong cây tự nhiên rất nhiều, đạt 1,57; 1,45; 1,32; 1,17 và 1,03% [22]

Mohsen Zargar và CS (2010) đã nghiên cứu tạo rễ tơ của cây dừa cạn

bằng phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium Rhizogenes trong điều kiện in vitro, để sản xuất và thu sinh khối 2 loại alkaloid vinbalastine và

vincristine Tiến hành nuôi cấy các đoạn thân 15 ngày tuổi có chiều dài 0,7 - 1,0cm trên môi trường MS và bổ sung BA (31,1mM) và NAA (5,4mM) Nuôi cấy 8 tuần trong điều kiện tối ở nhiệt độ 20 - 250C Kết quả tạo mô sẹo sau 8 tuần đạt 90% Nhiễm khuẩn mô sẹo trong thời gian 30 phút, đồng nuôi cấy trong thời gian 48 giờ Rửa khuẩn bằng dung dịch ½MS bổ sung cefataxime 800mg/l Cấy mô nhiễm khuẩn trên môi trường ½MS, cefataxime 400mg/l,

không bổ sung chất kích thích sinh trưởng, nuôi cấy điều kiện tối, sau 10 ngày

rễ tơ hình thành Sau 8 tuần rễ tơ dài 8 - 9 cm Bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), Mohsen Zargar và CS đã tách được vinblastine và vincristine từ rễ tơ thu được [20]

Nhóm tác giả Mohammed F và CS (2011), đã nghiên cứu quy trình tái sinh dừa cạn từ đoạn thân mang mắt chồi bên trong ống nghiệm Mục đích của nghiên cứu này nhằm nhân nhanh số lượng cây giống dừa cạn để phục vụ sản xuất vinbastine và vincristine Nhóm tác giả đã nghiên cứu ảnh hưởng của nồng

độ chất kích thích thuộc nhóm cytokinin và auxin đến quá trình nuôi cấy Kết quả cho thấy, nồng độ BAP 0,5mg/l + NAA 1,0mg/l thích hợp nhất cho sự phát sinh chồi Phản ứng ra rễ tốt trên môi trường ½MS bổ sung IBA 0,1mg/l Ra cây trên giá thể đất cho tỉ lệ sống đạt 100% [19]

Nghiên cứu của Kumar A và CS (2013) cho thấy, hiệu quả phát sinh chồi tốt nhất trên môi trường MS bổ sung BAP 1,0mg/l, NAA 0,2mg/l Ra rễ trên môi trường ½MS bổ sung IBA 1,0 mg/l cho số lượng rễ đạt 4,2 rễ/chồi, chiều dài rễ đạt 1,72cm Sau đó, đánh giá tính ổn định di truyền của một số tính trạng

nghiên cứu của cây dừa cạn trong nuôi cấy in vitro bằng kĩ thuật RAPD Kumar A (2013) đã cho thấy, không có biến dị soma trong nuôi cấy in vitro ở

dừa cạn [17]

Như vậy, các công trình nghiên cứu đều tập chung vào để sản xuất 2 loại

alkaloid là vinbastine và vincristine trong điều kiện nuôi cấy in vitro, tạo nguồn

nguyên liệu sản xuất thuốc chữa ung thư Đã có những nghiên cứu về môi trường cho hệ thống tái sinh, tuy nhiên với mỗi công trình nghiên cứu có một kết quả riêng phù hợp với từng điều kiện nuôi cấy Vì vậy, với mục đích tăng hàm lượng alkaloid của dừa cạn sản xuất đại trà trong tự nhiên, đối với điều kiện cụ thể ở ở Việt Nam cần thiết thăm dò một môi trường tối ưu cho hệ thống

tái sinh dừa cạn để phục vụ chuyển gen hiệu quả

1.4.2 Tình hình nuôi cấy in vitro cây dừa cạn ở Việt Nam

Hiện nay, ở Việt Nam các công trình nghiên cứu nuôi cấy cây dừa cạn

trong điều kiện in vitro tập trung theo các hướng: Nuôi cấy huyền phù để sản

xuất sinh khối; Nuôi cấy rễ tơ thu các hợp chất alkaloid; Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố như phytohormon thuộc nhóm auxin, cytokinin đến quá trình tổng hợp alkaloid phục vụ mục đích nghiên cứu sản xuất hợp chất thứ cấp từ dừa cạn

Ở Việt Nam, nghiên cứu về cây dừa cạn bắt đầu được công bố vào năm

2006 với công trình của Bùi Văn Lệ, Nguyễn Ngọc Hồng Nghiên cứu của các

tác giả thực hiện trên mô sẹo xanh cảm ứng từ lá dừa cạn nuôi cấy in vitro

trong môi trường MS lỏng, bổ sung chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin và cytokinin, đường sucrose với nồng độ khác nhau, nuôi trong điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày Sau đó đặt vào máy lắc 200 vòng/phút ở nhiệt độ 250C Kết quả cho thấy, bổ sung NAA 1,0mg/l + kinetin 0,5mg/l cho sinh khối trọng lượng khô đạt trọng lượng khô 6,88g/l và hàm lượng alkaloid toàn phần 89,26mg/l Trong khi đó, bổ sung 2,4-D 1,0mg/l + kinetin 0,5mg/1 sinh khối trọng lượng khô chỉ đạt 4,8g/l và alkaloid toàn phần 45,5mg/l Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đường sucrose đến nuôi cấy huyền phù tế bào cho thấy, đường sucrose 60g/l cho kết quả nuôi cấy tốt nhất đạt: Sinh khối trọng lượng khô 7,54g/l, alkaloid toàn phần 110,55mg/l Kết hợp tổ hợp NAA 1,0mg/l + kinetin 0,5mg/1+ sucrose 60g/l đã thu được hàm lượng vincristine từ mô nuôi cấy cao hơn lá dừa cạn ngoài tự nhiên [7]

Mục đích khảo sát hàm lượng alkaloid vinblastine trong cây dừa cạn tự

nhiên và trong nguồn mô thực vật nuôi cấy in vitro, làm cơ sở cho những nghiên cứu sản xuất chất này trong điều kiện in vitro Nguyễn Văn Vinh (2010)

đã nghiên cứu điều kiện của quá trình tái sinh chồi, rễ, và tạo dịch huyền phù tế

bào, khảo sát định tính vinblastine ở cây dừa cạn, các loại mô nuôi cấy in vitro

Cảm ứng tạo mô sẹo từ các tế bào nhu mô libe gân chính của tử diệp dừa cạn,

đạt hiệu quả cao trên môi trường MS bổ sung 2,4-D 1,0mg/l, BA 0,5mg/l Phát sinh chồi từ mô sẹo kết quả tốt nhất trên môi trường MS bổ sung NAA 0,5mg/l

và BA 2,0mg/l Rễ phát sinh từ mô sẹo tốt nhất trên môi trường MS bổ sung NAA 1,0mg/l Dịch huyền phù tế bào được tạo thành từ mô sẹo trên môi trường

MS bổ sung 2,4-D 0,5mg/l và BA 0,5mg/l Căn cứ vào lượng kết tủa và phản ứng màu đặc trưng của thuốc thử đối với các loại alkaloid, đánh giá định tính

thì các mẫu tự nhiên và mẫu nuôi cấy in vitro đều chứa alkaloid vinblastine

Mẫu mô sẹo và dịch huyền phù có hàm lượng alkaloid vinblastine thấp hơn

mẫu tự nhiên, chồi và rễ nuôi cấy in vitro [13]

Tuy nhiên, hướng chuyển gen tăng khả năng tổng hợp alkaloid vinblastine, vincristine trên thế giới còn khá mới mẻ nên các công trình nghiên cứu môi trường tối ưu để phục vụ công tác chuyển gen còn hạn chế Đây cũng

là hướng trọng tâm mà đề tài này sẽ nghiên cứu

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu, hoá chất

kĩ thuật, cân phân tích, bếp điện

2.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Thí nghiệm được thực hiện từ tháng 1 năm 2014 đến tháng 10 năm 2014 tại phòng Công nghệ tế bào, Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Pha môi trường

Pha môi trường với thành phần và nồng độ các chất phù hợp Môi trường

có đầy đủ các muối khoáng vitamin…, các chất phải được tan đều, không kết tủa Môi trường bổ sung thạch làm giá đỡ không quá rắn hay quá mềm để khi

Sau khi xác định được công thức môi trường cần pha, tính thể tích các hóa chất cần sử dụng trong môi trường nuôi cấy

Sau đó, môi trường được khử trùng trong nồi khử trùng ở 1200 C, áp suất

1 -1,2 atm, trong thời gian 20 phút Trong quá trình lấy môi trường ra khỏi nồi khủ trùng, lắc nhẹ bình chứa môi trường nuôi cấy để than hoạt tính tan đều Môi trường sau khi hấp để 2 -3 ngày bắt đầu sử dụng

Sau khi khử trùng, cấy hạt lên môi trường MS có bổ sung sucrose 30g/l, agar 8,5g/l, pH = 5,8 Các công thức thí nghiệm được nhắc lại 3 lần Đánh giá kết quả sau 10 ngày nuôi cấy Theo dõi các chỉ số sau:

(1) Tổng số hạt nảy mầm

(2) Số hạt không bị nhiễm

(3) Số hạt nảy mầm không bị nhiễm/tổng số hạt

2.2.3 Nghiên cứu môi trường phát sinh chồi và sinh trưởng

Sau khi vào mẫu thành công, thu được các cây con nảy mầm từ hạt Lá mầm của hạt sau khi nảy mầm và các đoạn thân mang mắt chồi bên của các cây con nói trên được sử dụng làm vật liệu cấy trên môi trường tạo chồi Để tìm ra môi trường tạo chồi và môi trường tạo rễ trong ống nghiệm tối ưu, chúng tôi đã

bố trí các thí nghiệm thăm dò môi trường nuôi cấy

Các đoạn thân mang mắt tạo chồi bên, nách lá mầm được cấy lên môi trường tạo chồi BAP với nồng độ từ 0,5mg/l; 1,0mg/l; 1,5mg/l; 2,0mg/l và môi