Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don) (LV thạc sĩ)

Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don) (LV thạc sĩ)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ĐỖ HUY HOÀNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN Ở CÂY DỪA CẠN (CATHARANTHUS ROSEUS (L.) G DON) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2016 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ĐỖ HUY HOÀNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN Ở CÂY DỪA CẠN (CATHARANTHUS ROSEUS (L.) G DON) Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.01.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Tâm THÁI NGUYÊN - 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây công trình nghiên cứu tôi, thực hướng dẫn khoa học PGS TS Nguyễn Thị Tâm Các số liệu kết trình bày luận văn trung thực, chưa công bố công trình khác Thái Nguyên, ngày tháng Tác giả luận văn Đỗ Huy Hoàng i năm 2016 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Nguyễn Thị Tâm, người tận tình hướng dẫn, bảo để hoàn thành luận văn thạc sĩ Tôi xin cảm ơn KTV Trần Thị Hồng, phòng thí nghiệm Công nghệ Tế bào nhiệt tình hướng dẫn giúp đỡ tiến hành thí nghiệm luận văn Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh học tạo điều kiện giúp đỡ trình học tập nghiên cứu luận văn Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè quan tâm, ủng hộ tạo động lực cho hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn tất giúp đỡ quý báu đó! Thái Nguyên, ngày … tháng … năm 2016 Người thực Đỗ Huy Hoàng ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi MỞ ĐẦU Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 Giới thiệu dừa cạn 1.1.1 Nguồn gốc phân loại dừa cạn 1.1.2 Đặc điểm hình thái dừa cạn 1.1.3 Thành phần hóa học số công dụng dừa cạn 1.1.4 Alkaloid dừa cạn 1.2 Công nghệ chuyển gen thực vật ứng dụng 1.2.1 Các phương pháp chuyển gen thực vật 1.2.2 Nghiên cứu nâng cao khả tổng hợp vinblastine vincristine dừa cạn phương pháp chuyển gen 10 1.3 Một số thành tựu nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen gus 12 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .19 2.1 Vật liệu nghiên cứu 19 2.1.1 Vật liệu thực vật 19 2.1.2 Chủng vi khuẩn 19 2.1.3 Hóa chất thiết bị 19 2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 20 2.3 Phương pháp nghiên cứu 20 2.3.1 Phương pháp nuôi cấy in vitro 20 iii 2.3.2 Phương pháp chuyển gen 20 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 25 3.1 Ảnh hưởng loại vật liệu làm thể nhận gen, mật độ A tumefaciens, nồng độ acetosyringone, thời gian nhiễm khuẩn, nồng độ kanamycin đến hiệu chuyển gen dừa cạn 25 3.1.1 Xác định mật độ tế bào A tumefaciens phù hợp cho chuyển gen dừa cạn 25 3.1.2 Xác định nồng độ acetosyringone (AS) phù hợp cho chuyển gen dừa cạn 27 3.1.3 Xác định thời gian nhiễm khuẩn A tumefaciens phù hợp cho chuyển gen dừa cạn 29 3.1.4 Xác định nồng độ kanamycin (Km) thích hợp để chọn lọc chuyển gen 31 3.2 Kết chuyển gen gus vào dừa cạn 36 3.3 Đề xuất quy trình chuyển gen vào dừa cạn 38 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO .43 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tên đầy đủ AS Acetosyringone BAP - Benzyl amoni purin Cs Cộng DNA Deoxyribonucleic acid gus β - Glucuronidase gene IBA Indol - - butyric acid Km Kanamycin LB Môi trường nuôi cấy Luria - Bertani MS Môi trường Murashige and Skoog nptII Neomycin phototranspherase II gene OD Optical density (Mật độ quang học) PCR Polumerase chain reaction (Phản ứng dây chuyền polimerase) T - DNA Transfer – DNA X - gluc 5-bromo-4 chloro-3-indolyl-β-D-glucuronic acid iv DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Ảnh hưởng mật độ vi khuẩn A tumefaciens đến tỉ lệ biểu gen gus tạm thời 25 Bảng 3.2: Ảnh hưởng nồng độ acetosyringone đến tỉ lệ biểu gen gus tạm thời 27 Bảng 3.3: Ảnh hưởng thời gian nhiễm khuẩn đến tỉ lệ biểu gen gus tạm thời 30 Bảng 3.4: Ảnh hưởng nồng độ kanamycin đến chọn lọc mẫu không chuyển gen 32 Bảng 3.5: Ảnh hưởng nồng độ kanamycin đến chọn lọc mẫu chuyển gen 34 Bảng 3.6: Kết biến nạp gen gus vào dừa cạn 37 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Ba giống Catharanthus roseus Hình 1.2: Sơ đồ Ti plasmid Hình 1.3: Quá trình chuyển T-DNA từ A.tumefaciens sang tế bào thực vật 10 Hình 2.1: Sơ đồ vector pCB-gusplus 19 Hình 3.1: Biểu đồ so sánh ảnh hưởng mật độ tế bào vi khuẩn A tumefaciens đến tỉ lệ biểu gen gus tạm thời 26 Hình 3.2: Biểu đồ so sánh ảnh hưởng nồng độ acetosyringone đến tỉ lệ biểu gen gus tạm thời 28 Hình 3.3: Kết biểu gen gus tạm thời 29 Hình 3.4: Biểu đồ so sánh ảnh hưởng thời gian nhiễm khuẩn đến tỉ lệ biểu gen gus tạm thời 31 Hình 3.5: Ảnh hưởng nồng độ kanamycin đến hiệu chọn lọc mẫu không chuyển gen 33 Hình 3.6: Đồ thị phản ánh ảnh hưởng kanamycin đến tỉ lệ sống sót mẫu chuyển gen 35 Hình 3.7: Mẫu chuyển gen môi trường chọn lọc bổ sung nồng độ kanamycin 50 mg/l 36 Hình 3.8: Kết biểu bền vững gen gus 38 Hình 3.9: Sơ đồ quy trình chuyển gen vào dừa cạn thông qua vi khuẩn A tumefaciens 39 Hình 3.10: Hình ảnh chuyển gen gus vào dừa cạn 41 vi MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Bệnh ung thư bệnh nguy hiểm, số người mắc bệnh ngày gia tăng độ tuổi mắc phải ngày trẻ hóa, tạo gánh nặng lớn cho gia đình xã hội Trong đó, loại thuốc chữa trị ung thư chưa nhiều giá thành chúng đắt Vì vậy, việc nghiên cứu phương pháp làm tăng hàm lượng alkaloid thảo dược để hạ giá thành thuốc chữa bệnh nhiều nhà khoa học giới nước quan tâm Cây dừa cạn có khả sản xuất indol alkaloid vinblastine, vincristine có dược tính quan trọng chế tạo loại thuốc chống ung thư, đặc biệt sử dụng chống ung thư máu Nhưng chất lại có hàm lượng nhỏ tế bào thực vật (khoảng phần vạn dừa cạn khô vinblastine vincristine 10 lần nữa) tổng hợp đường hóa học có cấu trúc phức tạp Trong dừa cạn, đường dẫn tới tổng hợp vinblastine vincristine qua số sản phẩm trung gian, xúc tác số enzym Trong đó, deacetylvindoline-4-O-acetyltransferase (DAT) enzyme chìa khóa xúc tác cho phản ứng cuối trình tổng hợp vindoline [26] Do vậy, nghiên cứu biện pháp nâng cao suất tổng hợp vinblastine vincristine dừa cạn công nghệ gen để phục vụ cho việc tạo thuốc chữa bệnh ung thư cần thiết Xuất phát từ thực tế trên, để góp phần tạo thành công dừa cạn chuyển gen với mục đích nâng cao suất tổng hợp hai loại ankaloid nói trên, tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don)” Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng quy trình chuyển gen vào dừa cạn để phục vụ chuyển gen mục tiêu 3.1.4.1 Xác định nồng độ kanamycin thích hợp cho chọn lọc tái sinh chồi mẫu không chuyển gen Chúng tiến hành thử nghiệm ảnh hưởng nồng độ kháng sinh từ mg/l, 25 mg/l, 50 mg/l, 75 mg/l, 100 mg/l, 150mg/l đến khả chọn lọc tái sinh chồi đoạn thân tuần nhằm xác định ngưỡng nồng độ phù hợp Kết trình bày bảng 3.4 Bảng 3.4: Ảnh hưởng nồng độ kanamycin đến chọn lọc mẫu không chuyển gen Nồng độ kanamycin Tỉ lệ tạo chồi (%) Tỉ lệ chồi sống sót Màu sắc chồi (sau tuần) (%) (sau tuần) 100 ± 0,00 100 ± 0,00 Xanh bình thường 25 27,78 ± 0,03 21,11 ± 0,02 Xanh nhạt 50 11,11 ± 0,03 7,78 ± 0,01 Xanh nhạt 75 3,33 ± 0,02 1,11 ± 0,01 Xanh nhạt 100 1,11 ± 0,01 Đoạn thân hóa đen 150 0 Đoạn thân hóa đen (mg/l) Từ kết bảng 3.4 cho thấy, việc bổ sung nồng độ Km khác từ đến 150 mg/l vào môi trường tạo chồi có ảnh hưởng rõ rệt đến khả cảm ứng tạo chồi tỉ lệ chồi sống sót mẫu không chuyển gen Sự cảm ứng tạo chồi mẫu sau tuần nồng độ Km 25mg/l cao 27,8% Tỉ lệ giảm rõ rệt bổ sung nồng độ Km từ 50 mg/l - 100mg/l đạt từ 1,1 11,1% Ở nồng độ Km 150mg/l không thu mẫu tạo chồi sau tuần thí nghiệm Các mẫu cảm ứng môi trường bổ sung nồng độ Km khác tạo chồi có màu xanh nhạt, đoạn thân không tạo chồi khô dần chuyển sang màu đen chết 32 A B D C E Hình 3.5: Ảnh hưởng nồng độ kanamycin đến hiệu chọn lọc mẫu không chuyển gen A: Đối chứng sau tuần; B: Km 25 mg/l sau tuần; C: Km 100 mg/l sau tuần D: Km 25 mg/l sau tuần; E: Km 100 mg/l sau tuần Sau tuần nuôi cấy, tỉ lệ chồi sống sót môi trường chọn lọc thấp Ngay nồng độ Km 25mg/l có gần 80% số mẫu bị chết Ở môi trường bổ sung Km 50mg/l 75mg/l số mẫu sống sót đạt 7,8% 1,1% Đến nồng độ Km 100mg/l không mẫu sống sót thời gian nghiên cứu Trong môi trường đối chứng (0 mg/l Km) tỉ lệ đạt 100% Các đoạn thân không cảm ứng tạo chồi, bị chết chuyển dần từ màu đen sang màu trắng Từ kết ban đầu này, lựa chọn môi trường bổ sung Km với ba nồng độ 25 mg/l, 50 mg/l 75 mg/l để nghiên cứu chọn lọc chồi chuyển gen 33 3.1.4.2 Xác định nồng độ kanamycin thích hợp cho chọn lọc tái sinh chồi chuyển gen Chúng tiến hành chuyển gen gus với hai đối tượng vật liệu mầm đoạn thân Sau ngày đồng nuôi cấy, mẫu chuyển lên môi trường tạo chồi có bổ sung ba nồng độ Km 25 mg/l, 50 mg/l 75 mg/l để xác định ngưỡng chọn lọc kháng sinh thích hợp cho chồi chuyển gen Tiếp tục theo dõi tỉ lệ mẫu tạo chồi sau tuần, tỉ lệ chồi sống sót sau tuần nghiên cứu Kết thu được trình bày bảng 3.5 Bảng 3.5: Ảnh hưởng nồng độ kanamycin đến chọn lọc mẫu chuyển gen Vật liệu Lá mầm Đoạn thân chuyển Tỉ lệ tạo chồi Tỉ lệ chồi sống Tỉ lệ tạo chồi Tỉ lệ chồi sống Nồng gen (%) sót (%) (%) sót (%) (sau tuần) (sau tuần) (sau tuần) (sau tuần) 25 60, 00 ± 0,03 54,45 ± 0,05 56,67 ± 0,03 51,11 ± 0,05 50 23,33 ± 0,03 6,67 ± 0,02 21,11 ± 0,03 13,33 ± 0,02 75 7,78 ± 0,03 4,45 ± 0,01 7,78 ± 0,02 2,22 ± 0,01 độ Km (mg/l) Kết cho thấy, Km có ảnh hưởng rõ rệt đến khả tạo chồi sống sót chồi chuyển gen Song nồng độ Km lại chênh lệch lớn hai loại vật liệu Tỉ lệ mẫu tạo chồi sau tuần nồng độ Km 25 mg/l cao, 60% với vật liệu mầm 56,6% với vật liệu đoạn thân Tỉ lệ giảm mạnh tăng nồng độ Km lên 75 mg/l 50 mg/l có từ 7,8% đến 23,3% mẫu tạo chồi thời gian nghiên cứu 34 Tỉ lệ chồi sống sót (%) 60 50 54.4 51.1 40 Lá mầm 30 Đoạn thân 20 13.3 10 6.67 25 50 4.4 2.2 75 Nồng độ kanamycin (mg/l) Hình 3.6: Đồ thị phản ánh ảnh hưởng kanamycin đến tỉ lệ sống sót mẫu chuyển gen Sau tuần, tỉ lệ mẫu sống sót môi trường có bổ sung Km 25 mg/l cao, 54,4% vật liệu mầm 51,1% vật liệu đoạn thân Nồng độ kháng sinh Km 25 mg/l tỏ không thích hợp cho chọn lọc mẫu chuyển gen, tỉ lệ mẫu sống sót lớn đồng nghĩa với hiệu chọn lọc chưa cao Khi tăng nồng độ kháng sinh Km lên 50 mg/l tỉ lệ mẫu sống sót vật liệu mầm giảm mạnh xuống 6,7% vật liệu đoạn thân đạt 13,3% Điều cho thấy, hiệu chọn lọc vật liệu mầm nồng độ Km 50 mg/l tốt Môi trường bổ sung nồng độ Km 75 mg/l gần ức chế hoàn toàn khả sống sót chồi, tỉ lệ mẫu sống sót thu thấp, đạt 2,2% 4,5% Các mầm không cảm ứng tạo chồi, bị chết môi trường chọn lọc dần chuyển sang màu vàng nhạt Chúng tiến hành lấy ngẫu nhiên từ chồi sống sót môi trường có bổ sung kanamycin 50 mg/l 75 mg/l để kiểm tra biểu gen gus Kết nhuộm cho thấy hầu hết chồi sống sót có màu xanh chàm đặc trưng Chứng tỏ gen gus chuyển vào nhân lên môi trường nuôi cấy Các mẫu bị chết gen kháng Km chưa chuyển vào chuyển vào không tiếp tục phiên mã nên chúng tái sinh môi trường chọn lọc 35 A B C D Hình 3.7: Mẫu chuyển gen môi trường chọn lọc bổ sung nồng độ kanamycin 50 mg/l A: Vật liệu mầm sau tuần B: Vật liệu đoạn thân sau tuần C: Vật liệu mầm sau tuần D: Vật liệu đoạn thân sau tuần Căn vào kết trên, lựa chọn nồng độ Km 50 mg/l ngưỡng chọn lọc thích hợp cho dừa cạn chuyển gen Theo Brukhin cs (2000), ngưỡng nồng độ chất chọn lọc phù hợp loại bỏ khoảng 90% không chuyển gen Kết nghiên cứu phù hợp với nhận xét 3.2 Kết chuyển gen gus vào dừa cạn Từ kết nghiên cứu thí nghiệm tối ưu điều kiện ảnh hưởng hiệu chuyển gen trên, tiến hành chuyển cấu trúc mang gen gus vào mầm dừa cạn Lá mầm ngâm dịch huyền phù vi khuẩn có OD600nm= 0,8, bổ sung acetosyringone 100M 30 phút Sau 36 đồng nuôi cấy ngày, chuyển mẫu lên môi trường nuôi cấy để chọn lọc tái sinh chồi chuyển gen: MS + sucrose 30g/l + agar 8g/l + MES 0,59g/l + muối B5 3g/l + BAP 0,5mg/l + cefotaxim 500 mg/l + kanamycin 50 mg/l Các mẫu tạo chồi đưa sang môi trường chọn lọc để tránh mẫu chết sản sinh chất làm ức chế tái sinh mẫu tạo chồi Chồi đạt chiều cao 3cm chuyển sang môi trường rễ: MS + sucrose 30g/l + agar 8g/l + BAP 0,5mg/l + IBA 0,4mg/l + kanamycin 50 mg/l Cây có chiều cao - 10cm rễ đạt từ - 7cm đưa bầu đất Chúng tiến hành lô thí nghiệm với tổng số 360 mẫu Kết trình bày bảng 3.6 Bảng 3.6 cho thấy, qua trình chọn lọc thu 84 mẫu tạo chồi (đạt 23,3 %) Số chồi sống sót thu 34 mẫu (đạt 9,45%) Hơn 50% chồi sống sót rễ Khi đưa môi trường thu 15 sống sót Lấy ngẫu nhiên rễ 15 đem nhuộm X-gluc để kiểm tra biểu gen gus Tất 15 cho kết dương tính xuất màu xanh chàm đặc trưng Bảng 3.6: Kết biến nạp gen gus vào dừa cạn Số Số mẫu Số chồi Số Hiệu suất Số chồi sống sót chuyển rễ gen gus (%) Lô thí mẫu tạo chồi sống sót nghiệm biến (sau (sau nạp tuần) tuần) Đối chứng 30 30 28 25 18 90 20 11 120 29 13 đối chứng Thí 4,17 nghiệm 150 35 10 Tổng 360 84 34 21 15 37 A B C D Hình 3.8: Kết biểu bền vững gen gus A; C: Lá rễ chuyển gen B; D: Lá rễ đối chứng Như hiệu suất chuyển gen gus thấp, đạt 4,17% Trong nghiên cứu Lê Trần Bình (2008), hiệu suất chuyển gen vào dòng lúa indica đạt 12,5% [1] Nghiên cứu Bùi Văn Thắng (2013) cho thấy, hiệu suất chuyển gen gus vào xoan ta 18,15% [12] 3.3 Đề xuất quy trình chuyển gen vào dừa cạn Từ kết nghiên cứu, tối ưu số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển gen vào dừa cạn bao gồm: (i) Vật liệu chuyển gen mầm; (ii) Nồng độ vi khuẩn OD600nm= 0,8; (iii) Nồng độ acetosyringone 100µM; (iv) Thời gian nhiễm khuẩn 30 phút; (v) Nồng độ kanamycin để chọn lọc chồi chuyển gen 50 mg/l Quy trình chuyển gen gus vào dừa cạn thông qua vi khuẩn A tumefaciens trình bày hình 3.9 38 Chuẩn bị vật liệu chuyển gen - Gieo hạt tạo in vitro - Thu mầm 10 – 14 ngày tuổi Chuẩn bị vi khuẩn A.tumefaciens với mật độ OD600nm = 0,8 Chuyển gen - Lá mầm nhiễm khuẩn thời gian 30 phút + AS 100 µM - Đồng nuôi cấy ngày môi trường: MS + sucrose 30g/l + agar 8g/l + MES 3,9g/l + muối B5 0,3g/l + AS 100µM Chọn lọc chồi chuyển gen Chọn lọc chồi môi trường: MS + sucrose 30g/l + agar 8g/l + MES 0,59g/l + muối B5 3g/l + BAP 0,5mg/l + cefotaxim 500 mg/l + kanamycin 50 mg/l Tái sinh chồi chuyển gen Chồi sống sót tái sinh môi trường: MS + sucrose 30g/l + agar 8g/l + MES 0,59g/l + muối B5 3g/l + BAP 0,5mg/l + cefotaxim 500 mg/l + kanamycin 50 mg/l Tạo hoàn chỉnh - Chồi tái sinh chuyển sang môi trường rễ: MS + sucrose 30g/l + agar 8g/l + BAP 0,5mg/l + IBA 0,4mg/l + kanamycin 50 mg/l - Đưa môi trường Hình 3.9: Sơ đồ quy trình chuyển gen vào dừa cạn thông qua vi khuẩn A Tumefaciens (1) Chuẩn bị vật liệu chuyển gen: Dùng dao tách mầm 10 - 14 ngày tuổi làm hai mảnh, sau sử dụng đầu kim nhọn gây tổn thương vào phần nách mầm Nuôi chủng A tumerfaciens C58 chứa gen gus môi trường LB đặc có bổ sung kanamycin 50 mg/l rifamicin 50 mg/l tủ ổn nhiệt 28oC, 39 48 Chọn khuẩn lạc mọc môi trường LB đặc nuôi cấy LB lỏng với chế độ lắc 2.000 vòng/phút 28oC 16 - 18 Lấy ml dung dịch khuẩn nuôi lỏng lần nuôi hoạt hóa 10 ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh kanamycin rifamycin - Ly tâm dung dịch nuôi lỏng lần với tốc độ 5000 vòng/ phút, 4oC 10 phút Loại bỏ dịch hoà tan cặn với môi trường 1/2 MS pha loãng OD600nm = 0,8 (2) Nhiễm khuẩn đồng nuôi cấy: Lá mầm ngâm dịch huyền phù vi khuẩn có bổ sung acetosyringone 100M 30 phút Sau thấm khô, cấy môi trường môi trường đồng nuôi cấy: MS + sucrose 30g/l + agar 8g/l + MES 3,9g/l + muối B5 0,3g/l + AS 100M Nuôi tối ngày (3) Chọn lọc tái sinh chồi chuyển gen: Các mẫu sau đồng nuôi cấy, rửa nước cất vô trùng Sau ngâm mẫu dung dịch 1/2 MS có bổ sung 500mg/l cefotaxim 10 phút Thấm khô mẫu chuyển lên môi trường nuôi cấy để chọn lọc tái sinh chồi chuyển gen: MS + sucrose 30g/l + agar 8g/l + MES 0,59g/l + muối B5 3g/l + BAP 0,5mg/l + cefotaxim 500 mg/l + kanamycin 50 mg/l Sau tuần, chuyển chồi sống sót sang môi trường chọn lọc để tránh ảnh hưởng mẫu chết đến phát triển chồi, đồng thời tăng hiệu chọn chọn lọc (4) Tạo hoàn chỉnh cây: Chồi đạt chiều cao - 3cm chuyển sang môi trường rễ: MS + sucrose 30g/l + agar 8g/l + BAP 0,5mg/l + IBA 0,4mg/l + kanamycin 50 mg/l Cây có chiều cao - 10cm rễ đạt từ - 7cm đưa bầu đất, để nơi tránh ánh sáng trực tiếp Sau tuần tưới dung dịch MS với tỷ lệ 1/10, ngày lần Sau đến tuần sống rễ mới, đưa môi trường 40 A B C D E F G H Hình 3.10: Hình ảnh chuyển gen gus vào dừa cạn A: Gieo hạt B: Lá mầm C: Nhiễm khuẩn D: Đồng nuôi cấy E: Chọn lọc chồi F: Tái sinh chồi G: Cây hoàn chỉnh H: 41 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Tối ưu số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển gen, từ xây dựng quy trình chuyển gen vào dừa cạn, cụ thể là: Vật liệu chuyển gen mầm; Nồng độ vi khuẩn OD600nm = 0,8; Nồng độ acetosyringone 100µM; Thời gian nhiễm khuẩn 30 phút; Nồng độ kanamycin để chọn lọc chồi chuyển gen 50 mg/l Chuyển thành công cấu trúc mang gen gus vào dừa cạn hiệu suất chuyển gen 4,17% Đề nghị Ứng dụng quy trình chuyển gen vào dừa cạn thông qua vi khuẩn A tumefaciens xây dựng để chuyển gen mục tiêu DAT, prx nhằm tạo giống có khả tổng hợp vinblastine vincristine cao 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Lê Trần Bình (2008), Phát triển trồng chuyển gen Việt Nam, Nhà xuất Khoa học Tự nhiên Công nghệ Đỗ Xuân Đồng, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình (2007), “Nghiên cứu quy trình tái sinh hệ thống chuyển gen cà chua Việt Nam”, Tạp chí Công nghệ sinh học, số 5, trang 217- 223 Hoàng Thị Giang, Mai Đức Chung, Nguyễn Thị Huế (2015), “Hoàn thiện quy trình chuyển gen cho giống lúa Taichung 65 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí khoa học phát triển, số 5, trang 764 - 773 Bùi Thị Hà, Trần Thị Anh, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng Mậu (2015), “Nghiên cứu hệ thống tái sinh đa chồi in vitro dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G.Don)”, Tạp chí Khoa học, số 4, trang 56 - 62 Võ Thị Huệ, Mã Yến Thanh (2011), “Thiết lập quy trình tái sinh in vitro đánh giá bước đầu chuyển nạp gen vào dầu mè (Jatropha curcas L.) thông qua Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí KHKT Nông Lâm Nghiệp, số 1, trang - 10 Vũ Thị Lan, Mai Thị Phương Nga, Nguyễn Trung Nam, Phạm Bích Ngọc, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình (2013), “Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến hiệu chuyển gen gus vào khoai lang thông qua Agrobacterium tumefaciens”, Báo cáo khoa học Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nhà xuất Đại học Thái Nguyên, trang 888 - 892 Trần Lê Lưu Li, Nguyễn Hữu Hoàng, Bùi Lan Anh (2008), “Thử nghiệm chuyển gen lan hồ điệp (Phalaenopsis amabilis) phương pháp bắn gen Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí phát triển KH&CN, số 10, trang 109 - 113 Chu Hoàng Mậu (2008), Phương pháp phân tích di truyền đại chọn giống trồng, Nhà xuất Đại học Thái Nguyên 43 Nguyễn Thị Thanh Nga, Hồ Mạnh Tường, Lê Trần Bình (2012), “Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào dưa hấu (Citrullus lanatus Thumb)”, Tạp chí Sinh học, số 3, trang 389 - 396 10 Đinh Thị Phòng, Nguyễn Thị Thu (2007), “Chuyển gen gus vào đỉnh phôi hạt chín giống đậu tương DT12 thông qua Agrobacteria tumefaciens”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, số 5, trang 471- 478 11 Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo (2005) Giáo trình công nghệ sinh học nông nghiệp, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 12 Bùi Văn Thắng, Đỗ Xuân Đồng, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2013), “Quy trình chuyển gen vào xoan ta (Melia azedazach L.) đạt hiệu suất cao”, Tạp chí Sinh học, số 2, trang 227 - 233 13 Lò Thị Mai Thu (2012), “ Phân lập đoạn gen CP từ Soybean mosaic virus phát triển vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi phục vụ tạo đậu tương chuyển gen kháng bệnh”, Luận án tiến sĩ Sinh học, Đại học Thái Nguyên 14 Đoàn Thu Thủy, Trịnh Quốc Cần, N Baiskh, O Normal, SW Datta (2008), “Kết chuyển gen gus vào lúa với điều khiển promoter khác nhau”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, số 6, trang 321- 326 15 Vương Đình Tuấn, Nguyễn Xuân Cường, Phan Thị Mỵ Lan ( 2012), “Nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng đến chuyển gen gus vào phôi trưởng thành gia đình Thông nhựa vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”, Kết nghiên cứu Khoa học công nghệ lâm nghiệp giai đoạn 2006-2010,Nhà xuất Nông nghiệp, trang 60 - 66 16 Hoàng Thị Sản (2003), Phân loại học thực vật, NXB Giáo dục 17 Viện dược liệu (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Tập 1, Nhà xuất Khoa học & Kỹ thuật Hà Nội 44 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 18 Demura T, Ye Z.H (2010) ‘‘Regulation of Plant Biomass Production’’, Curen Opin Plant Biol, in press 19 Guggisberg A., Hesse M., (2007), Alkaloids, The University of Zurich 20 James Clive (2009) Global stutus of commercialzad biotech/GM crops, ISAAA brief No.41 21 Javier Palazn, Rosa M Cusid, Jordi Gonzalo, Mercedes Bonfill, Carmen Morales, M Teresa Pinol (1998) "Relation Between the Amount of rolC Gene Product and Indole Alkaloid Accumulation in Catharanthus roseus Transformed Root Cultures" Journal of Plant Physiology, 153:712.] 22 Jefferson RA, Kavanagh TA, and Bevan MW (1987), “GUS fusion: βglucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants” EMBO 6: 3901-3907 23 Pahwa D (2008), Catharanthus alkaloids, B.Pharm Punjab University Chandigarh 24 Sheba Goklany, Ralph H Loring, James Glick and Carolyn W T LeeParsons (2009) "Assessing the limitations to terpenoid indole alkaloid biosynthesis in Catharanthus roseus hairy root cultures through gene expression profiling and precursor feeding" Biotechnology Progress, 25(5): 1289-1296 25 Vancanneyt G, Schmidt R, Connor-Sanchez AO, Willmitzer L, Sosa MR (1990), “Contruction of an intron-containing maker gene: Splicing of the intron in transgenic plants and its use in monitoring early events in Agobacterium-mediated plants transformation” Mol Gene genet, 220: 245-250 26 Wang Q, Xing S, Pan Q, Yuan F, Zhao J, Tian Y, Chen Y, Wang G, Tang K (2012) "Development of efficient Catharanthus roseus 45 regeneration and tumefaciens and transformation system using Agrobacterium hypocotyls as explants".Biotechnol 12 - 34 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3483169/ TÀI LIỆU WEB 27 Thái Phong Thần dược không cần tìm kiếm đâu xa, http://soha.vn 28 https://en.wikipedia.org/wiki/Agrobacterium 29 https://en.wikipedia.org/wiki/Agrobacterium_tumefaciens 30 http://en.wikipedia.org/wiki/Catharanthus_roseus 31 https://en.wikipedia.org/wiki/Ti_plasmid 46 ... phù hợp cho chuyển gen dừa cạn; - Nghiên cứu chuyển gen gus vào dừa cạn tạo dừa cạn chuyển gen; - Đề xuất quy trình chuyển gen vào dừa cạn Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu dừa cạn 1.1.1... công dừa cạn chuyển gen với mục đích nâng cao suất tổng hợp hai loại ankaloid nói trên, tiến hành thực đề tài: Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don) ... (L.) G Don) Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng quy trình chuyển gen vào dừa cạn để phục vụ chuyển gen mục tiêu Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu xác định loại vật liệu làm thể nhận gen, mật độ tế bào