Nghiên cứu đặc điểm hình thái và trình tự gen rpoC1 của cây dừa cạn Catharanthus roseus (L.) G. Don (LV thạc sĩ)

Nghiên cứu đặc điểm hình thái và trình tự gen rpoC1 của cây dừa cạn Catharanthus roseus (L.) G. Don (LV thạc sĩ)Nghiên cứu đặc điểm hình thái và trình tự gen rpoC1 của cây dừa cạn Catharanthus roseus (L.) G. Don (LV thạc sĩ)Nghiên cứu đặc điểm hình thái và trình tự gen rpoC1 của cây dừa cạn Catharanthus roseus (L.) G. Don (LV thạc sĩ)Nghiên cứu đặc điểm hình thái và trình tự gen rpoC1 của cây dừa cạn Catharanthus roseus (L.) G. Don (LV thạc sĩ)Nghiên cứu đặc điểm hình thái và trình tự gen rpoC1 của cây dừa cạn Catharanthus roseus (L.) G. Don (LV thạc sĩ)Nghiên cứu đặc điểm hình thái và trình tự gen rpoC1 của cây dừa cạn Catharanthus roseus (L.) G. Don (LV thạc sĩ)Nghiên cứu đặc điểm hình thái và trình tự gen rpoC1 của cây dừa cạn Catharanthus roseus (L.) G. Don (LV thạc sĩ)Nghiên cứu đặc điểm hình thái và trình tự gen rpoC1 của cây dừa cạn Catharanthus roseus (L.) G. Don (LV thạc sĩ)Nghiên cứu đặc điểm hình thái và trình tự gen rpoC1 của cây dừa cạn Catharanthus roseus (L.) G. Don (LV thạc sĩ)Nghiên cứu đặc điểm hình thái và trình tự gen rpoC1 của cây dừa cạn Catharanthus roseus (L.) G. Don (LV thạc sĩ)Nghiên cứu đặc điểm hình thái và trình tự gen rpoC1 của cây dừa cạn Catharanthus roseus (L.) G. Don (LV thạc sĩ)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

ĐINH ANH TUẤN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ TRÌNH TỰ GEN

rpoC1 CỦA CÂY DỪA CẠN [Catharanthus roseus (L.) G Don]

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên, năm 2016

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

ĐINH ANH TUẤN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ TRÌNH TỰ GEN

rpoC1 CỦA CÂY DỪA CẠN [Catharanthus roseus (L.) G Don]

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu

Thái Nguyên, năm 2016

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn củ a GS.TS Chu Hoàng Mậu Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực

và chưa từng ai công bố trong một công trình nào khác

Thái Nguyên, tháng 04 năm 2016

Tác giả luận văn

Đinh Anh Tuấn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới GS.TS Chu Hoàng Mậu đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô, cán bộ Phòng thí nghiệm Công nghệ gen và phòng thí nghiệm Thiết bị chung, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm, Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi tiến hành các thí nghiệm của đề tài

Tôi xin cảm ơn sự động viên, khích lệ của gia đình và bạn bè trong suốt thời gian ho ̣c tâ ̣p và thực hiện đề tài luận văn

Tác giả

Đinh Anh Tuấn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 3

3 Nội dung nghiên cứu 3

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 CÂY DỪA CẠN 4

1.1.1 Hệ thống phân loại cây Dừa cạn 4

1.1.2 Giá trị sử dụng của cây dừa cạn 6

1.2 MÃ VẠCH DNA (DNA BARCODING) 10

1.2.1 Đặc điểm của mã vạch DNA (DNA barcoding) 10

1.2.2 Ứng dụng mã vạch DNA trong nhận biết cây dược liê ̣u 12

1.3 GEN LỤC LẠP 15

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 17

2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BI ̣ 17

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 17

2.1.2 Hóa chất, thiết bị và máy móc 17

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.2.1 Phương pháp thu mẫu 17

2.2.2 Các phương pháp sinh học phân tử 18

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

2.2.2.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 18

2.2.2.2 Phương pháp nhân gen rpoC1 bằng kĩ thuật PCR 19

2.2.2.3 Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR ( phương pháp thôi gel) 20

2.2.2.4 Phương pháp xác đi ̣nh trình tự nucleotide của đoạn gen rpoC1 21

2.2.2.5 Phương pháp xử lý số liệu 21

2.3 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 22

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

3.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC CỦA CÁC GIỐNG DỪA CẠN THU TẠI HÀ GIANG VÀ THÁI NGUYÊN 23

3.1.1 Đặc điểm hình thái rễ, thân, hoa, quả và ha ̣t của cây dừa ca ̣n 23

3.1.2 Đặc điểm khác biê ̣t về hình thái giữa ba giống dừa ca ̣n 26

3.2 PHÂN LẬP GEN rpoC1 TỪ CÁC MẪU DỪA CẠN 28

3.2.1 Tách DNA tổng số từ các mẫu dừa cạn 28

3.2.2 Khuếch đại đoạn gen rpoC1 bằng PCR 28

3.2.3 Kết quả xác định trình tự đoạn gen rpoC1 phân lập từ các mẫu dừa ca ̣n 29 3.3 PHÂN TÍCH SỰ ĐA DẠNG CỦA CÁC MẪU DỪA CẠN DỰA TRÊN TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE VÀ TRÌNH TỰ AMINO ACID SUY DIỄN CỦA ĐOẠN GEN rpoC1 34

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37

1 Kết luận 37

2 Đề nghị 37

CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR nhân gen rpoC1 19

Bảng 3.1 Các vị trí sai khác giữa các trình tự nucleotide của đoạn gen

rpoC1 32

Bảng 3 2 Các vị trí sai khác giữa các trình tự amino acid suy diễn của gen

rpoC1 33

Bảng 3.3 Hệ số tương đồng và hệ số sai khác về trình tự các nucleotide của

gen rpoC1 phân lập từ các mẫu dừa cạn 34

Bảng 3.4 Hệ số tương đồng và hệ số sai khác về trình tự amino acid suy diễn

củ a gen rpoC1 phân lâ ̣p từ các mẫu dừa cạn 36

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Hoa của ba giống Catharanthus 5

Hình 3.1 Cây dừa cạn hoa trắ ng nhụy đỏ Hà Giang 23

Hình 3.2 Các bộ phâ ̣n của cây dừa cạn 24

Hình 3.3 Đặc điểm khác nhau về hình thái giữa ba giống dừ a ca ̣n 27

Hình 3.4 Kết quả điê ̣n di kiểm tra sản phẩm DNA tổng số 28

Hình 3.5. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm nhân gen rpoC1 29

Hình 3.6 Trình tự nucleotide củ a đoạn gen rpoC1 phân lâ ̣p từ các mẫu dừa cạn TIM_HG, TV_HG, TIM_TN, TRANG_TN và hai trình tự mang mã số KC561139, JN115007 trên Ngân hàng Gen 30

Hình 3.7 Trình tự amino acid suy diễn của đoa ̣n gen rpoC1 phân lâ ̣p từ các mẫu dừa cạn TIM_HG, TV_HG, TIM_TN, TRANG_TN và hai trình tự mang mã số KC561139, JN115007 trên Ngân hàng Gen 33

Hình 3.8 Sơ đồ hình cây so sánh mức độ tương đồng đoạn gen rpoC1 của 6 mẫu dừa cạn 35

Hình 3.9 Sơ đồ hình cây so sánh mức độ tương đồng dựa trên trình tự amino acid suy diễn của 6 mẫu dừa cạn 36

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT

rpoC1 RNA polymerase beta' chain

CTAB Cetyl trimethylammonium Bromide

TIM_HG Giống dừa cạn hoa hồng tím thu tại Hà Giang TV_HG Giống dừa cạn hoa trắng vàng thu tại Hà Giang TIM_TN Giống dừa cạn hoa hồng tím thu tại Thái Nguyên TRANG_TN Giống dừa cạn hoa trằng đỏ thu tại Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

MỞ ĐẦU

1 Đă ̣t vấn đề

Việt Nam là quốc gia nằm ở vùng nhiệt đới, có nhiều điều kiện cho thực vật phát triển và tạo ra sự phong phú, đa dạng của nhiều loài thực vật và nhiều hệ sinh thái khác nhau Theo thống kê tại Việt Nam hiện có gần 12000 loài thực vật bậc cao có mạch thuộc hơn 2256 chi, 305 họ; 69 loài thực vật hạt trần;

12000 loài thực vật hạt kín; 2200 loài nấm; 2176 loài tảo; 481 loài rêu; 368 loài

vi khuẩn lam; 691 loài dương xỉ và 100 loài khác [8]

Lịch sử phát triển môn phân loại học và các công trình nghiên cứu về phân loại thực vật từ trước còn chưa được đầy đủ Trong lịch sử nghiên cứu thực vật ở nước ta đã có nhiều công trình thống kê, phân loại nhiều loài cây,

có thể kể đến một số tác giả như: Tuệ Tĩnh đã mô tả tới 579 loài cây làm thuốc trong cuốn Nam dược thần hiệu, Lê Quí Ðôn với bộ Vân đài loại ngữ đã phân chia thực vật thành nhiều loại: cây cho hoa, cho quả, ngũ cốc, rau, cây loại mộc, loại thảo Lý Thời Chân cho xuất bản cuốn Bản thảo cương mục trong đó có đề cập tới trên 1000 vị thuốc thảo mộc [1]

Trong thời kỳ Pháp thuộc, do tài nguyên thực vật ở nước ta rất phong phú

đã gây được sự chú ý của nhiều nhà nghiên cứu phương Tây Công trình lớn nhất là bộ Thực vật chí tổng quát Ðông Dương do Lecomte và một số nhà thực vật học người Pháp đã biên soạn, phân loại, mô tả và thống kê các cây từ Dương

xỉ tới thực vật Hạt kín của toàn Ðông Dương Công trình nghiên cứu các cây thuốc ở Campuchia, Lào và Việt Nam của Pételot Phần lớn các nghiên cứu đều tập trung vào thực vật bậc cao, đặc biệt đối với cây thuốc [1], [17]

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Dừa cạn (Catharanthus roseus G Don) là loại cây cảnh phổ biến vì

dáng cây đẹp, mềm mại, lá xanh mướt, hoa rực sáng, là những nét đặc trưng tạo được sự hấp dẫn của loài cây này Dừa cạn cũng là một loại thảo dược dân gian vì có chứa nhiều loại alkaloid Từ dừa cạn có thể chiết được một số chất điều trị ung thư như vinblastine, vincristine Trên thế giới dừa cạn gồm 8 loài,

có ba giố ng dừ a ca ̣n trồ ng phổ biến ở Viê ̣t Nam phân biê ̣t nhau về màu sắc hoa: hoa màu hồ ng tím, hoa màu trắng vàng và hoa màu trắng đỏ

Đến nay, các mẫu thực vật vẫn thường được nhận diện bằng các đặc điểm hình thái, giải phẫu hoặc các đặc tính sinh lý, hóa sinh, di truyền nhờ vào bảng hướng dẫn định danh có sẵn Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp, như mẫu vật chưa phát triển đầy đủ các đặc tính hình thái, hoặc chúng bị hư hỏng các bộ phận ngoài, hoặc mẫu vật chết đã khiến quá trình nhận diện trở nên khó khăn thậm chí là không thể Trong những trường hợp này mã vạch DNA đã giúp giải quyết khó khăn trên Mã vạch DNA (DNA barcoding) sử dụng một trình tự DNA ngắn nằm trong hệ gen của sinh vật như là một chuỗi

ký tự duy nhất giúp phân biệt hai loài sinh vật với nhau, nó tương tự như máy quét trong siêu thị đọc hai mã vạch của hai sản phẩm mà nhìn bên ngoài chúng rất giống nhau, nhưng thực sự là khác nhau Hơn nữa, mã vạch DNA còn đóng góp thêm một ý nghĩa khác ngoài ý nghĩa giúp định danh mẫu vật,

nó còn giúp quá trình phân tích sự tiến hóa sinh học của loài trong tự nhiên

Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi lựa chọn đề tài: "Nghiên cứu đặc điểm hình thái và trình tự gen rpoC1 của cây dừa cạn [Catharanthus roseus (L.) G Don]" góp phần tư liệu hóa nguồn gen cây dừa cạn phục vụ

nghiên cứu ứng dụng vào thực tiễn chăm sóc sức khỏe cộng đồng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

2 Mu ̣c tiêu nghiên cứu

Phân tích đươ ̣c đă ̣c điểm hình thái và trình tự gen lu ̣c la ̣p rpoC1của các giố ng dừ a ca ̣n khác nhau về màu sắc hoa phu ̣c vu ̣ xây dựng mã vạch DNA cho cây dừ a ca ̣n (Catharanthus roseus (L.) G Don)

3 Nô ̣i dung nghiên cứu

1) Nghiên cứu đặc điểm thực vật học của cây dừa cạn và so sánh sự khác nhau về đặc điểm hình thái giữa các giống dừa cạn hoa hồng tím, hoa trắng vàng và hoa trắng đỏ thu từ mô ̣t số đi ̣a phương phía Bắc Viê ̣t Nam

2) Nghiên cứu thông tin về trình tự gen rpoC1 và khuếch đa ̣i đoa ̣n gen rpoC1

từ DNA hệ gen lục la ̣p của cây dừa cạn Giải trình tự nucleotide của đoa ̣n gen

rpoC1 phân lập từ bốn mẫu dừa ca ̣n thu từ hai tỉnh Hà Giang và Thái Nguyên 3) Phân tích sự đa dạng về trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn

củ a gen rpoC1 của các mẫu nghiên cứu và của gen rpoC1 trên Ngân hàng gen

quốc tế

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

1.1 CÂY DỪA CẠN

1.1.1 Hệ thống phân loại cây Dừa cạn

Giống Catharanthus (thuộc họ trúc đào Apocynaceae) gồm có 8 loài, hầu hết là cây thân thảo lâu năm Trong đó, chỉ có loài Catharanthus pusillus

có nguồn gốc từ Ấn Độ, còn tất cả các loài còn lại có nguồn gốc từ

Madagasca, số lượng nhiễm sắc thể cho tất cả các loài Catharanthus đều là

2n=16 [1], [22] Tám loài thuộc giống này đó là:

 Catharanthus coriaceus Markgr Madagascar;

 Catharanthus lanceus (Bojer ex A.D.C.) Pichon Madagascar;

 Catharanthus longifolius (Pichon) Phichon Madagascar;

 Catharanthus ovalis Markgr Madagasca;

 Catharanthus pusillus (Murray) G.Don India subcontinent;

 Catharanthus roseus (L) G Don Madagascar;

 Catharanthus scintulus (Pichon) Pichon Madagascar;

 Catharanthus trichophyllus (Baker) Pichon Madagascar [1], [22] Những giống Catharanthus có nguồn gốc từ Madagascar thường dùng để làm cảnh và được biết đến nhiều nhất là loài Madagascar Periwinkle hay còn

gọi là vinca nhờ vào khả năng chịu hạn và chịu nóng của nó Ngoài việc có

công dụng như một loài cây cảnh, từ lâu dịch chiết alkaloid từ Catharanthus roseus đã được sử dụng trong y học dân gian như một loài thuốc chống đái

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

tháo đường, lợi tiểu, chữa tiêu chảy, xuất huyết, giúp vết thương mau lành…

và ngày nay người ta còn tìm được một công dụng hết sức quan trọng của loài

Catharanthus roseus đó là khả năng trị bệnh ung thư rất hiệu quả [1], [22] Dừa cạn có tên khoa học là Catharanthus roseus (L) G Don; Vinca rosea L; Lochnera rosea Reich, tên gọi khác là bông dừa, hoa hải đằng, trường xuân hoa… Về phân loại khoa học, dừa ca ̣n có tên khoa học là Catharanthus roseus

(L.) G Don, thuộc Giới (regnum) Plantae, bộ (ordo) Gentianales, họ (familia)

Apocynaceae, chi (genus) Catharanthus, loài (species) C Roseus [1], [22]

Catharanthus roseus giàu alkaloid thuộc loại alkaloid terpenloid indole, trong nhóm này có ba giống dừa ca ̣n khác nhau về màu sắc hoa, ‘roseus’ với hoa màu tím hoặc hồng, ‘ocellatus’ với hoa màu trắng nhụy đỏ, ‘albus’ với

hoa màu trắng [22]

Hình 2.1 Hoa của ba giống Catharanthus

A: Catharanthus roseus var roseus

B: Catharanthus roseus var ocellatus C: Catharanthus roseus var albus

1.1.2 Giá trị sử dụng của cây dừa cạn

Trong dừa cạn có trên 10 alkaloid, rất phức tạp, người ta đã phát hiện

có hơn 60 chất khác nhau như: ajmalicin, tetrahydroalstonin, serpentin,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

lochnerin, akuammin, reserpin Trong tất cả các alkaloid, có loại vinblastin

và vincritin là hai chất có tác dụng tốt trong chữa các ung thư về máu, ajmalicin là thuốc điều trị tim mạch rất tốt cho rối loạn thần kinh tim Nhưng chỉ mới phát hiện ra những dược tính của dừa cạn trong việc áp dụng chữa bệnh vì trong tài liệu cổ của y học cổ truyền không thấy đề cập đến cây này Tuy vậy, y học cổ truyền một số nước cũng có ghi lại một vài kinh nghiệm sử dụng dừa cạn để chữa bệnh Ví dụ, ở Ấn Độ, châu Úc, nam châu Phi, quần

đảo Antilles, người ta dùng dừa cạn sắc uống để chữa bệnh tiểu đường cho

thấy kết quả rất khả quan Ngoài ra, rễ dừa cạn còn được dùng để tẩy giun, chữa sốt, làm thuốc thông tiểu, điều kinh, trị tăng huyết áp, chữa sốt rét, kiết

lị, tiêu hóa kém [1], [23] Bộ phận dùng để làm thuốc của dừa cạn là rễ, lá hoặc cả cây Thông thường, người ta thường nhổ nguyên cả bụi cây dừa cạn

về rửa sạch, cắt nhỏ, phơi khô để cất dùng dần Trước khi sử dụng có thể sao qua cho thơm rồi sắc nước uống Tùy theo mục đích trị liệu, dừa cạn có thể được phối hợp với các vị thuốc khác hoặc dùng độc vị [1]

Năm 1958, xuất phát từ kinh nghiệm dùng dừa cạn chữa khối u của người dân Ấn Độ, các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu và phát hiện chất kháng ung thư trong lá cây dừa cạn là vincaleucoblastine (còn gọi là vinblastin), 4 năm sau, Svoboda và cộng sự cũng tìm thêm một alkaloid nữa là vincaleucocristin (còn gọi là vincristin) Những thực nghiệm lâm sàng cho thấy, chiết xuất vinplastin, vincristin có tác dụng làm giảm bạch cầu, ức chế mạnh sự phân bào Các alkaloid này liên kết đặc hiệu với tubulin, là protein ống vi thể ở thoi phân bào, phong bế sự tạo thành các vi ống này và gây ngừng phân chia tế bào ở pha giữa Ở nồng độ cao, thuốc diệt được tế bào, còn ở nồng

độ thấp làm ngừng phân chia tế bào [23] Hàm lượng các alkaloid này trong

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

dừa cạn rất nhỏ (khoảng 1 phần vạn trong lá dừa cạn khô đối với vinblastin còn đối với vincristin thì ít hơn 10 lần nữa) Vì thế, quá trình điều chế hai alkaliod

từ cây dừa cạn là một quá trình phức tạp và chi phí giá thành cao [3]

Còn với khoa học hiện đại, từ năm 1952, y học đã phát hiện ra dược tính của dừa cạn Xuất phát từ việc bác sĩ Clark Noble ở Canada đã nhận được một gói chuyển phát nhanh loại cây này do một người dân gửi tới với lời giới thiệu “dân địa phương đã dùng chúng trị bệnh tiểu đường” nên ông đã đưa vào phân tích Kết quả khá bất ngờ, thay vì tác dụng hạ đường huyết trong máu, ông lại phát hiện ra hoạt tính trị bệnh ung thư bạch cầu của loại cây này Dừa cạn đã được đưa vào bệnh viện thử nghiệm và trở thành cây dược liệu chính thức theo y khoa hiện đại Khi dùng dừa cạn làm thuốc nên chọn loại hoa trắng vì hoạt chất của chúng cao hơn cây hoa đỏ, hồng Thành phần vincristin có tác dụng với bệnh nhân ung thư nhưng chúng lại là thành phần gây hại cho thai nhi, ức chế hệ thần kinh Vì vậy dừa cạn là cây dược liệu có độc, tránh dùng cho phụ nữ có thai, người huyết áp thấp Dừa cạn được xem

là đặc hữu của vùng đất Madagascar với giá trị dược tính cao nhất thế giới Hiện nay hàng năm người dân Madagascar xuất khẩu đến ngàn tấn dừa cạn phơi khô ra nước ngoài để làm dược liệu Công ty Dược liệu Trung ương Việt Nam II cũng đã xuất khẩu cây này từ thập niên 1990 Thị trường dược phẩm

Mỹ, Pháp, Nhật, Việt Nam… có nhiều loại thuốc được bào chế từ dừa cạn như thuốc trị cao huyết áp, ung thư (máu, tinh hoàn, dạ con)…Kết quả phân tích của bác sĩ Clark, chiết xuất dừa cạn giàu alkaloid (gồm các loại: vinblastin, vincristin, tetrahydroalstonin, pirinin, vindolin, catharanthin, vindolinin, ajmalicin….) [9] Trong đó thành phần vincristin, vinblastin khi tách chiết thành dạng thuốc tiêm sẽ có tác dụng lớn trong ức chế tế bào hoặc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

sự phân bào Cho nên chúng hạn chế được việc hình thành bạch cầu thừa ở bệnh nhân ung thư máu Đặc biệt đến nay, y khoa vẫn chưa tìm ra phương pháp

gì điều trị bệnh bạch cầu tốt hơn nên chiết xuất dừa cạn càng trở nên quý với bệnh nhân ung thư máu Tuy nhiên không phải cứ dùng trà dừa cạn thì chữa được ung thư, bởi một liều tiêm vincristin, vinblastin có hàm lượng rất cao, việc dùng các thành phần này cũng dễ bị ngộ độc nên cần có sự hướng dẫn của bác sỹ điều trị Hoạt chất trong dừa cạn phụ thuộc vào nơi trồng và thu hái Giống trồng ở Việt Nam được đánh giá là thảo dược tốt tương đương dừa cạn ở Madagascar, chứa khoảng 0,1- 0,2% alkaloid toàn phần Tỷ lệ alkaloid trong rễ (0,7-2,4%) cao hơn trong thân (0,46%) và lá (0,37-1,15%) Các nước Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung Quốc… cũng đang ra sức bào chế thuốc từ loại cây này [22]

Theo từ điển Cây thuốc Việt Nam, dừa cạn có vị hơi đắng, tính mát, có độc,

có tác dụng kháng ung thư, trấn tĩnh, an thần, hạ huyết áp, thanh nhiệt, giải độc, hoạt huyết, tiêu thũng Dừa cạn được nghiên cứu làm thuốc kìm hãm sự phát triển tế bào và được chỉ định trong điều trị bệnh Hodgkin (một loại ung thư hệ bạch huyết), bệnh bạch cầu lymphô cấp, một số ung thư Trong dân gian vẫn dùng trị cao huyết áp, trị bệnh đái đường, điều kinh, chữa tiêu hóa kém và chữa

lỵ, thông tiểu tiện, chữa bệnh đi tiểu đỏ và ít Có người dùng trị ung thư máu, ung thư phổi [1], [23] Ở Trung Quốc, toàn cây dừa cạn dùng trị cao huyết áp, bệnh bạch huyết lymphô cấp tính và ung thư, mụn nhọt độc Còn ở Nouvelle-Calédonie (châu Đại Dương), dừa cạn cũng là vị thuốc chống ung thư Ở Australia, nước hãm rễ cây dừa cạn là loại thuốc dân gian chống tiểu đường [36] Theo Tiến sĩ Võ Văn Chi, từ năm 1926 người ta đã tìm thấy một phức hợp có tính chất của digitalin, tới năm 1944 đã tìm thấy một hoạt chất có chức năng của insulin, điều đó cắt nghĩa được tác dụng hạ đường huyết của dừa cạn [1], [19]

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Theo kinh nghiệm sử dụng trong y học dân tộc của một số nước, rễ dừa cạn có tác dụng tẩy giun, chữa sốt, lị trực trùng, chứng tiêu khát, u xơ tuyến tiền liệt Thân và lá có tính chất săn da (astringent), lọc máu (despuratif), dùng chữa một số bệnh ngoài da, sốt rét, bệnh máu trắng, thông tiểu Kinh nghiệm dùng dừa cạn chữa bệnh tiểu đường cũng được ghi nhận ở Ấn Ðộ, châu Úc, nam châu Phi, quần đảo Antilles, nhưng chứng minh bằng thực tế khoa học thì chưa có [1], [22]

Chính nhờ thực nghiệm trên chuột mà các nhà khoa học Canada đã phát hiện tác dụng làm giảm bạch cầu của một số chất tách được từ dừa cạn và dẫn đến sự phát hiện ra chất vincaleucoblastin và 3 alkaloid khác cũng có tác dụng chống u là leurosin, leurocristin và leurosidin Ngoài ra người ta còn phát hiện tác dụng tẩy giun khá mạnh, tác dụng lợi tiểu của catharanthin, vindolinin và vindolidin Những thí nghiệm dùng trên người bệnh được bắt đầu vào những năm 1960 ở Mỹ, Pháp và một số nước khác [1], [22]

Ở nước ta, nhân dân dùng dừa cạn dưới dạng thuốc sắc để làm thuốc lợi tiểu, chữa huyết áp, tiểu đường, ngày dùng 10-16g Các bệnh về nội tiết như đái tháo đường, thông tiểu, viêm đường tiết niệu, tiểu tiện có máu, ít nước tiểu

và trong bế kinh Rễ và lá dùng rất tốt trong hạ huyết áp, nếu cần ta cho thêm cây hoa đại (bông sứ), cỏ mần trầu và lá lạc tiên mỗi thứ khoản 20g sắc nước uống liên tục trong nhiều tháng liền đối với huyết áp cao ở giai đoạn đầu dù

có nguyên nhân hay không có nguyên nhân vẫn rất tốt Có nơi dùng cây dừa cạn khô 20g dạng sắc nước uống để chữa những khối u nhỏ trong cơ thể, thời gian qua ở nhiều cơ sở điều trị đã chiết xuất vinblastin và vincristin là thuốc lựa chọn thứ nhất trong điều trị ung thư biểu mô tinh hoàn, là thuốc chọn thứ hai trong điều trị bệnh Hodgkin, ung thư nhau, ung thư biểu mô tế bào, có vảy

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

ở đầu và cổ, ung thư biểu mô tế bào thận và còn là một trong những thuốc lựa chọn thứ ba để điều trị u nguyên bào thần kinh, ung thư vú, ung thư vòm họng

và ung thư dạng nấm da [23], [36]

Dừa cạn còn dùng để điều trị bệnh sarcoma lympho, sarcoma bạch huyết bào, bệnh sarcoma chảy máu Kaposi, sarcoma tế bào lưỡi Đặc biệt dừa cạn không có sự kháng chéo giữa vinblastin với các loại thuốc chống ung thư khác Liều dùng thân và lá phơi khô 8 - 20g (dạng thuốc sắc, cao lỏng hay viên nén từ cao khô) Nước ta đã chiết được vinblastin từ lá dừa cạn và dùng dưới dạng thuốc tiêm để chữa bệnh bạch cầu lymphô cấp Tương tự các loại thuốc kháng ung thư khác, các chế phẩm alkaloid của dừa cạn cũng gây một

số phản ứng bất lợi như: buồn nôn, nôn, nhức đầu, tiêu chảy, táo bón, tắc ruột, liệt, chán ăn, viêm miệng, rụng tóc, giảm bạch cầu, viêm thần kinh Sử dụng liều cao và kéo dài có thể gây mù, tử vong Thuốc có thể gây độc cho thai, nên tránh dùng cho thai phụ và người đang nuôi con bằng sữa mẹ, người bị thấp huyết áp [1], [36]

1.2 MÃ VẠCH DNA

1.2.1 Đă ̣c điểm của mã vạch DNA (DNA barcoding)

Phương pháp phân loại hình thái có lịch sử phát triển lâu đời và đã xây dựng được một hệ thống phân loại sinh vật nói chung và thực vật nói riêng tương đối đầy đủ và toàn diện Phương pháp phân loại này chủ yếu dựa vào sự khác biệt về hình thái của các cơ quan trong cơ thể thực vật, đặc biệt là cơ quan sinh sản (hoa) Tuy nhiên, cách thức phân loa ̣i này cũng gặp rất nhiều khó khăn khi cần xác định những mẫu vật đang trong giai đoạn phát triển (chưa ra hoa), những mẫu có đặc điểm giống nhau do cùng thích nghi với điều kiện môi trường, hoặc khó nhận biết do có nhiều điểm tương đồng ở bậc phân

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

loại thấp như loài và dưới loài [16] Từ giữa những năm 1990, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, một phương pháp nghiên cứu mới trong lĩnh vực phân loại học đã hình thành và được gọi là phương pháp phân loại học phân tử Phương pháp này dựa trên các dữ liệu thông tin về hệ gen (DNA) trong và ngoài nhân hoặc các sản phẩm của chúng (protein) Tùy mục đích hoặc đối tượng nghiên cứu, người ta có thể lựa chọn các gen (đoạn DNA) khác nhau hoặc các sản phẩm khác nhau của hệ gen [5] Phân loại học phân tử (Molecular taxonomy) đã cho những kết quả khá chính xác, giúp cho việc phát hiện loài mới, giải quyết các mối nghi ngờ về vị trí phân loại, đánh giá đầy đủ về tính đa dạng di truyền, chủng loại phát sinh và sự tiến hóa của nhiều loài động vật, thực vật và vi sinh vật So với chỉ thị hình thái, chỉ thị DNA cho độ chính xác cao mà không lệ thuộc vào các yếu tố môi trường Đối với thực vật, hệ gen lục lạp (cpDNA) là những gen rất bảo thủ trong tiến hóa

Trong đó rpoC1 là một gen lu ̣c la ̣p, cấu trúc vòng kép, bền vững, chiều dài dao động từ 409- 545 bp [17] Chức năng của rpoC1 mã hóa cho tiểu đơn vị β

- RNA polymerase Căn cứ mức đô ̣ đô ̣t biến trong trình tự nucleotide của gen

mà có thể phân biệt hai loài hay xác đi ̣nh đươ ̣c quan hê ̣ ho ̣ hàng giữa các đối tươ ̣ng nghiên cứu Kết quả nghiên cứu sẽ góp phần cho viê ̣c thiết lâ ̣p mã va ̣ch DNA (DNA barcoding) cho cây dừ a ca ̣n

Năm 2003, Paul Hebert, nhà nghiên cứu tại Đại học Guelph ở Ontario, Canada, đề xuất thuâ ̣t ngữ "mã vạch DNA" (DNA Barcode) như là một cách

để xác định loài [6] Mã vạch được sử dụng là một đoạn DNA ngắn từ một phần của hệ gen và được dùng giống như cách một máy quét ở siêu thị phân biệt được các sản phẩm bằng cách nhận diện được các sọc màu đen đặc chưng của từng sản phẩm Trong công nghệ mã vạch, có thể hai mặt hàng trông rất

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

giống nhau và không phân biệt được bằng mắt thường, song qua mã vạch, máy quét có thể phân biệt được Một mã vạch DNA điển hình phải đáp ứng được các yêu cầu sau: (i) Có tính phổ biến cao để có thể thực hiện trên nhiều loài thực vật; (ii) Trình tự có tính đặc hiệu cao và có hiệu suất nhân bản cao; (iii) Có khả năng phân biệt đồng thời được nhiều loài [5], [6]

1.2.2 Ứng dụng mã vạch DNA trong nhận biết cây dươ ̣c liê ̣u

Những ứng dụng của mã vạch DNA không chỉ nhận diện nhanh các mẫu mà còn rất hữu ích trong việc tìm mối quan hệ giữa các mẫu mặc dù chúng hầu như không giống nhau về hình thái

Trong lĩnh vực pháp y, chỉ cần một lượng mẫu rất nhỏ, thậm chí chỉ vài dấu vết để lại trên hiện trường cũng có thể giúp cảnh sát truy tìm nguồn gốc tội phạm

Trong nông nghiệp, một trong những điều đáng lo ngại nhất là kiểm soát những tác nhân gây bệnh cho cây trồng, chi phí cho việc đó lên đến hàng

tỷ USD mỗi năm Sử dụng mã vạch DNA sẽ giúp định danh nhanh chóng các loài gây bệnh ở giai đoạn tiềm ẩn (giai đoạn ấu trùng), hỗ trợ chương trình kiểm soát sâu bệnh bảo vệ cây trồng Cho đến nay, về cơ bản đã hoàn thành

mã vạch DNA để nhận diện sâu bệnh ở cây ăn trái trên thế giới và chuyển giao thiết bị, công nghệ cho các nhân viên hải quan của nhiều quốc gia để họ

có thể xác định và ngăn cản sự lan truyền của trái cây nhiễm sâu bệnh Kinh doanh sản phẩm nông nghiệp sẽ được đẩy mạnh hơn và nhờ đó rút ngắn thời gian, đạt kết quả trong việc đối phó với sâu bệnh Mã vạch DNA cũng được

sử dụng để nhận diện những vật chủ trung gian gây bệnh Các nhà khoa học những người mà không phải là nhà phân loại học hoặc nghiên cứu về ký sinh trùng đã đẩy nhanh quá trình nhận diện các loài mang bệnh lây truyền giữa

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

người và động vật Và để hiểu biết thêm những bệnh truyền nhiễm cũng như phương pháp điều trị đạt được hiệu quả nhanh chóng Mã vạch DNA cho những vật chủ gây bệnh đang được xây dựng và bước đầu đưa vào sử dụng, điều này cung cấp cho các tổ chức và các cơ quan y tế cộng đồng các công cụ và phương pháp hiệu quả để ngăn cản và hạn chế sự phát triển của ruồi và diệt côn trùng

Mã vạch DNA cũng được ứng dụng tại hải quan nhằm hỗ trợ việc xác định nguồn gốc của sinh vật sống hoặc hàng nhập khẩu, để ngăn cản sự vận chuyển trái phép các loài thực vật và động vật quý hiếm qua biên giới Một thực tế đáng báo động, đa dạng sinh học trên thế giới đang liên tục giảm sút, trong đó nhiều loài có nguy cơ tuyệt chủng Không thể kiểm soát được săn bắn ở một số vùng Châu Phi điều đó đã làm cho loài linh trưởng giảm 90% Rất khó để phân biệt có phải thịt của những loài động vật hoang giã quý hiếm hay không Vì vậy, mã vạch DNA có thể giúp những cơ quan có thẩm quyền chỉ ra thịt có nguồn gốc từ những loài nguy cấp, ngăn chặn săn bắn bất hợp pháp và giúp bảo tồn sự đa dạng sinh học Một dự án chiến lược trên toàn thế giới của mã vạch DNA đã được công bố gần đây nhằm xây dựng một thư viện

mã vạch của các loài đang bị đe dọa Mã vạch DNA ngoài việc giúp ngăn ngừa bệnh, kiểm soát hành vi săn bắn trái phép những loài nguy cấp mà nó còn được ứng dụng trong nông nghiệp và khai thác lâm nghiệp Một số quốc gia có nền kinh tế phụ thuộc vào nguồn tài nguyên đã phải đối mặt với việc khai thác quá mức nguồn tài nguyên nông nghiệp, biển và lâm nghiệp gây ra sự suy giảm hoặc thậm chí tuyệt chủng của nhiều loài Để kiểm soát khai thác, nhà chức trách cần phải thiết lập hệ thống quản lý một cách hiệu quả để kiểm soát kinh doanh các sản phẩm nông nghiệp, biển và lâm nghiệp Có ít nhất hai

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

dự án về mã vạch cho cá (Fish-BOL) và cây thân gỗ (Tree-BOL) nhằm thúc đẩy công tác quản lý và bảo vệ nguồn tài nguyên thiên nhiên [17], [22]

Cuộc sống của chúng ta phụ thuộc vào nước Hiện tại nước ngọt trở thành nguồn tài nguyên quý giá cần được bảo vệ ở mỗi quốc gia Nguồn nước

bị ô nhiễm cần được xác định để phòng ngừa và có biện pháp xử lý Một vài sinh vật đơn giản trong nước được xem là ô nhiễm (ví dụ như ấu trùng của muỗi) Tuy nhiên, ô nhiễm càng cao thì càng khó khăn hơn trong việc xác định các chỉ số ô nhiễm Vì vậy, tại thời điểm này các nhà khoa học đang cố gắng xây dựng thư viện mã vạch DNA cho những “chỉ số mập mờ” Điều này giúp cho cán bộ quản lý môi trường tiêu chuẩn hóa lại các chỉ số trong việc đánh giá mức độ ô nhiễm của nước và thiết lập quy trình đánh giá tiêu chuẩn nước tốt hơn ở mỗi quốc gia

Thực vật dùng làm thuốc luôn cần được xác định ở cấp độ loài, vì vậy xác định chính xác loài là một bước quan trọng để có thể đảm bảo về chất lượng sản phẩm Cùng với sự phát triển của thị trường thảo dược, sự giả mạo các nguyên liệu thảo dược thuốc cũng trở thành vấn đề toàn cầu Các nguyên liệu thảo dược này có thể được thay thế bằng các loại thảo mộc khác có quan hệ họ hàng gần gũi, thậm chí từ những nguyên liệu giả mạo Việc giả mạo các nguyên liệu thảo dược thường là do: Vật liệu không phân biệt được bằng đă ̣c điểm hình thái; Những vật liệu có tên tương tự nhau; Việc thay thế những nguyên liệu có giá trị kinh tế bằng nguyên liệu khác rẻ tiền hơn

Tuy nhiên, việc xác định chính xác các nguyên liệu thảo dược làm thuốc theo phương pháp truyền thống như sự đánh giá cảm quan và phương pháp hóa học đôi khi gặp nhiều khó khăn, đặc biệt là những nguyên liệu có nguồn gốc từ thực vật đã được chế biến một phần hoặc ở dạng bột Vì vậy,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

phương pháp sử dụng các dấu chuẩn phân tử rõ ràng là chính xác và phổ biến hơn Việc nhận biết các nguyên liệu thảo dược sử dụng phương pháp mã vạch DNA có thể bảo vệ người dùng tránh khỏi tác dụng độc hại của các loại thuốc giả mạo, đặc biệt trong nhiều trường hợp có thể nguy hiểm đến tính mạng [5]

Trước đây người ta phân chia dừa cạn thành 2 giống là

Catharanthusroseus var roseus và Catharanthusroseus var angustus, đến

2004, dừa cạn có khoảng 100 giống khác nhau Đã có nhiều nghiên cứu về dừa cạn như chọn giống dựa vào hình thái hoặc dựa trên hàm lượng alkaloid, nghiên cứ u con đường sinh tổng hơ ̣p alkaloid, so sánh hàm lươ ̣ng alkaloid giữa lá, rễ, sử du ̣ng dừa ca ̣n điều chế thuốc chữa bê ̣nh, sử dụng các kỹ thuật AFLP, RAPD và sử dụng hóa phân loại để nhận dạng dừa ca ̣n [5], [11], [22]

1.3 GEN LỤC LẠP

Tế bào thực vật bậc cao chứa 3 cơ quan di truyền đó là: nhân, ty thể và lạp thể Mỗi cơ quan tử chứa bộ gen riêng của nó Di truyền gen ty thể và lục lạp không tuân theo quy luật Menden và thường di truyền theo kiểu đơn bố mẹ cho thế hệ sau Hiện tại các nhà khoa học tập trung nghiên cứu lạp thể nhất là lục lạp Ris và Plaut (1962) là những người đầu tiên khám phá ra sự có mặt của DNA trong lục lạp bằng cách quan sát tảo xanh Chlamydomonas moewusii dưới kính hiển vi DNA lục lạp có dạng vòng kép, thường có khoảng 120-170 nghìn bp, chiều dài khoảng 30-60µm, khối lượng khoảng 80-

130000000 dalton [7]

Hầu hết gen lục lạp của thực vật thường tồn tại ở dạng vòng, kép lớn Nhưng

ở một số loài như tảo dinophyte, hệ gen lục lạp lại được chia thành nhiều plasmid nhỏ, mỗi plasmid này có từ 2000-10000 bp, nhưng không có DNA mã hóa [6] Bộ gen của lục lạp gồm khoảng 100 gen, ở các loài thực vật trên cạn,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

trình tự gen gần như là giống nhau, chúng mã hóa cho 4 loại RNA ribosome,

30-31 tRNA, 21 proteins ribosome và 4 RNA polymerase tiểu đơn vị

Hệ gen lục lạp có một phần nhỏ được gọi là phần bảo thủ Phần này chứa một trình tự các nucleotide bền vững, khó bị các tác nhân lý, hóa học tác động gây đột biến, do đó đoạn nucleotide này hầu như không bị biến đổi trong quá trình tiến hóa Do vậy các nhà khoa học đã quan tâm nghiên cứu, sử dụng các đoạn gen này ở các loài thực vật khác nhau cho công nghệ mã vạch DNA, qua

đó phân tích trình tự nucleotide của đoạn gen đó để xét mối quan hệ họ hàng giữa các loài trong sinh giới hiện nay

Rất nhiều vùng gen trong hệ gen lục lạp đã được sử dụng trong công nghệ

mã vạch DNA như: matK, rpoC1, [5]

Maturase K trình tự gen này đã thành công trong việc xác định các loại

thuốc thảo dược "Dahuang" có nguồn gốc từ Rheum palmatum L (Polygonaceae), R tanguticum (Maxim ex Regel) Maxim ex Balf, R officinale Baill., và loài gần gũi Rheum L với mức độ biến đổi nội bộ loài và giữa các loài khác nhau là cao Vì vậy, nó thường được sử dụng để xác định các nguyên liệu thảo dược ở những vị trí địa lý khác nhau [5], [6]

rpoC1 là gen lu ̣c la ̣p, cấu trúc vòng kép, bền vững Chiều dài trung bình

520 bp Chức năng mã hóa cho enzyme RNA polymerase β – tiểu đơn vị [4], [8], [11]

Tuy nhiên qua nhiều nghiên cứu, các nhà khoa học đã thấy rằng trong số

các gen mã vạch, rpoC1 là một ứng cử viên hứa hẹn cho mã vạch DNA thực

vật Căn cứ mức đô ̣ đô ̣t biến trong trình tự nucleotide của gen mà có thể xác định đươ ̣c quan hê ̣ ho ̣ hàng giữa các đối tượng nghiên cứu [4], [8], [11]

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Những thay đổi ở DNA lục lạp (cpDNA) đã và đang được sử dụng cho các nghiên cứu về tiến hóa, sinh thái và phát sinh chủng loại ở thực vật CpDNA có mức độ bảo thủ trong việc thay thế cho các nucleotide Điều này tạo điều kiện cho sự so sánh những thay đổi ở phạm vi rộng trong phân loại thực vật Một số chỉ thị cpDNA như microsatellite lục lạp, một số vùng không

mã hóa, một số phân đoạn của chuỗi đơn lớn (trnC – trnD, trnD – trnT, psaA – trnS, petB – petD, trnH – psaA, trnD – trnT) và một số vùng đệm giữa các gen (trnL – trnF) đã được dử dụng trong các nghiên cứu về đa dạng di truyền

và phát sinh loài ở thực vật [10]

2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BI ̣

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu

Mẫu Dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G.Don) được thu thập tại hai

tỉnh Hà Giang và Thái Nguyên Hai mẫu dừa ca ̣n hoa màu hồng tím (ký hiệu

là TIM_HG) và dừ a ca ̣n hoa màu trắng vàng (ký hiệu là TV_HG) thu ta ̣i Hà

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Giang; hai mẫu dừ a ca ̣n hoa màu hồng tím (ký hiệu là TIM_TN) và dừa ca ̣n hoa trắng đỏ (ký hiệu là TRANG_TN)

2.1.2 Hóa chất, thiết bị và máy móc

Các hóa chất sử dụng trong sinh học phân tử như: Tris HCl, EDTA, phenol, ethanol (100%), agarose thuộc các hãng: Merck, Sigma, Biolabscasc

của các nước nước Mỹ, Anh, Đức Ngoài ra còn một số hóa chất khác

Các thí nghiệm được tiến hành trên các trang thiết bị như bộ nguồn điện di NanoPAC - 500 của Cleaver Scientific, Anh, bộ điện di DNA Cleaver Scientific, Anh, máy PCR eppendorf, Đức, máy UV Shimadzu UV 1800, Nhật Bản, một số thiết bị khác như lò vi sóng (Electrolux của Việt Nam), tủ sấy (Nuaire của Mĩ), tủ lạnh -20oC (Panasonic của Nhật Bản), tủ lạnh -85oC (Nuaire của Mĩ), pipetman, bể ổn nhiệt, máy ly tâm nồi khử trùng và một số thiết bị khác

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp thu mẫu

Thu thập mẫu dừa cạn có hoa màu hồng tím và hoa trắng ở khu vực thành phố Hà Giang và thành phố Thái Nguyên, cây dừa cạn được chọn đều là các cây khỏe mạnh, hoa đẹp Tiến hành trồng các cây này ở một địa điểm thích hợp có cường độ ánh sáng vừa đủ, tưới nước hàng ngày với lượng nước như nhau Sau một thời gian, thu hoạch lá non để tiến hành tách DNA Sau khi thu, mẫu lá được làm sạch bằng cồn và nước cất sau đó được cho vào túi nilon, buộc kín rồi đưa về phòng thí nghiệm bảo quản ở -80oC để tách chiết DNA phục vụ nghiên cứu

2.2.2 Các phương pháp sinh học phân tử

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

2.2.2.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số

DNA tổng số được tách chiết từ lá non của các mẫu giống dừa cạn sử dụng hóa chất CTAB Chúng tôi tiến hành tách chiết DNA tổng số theo các bước như sau:

Bước 1 Lấy 200mg lá non nghiền trong nitơ lỏng (– 1960C) thành bột mịn Bổ sung vào mẫu 600µl đệm rửa có thành phần (Tris – HCl 100mM, pH

= 8,0; EDTA 5mM, pH = 8,0; NaH2PO4 0,4%; sorbitol 350mM; nước) Chia

ra 4 ống Eppendorf 1,5ml Li tâm trong 15 phút, với tốc độ 12000 vòng/phút

ở 4ºC, bỏ dịch, thu cặn ( Bước này lặp lại 2 lần)

Bước 2 Thêm vào mỗi ống 500 µl đệm chiết ( bao gồm các thành phần: Tris – HCl 100mM, pH = 8,0; EDTA 20mM, pH = 8,0; CTAB 4%; NaCl 1,4M; nước), trộn nhẹ, ủ ở nhiệt độ 65ºC trong vòng 2 giờ (15 phút đảo nhẹ ống 1 lần) Sau khi ủ xong, lấy ra để ở nhiệt độ phòng 5 phút

Bước 3 Li tâm trong 15 phút, với tốc độ 12000 vòng/phút ở 4ºC Thu dịch pha trên chuyển sang ống Eppendorf 1,5 ml mới

Bước 4 Bổ sung thêm 500µl cloroform : isoamyl alcohol (24 cloroform : 1 isoamyl alcohol) để loại protein và tạp chất, đảo đều ống trong 15 phút Li tâm trong 15 phút, với tốc độ 12000 vòng/phút ở 4ºC Hút cẩn thận 500µl dịch trong ở pha trên sang ống Eppendorf 1,5µl mới (bỏ tủa) Bước này lặp lại 2 lần

Bước 5 Thêm 500µl isopropanol, trộn nhẹ, tủa DNA ở -20ºC để qua đêm Sau đó li tâm trong 15 phút, với tốc độ 12000 vòng/phút ở 4ºC, loại dịch thu tủa

Bước 6 Bổ sung 500µl cồn 70 độ Li tâm 10 phút, 12000 vòng/phút ở 4ºC, loại bỏ dịch thu tủa (lặp lại 2-3 lần) Làm khô ở nhiệt độ phòng rồi hòa tan DNA trong 50µl nước cất 2 lần đã khử trùng Bảo quản ở tủ -200C đến khi sử dụng