Thiết kế vector mang cấu trúc gen gmdreb2 nhằm phục vụ tạo cây đậu tương chuyển gen chịu hạn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HOÀNG THỊ THU HOÀN THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC GEN GmDREB2 NHẰM PHỤC VỤ TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG CHUYỂN GEN CHỊU HẠN LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái nguyên, 2014 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HOÀNG THỊ THU HOÀN THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC GEN GmDREB2 NHẰM PHỤC VỤ TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG CHUYỂN GEN CHỊU HẠN Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu Thái Nguyên, 2014 i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan nội dung trình bày luận văn tơi tìm hiểu, nghiên cứu hướng dẫn GS.TS Chu Hoàng Mậu cộng tác giúp đỡ cộng nhóm nghiên cứu Các số liệu, kết trình bày luận văn đồng ý cán hướng dẫn nhóm nghiên cứu Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Tác giả luận văn Hoàng Thị Thu Hoàn ii LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới GS.TS Chu Hồng Mậu tận tình hướng dẫn tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn NCS Đào Xuân Tân thầy cô Bộ môn Di truyền học & Sinh học đại, khoa Sinh – Kỹ thuật nông nghiệp, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình thực thí nghiệm đề tài Tơi xin cảm ơn TS Lê Văn Sơn cán Phịng Cơng nghệ DNA ứng dụng, Phịng thí nghiệm trọng điểm cơng nghệ gen, Viện Cơng nghệ sinh học nhiệt tình giúp đỡ tơi q trình thực đề tài Tôi xin cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Tân Trào, Tuyên Quang tạo điều kiện thuận lợi cho tơi học tập hồn thành khố học Tơi xin bày tỏ lời cảm ơn đến gia đình, bè bạn động viên khuyến khích giúp đỡ tơi q trình làm luận văn Đề tài luận văn thuộc chương trình đào tạo nghiên cứu sinh cao học Bộ môn Di truyền & Sinh học đại, khoa Sinh-KTNN, trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên Tác giả luận văn Hồng Thị Thu Hồn iii MỤC LỤC Trang Trang bìa phụ Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục bảng iv Danh mục hình v Những chữ viết tắt vi MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY ĐẬU TƯƠNG VÀ ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG 1.1.1 Cây đậu tương .3 1.1.2 Đặc tính chịu hạn thực vật đậu tương 1.2 DREB VÀ GEN DREB2 13 1.2.1 Gen DREB 13 1.2.2 DREB2 gen GmDREB2 15 1.3 CHUYỂN GEN VÀ VECTOR CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT 17 1.3.1 Kỹ thuật chuyển gen trực tiếp gián tiếp thực vật 17 1.3.2 Hệ thống vector dùng chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium 19 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 22 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 22 2.1.2 Hóa chất thiết bị 23 2.1.3 Địa điểm nghiên cứu .24 iv 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.2.1 Phân lập gen .24 2.2.1.1 Phương pháp tách chiết RNA 24 2.2.1.2 Phương pháp tổng hợp cDNA 25 2.2.1.3 Phương pháp PCR 26 2.2.1.4 Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony – PCR) 27 2.2.1.5 Phương pháp tinh sản phẩm PCR 27 2.2.1.6 Phương pháp ghép nối gen đích vào plasmid 27 2.2.1.7 Phương pháp tách chiết plasmid tái tổ hợp 28 2.2.1.8 Phương pháp xác định trình tự nucleotide gen 29 2.2.2 Phương pháp thiết kế vector 29 2.2.3 Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào A tumefaciens 30 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 PHÂN LẬP GEN GmDREB2 TỪ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG CHỊU HẠN DT2008 31 3.1.1 Nhân gen GmDREB2 từ mRNA kỹ thuật RT-PCR 31 3.1.2 Tách dòng đoạn mã hoá (cDNA) gen GmDREB2 32 3.1.3 Kết đọc trình tự đoạn mã hố gen GmDREB2 .35 3.2 KẾT QUẢ THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC GmDREB2 38 3.2.1 Kết cắt plasmid pBT mang gen GmDREB2 XbaI SacI .38 3.2.2 Kết cắt plasmid pBI121 XbaI SacI 39 3.2.3 Tạo vector chuyển gen pBI121 mang cấu trúc GmDREB2 40 3.3 KẾT QUẢ TẠO DÒNG VI KHUẨN A tumefaciens MANG CẤU TRÚC GEN GmDREB2 41 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 43 Kết luận 43 Đề nghị 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 iv DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Sản xuất đậu tương Việt Nam từ 2007 đến 2013 Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi sử dụng nghiên cứu 23 Bảng 2.2 Thành phần cho phản ứng tổng hợp cDNA 25 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR 26 Bảng 2.4 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 26 Bảng 2.5 Thành phần gắn gen GmDREB2 vào vector tách dòng pBT 27 Bảng 2.6 Thành phần hóa chất tách chiết plasmid 28 Bảng 3.1 Sự sai khác trình tự đoạn gen GmDREB2 giống đậu tương DT2008 trình tự có mã số DQ054363 36 Bảng 3.2 Sự sai khác trình tự amino acid protein DREB2 (DT2008) trình tự có mã số AAY89658 37 v DANH MỤC HÌNH Trang Hình 2.1 Ảnh hạt giống đậu tương DT2008 22 Hình 2.2 Sơ đồ cấu trúc vector sử dụng nghiên cứu 23 Hình 2.3 Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen 30 Hình 3.1 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân đoạn mã hố gen GmDREB2; 31 Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm tinh đoạn mã hoá gen GmDREB2 32 Hình 3.3 Ảnh đĩa khuẩn lạc 33 Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR từ khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn cDNA GmDREB2 34 Hình 3.5 Hình ảnh điện di kiểm tra plasmid pBT/GmDREB2 tái tổ hợp; 34 Hình 3.6 Sơ đồ so sánh trình tự đoạn mã hố gen GmDREB2 giống đậu tương DT2008 DQ054363 35 Hình 3.7 Sơ đồ so sánh trình tự amino acid protein DREB2 giống DT2008 AAY89658 37 Hình 3.8 Ảnh điện di sản phẩm plasmid pBT/GmDREB2 cắt XbaI SacI 38 Hình 3.9 Kết điện di kiểm tra sản phẩm plasmid pBI121 cắt XbaI SacI 39 Hình 3.10 Hình điện di sản phẩm colony- PCR từ khuẩn lạc mang plasmid pBI121/GmDREB2 tái tổ hợp 41 Hình 3.11 Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR từ vi khuẩn A tumefaciens mang plasmid pBI121/GmDREB2 42 vi NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT ABA Axit absisic bp Cặp base cs Cộng C:I Chloroform : Isoamyl DEPC Diethyl pyrocarbonate DNA Deoxyribonucleic Acid DREB Dehydration – Responsive Element Binding dNTP Deoxy Nucleotide Triphosphate EDTA Ethylene diamine tetra- acetic acid E coli Escherichia coli kb Kilo base LB Luria Bertani OD Optical density PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi RNA Ribonucleic Acid TAE Tris - Acetate - EDTA Taq Thermus aquaticus v/p vòng / phút X-gal 5-bromo-4-chloro-indolyl-β-D-galactopyranoside MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) gọi đậu nành trồng cạn ngắn ngày mang ý nghĩa chiến lược nhiều quốc gia giới có giá trị dinh dưỡng kinh tế cao Hạt đậu tương chứa 30% - 56% protein, chứa 12% - 25% lipid, chứa 36% - 40% hydrat cacbon loại amino acid cần thiết cho thể người như: cystein, lysine, triptophan, leucine, methyonine… Ngồi đậu tương cịn chứa nhiều loại vitamin (B1, B2, C, D, E, K…) nguồn lượng cần thiết cho sống người động vật Do có thời gian sinh trưởng ngắn, hệ rễ lại có nốt sần mang vi khuẩn cố định nitơ khơng khí nên đậu tương thường trồng luân canh với lúa ngô để tăng vụ, cải tạo đất bạc màu bảo vệ môi trường Cây đậu tương trở thành trồng quan trọng không Việt Nam mà nhiều nước giới Sản phẩm làm thực phẩm cho người, thức ăn cho gia súc, nguyên liệu quan trọng cho nhiều ngành công nghiệp Trong năm gần hạn hán xảy thường xuyên tác động xấu đến sinh trưởng, phát triển, làm giảm suất sản lượng trồng có đậu tương Đậu tương tương đối mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh thuộc vào nhóm chịu hạn kém, thiếu nước thời kì khác có tác động xấu, làm giảm suất đậu tương Đặc tính chịu hạn đậu tương tính trạng đa gen mà sản phẩm gen liên quan trực tiếp đến biểu tính chịu hạn có chức điều hồ nhóm gen chịu hạn DREB loại protein điều hịa có chức kích thích hoạt động phiên mã nhóm gen chịu hạn, nhân tố 34 M 10 11 12 13 0,50 kb 0,48 kb Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR từ khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn cDNA GmDREB2; giếng 1-13: khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn cDNA GmDREB2; M: thang chuẩn 1kb Tiếp theo mang nuôi khuẩn lạc chọn lọc môi trường LB lỏng có bổ sung carbenicillin ( tỉ lệ 1000LB: carbenicillin) Ni 370C, lắc 200 vịng/phút, 16 mang tách plasmid Sản phẩm tách plasmid điện di kiểm tra gel agrose, kết thể hình 3.5 M 10 11 12 13 Hình 3.5 Hình ảnh điện di kiểm tra plasmid pBT/GmDREB2 tái tổ hợp; Giếng 1-13: plasmid pBT/GmDREB2 dòng khuẩn lạc Kết hình 3.5 cho thấy, tách thành cơng plasmid tái tổ hợp, đảm bảo đủ số lượng chất lượng để phục vụ cho việc xác định trình tự nucleotide 35 3.1.3 Kết đọc trình tự đoạn mã hố gen GmDREB2 Để xác định trình tự đoạn mã hố gen GmDREB2 chúng tơi tiến hành đọc trình tự mẫu plasmid mang gen đích máy đọc trình tự tự động Kết xác định trình tự gen có kích thước 480 nucleotide mã hoá cho 159 amino acid Tiến hành so sánh trình tự đoạn mã hố gen GmDREB2 DT2008 với trình tự gen mang mã số DQ054363 công bố Ngân hàng gen quốc tế phần mềm BioEdit, kết trình bày hình 3.6 Hình 3.6 Sơ đồ so sánh trình tự đoạn mã hoá gen GmDREB2 giống đậu tương DT2008 DQ054363 Kết so sánh trình tự đoạn gen GmDREB2 giống DT2008 trình tự mang mã số DQ054363 (Hình 3.6) cho thấy mức độ tương đồng xác 36 định hai trình tự 96,5% Tuy nhiên tìm thấy có 17 vị trí nucleotide khác hai trình tự (Bảng 3.1) Bảng 3.1 Sự sai khác trình tự đoạn gen GmDREB2 giống đậu tương DT2008 trình tự có mã số DQ054363 TT Vị trí nucleotide DQ054363 DT2008 A C 36 T G 40 A T 45 T G 57 A G 63 G T 78 G A 202 A G 318 G C 10 348 G C 11 405 G C 12 406 A T 13 415 A G 14 416 T C 15 419 G A 16 437 A C 17 441 G C Tiếp theo tiếp tục so sánh protein suy diễn kết thu thể hình 3.7 37 Hình 3.7 Sơ đồ so sánh trình tự amino acid protein DREB2 giống DT2008 AAY89658 Kết so sánh trình tự amino acid hình 3.7 cho thấy tương đồng amino acid hai trình tự đạt 97,9%, xuất sai khác 10 vị trí amino acid vị trí số 3, 14, 21, 68, 206, 236, 239, 240, 246, 247 (Bảng 3.2) Bảng 3.2 Sự sai khác trình tự amino acid protein DREB2 (DT2008) trình tự có mã số AAY89658 TT Vị trí amino acid AAY89658 DT2008 E D 14 T S 21 E D 68 T A 106 K N 136 T S 139 I A 140 S N 146 Y S 10 147 E D 38 Như vậy, kết luận tách dịng thành cơng xác định trình tự đoạn gen GmDREB2 (cDNA) phân lập từ giống đậu tương chịu hạn DT2008 3.2 KẾT QUẢ THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC GmDREB2 3.2.1 Kết cắt plasmid pBT mang gen GmDREB2 XbaI SacI Thành phần phản ứng cắt gồm: H2O: μl; Buffer: μl; XbaI: 1,5 μl; SacI: 1,5 μl; pBT: 10 μl Ủ 370C/16 Khi vector pBT xử lý XbaI SacI, vector pBT bị cắt hai đầu gen đích hình thành hai đầu dính khác Việc xử lý cắt hai enzym khác có ý nghĩa việc ngăn cản đóng vịng trở lại vector thu cấu trúc gen GmDREB2 có đầu so le Dự đoán mặt lý thuyết, sản phẩm cắt pBT XbaI SacI chụp ảnh điện di có băng tương ứng với kích thước vector pBT mở vịng khoảng 2705 bp kích thước gen GmDREB2 480 bp Kết phản ứng cắt vector pBT XbaI SacI thể ảnh điện di 3,0kb 0,5kbb 2,705kb 0,48kb Hình 3.8 Ảnh điện di sản phẩm plasmid pBT/GmDREB2 cắt XbaI SacI; thang chuẩn kb 39 Kết hình ảnh cho thấy xuất băng gọn, rõ nét vị trí tính tốn lí thuyết, phản ứng cắt thành cơng Với mục đích cắt lấy gen đích mang hai đầu dính khác nên chúng tơi cắt băng có kích thước khoảng 480 bp để tinh bảo quản - 200C để dùng cho phản ứng tiếp sau 3.2.2 Kết cắt plasmid pBI121 XbaI SacI Thành phần phản ứng cắt gồm: H2O: 19,5 μl; Buffer: μl; XbaI: 2,5 μl; SacI: μl; pBI121: 20 μl Ủ 370C/16 Plasmid pBI121 có kích thước 13,0kb; mang vị trí cắt XbaI SacI hai đầu gen gus Với việc xử lý cặp enzym XbaI SacI plasmid pBI121 bị cắt mở vịng để loại bỏ gen gus, hình thành hai đầu tương ứng có liên kết bổ sung với hai đầu gen GmDREB2 Theo lý thuyết sản phẩm cắt pBI121 có hai băng tương ứng với kích thước khoảng 11,2 kb 1,8 kb (kích thước gen gus) Sản phẩm cắt điện di gel agarose 0,8% 11,2 kb 1,8 kb kb Hình 3.9 Kết điện di kiểm tra sản phẩm plasmid pBI121 cắt XbaI SacI; thang chuẩn 1kb 40 Kết hình ảnh cho thấy xuất hai đoạn băng theo tính tốn lý thuyết có kích thước khoảng 11,2 kb 1,8 kb Chúng tiến hành cắt băng mong muốn tinh sạch, bảo quản nhiệt độ - 200C để phục vụ cho việc thiết kế vector chuyển gen sau 3.2.3 Tạo vector chuyển gen pBI121 mang cấu trúc GmDREB2 Plasmid pBI121 dạng Ti-plasmid Agrobacterium tumefaciens cải biến cách loại bỏ gen gây độc gắn vào gen kháng kháng sinh để chọn lọc phù hợp với việc chuyển gen vào tế bào thực vật Chúng sử dụng loại enzym XbaI SacI để xử lý hai cấu trúc plasmid pBI121 GmDREB2 nên chúng dễ dàng ghép nối lại với nhờ enzym T4 ligase Thành phần phản ứng ghép nối gồm: H2O: μl; BufferT4: μl; T4 ligase: μl; GmDREB2: μl; plasmid pBI121 : μl Phản ứng thực 220C thời gian từ Sau đó, chúng tơi tiến hành biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E coli DH5α phương pháp sốc nhiệt để chọn lọc, nhân nhanh plasmid với số lượng lớn Kết biến nạp vào E coli DH5α cho thấy có nhiều khuẩn lạc sống sót mơi trường có kháng sinh chọn lọc kanamycin 50mg/l, chứng tỏ việc biến nạp thành công Kết kiểm tra vector tái tổ hợp phản ứng colony-PCR Để kiểm tra xem khuẩn lạc có mang vector tái tổ hợp hay khơng, chúng tơi tiến hành chọn khuẩn lạc riêng rẽ, trịn đều, từ đĩa khuẩn để tiến hành tách plasmid, sau thực phản ứng PCR plasmid với mồi đặc hiệu Kết colony- PCR kiểm tra điện di gel agrose 0,8% thể hình 3.10 Qua hình ảnh cho thấy mẫu plasmid tách chiết từ E coli DH5α biến nạp vector tái tổ hợp pBI121/GmDREB2 cho kết dương tính, xuất băng DNA có kích thước khoảng 480 bp Như 41 mẫu plasmid mang cấu trúc pBI121/GmDREB2 sử dụng tốt cho thí nghiệm M 500bp 480 bp Hình 3.10 Hình điện di sản phẩm colony- PCR từ khuẩn lạc mang plasmid pBI121/GmDREB2 tái tổ hợp; Giếng 1-3: dòng khuẩn lạc mang plasmid pBI121/GmDREB2 tái tổ hợp; M: thang chuẩn kb Từ khuẩn lạc kiểm tra dương tính, chúng tơi tiến hành ni lỏng mơi trường có bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin 50 mg/l, khuẩn nuôi máy lắc 200 v/p nhiệt độ 370C thời gian 16 Sau đó, chúng tơi tiến hành tách plasmid bảo quản - 200C để sử dụng biến nạp tiếp vào A tumefaciens làm công cụ chuyển gen 3.3 KẾT QUẢ TẠO DÒNG VI KHUẨN A tumefaciens MANG CẤU TRÚC GEN GmDREB2 Sau thiết kế thành công plasmid pBI121/GmDREB2 tiến hành biến nạp vào A tumefaciens phương pháp xung điện Đây phương pháp biến nạp cho hiệu cao, với thời gian thí nghiệm ngắn Sản phẩm q trình biến nạp ni phục hồi LB lỏng cấy trải môi trường LB đặc có chứa 50 mg/l kanamycin 50 mg/l rifamycin, 280C thời gian 48 42 Các dòng khuẩn lạc A tumefaciens tạo nhờ xung điện 2,5 kV chứa Ti-plasmid tái tổ hợp phát phương pháp chọn lọc môi trường chứa kháng sinh chọn lọc (kanamycin 50 mg/l 50 mg/l rifamycin) Chỉ có khuẩn lạc A tumefaciens biến nạp thành công plasmid pBI121/GmDREB2 sống mơi trường chọn lọc Để tìm A Tumefacien mang gen quan tâm, tiến hành kiểm tra phản ứng colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu Chọn ngẫu nhiên dòng khuẩn lạc A tumefaciens mọc đĩa thạch để tiến hành phản ứng colony-PCR Phản ứng thực với nhiệt độ gắn mồi 570C, lặp lại 30 chu kỳ Sản phẩm phản ứng điện di kiểm tra gel agarose 0,8%, kết thể (Hình 3.11) Kết điện di cho thấy dòng khuẩn lạc kiểm tra lên băng có kích thước khoảng 480 bp Với kết PCR đạt tỷ lệ 100%, khẳng định biến nạp thành công vector pBI121/GmDREB2 vào vi khuẩn A tumefaciens Các chủng vi khuẩn 1, 2, 3, 4, phục vụ cho việc chuyển gen vào thực vật M 500bp 480 bp Hình 3.11 Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR từ vi khuẩn A tumefaciens mang plasmid pBI121/GmDREB2; Giếng 1-5: dòng vi khuẩn mang plasmid pBI121/GmDREB2; M: thang chuẩn kb 43 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 1.1 Đã nhân bản, tách dịng thành cơng xác định trình tự gen GmDREB2 từ mRNA giống đậu tương chịu hạn DT2008 Gen GmDREB2 có kích thước 480 bp, mã hố 159 amino acid 1.2 Phát triển thành cơng vector chuyển gen mang cấu trúc pBI121/GmDREB2 1.3 Đã biến nạp thành công vector chuyển gen mang cấu trúc pBI121/GmDREB2 vào chủng vi khuẩn A tumefaciens tạo vi khuẩn tái tổ hợp phục vụ lây nhiễm để tạo chuyển gen Đề nghị Tiếp tục nghiên cứu chuyển cấu trúc pBI121/GmDREB2 vào thuốc đậu tương phương pháp lây nhiễm Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp để tạo chuyển gen Phân tích, đánh giá khả chịu hạn dòng chuyển gen 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng, Giáo trình cao học Nơng nghiệp, NXB Nơng nghiệp Hà Nội Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi lúa, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội Ngô Thế Dân (1999), Cây đậu tương, NXB Nơng Nghiệp Trịnh Đình Đạt (2006), Công nghệ sinh học tập – Công nghệ di truyền, NXB Giáo dục Trần Văn Điền (2007), Giáo trình đậu tương, NXB Nơng Nghiệp Hà Nội Nguyễn Thị Thuý Hường (2011), Phân lập, tạo đột biến điểm gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn thử nghiệm chuyển vào đậu tương Việt Nam, Luận án tiến sỹ Di truyền học, Đại học Thái Nguyên Trần Thị Phương Liên (1999), Nghiên cứu đặc tính hóa sinh sinh học phân tử số giống đậu tương có khả chịu nóng, chịu hạn Việt Nam, Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học Hà Nội Trần Thị Phương Liên (2010), Protein tính chống chịu thực vật, NXB Khoa học Tự nhiên Công nghệ Trần Đình Long (2000), Cây đậu tương, NXB Nơng Nghiệp 10 Nguyễn Hoàng Lộc, Lê Việt Dũng, Trần Quốc Dung (2007), Công nghệ DNA tái tổ hợp, NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh 45 11 Chu Hoàng Mậu (2005), Cơ sở phương pháp sinh học phân tử, NXB Đại học Sư phạm 12 Chu Hoàng Mậu (2008), Phương pháp phân tích di truyền đại chọn giống trồng, NXB Đại học Thái Nguyên 13 Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Thúy Hường, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hồng Hà (2011), Gen đặc tính chịu hạn đậu tương, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội 14 Chu Hồng Mậu, Nơng Thị Man, Lê Trần Bình (2001), Đánh giá số tính trạng kinh tế quan trọng khả chịu hạn dòng đậu tương (Glycine max (L.) Merril) đột biến, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, 1(13), Đại học Thái Nguyên, 16-21 15 Nguyễn Thị Tâm (2004), Nghiên cứu khả chịu nóng chọn dịng chịu nóng lúa công nghệ tế bào thực vật, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ sinh học Hà Nội 16 Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh (2005), Công nghệ sinh học nông nghiệp, NXB Đại học Sư phạm 17 Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2008), Nghiên cứu tính đa dạng di truyền phân lập số gen liên quan đến tính chịu hạn đậu xanh (Vigna radiate (L.) Wilczeck), Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ sinh học Hà Nội 18 Phạm Văn Thiều (2008), Cây đậu Tương - Kỹ thuật trồng chế biến sản phẩm, NXB Nông nghiệp Tài liệu tiếng Anh 19 Ahn J.H., Choi Y., Kim S.G., Kwon Y.M., Choi Y.D., Lee J.S (1998), Expression of a Soybean Hydroxyproline-Rich Glycoprotein Gene Is Correlated with Maturation of Root, Plant Physiol, pp 671 – 679 46 20 Cortés AJ, This D, Chavarro C, Madriñán S, Blair MW (2012), Nucleotide e diversity patterns at the drought-related DREB2 encoding genes in wild and cultivated common bean (Phaseolus vulgaris L.), Theor Appl Genet, 125(5):1069-85 21 Chen F., Chen S.Y and Liu Q (2002), Isolation of a rice cDNA encoding a DREB-like protein induced by stresses, NCBI, GenBank, Accession AY064403 22 Chen J, Xia X, Yin W (2009), Expression profiling and functional characterization of a DREB2-type gene from Populus euphratica, College of Forestry, Beijing Forestry University, No 35, Qinghua East Road, Beijing 100083, China 23 Chen M., Wang Q.Y., Xu Z.S., Li L.C., Ye X.G., Xia L.Q, Ma Y.Z (2007), GmDREB2, a soybean DRE – binding transcription factor, conferred droungt anh high – salt tolerance in transgenic plants, Biochem Biophys Res Commun, 353(2), pp 299 – 305 24 Chen Y., Chen P and de los Reyes B.G (2004), Analysis of the expression of DREB1 gene orthologs in cultivated and wild species of soybean, NCBI, Gen Bank, Accession AY802779 25 Fujita Y., Fujita M., Satoh R., Maruyama K., Parvez M.M., Seki M., Hiratsu K., Ohme-Takagi M., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K (2005), AREB1 is a transcription activator of novel ABRE-dependent ABA signaling that enhances drought stress tolerance in Arabidopsis, Plant Cel, 17(12), pp.3470-88 26 Hiroaki Fujii and Jian-Kang Zhu (2009), An auto phosphorylation site of the protein kinase SOS2 is important for salt telerance in Arabidopsis, Molecular Plant, doi: 10.1093/mp/ssn087 47 27 Huang B., Jin L and Liu J (2007), Molecular cloning and functional characterization of a DREB1/CBF-like gene (GhDREB1L) from cotton, Sci China, C, Life Sci 50 (1), 7-14 28 Kobayashi F, Ishibashi M, Takumi S (2008), Transcriptional activation of Cor/Lea genes and increase in abiotic stress tolerance through expression of a wheat DREB2 homolog in transgenic tobacco, Laboratory of Plant Genetics, Graduate School of Agricultural Science, Kobe University, 1-1 Rokkodai-cho, Nada-ku, Kobe,657-8501, Japan 29 Li X.P., Tian A.G., Luo G.Z., Gong Z.Z., Zhang J.S., Chen S.Y (2005), Soybean DRE-binding transcription factors that are responsive to abiotic stresses, Theor Appl Genet, 110(8), pp.1355-62 30 Liu L, Zhu K, Yang Y, Wu J, Chen F, Yu D (2008), Molecular cloning, expression profiling and trans-activation property studies of a DREB2like gene from chrysanthemum (Dendranthema vestitum), National Center for Soybean Improvement, National Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural University, Nanjing, 210095, People’s Republic of China 31 Liu W and Feng F (2008), Nicotiana tabacum DREB4 mRNA, complete cds, College of Life Science, Henan Agricultural University, Wenhua Road, Zhengzhou, Henan 450002, P.R China 32 Lucas S., Hammon N., Glavina del Rio T., Detter J., Dalin E., Tice H., Pitluck S., Tuskan G., Chapman J., Putnam N.H (2009), Populus trichocarpa AP2/ERF domain-contanining transcription factor (DREB11), mRNA, US DOE Joint Genome Institute, 2800, Mitchell Drive B100, Walnut Creek, CA 94598-1698, USA 33 Nakashima K, Shinwari ZK, Skuma Y, Seki M, Miura S, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K (2000), Organization and expression of two 48 Arabidopsis DREB2 genes encoding DRE-binding proteins involved in dehydration and high-salinity-responsive gene expression, Biological Resources Division, Japan International Research Center for Agricultural Sciences, Tsukuba, Ibaraki 34 Nguyen H.T.T., Chu M.H., Le S.V., Nguyen C.H., Chu H.H (2009), Glycine max mRNA for hypothetical protein (P5CS gene), isolate Song Ma-Son La (SL5), Accession FM999729 35 Porcel R., Azcon R., Ruiz-Lozano J.M (2005), Evaluation of the role of genes encoding for deltal-pyrroline-5-carboxylate synthetase (P5CS) during drought stress in arbuscular mycorrhizal Qlycine max and Lactuca sativa plant, NCBI, Accession AJ715851 36 Umezawa T, Yoshida R, Maruyama K, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K and Thomashow MF (2004), SRK2C, a SNF1-Related protein kinase 2, improves drought tolerance by controlling stressresponsive gene expression in Arabidopsis thaliana, Proceeding of National Academy of Science, 101 (49): 17306-17311 37 Xiaoshuang Li, Daoyuan Zhang, Haiyan Li, Yucheng Wang, Yuanming Zhang and Andrew J Wood (2014), EsDREB2B, a novel truncated DREB2-type transcription factor in the desert legume Eremosparton songoricum, enhances tolerance to multiple abiotic stresses in yeast and transgenic tobacco, BMC Plant Biology, 1471-2229 38 www Vietrade.gov.vn ... tài: ? ?Thiết kế vector mang cấu trúc gen GmDREB2 nhằm phục vụ tạo đậu tương chuyển gen chịu hạn? ?? Mục tiêu nghiên cứu Tạo vector chuyển gen mang cấu trúc gen GmDREB2 phân lập từ đậu tương chịu hạn. .. THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HOÀNG THỊ THU HOÀN THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC GEN GmDREB2 NHẰM PHỤC VỤ TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG CHUYỂN GEN CHỊU HẠN Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02... (cDNA) gen GmDREB2 32 3.1.3 Kết đọc trình tự đoạn mã hố gen GmDREB2 .35 3.2 KẾT QUẢ THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC GmDREB2 38 3.2.1 Kết cắt plasmid pBT mang gen GmDREB2 XbaI SacI .38 3.2.2 Kết