Thiết kế vector mang cấu trúc rnai chứa đoạn gen mã hóa protein vỏ nhằm phục vụ chuyển gen kháng virus gây bệnh khảm lá ở cây đậu tương

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC  NGUYỄN THỊ MINH THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC RNAi CHỨA ĐOẠN GEN MÃ HÓA PROTEIN VỎ NHẰM PHỤC VỤ CHUYỂN GEN KHÁNG VIRUS GÂY BỆNH KHẢM LÁ Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu Thái Nguyên - 2013 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nội dung trình bày luận văn tơi tìm hiểu, nghiên cứu dƣới hƣớng dẫn GS.TS Chu Hoàng Mậu cộng tác, giúp đỡ cộng nhóm nghiên cứu Các số liệu kết trình bày luận án đƣợc đồng ý cán hƣớng dẫn nhóm nghiên cứu, tài liệu trích dẫn ghi rõ nguồn gốc Tác giả Nguyễn Thị Minh Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ii LỜI CẢM ƠN Trƣớc tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới GS.TS Chu Hồng Mậu tận tình hƣớng dẫn, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu để tơi hồn thành Bản luận văn thạc sĩ Cơng nghệ sinh học Tôi xin chân thành cảm ơn NCS Lò Thị Mai Thu, cảm ơn nghiên cứu viên Phạm Thanh Tùng tập thể cán Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học tạo điều kiện tận tình giúp đỡ tơi hồn thành thí nghiệm luận văn Tơi xin cảm ơn thầy cô Bộ môn Di truyền Sinh học đại, Khoa Sinh-KTNN, Trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học Thái Nguyên; Tôi xin cảm ơn PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh Thầy, Cô khoa Khoa học Sự sống, Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Ngun nhiệt tình giúp đỡ tơi q trình học tập nghiên cứu Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới tồn thể gia đình, cảm ơn bạn bè đồng nghiệp ln cổ vũ, động viên suốt thời gian qua Tác giả Nguyễn Thị Minh Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 BỆNH HẠI CÂY ĐẬU TƢƠNG 1.1.1 Cây đậu tƣơng, đặc điểm sinh học đậu tƣơng 1.1.2 Phân loại bệnh hại đậu tƣơng 1.1.3 Bệnh khảm virus SMV BYMV đậu tƣơng 11 1.2 HỆ GEN CỦA SMV VÀ BYMV 13 1.2.1 Đặc điểm hệ gen SMV BYMV 13 1.2.2 Gen CP SMV BYMV 15 1.3 KỸ THUẬT RNAi VÀ ỨNG DỤNG TẠO CÂY CHUYỂN GEN KHÁNG VIRUS 16 1.3.1 Các RNA ức chế nhỏ (siRNA miRNA) 17 1.3.2 Cơ chế can thiệp RNAi 21 1.3.3 Ứng dụng kỹ thuật RNAi nghiên cứu tạo chuyển gen kháng virus 23 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iv Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Vật liệu nghiên cứu 25 2.1.1 Vật liệu 25 2.1.2 Hoá chất 26 2.1.3 Máy móc, thiết bị 26 2.1.4 Địa điểm nghiên cứu 26 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 26 2.2.1 PCR khuếch đại vùng CPi (SMV, BYMV) 27 2.2.2 Phƣơng pháp tách dòng gen 28 2.2.3 Phản ứng lai ghép gen CPi với vector pENTRTM/D-TOPO® 33 2.2.4 Phƣơng pháp tạo vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi kỹ thuật Gateway 34 2.2.5 Tạo tế bào khả biến A tumefaciens mang vector chuyển gen 36 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 38 3.1 KẾT QUẢ KHUẾCH ĐẠI VÙNG GEN CPi CỦA SMV VÀ BYMV 38 3.2 KẾT QUẢ THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC RNAi CHỨA VÙNG GEN CPi CỦA SMV VÀ BYMV 39 3.2.1 Tạo vector tái tổ hợp pENTRTM/D-TOPO® 39 3.2.2 Tạo vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi [CPi(SMV-BYMV)] kỹ thuật Gateway 42 3.3 KẾT QUẢ TẠO VI KHUẨN A.TUMEFACIENS MANG VECTOR CẤU TRÚC RNAi CHỨA VÙNG GEN CPi [pGW –CPi(SMV-BYMV)] 45 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Bp Cặp base BYMV Bean yellow mosaic virus (Virus khảm vàng đậu tƣơng) CS Cộng CP Coat protein (protein vỏ) cDNA Complementary DNA DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate EDTA Ethylen Diamin Tetraacetic Acid E.coli Escherichia coli IPTG Isopropylthio-beta-D-galactoside IhpRNA Intron hairpin RNA (cấu trúc RNA kẹp tóc mang intron) Kb Kilo base kDa KiloDalton LB Luria Bertani miRNA Micro - RNA OD Optical density PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) RISC RNA – inducing silencing complex RNA Ribonucleic Acid RNAi RNA interference siRNA Short interfering RNA SMV Soybean mosaic virus (Virus khảm đậu tƣơng) TAE Tris acetat EDTA X-gal 5-brom- 4-chloro-3-indolyl-D-galactosidase WB Washing buffer (dung dịch rửa) Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR 28 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng ghép nối gen vào vector pBT 30 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng ghép nối gen vào vector 33 pENTRTM/D-TOPO® Bảng 2.4 Thành phần phản ứng LR Số hóa trung tâm học liệu 35 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Hình 1.1 Tên hình Trang Hình ảnh đậu tƣơng bị bệnh khảm đậu tƣơng 13 (Soybean mosaic virus-SMV) Hình 1.2 Sơ đồ gen hệ gen SMV 14 Hình 1.3 Sự tạo thành miRNA từ gen nhân tế bào 20 Hình 2.1 Sơ đồ cấu trúc vector sử dụng nghiên cứu 25 Hình 2.2 Sơ đồ mơ tả bƣớc thiết kế vector mang cấu trúc 27 RNAi kỹ thuật Gateway(Karimi et al., 2002) Hình 3.1 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR vùng CPi SMV 38 BYMV Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR kiểm tra dòng tế 39 bào E.coli mang vùng gen CPi với cặp mồi SMV-CPiF/BYMV-CPi-R Hình 3.3 Sơ đồ mơ tả phản ứng lai ghép đoạn gen CPi vào vector 41 pENTRTM/D-TOPO® tạo vector tái tổ hợp pEN-CPi (SMV-BYMV) Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR từ khuẩn lạc với 42 cặp mồi M13-F/M13-R Hình 3.5 Hình ảnh điện di sản phẩm tách plasmid pEN-CPi (SMV- 43 BYMV) Hình 3.6 Sơ đồ mô tả phản ứng LR tạo vector pGW –CPi(SMV- 45 BYMV Hình 3.7 Sơ đồ cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium 47 tumefaciens Hình 3.8 Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR trực tiếp từ 50 khuẩn lạc A tumefaciens Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Đậu tƣơng (Glycine max (L.) Merrill) cơng nghiệp ngắn ngày, có giá trị kinh tế hàm lƣợng dinh dƣỡng cao Cây đậu tƣơng có nốt sần rễ có khả cố định nitơ khơng khí, trồng đậu tƣơng khơng mang lại hiệu kinh tế mà cịn góp phần cải tạo đất trồng trọt Hiện nay, suất sản lƣợng đậu tƣơng mức thấp nhiều nguyên nhân, có bệnh trùng, vi khuẩn virus gây Hiện ngƣời ta xác định đƣợc khoảng 20 loài bệnh hại đậu tƣơng, có bệnh nhiễm virus gây tổn thất lớn cho ngành sản xuất đậu tƣơng Virus gây bệnh bệnh khảm Soybean mosaic virus (SMV) bệnh khảm vàng Bean yellow mosaic virus (BYMV) đƣợc lan truyền từ bệnh sang khoẻ rệp muội đồng chủ yếu Khi bị bệnh đậu tƣơng có phần xanh nhạt, đậm biến vàng xen kẽ, non khảm mạnh biến dạng, đọt non xoăn lại, đốt thân co ngắn, chùn lại, phát triển chậm, biến dạng, thƣờng lép Hiện dừng biện pháp phịng mà chƣa có thuốc trị hai loại virus SMV BYMV Các biện pháp phòng bệnh theo truyền thống thƣờng phức tạp, tốn thời gian, hiệu không cao bền vững Phƣơng pháp công nghệ sinh học đại tạo chuyển gen kháng virus tỏ có hiệu cho lồi thực vật mà tự nhiên khơng có nguồn kháng bệnh có sẵn Ứng dụng kỹ thuật RNAi tạo chuyển gen kháng lại bệnh virus gây thực vật cách chuyển gen có nguồn gốc từ virus gây bệnh dựa nguyên lý bất hoạt gen sau phiên mã - RNA interference (RNAi) Xuất phát từ lý xây dựng đề tài cho luận văn thạc sĩ là: “Thiết kế Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vector mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen mã hóa protein vỏ nhằm phục vụ chuyển gen kháng virus gây bệnh khảm đậu tương" Mục tiêu nghiên cứu - Tạo đƣợc vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa vùng gen CPi phục vụ chuyển gen kháng bệnh khảm virus SMV BYMV đậu tƣơng - Tạo đƣợc chủng A tumefaciens mang vector chuyển gen RNAi chứa vùng CPi (SMV+BYMV) Nội dung nghiên cứu 3.1 Thu thập thông tin gen CP hai loài virus SMV BYMV gây bệnh khảm đậu tƣơng; 3.2 Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa vùng gen CPi(SMV-BYMV) kỹ thuật Gateway 3.3 Biến nạp vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa vùng gen CPi(SMV-BYMV) vào vi khuẩn A tumefaciens Kiểm tra kết biến nạp colony-PCR Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 37 (2) Rửa cuvet cồn 1000 tráng lại nƣớc khử ion, thấm khô khử trùng tia UV.chuyển tất hỗn hợp vector tái tổ hợp tế bào khả biến A tumefaciens vào cuvet (3) Xung điện 2.5 kv, 25 μF điện trở 400 sau dặt vào đá, sau phút bổ sung ml YEB (hoặc LB lỏng) (4) Chuyển 300 μl vào đĩa chọn lọc chứa kháng sinh streptomycine 40 mg/l, spectinomycine 100 mg/l rifamycin 50 mg/l, ủ 280C từ 24 – 48 Tiến hành colony – PCR chọn lọc dòng khuẩn thu đƣợc Cuối điện di kiểm tra sản phẩm Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 38 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 KẾT QUẢ KHUẾCH ĐẠI VÙNG GEN CPi CỦA SMV VÀ BYMV Tiến hành khuếch đại vùng CPi SMV BYMV từ đoạn gen nhân tạo PCR với cặp mồi SMV-CPi-F/BYMV-CPi-R sản phẩm đƣợc điện di gel agarose 0,8%, kết thu đƣợc đoạn CPi có kích thƣớc nhƣ thiết kế 0,573kb (Hình 3.1) M CPi 1,0kb 0,5kb 0,573kb Hình 3.1: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR vùng CPi SMV BYMV (M: thang DNA 1kb; CPi: vùng bảo thủ CPi khuếch đại từ đoạn CP nhân tạo) Vùng CPi(SMV-BYMV) đƣợc thiết kế bao gồm trình tự thuộc vùng bảo thủ gen CP hai loài virus SMV BYMV Đoạn CPi nhận đƣợc từ phản ứng PCR đƣợc tinh nhằm loại bỏ thành phần tạp chất sản phẩm PCR nhƣ mồi, đệm, dNTPs…Bởi Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 39 muối có đệm PCR làm ảnh hƣởng đến nồng độ đệm thích hợp cho enzyme thực phản ứng lai ghép 3.2 KẾT QUẢ THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC RNAi CHỨA VÙNG GEN CPi CỦA SMV VÀ BYMV 3.2.1 Tạo vector tái tổ hợp pENTRTM/D-TOPO® Sản phẩm PCR CPi đƣợc làm Kit GeneJET PCR Purification hãng Thermo Scientific đƣợc gắn vào vector pENTR theo Kit pENTR™/D-TOPO® tạo plasmid tái tổ hợp có mang vùng CPi [(CPi (pENSMV-BYMV)] Dựa vào hình thành mối liên kết hydro nucleotide CACC đầu 5’của sản phẩm PCR, với nucleotide GTGG đầu 3’trên vector nhờ enzyme topoisomerase (TOPO) vector nối đầu sản phẩm PCR vào vector mà plasmid tái tổ hợp pENTR/D có gắn đoạn gen quan tâm đƣợc tạo thành (Thành phần phản ứng đƣợc trình bày Bảng 2.4) Vector pENTRTM/D-TOPO®là vector đầu vào cho phản ứng lai LR kỹ thuật Gateway có kích thƣớc 2850bp, vector có hai vị trí attL1 attL2, đoạn gen cần chuyển đƣợc gắn vào hai vị trí (Hình 3.3) Sản phẩm gắn pENTR/D đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli One Shop® Top 10 phƣơng pháp sốc nhiệt để dịng hóa nhân nhanh plasmid với số lƣợng lớn Kết thể sản phẩm biến nạp thành cơng plasmid tái tổ hợp có mang vùng gen CPi [pENCPi (SMVBYMV)] vào vi khuẩn E coli One Shop® Top 10 thu đƣợc lƣợng lớn khuẩn lạc trắng Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 40 CPi (SMV - BYMV) Hình 3.3 Sơ đồ mơ tả phản ứng lai ghép đoạn gen CPi với vector pENTRTM/D-TOPO® tạo vector tái tổ hợp pEN-CPi (SMV-BYMV) Để kiểm tra có mặt đoạn gen dịng khuẩn lạc tiến hành kiểm tra phản ứng colony – PCR với cặp mồi M13-F/M13-R bổ sung với trình tự nằm vector, cặp mồi M13 có trình tự nhƣ sau: M13-F: 5´-GTAAAACGACGGCCAG- 3´ M13-R 5´-CAGGAAACAGCTATGAC-3´ Kết điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR đƣợc trình bày Hình 3.4 Trên vector pENTRTM/D-TOPO® vị trí gắn cặp mồi M13-F M13-R nằm hai đầu vị trí mà đoạn gen đƣợc chèn vào vector khoảng Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 41 cách hai mồi chƣa có đoạn CPi chèn vào vector 324 bp Kích thƣớc đoạn CPi 573 bp, đó, vector pENTRTM/D-TOPO® có đoạn CPi chèn vào kích thƣớc phân đoạn DNA thu đƣợc colony – PCR với cặp mồi M13 897bp (573 +324) Kết điện di cho thấy dòng khuẩn lạc (làn chạy số Hình 3.4) đƣợc chọn xuất băng DNA có kích thƣớc khoảng 0,9kb nhƣ tính tốn lý thuyết (Hình 3.4) M 0,9kb 0,5kb Hình 3.4: Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR từ khuẩn lạc với cặp mồi M13-F/M13-R (M: thang DNA 1kb; 1, 2, 3: sản phẩm colony-PCR từ ba dòng khuẩn lạc với cặp mồi SMV-CPi-F/BYMV-CPi-R; 4: sản phẩm colony-PCR từ dòng khuẩn lạc với cặp mồi M13-F/M13-R) Để kiểm tra đoạn gen mong muốn đƣợc chuyển vào vector nhân dịng pENTRTM/D-TOPO®, tiến hành lựa chọn dịng khuẩn lạc dƣơng tính với phản ứng colony-PCR nuôi để cất giữ tủ lạnh - 840C tách chiết plasmid Sản phẩm tách plasmid có nồng độ xấp xỉ 200 – 300 ng/ μl Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 42 kết điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết plasmid cho thấy thu đƣợc plasmid đảm bảo chất lƣợng số lƣợng cần thiết Kết xác định trình tự chứng tỏ đoạn gen CPi đƣợc nhân dịng, ghép nối thành cơng tạo vector tái tổ hợp pEN-CPi(SMV-BYMV) (Hình 3.5) M 2 M 3kb 2kb Hình 3.5: Hình ảnh điện di sản phẩm tách plasmid pEN-CPi (SMVBYMV) (M: thang DNA 1kb; 1-2: plasmid tách từ hai dòng khuẩn lạc) 3.2.2 Tạo vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi [CPi(SMV-BYMV)] kỹ thuật Gateway Plasmid pEN-CPi(SMV-BYMV) tiếp tục tham gia phản ứng LR với pK7GWIWG2(II) để tạo vector chuyển gen nhị thể mang vùng gen CPi (pGW-CPi(SMV-BYMV) dịng hóa vào tế bào khả biến E coli DH5α Để chọn đƣợc dòng khuẩn lạc mong muốn, phản ứng colony-PCR đƣợc thực kiểm tra có mặt vùng gen CPi tế bào E.coli Vector nhị thể vector có hai vector (plasmid) có mặt hoạt động Agrobacterium Một plasmid tách dịng từ E.coli có thiết Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 43 kế vùng bờ trái bờ phải, nằm chúng gen thị vùng gắn gen cần chuyển Plasmid thứ hai Ti-plasmid cải tiến: toàn vùng T-DNA vùng bờ trái bờ phải bị cắt bỏ giữ lại vùng vir, plasmid đƣợc gọi plasmid hỗ trợ Hệ thống vector hoạt động theo chế chuyển gen vi khuẩn đất Agrobacterium cách hữu hiệu Phản ứng LR phản ứng xảy tái tổ hợp vị trí attL attR đƣợc xúc tác enzyme LR ClonaseTMII đƣợc thực vector pEN-CPi với vector nhận destination pK7GWIWG2(II) Kết tạo đƣợc vector biểu thực vật mang cấu trúc RNAi với hai vị trí chèn đoạn gen đƣa vào theo chiều sene antiense đƣợc ngăn cách đoạn intron dƣới điều khiển promoter CaMV35S (kí hiệu: pGW –CPi(SMV-BYMV) Vector pK7GWIWG2(II) vector chuyển gen có cấu trúc đặc biệt, có hai vùng chứa cấu trúc attR1- ccdB- attR2 ngƣợc chiều đƣợc nối với đoạn intron Vì vậy, sản phẩm phản ứng LR plasmid pGW-CPi(SMV-BYMV) với hai vị trí tái tổ hợp mang đoạn gen có chiều sense – intron - antisense (hay gene – intron - antigene) Quá trình thực phản ứng LR để trao đổi đoạn gen quan tâm với đoạn ccdB đƣợc tiến hành với bƣớc trình bày mục (2.2.4) Cấu trúc pGWSMV-BYMV-CPi đƣợc dịng hóa tế bào E coli One Shop®Top 10 phƣơng pháp sốc nhiệt Các bƣớc đƣợc trình bày mục (2.2.4) để kiểm tra phản ứng LR có thành cơng khơng Kết thu đƣợc lƣợng lớn khuẩn lạc trắng mơi trƣờng chọn lọc Do vector pK7GWIWG2(II) có mang gen kháng kháng sinh chọn lọc (streptomycin, spectinomycin, chloramphenicol) gen ccdB – gen mã hóa plasmid F gây chết tế bào E.coli vector cấu trúc RNAi pGWCPi(SMV-BYMV) thu đƣợc sau phản ứng lai LR khơng có gen ccdB Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 44 Hình 3.6: Sơ đồ mơ tả phản ứng LB tạo vector pK7GW –CPi(SMVBYMV) Mặt khác, chủng E coli Top 10 khơng kháng kháng sinh nào, khuẩn lạc mọc đĩa thạch khuẩn lạc dƣơng tính có mang plasmid pK7GWIWG2(II) mà vị trí chứa đoạn gen ccdB bị đột biến mang pGW-CPi(SMV-BYMV) Vì vậy, để chọn đƣợc dịng khuẩn lạc mong muốn, tiến hành phản ứng colony - PCR Chọn lọc khuẩn lạc dƣơng tính mơi trƣờng LB bổ sung kháng sinh streptomycin 40 mg/l, Spectinomycin 100 mg/l Chloramphenicol 50 mg/l Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 45 3.3 KẾT QUẢ TẠO VI KHUẨN A.TUMEFACIENS MANG VECTOR CẤU TRÚC RNAi CHỨA VÙNG GEN CPi [pK7GW –CPi(SMVBYMV)] Agrobacterium tumefaciens loài vi khuẩn sống đất gây bệnh khối u hình chóp vị trí tổn thƣơng thực vật hai mầm Ti-plasmid Agrobacterium tumefaciens đƣợc tìm thấy tất dịng A.tumefaciens gây độc, có kích thƣớc khoảng 200-250kb Tạo A tumefaciens tái tổ hợp mang cấu trúc pK7GW-CPi(SMV-BYMV) phục vụ lây nhiễm vào mô tổn thƣơng để chuyển đoạn gen CPi mục tiêu thí nghiệm Plasmid pK7GW-CPi(SMV-BYMV) đƣợc biến nạp vào A tumefaciens chủng CV58C1 pGV2260 phƣơng pháp xung điện Đây phƣơng pháp biến nạp có hiệu thời gian thí nghiệm ngắn Sản phẩm trình biến nạp đƣợc ni chọn lọc mơi trƣờng LB đặc có chứa kháng sinh, ủ đĩa petri 280C 48 Do chủng vi khuẩn A tumefaciens CV58C1 pGV2260 mang gen mã hóa cho enzyme kháng kháng sinh rifamycin 50 mg/l, vector pK7GWCPi(SMV-BYMV) mang hai gen kháng kháng sinh streptomycine spectomycine nên sản phẩm sau biến nạp đƣợc nuôi đĩa chọn lọc chứa đồng thời kháng sinh chọn lọc Vì vậy, có khuẩn lạc A tumefaciens đƣợc biến nạp thành công plasmid pK7GW-CPi(SMVBYMV) sống đƣợc môi trƣờng chọn lọc Để chắn, tiến hành lấy khuẩn lạc mang cấu trúc pK7GW-CPi(SMV-BYMV) sau biến nạp vào A tumefaciens đƣợc chọn ngẫu nhiên nuôi kiểm tra phản ứng colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu SMV-CPi-F/BYMV-CPi-R đƣợc thực với nhiệt độ gắn mồi Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 46 560C, lặp lại 30 chu kỳ Sản phẩm colony-PCR đƣợc kiểm tra điện di gel agarose 0.8%, kết đƣợc trình bày Hình 3.8 1 2 4 M M 10 10 2kb 0,5kb Hình 3.8: Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR trực tiếp từ khuẩn lạc A tumefaciens (M: Thang DNA chuẩn 1kb; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10: Sản phẩm PCR 10 dòng khuẩn lạc) Kết Hình 3.8 cho thấy băng DNA có kích thƣớc khoảng 0,5kb kích thƣớc đoạn SMV-BYMV-CPi Điều chứng tỏ hai vị trí tái tổ hợp vector mang đoạn gen chèn vào chiều Với kết colony-PCR đạt 100%, khẳng định tạo đƣợc chủng A tumefaciens CV58C1 pGV2260 mang vector chuyển gen nhị thể chứa cấu trúc RNAi pK7GWSMV-BYMV-CPi Những dòng A tumefaciens sau kiểm tra đƣợc lƣu giữ glycerol -84oC để phục vụ chuyển gen tạo đậu tƣơng kháng virus sau Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 47 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 1.1 Đã khuếch đại vùng gen CPi (trình tự bảo thủ gen CP SMV BYMV) có kích thƣớc 573bp 1.2 Thiết kế thành công vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa vùng gen CPi SMV BYMV [pGW-CPi(SMV-BYMV)] kỹ thuật Gateway 1.3 Tạo đƣợc dòng vi khuẩn A.tumefaciens mang cấu trúc pK7GWCPi(SMV-BYMV) Đề nghị Sử dụng vi khuẩn A.tumefaciens mang cấu trúc pK7GW-CPi(SMVBYMV) để lây nhiễm vào mô tổn thƣơng nhằm tạo thuốc đậu tƣơng chuyển gen kháng virus SMV BYMV Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Chu Hoàng Hà, Nguyễn Minh Hùng, Bùi Chi Lăng, Lê Trần Bình (2004), “Đánh giá tính đa dạng dịng virus gây bệnh đốm vịng đu đủ Việt Nam thơng qua tách dịng, xác định so sánh trình tự gen mã hố protein vỏ (CP)”, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 2(4):451-459 Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Thúy Hƣờng, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hoàng Hà (2011) Gen đặc tính chịu hạn đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội Đỗ Năng Vịnh (2007) “Công nghệ can thiệp RNAi (RNAi) gây bất hoạt gen tiềm ứng dụng to lớn” Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 5(3): 265-275 Ngô Thế Dân cộng (1999), Cây đậu tương, Nxb Nông Nghiệp Nguyễn Thị Hải Yến, Phạm Thị Vân, Chu Hồng Hà, Chu Hồng Mậu, Lê Trần Bình (2011) “Tạo dòng cà chua PT18 kháng bệnh xoăn vàng virus kỹ thuật RNAi” Tạp chí Cơng nghệ Sinh học (3): 333 – 340 Nguyễn Thị Hải Yến, Phạm Thị Vân, Chu Hoàng Hà, Chu Hồng Mậu, Lê Trần Bình (2011) “So sánh tính kháng bệnh xoăn vàng dòng cà chua chuyển gen mang cấu trúc RNAi đơn gen đồng thời hai gen Tomato yellow leaf curl Vietnam virus” Hội thảo quốc gia Bệnh hại thực vật Việt Nam 2011: 290 – 299 Nguyễn Thị Hải Yến, Phạm Thị Vân, Chu Hồng Hà, Chu Hồng Mậu, Lê Trần Bình (2009) “Thiết kế vector cấu trúc RNAi mang gen virus gây bệnh xoăn cà chua”, Hội nghị Công nghệ sinh học tồn quốc: 473-477 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 49 Nguyễn Thị Hải Yến, Phạm Thị Vân, Chu Hoàng Hà, Chu Hoàng Mậu, Lê Trần Bình, (2008), Phân lập gen mã hóa protein vỏ virus gây bệnh xoăn vàng cà chua thu thập cà chua dại tỉnh Thái Nguyên Tạp chí Cơng nghệ Sinh học (4): 467-474 Trần Văn Điển (2007), Giáo trình đậu tương, Nxb Nông Nghiệp Tiếng Anh 10 Amarzguioui M, Holen T, Babaie E, Prydz H (2003), “Tolerance for mutations and chemical modifications in a siRNA” Nucleic Acids Res 31:589–595 11 Ambros V, Bartel B, Bartel DP, Burge CB, Carrington JC, Chen X, Dreyfuss G, Eddy SR, Griffiths-Jones S, Marshall M, et al., (2003 a) “A uniform system for microRNA annotation” RNA 9: 277-279 12 Denli AM, Tops BBJ, Plasterk RHA, Ketting RF, Hannon GJ (2004) “Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex” Nature 432:231–235 13 Elbashir SM, Lendeckel W, Tuschl T (2001), “RNA interference is mediated by 21- and 22- nucleotide RNAs” Genes Dev 15:188–200 14 Gregory R, Chendrimada T, Shiekhattar R (2006) “MicroRNA biogenesis: isolation and characterization of the microprocessor complex” Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) 342: 33–47 15 Hamilton JH, Baulcombe DC (1999) A species of small antisense RNA in post-transcriptional gene silencing in plants Science 286: 950-952 16 Hammond SM, Bernstein E, Beach D, Hannon GJ (2000) “An RNAdirected nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells” Nature 404: 293-296 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 50 17 Hill, J 1999 Soybean mosaic Pp 70-71 In Hartman, G.L., Sinclair, J.B., and Rupe, J.C (eds.) Compendium of soybean diseases 4th edition APS Press St Paul, MN 18 Lau NC, Lim LP, Weinstein EG, Bartel DP (2001), "An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans" Science 294 (5543): 858–62 19 Lee Y, Kim M, Han J, Yeom KH, Lee S, Baek SH, Kim VN (October 2004), “MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II” EMBO J 23 (20): 4051–60 20 Lund E, Dahlberg J (2006), "Substrate selectivity of exportin and Dicer in the biogenesis of microRNAs" Cold Spring Harbor symposia on quantitative biology 71: 59–66 21 Rhoades MW, Reinhart BJ, Lim LP, Burge CB, Bartel B and Bartel DP (2002) “Prediction of Plant MicroRNA Targets” Cell 110: 513-520 22 Rivas FV, Tolia NH, Song JJ, Aragon JP, Liu J, Hannon GJ, Joshua-Tor L (2005), “Purified Argonaute2 and an siRNA form recombinant human RISC” Nat Struct Mol Biol 12:340–349 23 Schwarz D S, Hutvagner G, Haley B and Zamore PD (2002) “Evidenc that siRNAs funtion as guides, nt primers in the Drosophila and human RNAi pathways” Mol Cell 10: 537-548 24 Shukla, D.D., Ward, C.W., and Brunt, A.A 1994 The Potyviridae CAB International, University Press, Cambridge, UK 25 Smith NA, Singh SP, Wang MB, Stoutjesdijk PA, Green AG and Waterhouse PM (2000) “Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs” Nature 407: 319–320 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 51 26 Song JJ , Smith SK, Hannon GJ, and Joshua-Tor L (2004) “Crystal Structure of Argonaute and Its Implications for RISC Slicer Activity” Science 305: 1434-1437 27 Sunkar R and Zhu J-K (2004) “Novel and Stress-Regulated MicroRNAs and Other Small RNAs from Arabidopsis” Plant Cell 16: 2001-2019 28 Wang MB and Metzlaff M (2005) “RNA silencing and antiviral defense in plants” Curr Opin Plant Biol 8: 216-22 29 Wesley SV, Helliwell CA, Smith NA, Wang MB, Rouse DT, Lie Q, Gooding PS, Singh SP, Abbott D, Stoutjesdijk PA, Robinson SP, Gleave AP, Green AG and Waterhouse PM (2001) “Construct design for efficient, effective and high-throughput gene silencing in plants” Plant J 27: 581–590 30 Zamore P D, Tuschl T, Sharp P A and Bartel D P (2000) “RNAi: doublestranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals” Cell 101: 25–33 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ... phục vụ chuyển gen kháng virus gây bệnh khảm đậu tương" Mục tiêu nghiên cứu - Tạo đƣợc vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa vùng gen CPi phục vụ chuyển gen kháng bệnh khảm virus SMV BYMV đậu. .. tumefaciens mang vector chuyển gen RNAi chứa vùng CPi (SMV+BYMV) Nội dung nghiên cứu 3.1 Thu thập thông tin gen CP hai loài virus SMV BYMV gây bệnh khảm đậu tƣơng; 3.2 Thiết kế vector chuyển gen mang cấu. .. (RNAi) Xuất phát từ lý xây dựng đề tài cho luận văn thạc sĩ là: ? ?Thiết kế Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vector mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen mã hóa protein vỏ nhằm phục