LUẬN văn THẠC sĩ SINH học (FULL) nghiên cứu đặc điểm cấu trúc một số gen thuộc hệ miễn dịch tôm sú (PENAEUS MONODON)

i LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nông Văn Hải TS Phạm Anh Tuấn tận tình hướng dẫn, bảo hết lịng giúp đỡ để tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu Tơi xin cảm ơn cấp Lãnh đạo Đại học Thái Nguyên, Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên, Khoa Sinh - KTNN Khoa Sau đại học tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Lãnh đạo Viện Cơng nghệ Sinh học, Phịng trọng điểm Cơng nghệ gen, tập thể cán nghiên cứu Phòng ADN ứng dụng thuộc Viện Công nghệ sinh học - Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, đặc biệt TS Kim Thị Phương Oanh tạo điều kiện vật chất, phương tiện giúp đỡ tơi q trình nghiên cứu Tôi xin cảm ơn cấp Lãnh đạo Trường Đại học khoa học, Khoa Khoa học Sự sống, Phòng ĐT - KH QHQT tạo điều kiện giúp đỡ tơi mặt suốt q trình nghiên cứu thực đề tài luận án Tôi xin cảm ơn tập thể nghiên cứu thực đề tài cấp nhà nước: “Nghiên cứu giải trình tự phần gen xây dựng sở liệu genome tôm sú (P monodon)” thuộc Chương trình Cơng nghệ sinh học thủy sản 2008-2010, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thơn tạo điều kiện kinh phí để tơi thực luận án Tôi xin bày tỏ biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân, bạn đồng nghiệp, người ln động viên, khuyến khích giúp đỡ mặt để tơi hồn thành cơng việc nghiên cứu Thái Ngun, tháng năm Tác giả luận án ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan tấ t cả kết nghiên cứ u luận án trung thực chưa công bố công trình khác Nế u sai tơi xin chị u trá ch nhiệm hoàn toàn Thái Nguyên, tháng năm Tác giả luận án MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG viii DANH MỤC CÁC HÌNH ix MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề .1 Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tôm sú bệnh thường gặp tôm sú .3 1.1.1 Giới thiệu tôm sú 1.1.2 Tình hình ni và dị ch bệ nh tôm sú Việ t Nam 1.1.3 Các bệnh thường gặp tôm sú 1.1.4 Phương phá p phòng trị bệnh tôm sú 12 1.2 Hệ miễn dịch tôm sú 14 1.2.1 Đáp ứng miễn dịch tế bào 15 1.2.2 Đáp ứng miễn dịch dịch thể 21 1.3 Nghiên cứ u gen và tiề m ứ ng dụ ng phò ng trị bệ nh cho tơm s.u 23 1.3.1 Tình hình nghiên cứu genome tơm sú giới 23 1.3.2 Nghiên cứu gen liên quan đế n khả miễ n dị ch tôm sú .24 1.3.3 Tiề m ứng dụ ng củ a gen liên quan đế n miễ n dị ch phò ng trị bệnh tôm sú 28 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 32 2.1 Vật liệu 32 2.1.1 Thu thập mẫu 32 2.1.2 Hóa chất 32 2.1.3 Thiết bị 34 2.1.4 Các vi sinh vật sử dụng nghiên cứu .34 2.2 Phương pháp nghiên cứu 35 2.2.1 Tách chiết RNA tổng số 36 2.2.2 Tinh mRNA 37 2.2.3 Tổng hợp cDNA 38 2.2.4 Thiết kế mồi phân lập số gen (cDNA) lựa chọn 41 2.2.5 Khuếch đại gen phản ứng PCR 48 2.2.6 Tinh sản phẩm PCR 49 2.2.7 Tạo dòng phân tử sản phẩm PCR 49 2.2.8 Xác định trình tự gen (cDNA) 50 2.2.9 Biểu gen ALFPm3 50 2.2.10 Phân tích liệu trình tự xử lý số liệu 55 2.3 Địa điểm nghiên cứu hoàn thành luận án 55 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 56 3.1 Gen Rab7 - protein liên quan đế n chế xâm nhiễ m củ a virus 56 3.1.1 Tạo dịng gen Rab7 từ mẫu tơm sú Việt Nam 56 3.1.2 Xác định phân tích trình tự gen Rab7 58 3.2 Gen syntenin - protein liên quan đến đườ ng dẫ n truyề n tí n hiệ u .61 3.2.1 Phân lậ p đoạn 5‟-syntenin từ mẫu tôm sú Việt Nam 62 3.2.2 Tạo dịng gen syntenin hồn chỉnh từ mẫu tơm sú Việt Nam 64 3.2.3 Xác định phân tích trình tự gen syntenin 65 3.3 Gen hemocyanin - protein có hoạt tính phenoloxidase 68 3.3.1 Phân lập đoạn 5‟-hemocyanin từ mẫu tôm sú Việt Nam 69 3.3.2 Tạo dịng gen hemocyanin hồn chỉnh từ mẫu tơm sú Việt Nam 72 3.3.3 Phân tích trình tự gen hemoccyanin .74 3.4 Gen Ran - protein điề u khiể n thự c bà o .76 3.4.1 Tạo dòng phần đoạn gen Ran từ mẫu tôm sú Việt Nam 77 3.4.2 Phân lập đoạn gen 3‟ 5‟-Ran 78 3.4.3 Tạo dòng gen Ran hồn chỉnh từ mẫu tơm sú Việt Nam 82 3.4.4 Xác định phân tích trình tự gen Ran 83 3.5 Gen caspase - protein tham gia và o chế apoptosis 84 3.5.1 Tạo dòng gen caspase từ mẫu tôm sú Việt Nam 85 3.5.2 Xác định phân tích trình tự gen caspase 86 3.6 Hệ thống cácgen mã hóa protein khá ng khuẩ n, kháng nấm kháng virus 90 3.6.1 Gen mã hóa protein khá ng virus PmAV 90 3.6.2 Gen mã hóa peptide khá ng khuẩ n t ương tự crustin (crustin - like antimicrobial peptide) 94 3.6.3 Gen mã hóa yếu tố kháng khuẩn (ALF - antiliposaccharide factor) .99 3.7 Biể u hiệ n yế u tố khá ng khuẩ n tái t ổ hợp (rALFPm3) 105 3.7.1 Tạo cấu trúc vector biểu gen 105 3.7.2 Xác định cấu trúc gen ALFPm3 chuyển vào genome nấm men 108 3.7.3 Xác định đoạn peptide ALFPm3 biểu 109 3.7.4 Phân tích hoạt tính rALFPm3 111 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 113 Kết luận 113 Kiến nghị 114 CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .115 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa tiếng Việt Nghĩa tiếng Anh 5‟UTR 3‟UTR Vùng 5‟ không dịch mã Vùng 3‟ không dịch mã 5‟ Untranslated region 3‟ Untranslated region AAP Mồi neo Abridged anchor primer AFLP Đa hình chiều dài DNA Amplified khuếch đại polymorphism ALF Yếu tố kháng khuẩn Anti-lipopolisaccharide factor ALFPm ALF dạng tôm sú Anti-lipopolisaccharide factor Penaeus fragment length monodon isorform ALFPm3 ALF dạng tôm sú Anti-lipopolisaccharide factor Penaeus monodon isorform AMP Peptide kháng khuẩn Antimicrobial peptide apoptosis Tế bào chết theo chương trình Programmed cell death bp Cặp base Base pair B.megaterium Bacillus megaterium Bacillus megaterium cDNA DNA bổ sung Complement DNA DP Mồi suy diễn Degenerate primer DNA Axit deoxyribonucelic Deoxyribonucleic acid dNTPs Hỗn hợp nucleotide (dATP, Deoxyribonucleoside triphosphate dCTP, dGTP, dTTP) ddNTPs Hỗn hợp deoxynicleotide Dideoxyribonucleoside triphosphate (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) dsRNA RNA sợi kép Double stranded RNA DEPC Chất khử Rnase Diethyl pyrocarbonate E aerogenes Vi khuẩn Enterobacter aerogenes Enterobacter aerogenes E coli Vi khuẩn Escherichia coli Escherichia coli EDTA Axit ethylenediaminetetraacetic Ethylenediaminetetraacetic acid EST Đoạn trình tự gen biểu Expressed sequence tag GSP Mồi đặc hiệu gen Gene specific primer vii kb Kb Kilo base LB Môi trường LB Luria Bertani mtDNA DNA ty thể Mitochondrial DNA mRNA RNA thông tin Messenger RNA OD Mật độ quang Optical density ORF Khung đọc mở Open reading frame PCR Phản ứng chuỗi polymerase Polymerase chain reaction PmAV Gen khá ng virus ở tôm sú Penaeus monodon antivrus PmRab7 Rab7 tôm sú Penaeus monodon Rab7 P pastoris Nấm men Pichia pastoris Pichia pastoris 3‟RACE Khuếch đại nhanh đầu 3‟ cDNA Rapid amplification of cDNA 3' ends 5‟RACE Khuếch đại nhanh đầu 5‟ cDNA Rapid amplification of cDNA 5' ends rALFPm3 ALF tái tổ hợp tôm sú dạng từ Recombinant anti-lipopolisaccharide tôm sú factor Penaeus monodon RNA Axit ribonucleic Ribonucleic acid RNAi RNA can thiệp RNA interference RNase Enzyme phân hủy RNA Ribonuclease RT Enzyme phiên mã ngược Reverse transcriptase RT-PCR PCR enzyme phiên mã ngược Reverse transcriptase-PCR siRNA RNA can thiệp nhỏ Small interfering RNA SNP Đa hình nucleotide đơn Single-nucleotide polymorphism SSC Dung dị ch Natri citrate Solution sodium citrate TSV Virus gây hội chứng taura Taura syndrome virus UAP Mồi khuếch đại chung Universal amplication primer UPM Hỗn hợp mồi chung Universal primer mix v/p vòng/phút rotor/minute WSSV Virus gây bệnh đốm trắng White spot syndrome virus YHV Virus gây bệnh đầu vàng Yellow head virus YP Môi trường YP Yeast peptone YPD Môi trường YPD Yeast peptone dextrose viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Thố ng kê cá c gen liên quan đế n hệ miễ n dị ch tôm .26 Bảng 2.1 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 34 Bảng 2.2 Trình tự mồi sử dụng nghiên cứu 47 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh tơm sú .3 Hình 1.2 Tơm sú nhiễm WSSV .10 Hình 1.3 Tơm sú nhiễm YHV .12 Hình 1.4 Tế bà o má u tôm sú .17 Hình 1.5 Hệ thống hoạt hóa proPO tổng hợp melanin 19 Hình 1.6 Cơ chế đơng máu tôm 21 Hình 2.1 Sơ đồ phân lập gen 35 Hình 2.2 Sơ đồ thiết kế mồi từ gen biết trình tự .42 Hình 2.3 Sơ đồ thiết kế mồi từ gen biết phần trình tự đầu 3‟ (Invitrogen) 42 Hình 2.4 Sơ đồ thiết kế mồi từ gen biết phần trình tự đầu 3‟ (Clontech) 43 Hình 2.5 Sơ đồ thiết kế mồi biết phần trình tự đầu 5‟ gen 43 Hình 2.6 Sơ đồ thiết kế mồi phân lập gen syntenin .44 Hình 2.7 Sơ đồ thiết kế mồi phân lập gen hemocyanin 44 Hình 2.8 Sơ đồ thiết kế mồi phân lập gen Ran 45 Hình 2.9 Sơ đồ thiết kế mồi để phân lập gen hoàn tồn tơm sú 46 Hình 2.10 Sơ đồ thiết mồi khuếch đại đoạn gen mã hóa peptide ALFPm3 trưởng thành 46 Hình 2.11 Sơ đồ biểu ALFPm3 51 Hình 3.1 Kết điện di sản phẩm khuếch đại tách dòng gen Rab7 57 Hình 3.2 Trình tự gen amino acid suy diễn Rab7 .58 Hình 3.3 So sánh trình tự nucleotide gen Rab7 tơm sú Việt Nam với trình tự cơng bố 59 Hình 3.4 Mơ cấu trúc bậc hai phân tích motif chức protein Rab7 60 Hình 3.5 Kết điện di sản phẩm khuếch đại tách dòng đoạn 5‟-syntenin 62 Hình 3.6 Trình tự nucleotide amino acid suy diễn đoạn 5‟-syntenin 63 đại tách dịng gen syntenin 64 Hình 3.7 Kết điện di sản phẩm khuếch 129 130 Lu Y., Tapay L M., Loh P C., Brock J A., Gose R B (1995), "Distribution of yellow head virus in selected tissue and organs of penaeid shrimp Penaeus vannamei", Dis Aqua Org 23, pp 67-70 131 Luo T., Li F., Lei K., Xu X (2007), "Genomic organization, promoter characterization and expression profiles of an antiviral gene PmAV from the shrimp Penaeus monodon", Mol Immunol 44(7), pp 1516-1523 132 Luo T., Yang H., Li F., Zhang X., Xu X (2006), "Purification, characterization and cDNA cloning of a novel lipopolysaccharide-binding lectin from the shrimp Penaeus monodon", Dev Comp Immunol 30(7), pp 607-617 133 Luo T., Zhang X., Shao Z., Xu X (2003), "PmAV, a novel gene involved in virus resistance of shrimp Penaeus monodon", FEBS Lett 551(1-3), pp 53-57 134 Ma T H., Benzie J A., He J G., Chan S M (2008), "PmLT, a C-type lectin specific to hepatopancreas is involved in the innate defense of the shrimp Penaeus monodon", J Invertebr Pathol 99(3), pp 332-341 135 Makesh M., Koteeswaran A., Chandaran N D J., Manohar B M., Ramasamy V (2006), "Development of monoclonal antibodies against VP28 of WSSV and its application to detect WSSV using immunocomb", Aquaculture 261, pp 64-71 136 Mangum C P (1985), "Oxygen transport in invertebrates", Am J Physiol 248(5 Pt 2), pp 505-514 137 Markl J (1986), "Evolution and function of structurally diverse subunits in the respiratory protein hemocyanin from arthropods", Biol Bull 171: 90-115 138 Markl J., Decker H (1992), "Molecular structure of the arthropod hemocyanins", Adv Comp Environ Physiol 13, pp 325-376 139 Markl J., Stocker W., Runzler R., Precht E (1986), "Immunological correspondences between the hemocyanin subunits of 86 arthropods: evolution of a multigene protein family", In: Linzen B (ed) Invertebrate oxygen carriers Springer, Heidelberg, pp 281-292 140 Marks H (2005), "Genomics and transcriptomics of White spot syndrome virus", PhD thesis Wageningen University - with references - with summary in Dutch 141 Marshall S H., Arenas G (2003), "Antimicrobial peptides: A natural alternative to chemical antibiotics and a potential for applied biotechnology.", J Biotechnol 6, pp 271-284 130 142 Martin G G., Graves B (2005), "Fine structure and classification of shrimp haemocytes", J Morphol 185, pp 339-348 143 Mateljan G (2006), "The World's Healthiest Foods, Essential Guide for the Healthiest Way of Eating", Published World's Healthiest Foods, 880 pp 144 Meng-Yi C., Kuang-Yu H U B., Chih-Cheng H., Yen-Ling S (2005), "More than one type of transglutaminase in invertebrates? A second type of transglutaminase is involved in shrimp coagulation", Dev Comp Immunol 29, pp 1003-1016 145 Motoh H (1984), "Biology and ecology of Penaeus monodon Proceedings of the First International Conference on the Culture of Penaeid Prawns/Shrimp", SEAFDEC Aquaculture Department, Iloilo City, pp 27-36 146 Mylonakis E., Aballay A (2005), "Worms and flies as genetically tractable animal models to study host-pathogen interactions", Infect Immun 73(7), pp 38333841 147 Nadala E C., Tapay L M., Cao S., Loh P C (1997), "Detection of yellowhead virus and Chinese baculovirus in penaeid shrimp by the Western blot technique", J Virol Methods 69(1-2), pp 39-44 148 Nadala E C B J., Loh P C (2000), "Dot-blot nitrocellulose immunoassay for the detection of white spot virus and yellow head virus of penaeid shrimp", J Virol Methods 84, pp 175-179 149 Nagai T., Osaki T., Kawabata S (2001), "Functional conversion of hemocyanin to phenoloxidase by horseshoe crab antimicrobial peptides", J Biol Chem 276(29), pp 27166-27170 150 Nappi A J., Ottaviani E (2000), "Cytotoxicity and cytotoxic molecules in invertebrates", Bioessays 22(5), pp 469-480 151 Nathan C., Shiloh M U (2000), "Reactive oxygen and nitrogen intermediates in the relationship between mammalian hosts and microbial pathogens", Proc Natl Acad Sci U S A 97(16), pp 8841-8848 152 Nayak S., Singh S K., Ramaiah N., Sreepada R A (2010), "Identification of upregulated immune-related genes in Vibrio harveyi challenged Penaeus monodon postlarvae", Fish Shellfish Immunol 29(3), pp 544-549 153 Neves C A., Santos E A., Bainy A C (2000), "Reduced superoxide dismutase activity in Palaemonetes argentinus (Decapoda, Palemonidae) infected by Probopyrus ringueleti (Isopoda, Bopyridae)", Dis Aquat Organ 39(2), pp 155-158 131 154 Nevo R., Stroh C., Kienberger F., Kaftan D., Brumfeld V., Elbaum M., Reich Z., Hinterdorfer P (2003), "A molecular switch between alternative conformational states in the complex of Ran and importin beta1", Nat Struct Biol 10(7), pp 553-557 155 O'Brien V (1998), "Viruses and apoptosis", J Gen Virol 79(8), pp 1833-1845 156 Ongvarrasopone C., Chanasakulniyom M., Sritunyalucksana K., Panyim S (2008), "Suppression of PmRab7 by dsRNA inhibits WSSV or YHV infection in shrimp", Mar Biotechnol (NY) 10(4), pp 374-381 157 Pais R., Khushiramani R., Karunasagar I., Karunasagar I (2008), "Effect of immunostimulants on the haemolymph haemagglutinins of tiger shrimp Penaeus monodon", Aquac Res 39, pp 1339-1345 158 Peng S E., Lo C F., Lin S C., Chen L L., Chang Y S., Liu K F., Su M S., Ko G H (2001), "Performance of WSSV-infected and WSSV-negative Penaeus monodon postlarvae in culture ponds", Dis Aquat Org 46(3), pp 165-172 159 Perkel J M (2009), "Shrimp study exposes mechanisms of innate immunity", J Proteome Res 8(3), pp 1107 160 Phongdara A., Laoong-u-thai Y., Wanna W (2007), "Cloning of eIF5A from shrimp Penaeus monodon, a highly expressed protein involved in the survival of WSSV-infected shrimp", Aquaculture 265, pp 16-26 161 Pick C., Schneuer M., Burmester T (2009), "The occurrence of hemocyanin in Hexapoda", FEBS J 276(7), pp 1930-1941 162 Ponprateep S., Somboonwiwat K., Tassanakajon A (2009), "Recombinant anti-lipopolysaccharide factor isoform and the prevention of vibriosis in the black tiger shrimp, Penaeus monodon", Aquaculture 289, pp 219-224 163 Ramasamy P., Rajan P R., Jayakumar R., Rani S., Brenner G P (1996), "Lagenidium callinectes (Couch, 1942) infection and its control in cultured larval Indian tiger prawn, Penaeus monodon Fabricus", J Fish Dis 19, pp 75-82 164 Rameshthangam P., Ramasamy P (2007), "Antiviral activity of bis(2methylheptyl)phthalate isolated from Pongamia pinnata leaves against White Spot Syndrome Virus of Penaeus monodon Fabricius", Virus Res 126(1-2), pp 38-44 165 Ranganathan S., Simpson K J., Shaw D C., Nicholas K R (1999), "The whey acidic protein family: a new signature motif and three-dimensional structure by comparative modeling", J Mol Graph Model 17(2), pp 106-113 132 166 Rattanachai A., Hirono I., Ohira T., Takahashi Y., Aoki T (2004), "Molecular cloning and expression analysis of alpha 2-macroglobulin in the kuruma shrimp, Marsupenaeus japonicus", Fish Shellfish Immunol 16(5): 599-611 167 Reddy K V R., Yedery R D., Aranha C C (2004), "Antimicrobial peptide: Premises and promises", Int J Antimicrob Agents 24, pp 536-547 168 Reed L A., Siewickib T C., Shah J C (2004), "Pharmacokinetics of oxytetracycline in the white shrimp, Litopenaeus setiferus", Aquaculture 232, pp 11 -28 169 Relf J M., Chisholm J R., Kemp G D., Smith V J (1999), "Purification and characterization of a cysteine-rich 11.5-kDa antibacterial protein from the granular haemocytes of the shore crab, Carcinus maenas", Eur J Biochem 264(2), pp 350-357 170 Robalino J., Almeida J S., McKillen D., Colglazier J., Trent H F., Chen Y A., Peck M E., Browdy C L., Chapman R W., Warr G W., Gross P S (2007), "Insights into the immune transcriptome of the shrimp Litopenaeus vannamei: tissue-specific expression profiles and transcriptomic responses to immune challenge", Physiol Genomics 29(1) pp 44-56 171 Robalino J., Browdy C L., Prior S., Metz A., Parnell P., Gross P., Warr G (2004), "Induction of antiviral immunity by double-stranded RNA in a marine invertebrate", J Virol 78(19), pp 10442-10448 172 Roch P (1999), "Defense mechanisms and disease prevention in farmed marine invertebrates", Aquaculture 172, pp 125-145 173 Romanos M A., Scorer C A., Clare J J (1992), "Foreign Gene Expression in Yeast: A Review", Yeast 8, pp 423-488 174 Rosenberry B (2004), "World shrimp farming 2004 In Shrimp News International", San Diego, California, USA 175 Rost B., Yachdav G., Liu J (2007), "The PredictProtein Server", Nucleic Acids Research32 (Web Server issue, pp 321-326, Website: http://www.predictprotein.org/: 176 Roux M M., Pain A., Klimpel K R., Dhar A K (2002), "The lipopolysaccharide and beta-1,3-glucan binding protein gene is upregulated in white spot virus-infected shrimp (Penaeus stylirostris)", J Virol 76(14), pp 71407149 177 Salvesen G S., Dixit V M (1999), "Caspase activation: the induced-proximity model", Proc Natl Acad Sci U S A 96(20), pp 10964-10967 178 Sambrook J., Russell D.W (2001), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 133 179 Sangsuriya P., Rojtinnakorn J., Senapin S., Flegel T W (2007), "Characterization and tissue expression of apoptosis-related ALG-2 interacting protein Alix/AIP1 from the black tiger shrimp Penaeus monodon", Fish Shellfish Immunol 23(2), pp 485-492 180 Sarathi M., Simon M C., Ahmed V P., Kumar S R., Hameed A S (2008), "Silencing VP28 gene of white spot syndrome virus of shrimp by bacterially expressed dsRNA", Mar Biotechnol (NY) 10(2), pp 198-206 181 Seabra M C., Mules E H., Hume A N (2002), "Rab GTPases, intracellular traffic and disease", Trends Mol Med 8(1), pp 23-30 182 Shekhar M S., Azad I S., Ravichandran P (2006), "Comparison of dot blot and PCR diagnostic techniques for detection of white spot syndrome virus in different tissues of Penaeus monodon", Aquaculture 261, pp 1122-1127 183 Sithigorngul P., Chauychuwong P., Sithigorngul W., Longyant S., Chaivisuthangkura P., Menasveta P (2000), "Development of a monoclonal antibody specific to yellow head virus (YHV) from Penaeus monodon", Dis Aquat Org 42, pp 27-34 184 Sithigorngul P., Rukpratanporn S., Chauychuwong P., Sithigorngul W., Longyant S., Chaivisuthangkura P., Menasveta P (2002), "Monoclonal antibodies specific to yellow head virus (YHV) from Penaeus monodon", Dis Aquat Org 49, pp 71-76 185 Smith V J., Fernandes J M., Kemp G D., Hauton C (2008), "Crustins: enigmatic WAP domain-containing antibacterial proteins from crustaceans", Dev Comp Immunol 32(7), pp 758-772 186 Smith V J., Fernandes J M., Kemp G D., Hauton C (2008), "Crustins: Enigmatic WAP domain-containing antibacterial proteins from crustaceans", Dev Comp Immunol 32, pp 758-772 187 Soderhall I., Bangyeekhun E., Mayo S., Soderhall K (2003), "Hemocyte production and maturation in an invertebrate animal; proliferation and gene expression in hematopoietic stem cells of Pacifastacus leniusculus", Dev Comp Immunol 27(8), pp 661-672 188 Soderhall K., Cerenius L (1998), "Role of the prophenoloxidase-activating system in invertebrate immunity", Curr Opin Immunol 10(1), pp 23-28 134 189 Somboonwiwat K., Chaikeeratisak V., Wang H C., Fang Lo C., Tassanakajon A (2010), "Proteomic analysis of differentially expressed proteins in Penaeus monodon hemocytes after Vibrio harveyi infection", Proteome Sci 8, pp 39 190 Somboonwiwat K., Marcos M., Tassanakajon A., Klinbunga S., Aumelas A., Romestand B., Gueguen Y., Boze H., Moulin G., Bachere E (2005), "Recombinant expression and anti-microbial activity of anti-lipopolysaccharide factor (ALF) from the black tiger shrimp Penaeus monodon", Dev Comp Immunol 29(10), pp 841-851 191 Sritunyalucksana K., Cerenius L., Soderhall K (1999), "Molecular cloning and characterization of prophenoloxidase in the black tiger shrimp, Penaeus monodon", Dev Comp Immunol 23(3), pp 179-186 192 Sritunyalucksana K., Wannapapho W., Lo C F., Flegel T W (2006), "PmRab7 is a VP28-binding protein involved in white spot syndrome virus infection in shrimp", J Virol 80(21), pp 10734-10742 193 Sritunyalucksana K., Wongsuebsantati K., Johansson M W., Soderhall K (2001), "Peroxinectin, a cell adhesive protein associated with the proPO system from the black tiger shrimp, Penaeus monodon", Dev Comp Immunol 25(5-6), pp 353-363 194 Supamattaya K., Chittiwan V., Boonyaratpalin M (2006), "Immunological factors in Black Tiger shrimp, Penaeus monodon, Fabricius", www.en.engormix.com: 195 Supungul P., Klinbunga S., Pichyangkura R., Hirono I., Aoki T., Tassanakajon A (2004), "Antimicrobial peptides discovered in the black tiger shrimp Penaeus monodon using the EST approach", Dis Aquat Organ 61(1-2), pp 123-135 196 Supungul P., Klinbunga S., Pichyangkura R., Jitrapakdee S., Hirono I., Aoki T., Tassanakajon A (2002), "Identification of immune-related genes in hemocytes of black tiger shrimp (Penaeus monodon)", Mar Biotechnol (NY) 4(5), pp 487-494 197 Supungul P., Tang S., Maneeruttanarungroj C., Rimphanitchayakit V., Hirono I., Aoki T., Tassanakajon A (2008), "Cloning, expression and antimicrobial activity of crustinPm1, a major isoform of crustin, from the black tiger shrimp Penaeus monodon", Dev Comp Immunol 32(1), pp 61-70 198 Susan L G., Saban T., Peter J H (2008), "Extraction and purification of total RNA using TRIzol or trireagent", Dept of Animal Sciences, University of Florida (SLG is currently at Purdue Pharma Inc.) www.animal.ufl.edu/hansen/protocols/RNA_extraction.htm 135 199 Takahashi Y., Kondo M., Itami T., Honda T., Inagawa H., Nishizawa T., Soma G I., Yokomizo Y (2000), "Enhancement of disease resistance against penaeid acute viraemia and induction of virus-inactivating activity in haemolymph of kuruma shrimp, Penaeus japonicus, by oral administration of Pantoea agglomerans lipopolysaccharide (LPS)", Fish Shellfish Immunol 10(6), pp 555-558 200 Tang K F J., Lightner D V (1999), "A yellowhead virus gene probe: nucleotide sequence and application for in situ hybridization", Dis Aquat Org 35, pp 165-173 201 Tanticharoen M., Flegel T W., Meerod W., Grudloyma U., Pisamai N (2008), "Aquacultural biotechnology in Thailand: the case of the shrimp industry", J Biotechnol, 10 (6), pp 588-603 202 Tassanakajon A., Amparyup P., Somboonwiwat K., Supungul P (2010), "Cationic antimicrobial peptides in penaeid shrimp", Mar Biotechnol (NY) 12(5), pp 487-505 203 Tassanakajon A., Klinbunga S., Paunglarp N., Rimphanitchayakit V., Udomkit A., Jitrapakdee S., Sritunyalucksana K., Phongdara A., Pongsomboon S., Supungul P., Tang S., Kuphanumart K., Pichyangkura R., Lursinsap C (2006), "Penaeus monodon gene discovery project: the generation of an EST collection and establishment of a database", Gene 384, pp 104-112 204 Tharntada S., Ponprateep S., Somboonwiwat K., Liu H., Soderhall I., Soderhall K., Tassanakajon A (2009), "Role of anti-lipopolysaccharide factor from the black tiger shrimp, Penaeus monodon, in protection from white spot syndrome virus infection", J Gen Virol 90(Pt 6), pp 1491-1498 205 Tharntada S., Somboonwiwat K., Rimphanitchayakit V., Tassanakajon A (2008), "Anti-lipopolysaccharide factors from the black tiger shrimp, Penaeus monodon, are encoded by two genomic loci", Fish Shellfish Immunol 24(1), pp 4654 206 Tonganunt M., Nupan B., Saengsakda M., Suklour S., Wanna W., Senapin S., Chotigeat W., Phongdara A (2008), "The role of Pm-fortilin in protecting shrimp from white spot syndrome virus (WSSV) infection", Fish Shellfish Immunol 25(5), pp 633-637 207 Tonganunt M., Phongdara A., Chotigeat W., Fujise K (2005), "Identification and characterization of syntenin binding protein in the black tiger shrimp Penaeus monodon", J Biotechnol 120(2), pp 135-145 136 208 van de Braak C B., Botterblom M H., Taverne N., van Muiswinkel W B., Rombout J H., van der Knaap W P (2002), "The roles of haemocytes and the lymphoid organ in the clearance of injected Vibrio bacteria in Penaeus monodon shrimp", Fish Shellfish Immunol 13(4), pp 293-309 209 van de Braak C B T (2002), "Haemocytic defence in black tiger shrimp (Penaeus monodon)", Thesis, Wageningen University - with ref - with summary in Dutch 210 Vargas-Albores F., Yepiz-Plascencia G (1998.), "Shrimp immunity: A review", Trends Comp Biochem Physiol 5, pp 195-210 211 Vaseeharan B., Prem Anand T., Murugan T., Chen J C (2006), "Shrimp vaccination trials with the VP292 protein of white spot syndrome virus", Lett Appl Microbiol 43(2), pp 137-142 212 Venegas C A., Nonaka L., Mushiake K., Nishizawa T., Murog K (2000), "Quasi-immune response of Penaeus japonicus to penaeid rod-shaped DNA virus (PRDV)", Dis Aquat Organ 42(2), pp 83-89 213 Vlak J M., Bonami J R., Flegel T W., Kou G H., Lightner D V., Lo C F., Loh P C., Walker P J (2005), "Nimaviridae", In Virus Taxonomy - Eight Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses: 187-192 Edited by C M Fauquet, M A Mayo, J Maniloff, U Desselberger & L A Ball London: Elsevier Academic Press 214 Voit R., Feldmaier-Fuchs G (1990), "Arthropod hemocyanins Molecular cloning and sequencing of cDNAs encoding the tarantula hemocyanin subunits a and e", J Biol Chem 265(32), pp 19447-19452 215 Walker P J., Cowley J A., Spann K M., Hodgson Raj Hall M R., Withyachumnarnkul B (2001), "Yellow head complex viruses: transmission cycles and topographical distribution in the Asia- Pacific region", In: Browdy CL, Jory DE (eds) The new wave Proc Spec Session Sustainable Shrimp Culture, Aquaculture 2001 The World Aquaculture Society Baton Rouge LA, pp 227-237 216 Wang C S., Tang K J., Kuo G H., Chen S N (1996), "Yellowhead diseaselike virus infection in the kuruma shrimp Penaeus japonicus cultured in Taiwan", Fish Pathol 31, pp 177-182 137 217 Wang H., Ma J., Ruan L., Xu X (2009), "Cloning of a centaurin-alpha1 like gene MjCent involved in WSSV infection from shrimp Marsupeneaus japonicus", Fish Shellfish Immunol 26(2), pp 279-284 218 Wang L., Zhi B., Wu W., Zhang X (2008), "Requirement for shrimp caspase in apoptosis against virus infection", Dev Comp Immunol 32(6), pp 706-715 219 Wang R., Lee S Y., Cerenius L., Soderhall K (2001), "Properties of the prophenoloxidase activating enzyme of the freshwater crayfish, Pacifastacus leniusculus", Eur J Biochem 268(4), pp 895-902 220 Wang R., Liang Z., Hal M., Soderhall K (2001), "A transglutaminase involved in the coagulation system of the freshwater crayfish, Pacifastacus leniusculus Tissue localisation and cDNA cloning", Fish Shellfish Immunol 11(7): 623-637 221 Wang Y C., Lo C F., Chang P S., Kou G H (1998), "Experimental infection of White spot baculovirus in some cultured and wild decapods in Taiwan", Aquaculture 164, pp 221-231 222 Westenberg M., Heinhuis B., Zuidema D., Vlak J M (2005), "siRNA injection induces sequence-independent protection in Penaeus monodon against white spot syndrome virus", Virus Res 114(1-2), pp 133-139 223 Wilson K., Cahill V., Ballment E., Benzie J (2000), "The complete sequence of the mitochondrial genome of the crustacean Penaeus monodon: are malacostracan crustaceans more closely related to insects than to branchiopods?", Mol Biol Evol 17(6), pp 863-874 224 Wilson K., Li Y T., Whan V., Lehnert S A., Byrne K., Moore S S (2002), "Genetic mapping of the black tiger shrimp Penaeus monodon with amplified fragment length polymorphims", Aquaculture 204, pp 297-309 225 Witteveldt J., Cifuentes C C., Vlak J M., van Hulten M C (2004), "Protection of Penaeus monodon against white spot syndrome virus by oral vaccination", J Virol 78(4), pp 2057-2061 226 Witteveldt J., Vlak J M., van Hulten M C (2004), "Protection of Penaeus monodon against white spot syndrome virus using a WSSV subunit vaccine", Fish Shellfish Immunol 16(5), pp 571-579 227 Wongprasert K., Sangsuriya P., Phongdara A., Senapin S (2007), "Cloning and characterization of a caspase gene from black tiger shrimp (Penaeus monodon)-infected with white spot syndrome virus (WSSV)", J Biotechnol 131(1), pp 9-19 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 138 228 Wongteerasupaya C., Sriurairatana S., Vickers J E., Anutara A., Boonsaeng V., Panyim S (1995), "Yellowhead virus of Penaeus monodon is an RNA virus", Dis Aquat Org 22, pp 45-50 229 Wongteerasupaya C., Tongcheua W., Boonsaeng V., Panyim S., Tassanakajon A., Withyachumnarnkul B., Flegel T.W (1997), "Detection of yellowhead virus (YHV) of Penaeus monodon by RT-PCR amplification", Dis Aquat Org 31, pp 181186 230 Wongteerasupaya C., Wongwisansri S., Boonsaeng V., Panyim S., Pratanpipat P., Nash G L., Withyachumnarnkul B., Flegel T W (1996), "DNA fragment of Penaeus monodon baculovirus PmNOBII gives positive in situ hybridization with white-spot viral infections in six penaeid shrimp species", Aquaculture 143, pp 23-32 231 Wouters R., Lavens P., Nueto J., Sorgeloos P (2001), "Penaeid shrimp broodstock nutrition: an updated review on research and development", Aquaculture 202, pp 1-21 232 Wu J L., Muroga K (2004), "Apoptosis does not play an important role in the resistance of 'immune' Penaeus japonicus against white spot syndrome virus", J Fish Dis 27(1), pp 15-21 233 Wurzer W J., Planz O., Ehrhardt C., Giner M., Silberzahn T., Pleschka S., Ludwig S (2003), "Caspase activation is essential for efficient influenza virus propagation", J EMBO 22, pp 2717-2728 234 Wuthisuthimethavee S., Lumubol P., Toojinda T., Tragoonrung S., Vanavichit A (2005), "SSLP-based linkage map construction in black tiger shrimp (Penaeus monodon Fabricius)", ScienceAsia 31, pp 91-97 235 Xian J A., Wang A L., Ye C X., Chen X D., Wang W N (2010), "Phagocytic activity, respiratory burst, cytoplasmic free-Ca(2+) concentration and apoptotic cell ratio of haemocytes from the black tiger shrimp, Penaeus monodon under acute copper stress", Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol 152(2), pp 182-188 236 Xu Z R., Du H H., Xu Y X., Sun J Y., Shen J (2006), "Crayfish Procambarus clarkii protected against white spot syndrome virus by oral administration of viral proteins expressed in silkworms", Aquaculture 253, pp 179-183 237 Ye X., Gao F Y., Zheng Q M., Bai J J., Wang H., Lao H H., Jian Q (2009), "Cloning and characterization of the tiger shrimp lysozyme", Mol Biol Rep 36(6), pp 1239-1246 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 139 238 Yeaman M R., Yount N Y (2003), "Mechanisms of antimicrobial peptide action and resistance", Pharmacol Rev 55(1), pp 27-55 239 Yeh M S., Huang C J., Cheng J H., Tsai I H (2007), "Tissue-specific expression and regulation of the haemolymph clottable protein of tiger shrimp (Penaeus monodon)", Fish Shellfish Immunol 23(2), pp 272-279 240 Yeh M S., Kao L R., Huang C J., Tsai I H (2006), "Biochemical characterization and cloning of transglutaminases responsible for hemolymph clotting in Penaeus monodon and Marsupenaeus japonicus", Biochim Biophys Acta 1764(7), pp 1167-1178 241 Yi G., Wang Z., Qi Y., Yao L., Qian J., Hu L (2004), "Vp28 of shrimp white spot syndrome virus is involved in the attachment and penetration into shrimp cells", J Biochem Mol Biol 37(6), pp 726-734 242 Yoganandhan K., Syed Musthaq S., Narayanan R B., Sahul Hameed A S (2004), "Production of polyclonal antiserum against recombinant VP28 protein and its application for the detection of white spot syndrome virus in crustaceans", J Fish Dis 27(9), pp 517-522 243 You E M., Liu K F., Huang S W., Chen M., Groumellec M L., Fann S J., Yu H T (2010), "Construction of integrated genetic linkage maps of the tiger shrimp (Penaeus monodon) using microsatellite and AFLP markers", Anim Genet 41, pp 365-376 244 Zhang J., Li F., Wang Z., Zhang X., Zhou Q., Xiang J (2006), "Cloning, expression and identification of ferritin from Chinese shrimp, Fenneropenaeus chinensis", J Biotechnol 125(2), pp 173-184 245 Zhang X., Huang C., Qin Q (2004), "Antiviral properties of hemocyanin isolated from shrimp Penaeus monodon", Antiviral Res 61(2), pp 93-99 246 Zhang Y., Wang S., Xu A., Chen J., Lin B., Peng X (2006), "Affinity proteomic approach for identification of an IgA-like protein in Litopenaeus vannamei and study on its agglutination characterization", J Proteome Res 5(4), pp 815-821 247 Zhang Z F., Shao M., Ho Kang K (2006), "Classification of haematopoietic cells and haemocytes in Chinese prawn Fenneropenaeus chinensis", Fish Shellfish Immunol 21(2), pp 159-169 140 PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: Dụng cụ nghiền mẫu (Homogenizer) PHỤ LỤC 2: Vector pJET1.2 (Fermentas) 141 PHỤC LỤC 3: Vector pCR2.1 (Invitrogen) PHỤ LỤC 4: Vector pPICZA (Invitrogen) 142 PHỤ LỤC 5: Vị trí đa tách dòng pPICZA 143 PHỤC LỤC 6: Một phần trình tự nucleotide ALFPm3 dung hợp cấu trúc AOX1 vector biểu pPCICZA Ste 13 Kex2 Kex2 EcoRI EcoRI Trình tự đoạn gen ALFPm3 Trình tự đoạn gen ALFPm3 PHỤ LỤC 7: Một phần trình tự nucleotide ALFPm3 dung hợp cấu trúc AOX1 vector biểu pPCICZA XbaI rình Trìnhtự tựđoạn đoạngen gen ALFPm3 ALFPm3 c-myc c-mycepitope epitope Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Đuôi Đuôihistag histag http://www.lrc-tnu.edu.vn ... ứng miễn dịch tạo ngun liệu cho nghiên cứu phịng trị bệnh tơm sú, tiến hành thực đề tài: ? ?Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc số gen thuộc hệ miễn dịch tôm sú (Penaeus monodon)? ?? Mục tiêu nghiên cứu. .. pháp sinh học phân tử đại nhằm tập chung nghiên cứu gen chức Trong năm gần đây, nghiên cứu cDNA/EST genome tôm sú đạt số kết góp phần làm sáng tỏ số chế phân tử liên quan đến sinh trưởng, sức sinh. .. 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Để phân lập xác định trình tự số gen lựa chọn liên quan đến hệ miễn dịch tôm sú Đề tài thực theo sơ đồ nghiên cứu sau: Mẫu mô tôm sú Tách chiết RNA tổng số Tinh mRNA Tổng