Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc một số gen thuộc hệ miễn dịch tôm sú (Penaeus Monodon).

Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc một số gen thuộc hệ miễn dịch tôm sú (Penaeus Monodon).

B GIÁO DC VÀ ÀO TO IăHCăTHỄIăNGUYểN HOẨNGăTHăTHUăYN NGHIểNăCUăCăIMăCUăTRÚCă MTăSăGENăTHUCăHăMINăDCHăTỌMăSÚă (PENAEUS MONODON) LUNăỄNăTINăSăSINHăHC THÁI NGUYÊN - 2012 ii LIăCAMăOAN Tôi xin cam đoan tâ t ca các kt qu nghiên c u trong lun án là trung thc và cha tng đc công b trong bt k công trình nào khác. Nê u sai tôi xin chi u tra ch nhiê m hoa n toa n. 2 Tácăgiălun án HoƠngăThăThuăYn iii MCăLC LI CM N i LIăCAMăOAN ii MC LC iii DANH MC CÁC KÝ HIU VÀ CÁC CH VIT TT vi DANH MC CÁC BNG viii DANH MC CÁC HÌNH ix M U 1 1. t vn đ 1 2. Mc tiêu nghiên cu 2 3. Ni dung nghiên cu 2 Chng 1. TNG QUAN TÀI LIU 3 1.1. Tôm sú và các bnh thng gp  tôm sú 3 1.1.1. Gii thiu v tôm sú 3 1.1.2. Tình hình nuôi va di ch bê nh tôm sú  Viê t Nam 5 1.1.3. Các bnh thng gp  tôm sú 7 1.1.4. Phng pha p phòng và tr bnh  tôm sú 12 1.2. H min dch tôm sú 14 1.2.1. áp ng min dch t bào 15 1.2.2. áp ng min dch dch th 21 1.3. Nghiên c u gen va tiê m nng  ng du ng trong pho ng tri bê nh cho tôm su 23 1.3.1. Tình hình nghiên cu genome tôm sú trên th gii 23 1.3.2. Nghiên cu gen liên quan đê n kha nng miê n di ch  tôm su 24 1.3.3. Tiê m nng ng du ng cu a gen liên quan đê n miê n dich trong pho ng tr bnh  tôm su 28 Chng 2. VT LIU VÀ PHNG PHÁP 32 2.1. Vt liu 32 2.1.1. Thu thp mu 32 iv 2.1.2. Hóa cht 32 2.1.3. Thit b 34 2.1.4. Các vi sinh vt đc s dng trong nghiên cu 34 2.2. Phng pháp nghiên cu 35 2.2.1. Tách chit RNA tng s 36 2.2.2. Tinh sch mRNA 37 2.2.3. Tng hp cDNA 38 2.2.4. Thit k mi phân lp mt s gen (cDNA) la chn 41 2.2.5. Khuch đi gen bng phn ng PCR 48 2.2.6. Tinh sch sn phm PCR 49 2.2.7. To dòng phân t sn phm PCR 49 2.2.8. Xác đnh trình t gen (cDNA) 50 2.2.9. Biu hin gen ALFPm3 50 2.2.10. Phân tích d liu trình t và x lý s liu 55 2.3. a đim nghiên cu 55 Chng 3. KT QU VÀ THO LUN 56 3.1. Rab7 - protein liên quan đê n c chê xâm nhiê m cu a virus 56 3.1.1. To dòng gen Rab7 t mu tôm sú Vit Nam 56 3.1.2. Xác đnh và phân tích trình t gen Rab7 58 3.2. Syntenin - protein liên quan đn con đ ng dâ n truyê n ti n hiê u 61 3.2.1. Phân lâ p đon 5‟-syntenin t mu tôm sú Vit Nam 62 3.2.2. To dòng gen syntenin hoàn chnh t mu tôm sú Vit Nam 64 3.2.3. Xác đnh và phân tích trình t gen syntenin 65 3.3. Hemocyanin - protein có hot tính phenoloxidase 68 3.3.1. Phân lp đon 5‟-hemocyanin t mu tôm sú Vit Nam 69 3.3.2. To dòng gen hemocyanin hoàn chnh t mu tôm sú Vit Nam 72 3.3.3. Phân tích trình t gen hemoccyanin 74 3.4. Ran - protein điê u khiê n th c ba o 76 3.4.1. To dòng mt phn đon gen Ran t mu tôm sú Vit Nam 77 v 3.4.2. Phân lp đon gen 3‟ và 5‟-Ran 78 3.4.3. To dòng gen Ran hoàn chnh t mu tôm sú Vit Nam 82 3.4.4. Xác đnh và phân tích trình t gen Ran 83 3.5. Caspase - protein tham gia va o c chê apoptosis 84 3.5.1. To dòng gen caspase t mu tôm sú Vit Nam 85 3.5.2. Xác đnh và phân tích trình t gen caspase 86 3.6. H thng các protein kháng khun, kháng nm và kháng virus 90 3.6.1. Protein kha ng virus PmAV 90 3.6.2. Peptide kha ng khuâ n t ng t crustin (crustin - like antimicrobial peptide) 94 3.6.3. Yê u tô kha ng khuâ n (ALF - antiliposaccharide factor) 99 3.7. Biê u hiê n yê u tô kha ng khuâ n tái t hp (rALFPm3) 105 3.7.1. To cu trúc vector biu hin gen 105 3.7.2. Xác đnh cu trúc gen ALFPm3 đc chuyn vào genome nm men 108 3.7.3. Xác đnh đon peptide ALFPm3 đc biu hin 109 3.7.4. Phân tích hot tính ca rALFPm3 111 KT LUN VÀ KIN NGH 113 1. Kt lun 113 2. Kin ngh 114 CỄCăCỌNGăTRỊNHăẩăCỌNGăB LIểNăQUANăN LUN ÁN 115 TÀI LIU THAM KHO PH LC vi DANHăMCăCỄCăKụăHIUăVẨăCỄCăCHăVITăTT Tăvitătt NghaătingăVit NghaătingăAnh 5‟UTR Vùng 5‟ không dch mã 5‟ Untranslated region 3‟UTR Vùng 3‟ không dch mã 3‟ Untranslated region AAP Mi neo Abridged anchor primer AFLP a hình chiu dài DNA đc khuch đi Amplified fragment length polymorphism ALF Yu t kháng khun Anti-lipopolisaccharide factor ALFPm ALF dng 1  tôm sú Anti-lipopolisaccharide factor Penaeus monodon isorform 1 ALFPm3 ALF dng 3  tôm sú Anti-lipopolisaccharide factor Penaeus monodon isorform 3 AMP Peptide kháng khun Antimicrobial peptide apoptosis T bào cht theo chng trình Programmed cell death bp Cp base Base pair B.megaterium Bacillus megaterium Bacillus megaterium cDNA DNA bô sung Complement DNA DP Mi suy din Degenerate primer DNA Axit deoxyribonucelic Deoxyribonucleic acid dNTPs Hn hp các nucleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) Deoxyribonucleoside triphosphate ddNTPs Hn hp các deoxynicleotide (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) Dideoxyribonucleoside triphosphate dsRNA RNA si kép Double stranded RNA DEPC Cht kh Rnase Diethyl pyrocarbonate E. aerogenes Vi khun Enterobacter aerogenes Enterobacter aerogenes E. coli Vi khun Escherichia coli Escherichia coli EDTA Axit ethylenediaminetetraacetic Ethylenediaminetetraacetic acid EST on trình t gen biu hin Expressed sequence tag GSP Mi đc hiu gen Gene specific primer vii kb Kb Kilo base LB Môi trng LB Luria Bertani mtDNA DNA ty th Mitochondrial DNA mRNA RNA thông tin Messenger RNA OD Mt đ quang Optical density ORF Khung đc m Open reading frame PCR Phn ng chui polymerase Polymerase chain reaction PmAV Gen kha ng virus  tôm su Penaeus monodon antivrus PmRab7 Rab7  tôm sú Penaeus monodon Rab7 P. pastoris Nm men Pichia pastoris Pichia pastoris 3‟RACE Khuch đi nhanh đu 3‟ cDNA Rapid amplification of cDNA 3' ends 5‟RACE Khuch đi nhanh đu 5‟ cDNA Rapid amplification of cDNA 5' ends rALFPm3 ALF tái t hp  tôm sú dng 3 t tôm sú Recombinant anti-lipopolisaccharide factor Penaeus monodon 3 RNA Axit ribonucleic Ribonucleic acid RNAi RNA can thip RNA interference RNase Enzyme phân hy RNA Ribonuclease RT Enzyme phiên mã ngc Reverse transcriptase RT-PCR PCR bng enzyme phiên mã ngc Reverse transcriptase-PCR siRNA RNA can thip nh Small interfering RNA SNP a hình các nucleotide đn Single-nucleotide polymorphism SSC Dung di ch Natri citrate Solution sodium citrate TSV Virus gây hi chng taura Taura syndrome virus UAP Mi khuch đi chung Universal amplication primer UPM Hn hp mi chung Universal primer mix v/p vòng/phút rotor/minute WSSV Virus gây bnh đm trng White spot syndrome virus YHV Virus gây bnh đu vàng Yellow head virus YP Môi trng YP Yeast peptone YPD Môi trng YPD Yeast peptone dextrose viii DANHăMCăCỄCăBNG Bng 1.1. Thô ng kê ca c gen liên quan đê n hê miê n dich  tôm 26 Bng 2.1. Các thit b s dng trong nghiên cu 34 Bng 2.2. Trình t các mi s dng trong nghiên cu 47 ix DANHăMCăCỄCăHỊNH Hình 1.1. Hình nh tôm sú 3 Hình 1.2. Tôm sú nhim WSSV 10 Hình 1.3. Tôm sú nhim YHV 12 Hình 1.4. Tê ba o ma u tôm su 17 Hình 1.5. H thng hot hóa proPO và tng hp melanin 19 Hình 1.6. C ch đông máu  tôm 21 Hình 2.1. S đ phân lp gen 35 Hình 2.2. S đ thit k mi t gen đã bit trình t 42 Hình 2.3. S đ thit k mi t gen đã bit mt phn trình t đu 3‟ (Invitrogen) 42 Hình 2.4. S đ thit k mi t gen đã bit mt phn trình t đu 3‟ (Clontech) 43 Hình 2.5. S đ thit k mi khi bit mt phn trình t đu 5‟ ca gen 43 Hình 2.6. S đ thit k mi phân lp gen syntenin 44 Hình 2.7. S đ thit k mi phân lp gen hemocyanin 44 Hình 2.8. S đ thit k mi phân lp gen Ran 45 Hình 2.9. S đ thit k mi đ phân lp gen hoàn toàn mi  tôm sú 46 Hình 2.10. S đ thit mi khuch đi đon gen mã hóa peptide ALFPm3 trng thành 46 Hình 2.11. S đ biu hin ALFPm3 51 Hình 3.1. Kt qu đin di sn phm khuch đi và tách dòng gen Rab7 57 Hình 3.2. Trình t gen và amino acid suy din ca Rab7 58 Hình 3.3. So sánh trình t nucleotide  gen Rab7 ca tôm sú Vit Nam vi trình t đã công b 59 Hình 3.4. Mô phng cu trúc bc hai và phân tích các motif chc nng ca protein Rab7 60 Hình 3.5. Kt qu đin di sn phm khuch đi và tách dòng đon 5‟-syntenin 62 Hình 3.6. Trình t nucleotide và amino acid suy din ca đon 5‟-syntenin 63 Hình 3.7. Kt qu đin di sn phm khuch đi và tách dòng gen syntenin 64 x Hình 3.8. Trình t gen và amino acid suy din ca syntenin 66 Hình 3.9. So sánh trình t amino acid ca protein syntenin gia các loài khác nhau 67 Hình 3.10. Kt qu đin di sn phm khuch đi và tách dòng đon 5‟-hemocyanin 70 Hình 3.11. Trình t nucleotide và amino acid suy din ca đon 5‟-hemocyanin 71 Hình 3.12. Kt qu đin di sn phm khuch đi và tách dòng gen hemocyanin 72 Hình 3.13. Trình t gen và amino acid suy din ca hemocyanin 73 Hình 3.14. So sánh trình t amino acid ca protein hemocyanin gia các loài 75 Hình 3.15. Kt qu đin di sn phm khuch đi và tách dòng mt phn đon gen Ran 77 Hình 3.16. Trình t nucleotide và amino acid đon gen Ran 78 Hình 3.17. Kt qu đin di sn phm khuch đi và tách dòng đon gen 3‟-Ran 79 Hình 3.18. Kt qu đin di sn phm khuch đi và tách dòng đon gen 5‟-Ran 80 Hình 3.19. Trình t nucleotide và amino acid suy din ca gen Ran 81 Hình 3.20. Kt qu đin di sn phm khuch đi và tách dòng gen Ran 82 Hình 3.21. So sánh trình t amino acid ca protein Ran gia các loài khác nhau 83 Hình 3.22. Kt qu đin di sn phm khuch đi và tách dòng gen caspase 86 Hình 3.23. Trình t nucleotide và amino acid ca caspase 87 Hình 3.24. So sánh trình t nucleotide ca gen caspase ca tôm sú Vit Nam vi trình t đã công b 88 Hình 3.25. So sánh trình t amino acid suy din ca protein caspase tôm sú vi các loài tôm khác nhau 90 Hình 3.26. Kt qu đin di sn phm khuch đi và tách dòng gen PmAV 92 Hình 3.27. Trình t gen và amino acid suy din ca protein PmAV 93 Hình 3.28. So sánh trình t amino acid ca protein PmAV 94 Hình 3.29. Kt qu đin di sn phm khuch đi và tách dòng gen mã hóa peptide kha ng khuâ n tng t crustin 96 Hình 3.30. Trình t gen và amino acid suy din ca gen mã hóa peptide kháng khun tng t crustin 96 [...]... còn l i c a thân bi i t màu nâu sang màu xanh ho t (Hình 1.1) Trong các loài tôm nuôi, tôm sú là ho [209] Hình 1.1 Hình nh tôm sú [14] 4 Tôm sú , phía Tây Nam nuôi và [174] Loài tôm này - 34 0/00 Tôm sú có pha - 4 tháng c - 50 g Tôm - 250 100 - 300 - 200 - 200 g Tôm sú có sú [11] Tôm sú là loài giáp xác có tin [11] sú , Tôm cái - 280 - u trùng theo các larvae) postlarvae) chu trình [11], [145], [174]... [119] Các , ng c p mé b chìm xu Gan, t WSSV t và ng có màu tr ng ho trên , tôm (Hình 1.2) vài mm này là 1 cm [2], [51] Genome c a WSSV là DNA s c kho ng ng phân l p t genome c a WSSV WSSV phân l p t tôm sú c nh nh t 292967 bp, c l n nh t là 307287 bp, genome c a Trung Qu c là 307107 bp Genome [140] genome tôm sú và [213] WSSV [66] l tôm kho c và th nhi m b i giáp xác hoang dã trong ao và do m tr ng [50],... sông C u Long b thi t h i l n nh t do t p trung kho ng 87% di n tích nuôi tôm c ac c Hi các t nh ven bi n phía Nam t - 1994 b nh u vàng b m tr ng và b ng tôm ch t hàng lo t nh tôm sú có lo i [8], [10], [11] N trung [9], sú [3], [4], [13] sú [2] phòng [15] sú [1], [12], 7 1.1.3 Các 1.1.3.1 liên quan B tôm kitin, mang, , , Các , gây tôm nuôi là Vibrio, chitin [103] hi Vibrio V cholerae, V parahaemolyticus... crustin ng t tôm 98 Hình 3.32 K t qu n di s n ph m khu i và tách dòng gen ALF 100 Hình 3.33 Trình t nucleotide và amino acid suy di n c a ALFPm 101 Hình 3.34 Trình t nucleotide và amino acid suy di n c a ALFPm3 102 Hình 3.35 So sánh trình t nucleotide c a gen ALFPm v i trình t 102 Hình 3.36 So sánh trình t nucleotide c a gen ALFPm3 v i trình t tôm sú Vi t Nam tôm sú Vi t Nam... maker 24 microsatellite marker genome là 2033,4 cM marker [243] - EST) EST/cDNA genome tôm sú lite và [203] 1.3.2 phân tích các (Expressed sequence tag, EST/ cDNA) 25 [111] [195], [196] EST quan t [203] Nh ng nghiên c u v ph n ng t bào và d ch th c các nhà khoa h c r c bi các nhân t mc a ng mi n d ch [26], [27], [172] Trong nh hi tôm khi b nhi i s phát tri n c i, nh ng nghiên c k t qu góp ph n làm sáng... có hàm amino acid cao, ngoài ra còn vitamin cho B6, E, A, D Alzheimer Các : H selenium c (apoptosis [143], [231] Tôm sú là loài [174] [16] 1.1.2 Tình hình tôm sú 32 , ong phú 6 [201] công, con (postlarva 15 [3] Theo th ng kê c a B Thu S n (1995), t - 1995 d ch b nh tôm th ng di n tích nuôi tôm có d ch b nh là 84.558 ha v i s kho ng 294 t ng thi t h c tính là 5.225 t n, tr giá n nay, d ch b nh v n t n... dài 150es [44], [228] [215], b YH associated virus - [53] [103] 12 [8] Tôm n [35], [44] [70], [71], dot blot [129], [148], RT - PCR [229] Western blot [147], [200] [183], [184] 1.1.4 ph phòng và tôm sú 13 K c tr 7-10 ngày [8] P các là [238] và [8] gây ra là phòng CR 14 mang cho tôm [2], [117] Có tôm không có xúc [68] [90], [215] và tôm tác nhân theo [212] các sau khi WSSV, và WSSV Các Sargassum polycystumwas... [134] sinh v [155] virus trong Tuy nhiên, n mã hóa protein có các gen trì hoãn quá trình apoptosis M vào các caspase - , virus Quá trình apoptosis Các caspase là protein trung tâm trong quá trình apoptosis caspase WSSV tôm nuôi , tôm Marsupenaeus japonicus) gen , apoptosis apoptosis vai trò trong apoptosis trong tôm kháng virus WSSV là tôm càng tiêm WSSV vào ngày 3 Apoptosis sau [119] [227] 21 1.2... 2004, các protein tôm tách dòng và Lo và cDNA gen HSP70 , stress và [125] tôm sú amino acid HSP70 bào máu tôm 3 sau và sau 30 phút là (Antimicrobial peptides - AMPs) có protein , [141] AMPs có sinh trùng, màng peptide này và màng chí vi , [36], [83] zyme có vai trò polysaccharide Gram (-), các 23 , cho phép các lysozyme các bên trong và bên ngoài sterases và chitinases [55] 1.3 1.3.1 genome [107] [223]... i ch ng B megaterium 111 Hình 3.45 Ho t tính c i v i ch ng E aerogenes 112 1 1 Vibrio spp g V harvey (Yellow head virus - YHV), t liên quan immune sy (White spot syndrome virus - sequence tag - 2 , các gi phòng phòng cho tôm Tuy nhiên, các làm phòng tôm sú (Penaeus monodon 2 , 3 - - g 3 1.1 Penaeus monodon Ngoài ra, loài tôm này [11] Penaeidae và [38] Animalia Ngành: Arthropoda : Malacostraca . cho nghiên cu phòng tr bnh  tôm sú, chúng tôi tin hành thc hin đ tài: Nghiên cu đc đim cu trúc mt s gen thuc h min dch tôm sú (Penaeus. bê nh tôm sú  Viê t Nam 5 1.1.3. Các bnh thng gp  tôm sú 7 1.1.4. Phng pha p phòng và tr bnh  tôm sú 12 1.2. H min dch tôm sú 14 1.2.1.