LUẬN văn THẠC sĩ SINH học (FULL) nghiên cứu một số loại màng sử dụng trong chế tạo KIT xác định nhóm máu

LỜI CẢM ƠN Trước hết, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Thẩm Thị Thu Nga, phòng Công nghệ Gen động vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, định hướng nghiên cứu, hướng dẫn thí nghiệm, sửa luận văn tạo điều kiện hóa chất trang thiết bị nghiên cứu để tơi hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán Phịng Cơng nghệ Gen động vật, Viện Cơng nghệ sinh học giúp đỡ tơi tận tình suốt q trình làm luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn Khoa Sinh - KTNN, Khoa Sau đại học, trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên thầy giáo nhiệt tình giảng dạy tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa học Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn người thân gia đình bạn bè giúp đỡ động viên suốt thời gian học tập Thái Nguyên, tháng năm Học viên CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACD Axit citrate dextrose CMC Carboxyl methyl cellulose CPD Citrate, phosphat, dextrose CPDA Citrate, phosphat, dextrose, adenin Cs Cộng DEAE Diethylaminoethyl cellulose EDTA Ethylene diamine tetraacetic axit ELISA Enzyme-linked immuno sorbent assay HBV Hepatitis B virus HCV Hepatitis C virus HIV Human immunodeficiency virus Ig Immunoglobulin Nxb Nhà xuất PA Poly acrylate PCR Polymerase chain reaction PLA Polylactic axit PVA Polyvinyl alcohol BSA Bovine serum albumin MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 M ÁU VÀ CHỨC NĂNG CỦA MÁU 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Khối lượng máu Error! Bookmark not defined 1.2 PHÂN LOẠI NHÓM MÁU 1.2.1 Hệ thống nhóm máu ABO 1.2.2 Hệ thống nhóm máuRh 1.3 KHÁNG NGUYÊN, KHÁNG THỂ .6 1.3.1 Kháng nguyên (antigen) .6 1.3.2 Kháng thể (antibody) 1.4 CÔNG TÁC TRUYỀN MÁU TRÊN THẾ GIỚI 1.4.1 Lịch sử công tác truyền máu 1.4.2 Truyền máu đại 1.5 AN TOÀN TRUYỀN MÁU 1.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH NHÓM MÁU 11 1.7 MỘT SỐ NGUYÊN NHÂN GÂY BẤT THƯỜNG TRONG XÁC ĐỊNH NHÓM MÁU BẰNG PHƯƠNG PHÁP HUYẾT THANH MẪU 12 1.7.1 Phản ứng yếu 12 1.7.2 Bệnh lý 13 1.7.3 Các nguyên nhân khác 13 1.8 NGUYÊN LIỆU TẠO MÀNG TRONG CHẾ TẠO THẺ XÉT NGHIỆM NHÓM MÁU 14 1.9 CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 15 1.9.1 .CÁ C NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC 15 1.9.2 .CÁ C NGHIÊN CỨU CỦA NƯỚC NGOÀI 16 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19 2.1 NG UYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT 19 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.3 HƯỚNG DẪN SỬ DỤNG THẺ XÉT NGHIỆM .20 2.3.1 Lấy mẫu 20 2.3.2 Qui trình xét nghiệm 20 2.3.3 Đọc kết 21 2.3.4 Ưu điểm xét nghiệm thẻ 22 2.3.5 Hạn chế phương pháp xét nghiệm thẻ .22 2.4 HƯỚNG DẪN CỤ THỂ CHO THU THẬP MÁU, CÁC THÀNH PHẦN VÀ CÁC CHẾ PHẨM MÁU 23 2.5 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU .25 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 NG HIÊN CỨU PHỦ KHÁNG THỂ LÊN MỘT SỐ LOẠI MÀNG 26 3.1.1 Màng cellophane 26 3.1.2 Màng Cacboxymethylcellulose (CMC) 28 3.1.3 Màng Polyvinyl alcolhol (PVA) 31 3.2 NGHIÊN CỨU PHỦ KHÁNG THỂ ANTI-A, ANTI-B LÊN MÀNG 35 3.3 NGHIÊN CỨU XÉT NGHIỆM KIỂM CHỨNG TỰ ĐỘNG LÀM SONG SONG VỚI XÉT NGHIỆM TRÊN THẺ 38 3.4 SO SÁNH ĐỘ NHẠY VÀ ĐỘ CHÍNH XÁC CỦA THẺ VỚI CÁC PHƯƠNG PHÁP KHÁC .39 3.5 NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN BẢO QUẢN THẺ, CÁC HÓA CHÁT VÀ DỤNG CỤ KÈM THEO 41 3.6 GIÁ THÀNH SẢN PHẨM 43 3.7 TÍNH MỚI CỦA ĐỀ TÀI 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Đặc điểm nhóm máu hệ ABO tỉ lệ Việt Nam .4 Bảng 1.2 Đặc điểm nhóm máu hệ Rhesus tỉ lệ Việt Nam Bảng 2.1 Kết kiểm chứng nhóm máu .21 Bảng 2.2 Độ nhạy thẻ xét nghiệm xác định với nhóm máu A 23 Bảng 2.3 Độ nhạy thẻ xét nghiệm xác định với nhóm máu B 23 Bảng 2.4 Độ nhạy thẻ xét nghiệm xác định với nhóm máu AB .24 Bảng 2.5 Độ nhạy thẻ xét nghiệm xác định với nhóm máu O 24 Bảng 3.1 Độ nhạy độ đặc hiệu thẻ xét nghiệm ép màng cellophane 27 Bảng 3.2 Độ nhạy thẻ xét nghiệm với nồng độ CMC khác .29 Bảng 3.3 Độ nhạy độ đặc hiệu thẻ xét nghiệm ép màng CMC 31 Bảng 3.4 Độ nhạy thẻ xét nghiệm với nồng độ PVA khác .32 Bảng 3.5 Độ nhạy độ đặc hiệu thẻ xét nghiệm ép màng PVA 34 Bảng 3.6 Độ nhạy thẻ sử dụng loại màng Cellophane, CMC, PVA 35 Bảng 3.7 Độ nhạy thẻ xét nghiệm với lượng kháng thể khác 38 Bảng 3.8 So sánh độ nhạy độ đặc hiệu thẻ xét nghiệm với phương pháp xét nghiệm phiến kính xét nghiệm tube 40 Bảng 3.9 Thời hạn sử dụng thẻ xét nghiệm 42 Bảng 3.10 Giá thành sản xuất thẻ xét nghiệm nhóm máu đề tài sản xuất .43 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc phân tử màng CMC 14 Hình 1.2 Cấu trúc phân tử PVA 14 Hình 1.3 Cấu trúc phân tử cellophane 15 Hình 3.1 Phủ kháng thể lên màng cellophane .27 Hình 3.2 Xét nghiệm thẻ ép màng cellophane .27 Hình 3.3 Phủ màng CMC lên bề mặt thẻ xét nghiệm .30 Hình 3.4 Xét nghiệm thẻ ép màng CMC 2% 30 Hình 3.5 Xét nghiệm thẻ ép màng CMC 3% 30 Hình 3.6 Phủ màng PVA lên bề mặt thẻ xét nghiệm 32 Hình 3.7 Xét nghiệm thẻ ép màng PVA 3% 33 Hình 3.8 Xét nghiệm thẻ ép màng PVA 5% 33 Hình 3.10 Phủ kháng thể lên màng CMC 2% .36 Hình 3.11 Xét nghiệm màng CMC với 20µl kháng thể 37 Hình 3.12 Xét nghiệm màng CMC với 30µl kháng thể 37 Hình 3.13 Xét nghiệm màng CMC với 40µl kháng thể 37 Hình 3.14 Mẫu đối chứng không bị vẩn đục 39 Hình 3.15 Mẫu đối chứng bị vẩn đục 39 Hình 3.16 Xét nghiệm nhóm máu phiến 39 Hình 3.17 Xét nghiệm nhóm máu tube 39 Hình 3.18 Xét nghiệm nhóm máu thẻ EldonCard 41 Hình 3.19 Thẻ xét nghiệm nhóm máu ABO+D đề tài sản xuất 42 MỞ ĐẦU LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Theo Quy chế truyền máu Bộ Y tế ban hành ngày 19 tháng năm 2007, định nhóm máu hệ ABO giường bệnh xét nghiệm bắt buộc nhằm phòng tránh tai biến tan máu cấp lòng mạch truyền nhầm nhóm máu [1] Trên bề mặt hồng cầu người có 30 kháng nguyên thường gặp hàng trăm kháng nguyên khác kháng ngun có tính miễn dịch yếu Các kháng nguyên xếp thành hệ thống nhóm máu ABO, Rh, Lewis, MNSs, P, Kell Trong số có hai hệ thống nhóm máu ABO Rh đóng vai trị đặc biệt quan trọng truyền máu [6] Sự khơng tương thích mặt miễn dịch hệ nhóm máu ABO nguy đe dọa nhiều y học truyền máu [49] Những biến chứng người bệnh truyền nhầm nhóm máu thường lỗi xảy trình xét nghiệm máu [35] Định nhóm máu đầu giường thực trước truyền máu nằm luật y tế nhiều nước giới Vấn đề quan trọng định nhóm máu đầu giường hệ nhóm máu ABO khả tương thích, tính xác xét nghiệm [15], [20] Điều phụ thuộc vào độ xác thiết bị xét nghiệm Do vậy, định truyền nhầm nhóm máu lỗi kỹ thuật hiệu suất sử dụng thiết bị nghèo nàn [44] Để bảo đảm an toàn truyền máu mặt miễn dịch, phòng xét nghiệm phát máu định nhóm máu hệ ABO, hệ Rh hệ nhóm máu hồng cầu khác, xác định kháng thể bất thường, tiến hành phản ứng hoà hợp điều kiện, nhiệt độ khác thực quy trình truyền máu Ở Việt Nam, định nhóm máu hệ ABO, làm phản ứng chéo nhiệt độ 22 C nên an toàn truyền máu mặt miễn dịch hạn chế [1] Trên giới, thẻ định nhóm máu Eldoncard A/S bắt đầu sử dụng từ năm 1956 Việc định nhóm máu ABO, Rh thực dễ dàng thời gian ngắn Thẻ định nhóm máu cho phép người sử dụng nhận biết nhóm máu họ A, O, B hay AB, Rh(-) hay Rh(+) [17] Việc xác định tình trạng nhóm máu Rh phụ nữ mang thai quan trọng Nếu phụ nữ mang thai có Rh(-), bào thai có Rh(+), hệ miễn dịch người mẹ công tế bào hồng cầu bào thai, dẫn đến làm ngưng kết hồng cầu thai nhi Tùy theo mức độ ngưng kết dẫn đến sẩy thai thai chết [23] Tại Việt Nam, có số công ty bắt đầu cung cấp kit dạng thẻ xét nghiệm định nhóm máu nhập Tuy nhiên, phịng xét nghiệm sinh hóa chưa thể đưa vào sử dụng xét nghiệm cho bệnh nhân giá thành cao so với xét nghiệm phương pháp truyền thống [1] Vậy yêu cầu đặt phải tạo thẻ định máu ABO, Rh, đáp ứng nhu cầu sử dụng nước Để góp phần vào việc tạo thẻ định máu ABO, Rh, tiến hành nghiên cứu đề tài: “NGHIÊN CỨU MỘT SỐ LOẠI MÀNG SỬ DỤNG TRONG CHẾ TẠO KIT XÁC ĐỊNH NHÓM MÁU ” MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Tạo thẻ xác định nhóm máu hệ ABO hệ Rh - Xác định độ nhạy độ xác thẻ xét nghiệm nhóm máu đề tài sản xuất - Xác định điều kiện bảo quản thẻ định nhóm máu NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Xác định loại màng thích hợp để gắn kháng thể anti-A, anti-B, anti-D - Xác định hàm lượng kháng thể thích hợp đưa lên màng - Nghiên cứu xét nghiệm kiểm chứng tự động làm song song với xét nghiệm thẻ để dựa vào đánh giá kết xét nghiệm - So sánh độ nhạy độ xác thẻ với phương pháp khác - Nghiên cứu điều kiện bảo quản thẻ, hóa chất dụng cụ kèm theo - Hướng dẫn cụ thể cho thu thập máu, thành phần máu chế phẩm máu CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 MÁU VÀ CHỨC NĂNG CỦA MÁU 1.1.1 Định nghĩa Máu tổ chức màu đỏ, vận chuyển hệ thống mạch Máu với bạch huyết, dịch gian bào dịch não tủy tạo thành môi trường thể Máu thành phần quan trọng môi trường bên thể đảm nhiệm nhiều chức sinh lý khác [2] 1.1.2 Thành phần máu Máu gồm hai thành phần: thể hữu hình (huyết cầu) huyết tương Các thể hữu hình máu hồng cầu, bạch cầu tiểu cầu, chiếm 43 - 45% tổng số máu, số gọi hematocrit Hồng cầu thành phần chiếm chủ yếu thể hữu hình Huyết tương chiếm 55 - 57% tổng số máu Huyết tương chứa nước, protein, chất điện giải, hợp chất hữu vô cơ, hocmon, vitamin, chất trung gian hoá học, sản phẩm chuyển hố Huyết tương chứa tồn chất cần thiết cho thể toàn chất cần thải Huyết tương bị lấy fibrinogen gọi huyết [3] 1.2 PHÂN LOẠI NHÓM MÁU Sự hiểu biết kháng ngun nhóm máu vơ cần thiết cho cơng tác truyền máu Truyền máu áp dụng từ lâu cấp cứu điều trị Khi truyền máu gặp nhiều tai biến nguy hiểm Ngày hiểu nguyên nhân tai biến có mặt cuả kháng thể tự nhiên thể Các kháng thể chống lại kháng ngun với tính miễn dịch cao có bề mặt hồng cầu Trên bề mặt hồng cầu người có 30 kháng nguyên thường gặp nhiều kháng nguyên khác kháng ngun có tính miễn dịch yếu, thường dùng để nghiên cứu gen Các kháng nguyên xếp thành hệ thống nhóm máu ABO, Rh, Lewis, MNSs, P, Kell, Lutheran, Duffy, Kidd [1] Trong số nhóm máu, có hai hệ thống nhóm máu ABO Rh đóng vai trị đặc biệt quan trọng truyền máu 1.2.1 Hệ thống nhóm máu ABO Năm 1901, Landsteiner phát tượng huyết người làm ngưng kết hồng cầu người ngược lại Sau đó, nguời ta tìm kháng nguyên A kháng nguyên B, kháng thể a (anti-A) kháng thể b (anti-B) Kháng nguyên A B có mặt màng hồng cầu; kháng thể a b có mặt huyết tương Kháng thể a làm ngưng kết hồng cầu mang kháng nguyên A, kháng thể b làm ngưng kết hồng cầu mang kháng nguyên B Do thể có trạng thái dung nạp với kháng nguyên thân, nên huyết tương kháng thể chống lại kháng nguyên có bề mặt hồng cầu thể Từ hệ thống nhóm máu ABO chia làm nhóm: nhóm A, nhóm B, nhóm AB nhóm O Ký hiệu nhóm máu biểu thị có mặt kháng nguyên bề mặt hồng cầu [5] Bảng 1.1 Đặc điểm nhóm máu hệ ABO tỉ lệ Việt Nam Tên nhóm Kháng nguyên Kháng thể Tỷ lệ máu màng hồng cầu huyết A A Chống b 21,5 B B Chống a 29,5 AB A B Khơng có a b O Khơng có A, B Chống a chống b 43 Nguồn: Đỗ Trung Phấn (2006)[4] Cơ thể nhóm máu A có kháng nguyên A bề mặt hồng cầu có kháng thể b (anti-B) huyết tương Cơ thể nhóm máu B có kháng nguyên B bề mặt hồng cầu có kháng thể a (anti-A) huyết tương Cơ thể nhóm máu AB có kháng nguyên A B bề mặt hồng cầu khơng có kháng thể a b huyết tương Hình 3.11 Xét nghiệm màng CMC với 20µl kháng thể Control; Anti-A; 3- Anti-B; Anti-D Hình 3.12 Xét nghiệm màng CMC với 30µl kháng thể Control; Anti-A; 3- Anti-B; Anti-D Hình 3.13 Xét nghiệm màng CMC với 40µl kháng thể Control; Anti-A; 3- Anti-B; Anti-D Qua số liệu bảng 3.7, thẻ phủ 20µl kháng thể cho kết xét nghiệm hệ nhóm máu ABO Rh đạt 94,07% Do lượng kháng thể phủ lên thẻ nên kết khơng rõ ràng, khó quan sát mắt thường Thẻ phủ 40µl kháng thể cho kết quan sát mắt thường cho kết 96,30%, nhiên thời gian làm khô lâu, lượng huyết nhiều, kết thu chậm Đồng thời, lượng huyết phủ lên màng nhiều lượng kháng thể phủ trước nên cho kết khơng xác Với thẻ phủ 30µl kháng thể cho kết đạt 97,79% thời gian làm khô nhanh, dễ dàng quan sát kết mắt thường, đồng thời tiết kiệm chi phí sản xuất Bảng 3.7 Độ nhạy thẻ xét nghiệm với lượng kháng thể khác Nhóm máu Số mẫu Lượng kháng thể phủ lên màng (n) 20µl 30µl 40µl Nhóm A 18 88,89 94,44 83,33 Nhóm B 13 92,31 92,31 100 Nhóm AB 18 94,44 100 94,44 Nhóm O 16 93,75 100 100 Nhóm Rh(+) 20 95,00 100 100 Nhóm Rh(-) 100 100 100 97,79 96,30 Trung bình 94,07 Để thuận tiện cho nghiên cứu tiếp theo, sử dụng thẻ xét nghiệm CMC 2%, phủ 30µl kháng thể 3.3 NGHIÊN CỨU XÉT NGHIỆM KIỂM CHỨNG TỰ ĐỘNG LÀM SONG SONG VỚI XÉT NGHIỆM TRÊN THẺ Mẫu đối chứng âm khơng có kháng thể sử dụng làm kiểm chứng Vì khơng cần cung cấp kháng thể nên thẻ dành vị trí để làm kiểm chứng nhỏ huyết khơng chứa kháng thể lên vị trí kiểm chứng màng Khi xét nghiệm, nhỏ giọt nước muối đẳng trương vào vị trí này, sau thêm 30µl huyết mẫu Mẫu đối chứng cho kết âm tính xét nghiệm mẫu máu thẻ có giá trị Nếu mẫu đối chứng có tượng ngưng kết hay máu bị vẩn đục loại bỏ mẫu máu Hình 3.14 Mẫu đối chứng không bị vẩn đục Control; Anti-A; 3- Anti-B; Anti-D Hình 3.15 Mẫu đối chứng bị vẩn đục Control; Anti-A; 3- Anti-B; Anti-D 3.4 SO SÁNH ĐỘ NHẠY VÀ ĐỘ CHÍNH XÁC CỦA THẺ VỚI CÁC PHƯƠNG PHÁP KHÁC Hình 3.16 Xét nghiệm nhóm máu phiến Hình 3.17 Xét nghiệm nhóm máu tube Để kiểm tra độ nhạy thẻ, làm song song xét nghiệm thẻ xét nghiệm phiến kính xét nghiệm tube theo phương pháp huyết mẫu Kết thu sau: Bảng 3.8 So sánh độ nhạy độ đặc hiệu thẻ xét nghiệm với phương pháp xét nghiệm phiến kính xét nghiệm tube Độ nhạy (%) Nhóm máu Số mẫu Thẻ Phiến (n) xét kính Độ đặc hiệu (%) Tube nghiệm Thẻ Phiến xét kính Tube nghiệm Nhóm A 28 100 100 100 100 100 100 Nhóm B 38 97,37 94,7 100 100 100 100 Nhóm AB 20 100 100 100 100 100 100 Nhóm O 11 100 90,91 100 100 100 100 Rh(+) 20 95,00 100 95,5 100 100 100 Rh(-) 100 100 100 100 100 100 98,73 97,60 99,25 100 100 100 Trung bình Khi tiến hành so sánh độ nhạy thẻ xét nghiệm nhóm máu đề tài sản xuất với phương pháp xét nghiệm phiến kính xét nghiệm tube, kết khơng có khác biệt lớn Độ nhạy trung bình thẻ xét nghiệm, xét nghiệm phiến kính xét nghiệm tube 98,73%, 97,60%, 99,25% Độ đặc hiệu đạt 100% Kết xét nghiệm sử dụng thẻ đề tài sản xuất có độ nhạy 98,73%, độ đặc hiệu 100% Mặc dù độ nhạy chưa đạt yêu cầu đặt ban đầu 100%, nhiên, kết tương đối cao so sánh với phương pháp thường quy phịng thí nghiệm Thơng thường đọc kết dương tính sau khuấy trộn mẫu thời gian 60 giây Phản ứng âm tính đọc kết sau phút Nếu không chắn kết phải lặp lại xét nghiệm Trên giới, thẻ xét nghiệm EldonCard (Đan Mạch) xuất từ năm 1950 cho độ xác gần tuyệt đối, xuất 0,3‰ lỗi xét nghiệm nhóm ABO [17] Thẻ HealthTEST Rh card cho kết Rh(-) có độ nhạy 99,70% đặc hiệu 98,90% [28] Độ nhạy mức độ đặc hiệu nhóm máu hệ ABO 92,80% 95,90% nghiên cứu Ingrand cộng [29] Sai số xét nghiệm kể sử dụng kit hay sử dụng phương pháp thường qui nhiều nguyên nhân khác điều tránh khỏi Một điều tra Pháp cho thấy xét nghiệm định nhóm máu bệnh viện cho kết độ nhạy 93,9% ± 3% [10] Hai lỗi thường gặp xét nghiệm nhóm máu thực khơng xác quy trình xét nghiệm viên thiếu kinh nghiệm Việc đưa kết luận với mẫu cho kết không rõ ràng, trước hết cần lặp lại xét nghiệm sau kết hợp với xét nghiệm khác Hình 3.18 Xét nghiệm nhóm máu thẻ EldonCard Có kết tủa; Khơng có kết tủa; Có kết tủa; Khơng có kết tủa 3.5 NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN BẢO QUẢN THẺ, CÁC HÓA CHÁT VÀ DỤNG CỤ KÈM THEO Sử dụng chất bảo quản NaN3 nồng độ 0,1% Đây chất bảo quản phổ biến thường dùng để bảo quản protein Kháng thể dạng dung dịch bảo quản NaN3 điều kiện 2-8 C giữ hoạt tính sau năm Kháng thể khơ bảo quản chân khơng có độ bền tương đối cao Thẻ xét nghiệm định nhóm máu nghiên cứu bảo quản điều kiện nhiệt độ phòng (20- 28 C), ngăn mát tủ lạnh (2-8 C) trạng thái đóng gói ngun bao nilon hút chân khơng dạng khơng bao gói Kiểm tra định kỳ với loại thẻ Kết sau: Bảng 3.9 Thời hạn sử dụng thẻ xét nghiệm Thẻ khơng bao gói Thẻ có bao gói 0 Nhiệt độ phịng 2-8 C Nhiệt độ phòng 2-8 C ngày 10 ngày tháng tháng Thời gian cịn hoạt tính Thẻ coi khơng cịn hoạt tính kháng thể khơng đọc kết với bốn nhóm máu xét nghiệm cho kết sai sau lặp lại xét nghiệm lần thứ hai Hình 3.19 Thẻ xét nghiệm nhóm máu ABO+D đề tài sản xuất Thời hạn bảo quản thẻ bắt đầu nghiên cứu sau sản xuất lô mẫu ngày 17/10/2011 Thẻ mở bao gói để nhiệt độ phịng sau tuần, có tượng kháng thể hút ẩm, lan rộng bám dính vào bao gói Vì vậy, kết xét nghiệm bị ảnh hưởng khó đọc kết hay kết sai Với thẻ bảo quản bao nilon hút chân không để ngăn mát tủ lạnh giữ nguyên hoạt tính sau tháng Đến thời điểm nay, mẫu bảo quản nhiệt độ 2-8 C cịn hoạt tính So sánh với số thẻ định nhóm máu có thị trường Eldon có thời hạn bảo quản năm, thẻ Sifin có thời hạn bảo quản năm, thẻ xét nghiệm máu đề tài sản xuất chấp nhận giá thành thời hạn sử dụng 3.6 GIÁ THÀNH SẢN PHẨM Để sản xuất kit cạnh tranh thị trường giá thành vấn đề quan trọng thứ sau chất lượng Giá thành sản xuất thẻ xét nghiệm nhóm máu thể bảng 3.10 Bảng 3.10 Giá thành sản xuất thẻ xét nghiệm nhóm máu đề tài sản xuất Nguyên liệu Đơn vị Số lượng Giá thành (VNĐ) CMC µl 400 Giá thể Chiếc 300 Kháng thể µl 2400 Que khuấy 1000 Giá thẻ xét nghiệm phụ thuộc giá kháng thể Giá thành kit đơn 4.100 VNĐ Một cách giảm giá thành sản phẩm giảm lượng huyết mẫu đưa lên màng Trước đây, sử dụng 50μl huyết mẫu cho vị trí phản ứng Điều phù hợp cho xét nghiệm nhà sử dụng pipet pasteur nhỏ giọt, lượng mẫu đem xét nghiệm khơng định lượng xác Tuy nhiên, có dụng cụ thích hợp pipetman cần với 30μl huyết mẫu đưa lên thẻ đọc kết rõ ràng 3.7 TÍNH MỚI CỦA ĐỀ TÀI Xác định nhóm máu phương pháp huyết mẫu phương pháp thường quy labo sinh hố Việc xác định nhóm máu phương pháp chuẩn hoá cho hố chất quy trình Tuy nhiên, để tăng tính chun nghiệp, tiện dụng, an tồn cho người xét nghiệm phổ biến cho người sử dụng sử dụng nhà số trường hợp khẩn cấp, xét nghiệm dạng thẻ sử dụng lần nghiên cứu chế tạo giới từ năm 50 Hiện giới, số lượng thẻ xét nghiệm định nhóm máu chế tạo ngày nhiều (Serafol ABO bedside card [59], Olympus (R) TM PK [28], thẻ định nhóm máu Eldon Card [23]); thẻ xét nghiệm dạng ống (gel card PaLMS Australia, Ortho Gelcard Mỹ ) Tại Việt Nam, nay, việc chế tạo loại kit xét nghiệm nói chung thẻ xét nghiệm nói riêng nước ta cịn tương đối mẻ, kit dạng thẻ chế tạo chưa có nghiên cứu tạo thẻ xét nghiệm nhóm máu hệ ABO, Rh Nguyên nhân là xét nghiệm đơn giản, giá thành cho xét nhiệm thấp, muốn chế tạo kit dạng thẻ phải đáp ứng yêu cầu giá thành phải thấp nhiều so với giá xét nghiệm thường quy thấp giá xét nghiệm theo qui định Bộ Y tế Theo xu hướng đó, phạm vi đề tài này, chúng tơi nghiên cứu quy trình chế tạo thẻ định nhóm máu hệ ABO, Rh để sản xuất nước, hạ giá thành sản phẩm, đáp ứng mục tiêu chung đặt ban đầu KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đã tạo loại màng cellophane, màng CMC màng PVA cho thẻ xét nghiệm nhóm máu Trong đó, xét nghiệm nhóm máu thẻ phủ màng CMC nồng độ 2% cho độ nhạy trung bình cao (98,06%), thời gian làm khô nhanh, thao tác dễ dàng không bị biến tính nhiệt độ cao Xác định hàm lượng kháng thể đưa lên màng 30µl loại Thẻ đơn xét nghiệm nhóm máu đề tài sản xuất có giá thành 4100VNĐ/thẻ đơn Thẻ bảo quản bao nilon hút chân không, bảo quản nhiệt độ 2-8 C giữ nguyên hoạt tính sau tháng KIẾN NGHỊ Để thẻ xét nghiệm cạnh tranh tốt với loại thẻ nhập ngoại khác, cần tiếp tục thu thập mẫu máu Rh(-) để khảo sát thêm độ xác Nghiên cứu bổ sung số dụng cụ kèm theo dao, que khuấy, màng phủ lên thẻ sau xét nghiệm dung dịch muối sinh lý để tăng tính tiện dụng cho người sử dụng Việc chế tạo thẻ chưa có dây chuyền sản xuất mà làm thủ cơng, chưa thương mại hóa Hiện nay, nhu cầu xét nghiệm nhóm máu nước ta lớn Số ca truyền máu khoảng đến triệu ca năm Trên giới, thẻ xét nghiệm định nhóm máu xuất từ năm 50 Ở Việt Nam, nhu cầu sử dụng xét nghiệm định nhóm máu bắt đầu xuất thực thị trường tiềm TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Bộ Y tế (2008), Tài liệu tập huấn an toàn truyền máu, Hà Nội Lê Quang Long (1996), Bài giảng sinh lý người động vật, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội Đỗ Trung Phấn (2000), An toàn truyền máu, Nxb Khoa học kỹ thuật Đỗ Trung Phấn (2006), “Huyết học - Truyền máu”, Bài giảng sau đại học, Nxb Y học Thái Quý (1999), “Lịch sử truyền máu”, Bài giảng sau đại học, Trường Đại học Y Hà Nội Lê Đình Sáng (2010), Huyết học - Truyền máu, Nxb Đại học Y khoa Hà Nội Lê Đình Sáng (2010), Miễn dịch học lâm sàng, Nxb Đại học Y khoa Hà Nội Nguyễn Anh Trí (2004), “An tồn truyền máu biện pháp để đảm bảo truyền máu an toàn”, Một số chuyên đề Huyết học – Truyền máu, Nxb Y học, tr 46-60 TIẾNG ANH Al-Tamimi M et al., (2012), “Validation of paper-based assay for rapid blood typing”, Analytical chemistry, 84(3): 1661-8 10 Ammaranond P et al., (2011), “Enhanced agglutination reaction of ABO subgroups by gold nanoparticle solution: implication for identification of ABO subgroups”, Journal of biomedical nanotechnology, 7(6): 840-5 11 Anderson DR, et al (2000), “Evaluation of polyethylene terephthalate for ABO and Rh typing and alloantibody screening”, Transfusion, 40(6): 669-72 12 Ballerini DR et al., (2011), “An inexpensive thread-based system for simple and rapid blood grouping”, Analytical and bioanalytical chemistry, 399(5): 1869-75 13 Bienek DR, Charlton DG (2011), “Accuracy of user-friendly blood typing kits tested under simulated military field conditions”, Military medicine, 176(4): 454-60 14 Brewer J (1961), Serological test card with color solid as visualizing agent, U.S Pat Nos 3,074,853 15 Caspari G et al., (2002), “The risk of transfusion to the wrong patient in Germany”, Transfusion, 42(9): 1238–1239 16 Cheng D, Hao Y (2011), “Comparative evaluation of the microcolumn gel card test and the conventional tube test for measurement of titres of immunoglobulin G antibodies to blood group A and blood group B”, The Journal of international medical research, 39(3): 934-43 17 Daurat G et al., (2002), “Validity of pretransfusion bedside agglutination tests for pretransfusional control”, Transfusion clinique et biologique, 9(4): 258-64 18 Denise M (1999), Modern blood banking and transfusion practise, book promotion & service, fourth edition, pp.90-213 19 Divya Talwar, Amit Arora (2010), “Blood group testing in developing countries: an ignored concern”, Journal of infection in developing countries, 4(12): 852-853 20 Du Chesne A et al., (1992), “Possibilities for using bedside cards as secondary comparison in trace element studies with the PCR technique”, Archiv für Kriminologie, 190(3-4): 103-8 21 Dujardin PP et al., (2000), “Errors in interpreting the pretransfusion bedside compatibility test: an experimental study”, Vox sanguinis, 78(1): 37-43 22 Eldon Knud (1956), “Experience with ABO and Rh blood-grouping cards”, British Medical Journal, 1218-1220 23 Eldon Knud (1966), Instrument for blood grouping on blood grouping cards, U.S Pat Nos 3,424,558 24 Ensign BG et al., (1995), “ABO and Rh blood type errors on Air Force identification cards”, Military medicine, 160(6): 288-90 25 Euan R Tovey, Brian A Baldo (1989), “Protein binding to nitrocellulose, nylon and PVDF membranes in immunoassays and electroblotting”, Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 19(2-3): 169-183 26 Felix Giebel et al., (2008), “Evaluation of four bedside test systems for card performance, handling and safety”, Original Article Originalarbeit 27 Fujii Y (2011), “Prevention of ABO-incompatible transfusion”, Japanese journal of anesthesiology, 60(1): 47-54 28 Gamma Biologicals, Inc (2003), Olympus (R) PK TM Blood grouping reagents 29 Ginestra E et al., (2004), “DNA extraction from blood determination membrane card test”, Forensic science international, 146 Suppl: S145-6 30 Harvey G Klein, David J Anstee (2005), Mollison’s Blood Transfusion in Clinical Medicine, Blackwell Publishing, pp 1-252 31 Hermut Schenkel - Brunner (2000), Human blood groups - Chemical and Biochemical - Basis of Antigen specificifi, Springer Wien NewYork, pp 54-622 32 Herold TJ et al., (2005), “Determining the accuracy of a rapid pointof-care test for determining Rh phenotype”, Academic emergency medicine, 12(5): 474-6 33 Ingrand P et al., (1998), “Reliability of the pretransfusion bedside compatibility test: association with transfusion practice and training”, Transfusion, 38(11-12): 1030-6 34 Jarujamrus P et al., (2012), “Mechanisms of red blood cells agglutination in antibody-treated paper”, The Analyst, 137(9): 220510 35 Jean C.E (2001), “WHO strategies for safe blood transfusion”, Chinese journal of blood transfusion (14), pp 39-42 36 Khan MS et al., (2010), “Paper diagnostic for instantaneous blood typing”, Analytical chemistry, 82(10): 4158-64 37 Krombach J et al., (2002), “Human error The persisting risk of blood transfusion A report of life cases”, Anesthesia and analgesia, 94(1): 154-6 38 Langston MM et al., (1999), “Evaluation of the gel system for ABO grouping and D typing”, Transfusion, 39(3): 300-5 39 Lapierre Y et al., (1990), “The gel test: A new way to detect red cell antigen-antibody reactions”, Transfusion, 30: 109-113 40 Lee HY et al., (2011), “Rapid direct PCR for ABO blood typing”, Journal of forensic sciences, 56 Suppl 1: S179-82 41 Leitch K et al., (1993), “A preliminary trial of the gel test for blood group serology”, British journal of biomedical science, 50(1): 64-6 42 Mass M (1970), Identification card, U.S Pat Nos 3,502,437 43 Mc Gowan A et al., (1989), “Stability of murine monoclonal anti-A anti-B and anti-AB, grouping reagents and a multi-centre evaluation of their performance in routine use”, Vox sanguinis, 56(2): 122-130 44 Meinshausen E, Wendt M (1989), “Introduction of a new card for the bedside test'”, Der Anaesthesist, 38: 555–557 45 Migeot V et al., (2002), “Reliability of bedside ABO testing before transfusion”, Transfusion, 42(10): 1348-1355 46 Nathalang O et al., (2001), “A preliminary study of the distribution of blood group systems in Thai blood donors determined by the gel test”, The Southeast Asian journal of tropical medicine and public health, 32(1): 204-7 47 Novaretti MC et al., (2004), “Comparison of conventional tube test technique and gel microcolumn assay for direct antiglobulin test: a large study”, Journal of clinical laboratory analysis, 18(5): 255-8 48 Ortho-Clinical Diagnostics (2006), “Immunohematology”, Evaluation report 49 Perrotta PL, Snyder EL (2001), “Non-infectious complications of transfusion therapy”, Blood reviews, 15: 69–83 50 Plapp FV (1989), “New techniques for compatibility testing”, Archives of pathology and laboratory medicine, 113(3): 262-9 51 Proverbio D et al., (2011), “Comparison of gel column agglutination with monoclonal antibodies and card agglutination methods for assessing the feline AB group system and a frequency study of feline blood types in northern Italy”, Veterinary clinical pathology, 40(1): 32-9 52 Raache R et al., (1998), “Production of monoclonal antibodies specific for the ABO blood group and rhesus D antigens”, Archives de l'Institut Pasteur d'Algérie, 62:118-137 53 Rachel JM, Plapp FV (1990), “Bedside blood grouping”, Medical laboratory sciences, 47(4): 330-6 54 Rouger P et al., (1997), “Advances in the use of monoclonal antibodies for blood testing”, Transfusion clinique et biologique, 4(4): 345-349 55 Rouger P et al., (2000), “Immunologic risk analysis of blood transfusion 1991–1998 (in France)”, Transfusion clinique et biologique, 7(1): 9-14 56 Seth M et al., (2011), “Comparison of five blood-typing methods for the feline AB blood group system”, American journal of veterinary research, 72(2): 203-9 57 Taylor J et al., (2011), “Multi-centre evaluation of pretransfusional routine tests using 8-column format gel cards”, Transfusion medicine, 21(2): 90-8 58 Uthemann H, Weber M (1982), “Securing the ABO-identity by serafol before blood transfusions”, Der Anaesthesist, 31(4): 204-5 59 Voak D (1989), “Monoclonal blood group antibodies”, Contributions to infusion therapy, 24: 200-13 60 Yves Lapierre et al., (1996), Method detecting antigens and/or antibodies, U.S Pat Nos 5,512,432 ... tạo thẻ định máu ABO, Rh, đáp ứng nhu cầu sử dụng nước Để góp phần vào việc tạo thẻ định máu ABO, Rh, tiến hành nghiên cứu đề tài: “NGHIÊN CỨU MỘT SỐ LOẠI MÀNG SỬ DỤNG TRONG CHẾ TẠO KIT XÁC ĐỊNH... ĐỊNH NHÓM MÁU ” MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Tạo thẻ xác định nhóm máu hệ ABO hệ Rh - Xác định độ nhạy độ xác thẻ xét nghiệm nhóm máu đề tài sản xuất - Xác định điều kiện bảo quản thẻ định nhóm máu NỘI... biến cho người sử dụng sử dụng nhà số trường hợp khẩn cấp, xét nghiệm dạng thẻ sử dụng lần nghiên cứu chế tạo giới từ năm 50 Hiện giới, số lượng thẻ xét nghiệm định nhóm máu chế tạo ngày nhiều