nghiên cứu một số loại màng sử dụng trong chế tạo kit xác định nhóm máu

Để bảo đảm an toàn truyền máu về mặt miễn dịch, mọi phòng xét nghiệm phát máu đều định nhóm máu hệ ABO, hệ Rh và các hệ nhóm máu hồng cầu khác, xác định kháng thể bất thường, tiến hành p

- -

NGUYỄN ĐỨC HÙNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ LOẠI MÀNG SỬ DỤNG TRONG CHẾ TẠO KIT XÁC ĐỊNH NHÓM MÁU

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN, NĂM 2012

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS THẨM THỊ THU NGA

THÁI NGUYÊN, NĂM 2012

Công nghệ Gen động vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã định hướng nghiên cứu, hướng dẫn thí nghiệm, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện về hóa chất cũng như trang thiết bị nghiên cứu để tôi hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Công nghệ Gen động vật, Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ tôi tận tình trong suốt quá trình làm luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa Sinh - KTNN, Khoa Sau đại học, trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên cùng các thầy cô giáo đã nhiệt tình giảng dạy và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập

Thái Nguyên, tháng 4 năm 2012

Học viên

Nguyễn Đức Hùng

Carboxyl methyl cellulose

Citrate, phosphat, dextrose

Citrate, phosphat, dextrose, adenin Cộng sự

Diethylaminoethyl cellulose

Ethylene diamine tetraacetic axit

Enzyme-linked immuno sorbent assay

Hepatitis B virus

Hepatitis C virus

Human immunodeficiency virus

Immunoglobulin Nhà xuất bản Poly acrylate Polymerase chain reaction

Polylactic axit

Polyvinyl alcohol

Bovine serum albumin

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 MÁU VÀ CHỨC NĂNG CỦA MÁU 3

1.1.1 Định nghĩa 3

1.1.2 Khối lượng của máu Error! Bookmark not defined 1.2 PHÂN LOẠI NHÓM MÁU 3

1.2.1 Hệ thống nhóm máu ABO 4

1.2.2 Hệ thống nhóm máuRh 5

1.3 KHÁNG NGUYÊN, KHÁNG THỂ 6

1.3.1 Kháng nguyên (antigen) 6

1.3.2 Kháng thể (antibody) 7

1.4 CÔNG TÁC TRUYỀN MÁU TRÊN THẾ GIỚI 7

1.4.1 Lịch sử công tác truyền máu 8

1.4.2 Truyền máu hiện đại 8

1.5 AN TOÀN TRUYỀN MÁU 8

1.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH NHÓM MÁU 11

1.7 MỘT SỐ NGUYÊN NHÂN GÂY BẤT THƯỜNG TRONG XÁC ĐỊNH NHÓM MÁU BẰNG PHƯƠNG PHÁP HUYẾT THANH MẪU 12

1.7.1 Phản ứng yếu 12

1.7.2 Bệnh lý 13

1.7.3 Các nguyên nhân khác 13

1.8 NGUYÊN LIỆU TẠO MÀNG TRONG CHẾ TẠO THẺ XÉT NGHIỆM NHÓM MÁU 14

1.9 CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 15

1.9.1.CÁC NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC 15

1.9.2.CÁC NGHIÊN CỨU CỦA NƯỚC NGOÀI 16

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19

2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT 19

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.3.2 Qui trình xét nghiệm 20

2.3.3 Đọc kết quả 21

2.3.4 Ưu điểm của xét nghiệm trên thẻ 22

2.3.5 Hạn chế của phương pháp xét nghiệm trên thẻ 22

2.4 HƯỚNG DẪN CỤ THỂ CHO THU THẬP MÁU, CÁC THÀNH PHẦN VÀ CÁC CHẾ PHẨM MÁU 23

2.5 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 25

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 NGHIÊN CỨU PHỦ KHÁNG THỂ LÊN MỘT SỐ LOẠI MÀNG 26

3.1.1 Màng cellophane 26

3.1.2 Màng Cacboxymethylcellulose (CMC) 28

3.1.3 Màng Polyvinyl alcolhol (PVA) 31

3.2 NGHIÊN CỨU PHỦ KHÁNG THỂ ANTI-A, ANTI-B LÊN MÀNG 35

3.3 NGHIÊN CỨU XÉT NGHIỆM KIỂM CHỨNG TỰ ĐỘNG LÀM SONG SONG VỚI XÉT NGHIỆM TRÊN THẺ 38

3.4 SO SÁNH ĐỘ NHẠY VÀ ĐỘ CHÍNH XÁC CỦA THẺ VỚI CÁC PHƯƠNG PHÁP KHÁC 39

3.5 NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN BẢO QUẢN THẺ, CÁC HÓA CHÁT VÀ DỤNG CỤ KÈM THEO 41

3.6 GIÁ THÀNH SẢN PHẨM 43

3.7 TÍNH MỚI CỦA ĐỀ TÀI 43

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Đặc điểm các nhóm máu hệ ABO và tỉ lệ ở Việt Nam 4

Bảng 1.2 Đặc điểm nhóm máu hệ Rhesus và tỉ lệ ở Việt Nam 5

Bảng 2.1 Kết quả kiểm chứng nhóm máu 21

Bảng 2.2 Độ nhạy của thẻ xét nghiệm khi xác định với nhóm máu A 23

Bảng 2.3 Độ nhạy của thẻ xét nghiệm khi xác định với nhóm máu B 23

Bảng 2.4 Độ nhạy của thẻ xét nghiệm khi xác định với nhóm máu AB 24

Bảng 2.5 Độ nhạy của thẻ xét nghiệm khi xác định với nhóm máu O 24

Bảng 3.1 Độ nhạy và độ đặc hiệu của thẻ xét nghiệm được ép màng cellophane 27

Bảng 3.2 Độ nhạy của thẻ xét nghiệm với các nồng độ CMC khác nhau 29

Bảng 3.3 Độ nhạy và độ đặc hiệu của thẻ xét nghiệm được ép màng CMC 31

Bảng 3.4 Độ nhạy của thẻ xét nghiệm với các nồng độ PVA khác nhau 32

Bảng 3.5 Độ nhạy và độ đặc hiệu của thẻ xét nghiệm được ép màng PVA 34

Bảng 3.6 Độ nhạy của thẻ sử dụng các loại màng Cellophane, CMC, PVA 35

Bảng 3.7 Độ nhạy của thẻ xét nghiệm với lượng kháng thể khác nhau 38

Bảng 3.8 So sánh độ nhạy và độ đặc hiệu của thẻ xét nghiệm với phương pháp xét nghiệm trên phiến kính và xét nghiệm trong tube 40

Bảng 3.9 Thời hạn sử dụng thẻ xét nghiệm 42

Bảng 3.10 Giá thành sản xuất 1 thẻ xét nghiệm nhóm máu do đề tài sản xuất 43

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử của màng CMC 14

Hình 1.2 Cấu trúc phân tử của PVA 14

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử của cellophane 15

Hình 3.1 Phủ kháng thể lên màng cellophane 27

Hình 3.2 Xét nghiệm trên thẻ ép màng cellophane 27

Hình 3.3 Phủ màng CMC lên bề mặt của thẻ xét nghiệm 30

Hình 3.4 Xét nghiệm trên thẻ ép màng CMC 2% 30

Hình 3.5 Xét nghiệm trên thẻ ép màng CMC 3% 30

Hình 3.6 Phủ màng PVA lên bề mặt của thẻ xét nghiệm 32

Hình 3.7 Xét nghiệm trên thẻ ép màng PVA 3% 33

Hình 3.8 Xét nghiệm trên thẻ ép màng PVA 5% 33

Hình 3.10 Phủ kháng thể lên màng CMC 2% 36

Hình 3.11 Xét nghiệm trên màng CMC với 20µl kháng thể 37

Hình 3.12 Xét nghiệm trên màng CMC với 30µl kháng thể 37

Hình 3.13 Xét nghiệm trên màng CMC với 40µl kháng thể 37

Hình 3.14 Mẫu đối chứng không bị vẩn đục 39

Hình 3.15 Mẫu đối chứng bị vẩn đục 39

Hình 3.16 Xét nghiệm nhóm máu trên phiến 39

Hình 3.17 Xét nghiệm nhóm máu trong tube 39

Hình 3.18 Xét nghiệm nhóm máu bằng thẻ EldonCard 41

Hình 3.19 Thẻ xét nghiệm nhóm máu ABO+D do đề tài sản xuất 42

MỞ ĐẦU

1 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Theo Quy chế truyền máu do Bộ Y tế ban hành ngày 19 tháng 1 năm 2007, định nhóm máu hệ ABO tại giường bệnh là một xét nghiệm bắt buộc nhằm phòng tránh tai biến tan máu cấp trong lòng mạch do truyền nhầm nhóm máu [1]

Trên bề mặt hồng cầu người có 30 kháng nguyên thường gặp và hàng trăm kháng nguyên khác nhưng đều là kháng nguyên có tính miễn dịch yếu Các kháng nguyên xếp thành hệ thống các nhóm máu ABO, Rh, Lewis, MNSs, P, Kell Trong

số này có hai hệ thống nhóm máu ABO và Rh đóng vai trò đặc biệt quan trọng trong truyền máu [6]

Sự không tương thích về mặt miễn dịch trong hệ nhóm máu ABO là nguy cơ

đe dọa nhiều nhất trong y học truyền máu [49] Những biến chứng ở người bệnh do truyền nhầm nhóm máu thường do lỗi xảy ra trong quá trình xét nghiệm máu [35] Định nhóm máu đầu giường được thực hiện trước khi truyền máu và nằm trong luật

y tế của nhiều nước trên thế giới Vấn đề quan trọng trong định nhóm máu đầu giường đối với hệ nhóm máu ABO là khả năng tương thích, tính chính xác của các xét nghiệm [15], [20] Điều này phụ thuộc vào độ chính xác của các thiết bị xét nghiệm Do vậy, các quyết định truyền nhầm nhóm máu do lỗi kỹ thuật và hiệu suất

sử dụng thiết bị nghèo nàn [44]

Để bảo đảm an toàn truyền máu về mặt miễn dịch, mọi phòng xét nghiệm phát máu đều định nhóm máu hệ ABO, hệ Rh và các hệ nhóm máu hồng cầu khác, xác định kháng thể bất thường, tiến hành phản ứng hoà hợp ở các điều kiện, nhiệt

độ khác nhau và thực hiện quy trình truyền máu đúng Ở Việt Nam, chúng ta chỉ định được nhóm máu hệ ABO, làm phản ứng chéo ở nhiệt độ 220

C nên an toàn truyền máu về mặt miễn dịch vẫn còn hạn chế [1]

Trên thế giới, thẻ định nhóm máu Eldoncard A/S bắt đầu được sử dụng từ năm 1956 Việc định nhóm máu ABO, Rh được thực hiện dễ dàng và trong thời gian ngắn Thẻ định nhóm máu cho phép người sử dụng nhận biết được nhóm máu

họ là A, O, B hay AB, Rh(-) hay Rh(+) [17] Việc xác định tình trạng nhóm máu Rh

ở phụ nữ mang thai cũng rất quan trọng Nếu phụ nữ mang thai có Rh(-), bào thai có Rh(+), hệ miễn dịch của người mẹ sẽ tấn công các tế bào hồng cầu của bào thai, dẫn đến làm ngưng kết hồng cầu của thai nhi Tùy theo mức độ ngưng kết dẫn đến sẩy thai hoặc thai chết [23]

Tại Việt Nam, đã có một số công ty bắt đầu cung cấp các bộ kit dạng thẻ xét nghiệm định nhóm máu nhập Tuy nhiên, các phòng xét nghiệm sinh hóa chưa thể đưa vào sử dụng xét nghiệm cho bệnh nhân do giá thành còn quá cao so với xét nghiệm bằng phương pháp truyền thống [1] Vậy yêu cầu đặt ra là phải tạo ra được thẻ định máu ABO, Rh, đáp ứng nhu cầu sử dụng trong nước

Để góp phần vào việc tạo ra thẻ định máu ABO, Rh, chúng tôi tiến hành

nghiên cứu đề tài: “NGHIÊN CỨU MỘT SỐ LOẠI MÀNG SỬ DỤNG TRONG

CHẾ TẠO KIT XÁC ĐỊNH NHÓM MÁU ”

2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

- Tạo được thẻ xác định nhóm máu hệ ABO và hệ Rh

- Xác định độ nhạy và độ chính xác của thẻ xét nghiệm nhóm máu do đề tài sản xuất

- Xác định điều kiện bảo quản thẻ định nhóm máu

3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Xác định loại màng thích hợp để gắn kháng thể anti-A, anti-B, anti-D

- Xác định hàm lượng kháng thể thích hợp đưa lên màng

- Nghiên cứu xét nghiệm kiểm chứng tự động làm song song với xét nghiệm trên thẻ để dựa vào đó đánh giá kết quả xét nghiệm

- So sánh độ nhạy và độ chính xác của thẻ với các phương pháp khác

- Nghiên cứu điều kiện bảo quản thẻ, các hóa chất và dụng cụ kèm theo

- Hướng dẫn cụ thể cho thu thập máu, các thành phần của máu và các chế phẩm máu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 MÁU VÀ CHỨC NĂNG CỦA MÁU

1.1.1 Định nghĩa

Máu là tổ chức màu đỏ, vận chuyển trong hệ thống mạch Máu cùng với bạch huyết, dịch gian bào và dịch não tủy tạo thành môi trường trong cơ thể Máu là thành phần quan trọng nhất của môi trường bên trong cơ thể và đảm nhiệm nhiều

chức năng sinh lý khác nhau [2]

1.1.2 Thành phần của máu

Máu gồm hai thành phần: thể hữu hình (huyết cầu) và huyết tương Các thể hữu hình của máu là hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu, chiếm 43 - 45% tổng số máu, chỉ số này được gọi là hematocrit Hồng cầu là thành phần chiếm chủ yếu trong thể hữu hình Huyết tương chiếm 55 - 57% tổng số máu Huyết tương chứa nước, protein, các chất điện giải, các hợp chất hữu cơ và vô cơ, các hocmon, các vitamin, các chất trung gian hoá học, các sản phẩm chuyển hoá Huyết tương chứa toàn bộ các chất cần thiết cho cơ thể và toàn bộ các chất cần được thải ra ngoài Huyết tương bị lấy mất fibrinogen thì được gọi là huyết thanh [3]

1.2 PHÂN LOẠI NHÓM MÁU

Sự hiểu biết về kháng nguyên nhóm máu là vô cùng cần thiết cho công tác truyền máu Truyền máu đã được áp dụng từ lâu trong cấp cứu và điều trị Khi truyền máu đã gặp nhiều tai biến rất nguy hiểm Ngày nay chúng ta đã hiểu rằng nguyên nhân tai biến là do sự có mặt cuả kháng thể tự nhiên trong cơ thể Các kháng thể này chống lại các kháng nguyên với tính miễn dịch cao có trên bề mặt hồng cầu Trên bề mặt hồng cầu người có 30 kháng nguyên thường gặp và nhiều kháng nguyên khác nhưng đều là kháng nguyên có tính miễn dịch yếu, thường chỉ dùng để nghiên cứu gen Các kháng nguyên xếp thành hệ thống các nhóm máu ABO, Rh, Lewis, MNSs, P, Kell, Lutheran, Duffy, Kidd [1]

Trong số các nhóm máu, có hai hệ thống nhóm máu ABO và Rh đóng vai trò đặc biệt quan trọng trong truyền máu

1.2.1 Hệ thống nhóm máu ABO

Năm 1901, Landsteiner phát hiện ra hiện tượng huyết thanh của người này làm ngưng kết hồng cầu của người kia và ngược lại Sau đó, nguời ta đã tìm được kháng nguyên A và kháng nguyên B, kháng thể a (anti-A) và kháng thể b (anti-B) Kháng nguyên A và B có mặt trên màng hồng cầu; kháng thể a và b có mặt trong huyết tương Kháng thể a sẽ làm ngưng kết hồng cầu mang kháng nguyên A, kháng thể b sẽ làm ngưng kết hồng cầu mang kháng nguyên B Do cơ thể có trạng thái dung nạp với kháng nguyên bản thân, nên trong huyết tương không có kháng thể chống lại kháng nguyên có trên bề mặt hồng cầu của chính cơ thể đó Từ đó hệ thống nhóm máu ABO được chia làm 4 nhóm: nhóm A, nhóm B, nhóm AB và nhóm O Ký hiệu nhóm máu biểu thị sự có mặt của kháng nguyên trên bề mặt hồng cầu [5]

Bảng 1.1 Đặc điểm các nhóm máu hệ ABO và tỉ lệ ở Việt Nam

Tên nhóm

máu

Kháng nguyên trên màng hồng cầu

Kháng thể trong huyết thanh

Cơ thể nhóm máu O không có kháng nguyên A và B trên bề mặt hồng cầu, trong huyết tương có cả kháng thể a và b

1.2.2 Hệ thống nhóm máu Rh

Năm 1940, Landsteiner và Wiener lấy máu khỉ Macacus rhesus tiêm vào

máu thỏ nhiều lần, máu thỏ hình thành một hệ thống miễn dịch với hồng cầu của

máu khỉ Macacus rhesus Sau đó lấy huyết thanh máu thỏ đã được miễn dịch trộn

với hồng cầu của người Người ta thấy huyết thanh của thỏ làm ngưng kết hồng cầu của đa số người được thử Điều này chứng tỏ hồng cầu của những người này có chứa kháng nguyên giống như kháng nguyên của hồng cầu khỉ Người ta gọi kháng nguyên đó là kháng nguyên Rh [3]

Lúc đầu, Landsteiner và Wiener xếp những người có hồng cầu bị ngưng kết bởi huyết thanh này vào nhóm Rh(+), những người có hồng cầu không bị ngưng kết vào nhóm Rh(-) Sau này, Landsteiner và Wiener nhận thấy hệ thống kháng nguyên

Rh không đơn giản như vậy Hệ thống Rh có nhiều kháng nguyên, phần lớn chúng

có tính phản ứng chéo và sinh miễn dịch yếu Do đó kháng thể không gây ngưng kết mạnh như hệ thống ABO [6]

Bảng 1.2 Đặc điểm nhóm máu hệ Rhesus và tỉ lệ ở Việt Nam

chống Rh gây ngưng kết hồng cầu Rh(+) của người cho vẫn tồn tại trong máu người nhận Sau 2-4 tháng truyền máu Rh(+), nồng độ kháng thể chống Rh trong máu người Rh(-) mới đạt tối đa Nếu truyền máu Rh(+) cho những người này lần thứ 2

có thể gây ra tai biến truyền máu nặng Sau nhiều lần truyền máu Rh(+) cho người Rh(-), người Rh(-) trở nên rất mẫn cảm với kháng nguyên Rh, tai biến khi truyền máu là rất nguy hiểm Đó là lý do tại sao ta phải lưu ý tới người đã được truyền máu nhiều lần [26]

Trường hợp thứ hai là người mẹ người Rh(-), bố Rh(+) Đứa trẻ được di truyền bố Rh(+) từ bố Hồng cầu bố Rh(+) của thai sang máu mẹ Người mẹ sẽ có quá trình tạo kháng thể chống Rh, các kháng thể này qua nhau thai làm ngưng kết hồng cầu thai Nếu người mẹ có thai lần đầu thì cơ thể người mẹ chưa sản xuất đủ kháng thể để gây nguy hiểm cho thai nhi [26]

Trường hợp tiếp theo cần lưu ý là người phụ nữ có tiền sử sảy thai Những người này nếu cần truyền máu phải xét nghiệm nhóm máu Rh Nếu người mẹ này

có nhóm máu Rh(-) và trong máu đã có kháng thể chống Rh thì việc truyền máu Rh(+) cho họ sẽ có tai biến rất nguy hiểm [6]

1.3 KHÁNG NGUYÊN, KHÁNG THỂ

1.3.1 Kháng nguyên (antigen)

Kháng nguyên là những chất khi xâm nhập vào cơ thể sinh vật thì được hệ thống miễn dịch nhận biết và sinh ra các kháng thể tương ứng có đặc tính kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên đó [7]

Tính đặc hiệu của kháng nguyên

Tính đặc hiệu của mỗi đáp ứng miễn dịch có được là do mỗi kháng nguyên

có một cấu trúc riêng Tính đặc hiệu của kháng nguyên không phải do toàn bộ phân

tử kháng nguyên quyết định, mà do một hoặc nhiều đoạn nhỏ (Epitop) nằm trên phân tử kháng nguyên quyết định Epitop có chức năng kích thích cơ thể tạo ra đáp ứng miễn dịch đặc hiệu với kháng nguyên đó và là vị trí để kháng thể hoặc tế bào lympho mẫn cảm có thể gắn vào một cách đặc hiệu [7]

Phản ứng chéo

Kháng thể có tính đặc hiệu rất cao, nhưng cũng có trường hợp kháng thể của kháng nguyên A lại tác dụng với kháng nguyên B, ta gọi là phản ứng chéo Nguyên nhân của phản ứng chéo có thể là do trên hai kháng nguyên này có hai epitop giống nhau [7]

1.3.2 Kháng thể (antibody)

Kháng thể là các phân tử immunoglobulin (Ig) có bản chất glycoprotein do các tế bào lympho B cũng như các tương bào (biệt hóa từ lympho B) tiết ra để hệ miễn dịch nhận biết và vô hiệu hóa các tác nhân lạ Mỗi kháng thể chỉ có thể nhận diện một epitope kháng nguyên duy nhất Các kháng thể được phân thành 5 lớp: IgG, IgA, IgM, IgE và IgD [7]

Kháng thể đơn dòng

Các kháng thể đơn dòng chỉ nhận biết một epitope trên một kháng nguyên cho sẵn Các kháng thể đơn dòng cùng một dòng thì giống hệt nhau và được sản xuất bởi cùng một dòng tương bào [51]

Kháng thể đơn dòng là một công cụ hữu hiệu thiết yếu trong nghiên cứu từ miễn dịch đến protein chips nhằm tạo các kit chẩn đoán bệnh, các liệu pháp trị liệu [52] Kháng thể đơn dòng đã dần thay thế kháng thể đa dòng nhờ tính đặc hiệu và

có thể sản xuất số lượng lớn với giá thành thấp [42] Kháng thể đơn dòng IgM chống A, B, AB, D sử dụng cho định nhóm máu với độ nhạy và tính đặc hiệu cao ngày càng được nghiên cứu cải tiến, có phản ứng ngưng kết với nhóm máu yếu (sub-group) rất sẵn có trên thị trường [51], [59]

Kháng thể đa dòng

Các kháng thể đa dòng là một tập hợp các kháng thể đặc hiệu với các epitope khác nhau trên một kháng nguyên cho trước Trong đáp ứng miễn dịch, cơ thể tổng hợp nhiều kháng thể tương ứng với các epitope của cùng một kháng nguyên: đáp ứng như vậy gọi là đa dòng [7]

1.4 CÔNG TÁC TRUYỀN MÁU TRÊN THẾ GIỚI

1.4.1 Lịch sử công tác truyền máu

Lịch sử truyền máu trong y học thực sự mở ra sau khi Karl Landsteiner và học trò phát hiện ra hệ nhóm máu ABO Năm 1913, Reuben Ottenberg nêu vấn đề hoà hợp nhóm máu trong truyền máu và đưa ra sơ đồ truyền máu mang tên ông, từ đây đã khắc phục được tình trạng tử vong do truyền nhầm nhóm máu [5]

Năm 1921 ở các nước như Anh, Hà Lan và Australia đã thành lập được những trung tâm truyền máu đầu tiên trên thế giới Năm 1943, J Loutit, P Mollison

Đến năm 1952 Walter và Murphy mô tả kỹ thuật lấy máu kín bằng túi polyvinyl, sau đó Gibson và cộng sự phát triển hệ thống lấy máu bằng túi chất dẻo cho phép tách huyết tương ra khỏi máu sau khi để lắng và có thể bảo quản bằng đông lạnh lâu dài Đó là những điều kiện tốt cho một thời kỳ mới trong bảo quản, sử dụng các thành phần máu trong y học [8]

1.4.2 Truyền máu hiện đại

Truyền máu hiện nay đã phát triển và trở thành chương trình quốc gia của nhiều nước trên thế giới, cuộc cách mạng khoa học kỹ thuật đã đưa việc sản xuất các chế phẩm máu đi vào công nghiệp hoá

An toàn truyền máu được quan tâm không chỉ đảm bảo bằng cách phù hợp

về mặt miễn dịch mà là không truyền các bệnh nhiễm trùng cho người nhận bằng các biện pháp sàng lọc An toàn truyền máu trở thành luật quốc gia, luật quốc tế và được kiểm soát chặt chẽ, quan tâm đặc biệt, được đầu tư trang thiết bị, kỹ thuật hiện đại, phương pháp áp dụng có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, các xét nghiệm được tập trung làm ở các cơ sở lớn, hiện đại và có chất lượng An toàn truyền máu chỉ được đảm bảo khi có những trung tâm truyền máu lớn, có trang thiết bị hiện đại và đội ngũ cán bộ được đào tạo tốt An toàn truyền máu không chỉ là đảm bảo an toàn người cho, người nhận và cán bộ làm công tác truyền máu mà còn đảm bảo an toàn

về số lượng, chất lượng, trong cấp cứu, trong điều trị hàng ngày và dự phòng [8]

1.5 AN TOÀN TRUYỀN MÁU

Vấn đề an toàn truyền máu bao gồm việc xác định nhóm máu tất cả các hệ của cả người cho và người nhận, xác định kháng thể bất thường, tiến hành phản ứng hoà hợp ở các điều kiện, nhiệt độ khác nhau và thực hiện quy trình truyền máu đúng Các biện pháp này đã được trú trọng ở các nước phát triển rất sớm Tại các nước đang phát triển, vấn đề này còn chưa được quan tâm do vấn đề kinh phí, trình

độ cán bộ, do vậy đã có nhiều trường hợp đáng tiếc xảy ra gây tử vong hoặc gây nên tình trạng truyền máu không hiệu lực cho người bệnh Nếu truyền 50ml máu không tương thích cho người bệnh sẽ gây ra một phản ứng cấp tính tán huyết Điều này cho thấy vai trò của xác định nhóm máu trước khi truyền máu [27]

Tại Việt Nam để bảo đảm an toàn truyền máu cho người bệnh, chúng ta mới chỉ thực hiện được việc định nhóm máu hệ ABO, làm phản ứng hoà hợp ở nhiệt độ phòng thí nghiệm, do vậy chưa bảo đảm an toàn truyền máu về mặt miễn dịch

Để bảo đảm an toàn truyền máu về mặt miễn dịch trước tiên chúng ta phải nắm vững được các kiến thức sau:

Chức năng và các thành phần của máu

Kháng nguyên, kháng thể, phản ứng kháng nguyên, kháng thể và các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng kháng nguyên, kháng thể

Nhóm máu hệ ABO và các phương pháp xác định nhóm máu hệ ABO

Hệ thống nhóm máu Rh và các hệ nhóm máu hồng cầu khác

Tầm quan trọng của phản ứng hoà hợp [1]

Trong thực hành truyền máu, ngoài những qui định về những xét nghiệm phát hiện các virut lây theo đường máu, kỹ thuật bảo quản , chúng ta cần phải thực hiện đúng qui tắc về nhóm máu Qui tắc cơ bản là không để kháng nguyên và kháng thể tương ứng gặp nhau trong máu người nhận Đối với hệ thống nhóm máu ABO, thoả mãn qui tắc trên là phải truyền máu cùng nhóm Dựa vào kháng thể đã biết của huyết thanh mẫu (anti-A, anti-B, anti-AB), người ta xác định chính xác kháng nguyên A và B trên bề mặt hồng cầu Đồng thời với việc xác định nhóm máu thuộc

hệ ABO, chúng ta cần phải làm các phản ứng chéo bằng cách trộn hồng cầu người cho với huyết thanh máu người nhận và ngược lại trộn hồng cầu người nhận với

huyết thanh máu người cho Các phản ứng trên không có hiện tượng ngưng kết hồng cầu thì máu đó mới được truyền [27]

Để đảm bảo an toàn tuyệt đối, tốt nhất là truyền máu tự thân Đối tượng được lấy máu lúc khoẻ mạnh và được bảo quản trong ngân hàng, khi cần thì lấy chính máu của họ truyền cho họ Tuy nhiên, hiện nay chưa có điều kiện kỹ thuật để bảo quản máu được lâu (đặc biệt là các nước đang phát triển) nên điều này chưa thực hiện được [34]

Để khắc phục tai biến truyền máu và tình trạng lây nhiễm bệnh qua truyền máu, các nhà khoa học đã nghiên cứu sản xuất ra máu nhân tạo để làm dịch truyền thay thế máu Song phạm vi ứng dụng máu nhân tạo chưa được rộng rãi vì giá thành còn quá đắt [14]

Trong trường hợp cần truyền máu mà lại không có máu cùng nhóm, người ta

có thể truyền theo một qui tắc tối thiểu: không để xảy ra ngưng kết hồng cầu của người cho trong máu của người nhận Nếu để xảy ra tai biến này thì chỉ cần truyền nhầm 2ml máu đã có thể gây chết người do tắc mạch, rối loạn trao đổi khí của máu, tan máu, suy thận cấp Như vậy có thể truyền máu khác nhóm, nhưng phải tuân theo nguyên tắc: nhóm O truyền được cho nhóm A, B và AB; nhóm A và B truyền được cho nhóm AB; nhóm AB không truyền được cho nhóm O, A và B Tai biến do truyền máu rất khó xảy ra vì kháng thể trong máu người cho ngay lập tức bị pha loãng trong máu của người nhận Các kháng thể này sau đó sẽ bị các enzym phân giải Tuy vậy, ngày nay nhờ công tác hiến máu nhân đạo được phổ cập nên sự truyền máu theo qui tắc tối thiểu ít được ứng dụng

Đối với hệ máu Rh, kháng thể chống Rh chỉ hình thành ở người Rh(-) khi được miễn dịch bằng hồng cầu Rh(+) Tỷ lệ Rh(-) của người Việt Nam lại rất thấp (0,04%) nên người ta chú ý hai trường hợp cần xét nghiệm nhóm máu hệ Rh [4] Đó

là người đã được truyền máu nhiều lần và người phụ nữ có tiền sử xảy thai, đẻ non Việc xét nghiệm nhóm máu hệ Rh cũng dựa trên kháng thể của huyết thanh mẫu để tìm kháng nguyên Người có nhóm máu Rh(+) chỉ có thể cho người cũng có nhóm máu Rh(+) và nhận người có nhóm máu Rh(+) hoặc Rh(-) Người có nhóm máu

Rh(-) có thể cho người có nhóm máu Rh(+) hoặc Rh(-) nhưng chỉ nhận được người

có nhóm máu Rh(-) [3]

1.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH NHÓM MÁU

Theo Quy chế truyền máu do Bộ Y tế ban hành ngày 19 tháng 1 năm 2007, định nhóm máu hệ ABO tại giường bệnh là một xét nghiệm bắt buộc nhằm phòng tránh tai biến tan máu cấp trong lòng mạch do truyền nhầm nhóm máu Định nhóm máu có thể thực hiện bằng 2 phương pháp:

1.6.1 Phương pháp huyết thanh mẫu ( phương pháp trực tiếp)

- Dùng huyết thanh mẫu đã biết trước kháng thể để tìm kháng nguyên nhóm máu trên màng hồng cầu

- Trộn huyết thanh mẫu với máu người thử, dựa vào hiện tượng ngưng kết hay không ngưng kết mà người ra tìm ra kháng nguyên trên màng hồng cầu và từ đó xác định được nhóm máu [1]

1.6.2 Phương pháp hồng cầu mẫu ( phương pháp gián tiếp)

- Dùng hồng cầu mẫu đã biết trước kháng nguyên để tìm kháng thể trong huyết tương người thử

- Trộn hồng cầu đã biết trước kháng nguyên với huyết tương người thử Dựa vào hiện tượng ngưng kết hay không ngưng kết mà người ta biết được kháng thể trong huyết tương người thử, từ đó xác định được nhóm máu người thử [1]

1.6.3 Phản ứng chéo

Mặc dầu đã biết được nhóm máu của người cho và người nhận, nhưng trước khi truyền máu bao giờ cũng phải làm phản ứng chéo để xác định sự hoà hợp giữa máu người cho và người nhận Lấy hồng cầu rửa người cho trộn với huyết thanh người nhận vào trong một ống nghiệm và lấy huyết thanh người cho trộn với hồng cầu rửa người nhận vào trong một ống nghiệm Quan sát trên kính hiển vi hiện tượng ngưng kết hồng cầu Nếu không có hiện tượng ngưng kết hồng cầu trong cả hai ống nghiệm thì kết luận hai nhóm máu là hoà hợp và truyền được cho nhau [1]

Nhóm máu ở người được phân loại tuỳ thuộc vào các kháng thể có mặt trên

bề mặt tế bào hồng cầu Hệ nhóm máu ABO gồm 4 nhóm máu: A, B, AB và O tuỳ thuộc vào sự có mặt hay vắng mặt kháng nguyên A, B Nhóm máu A: có mặt kháng nguyên A trên bề mặt tế bào hồng cầu; Nhóm máu B: có mặt kháng nguyên B trên

bề mặt tế bào hồng cầu; Nhóm máu AB: có mặt cả kháng nguyên A và B trên bề mặt tế bào hồng cầu; Nhóm máu O: không có mặt 2 kháng nguyên trên [14]

Nguyên lý xét nghiệm là xét nghiệm ngưng kết phát hiện sự có mặt của các kháng nguyên trên bề mặt hồng cầu Nếu các kháng nguyên có mặt trên hồng cầu, chúng sẽ ngưng kết với các kháng thể tương ứng (phản ứng dương tính) Kết quả của xét nghiệm nhóm máu dựa trên nguyên lý ngưng kết được đọc bằng mắt thường Vì đọc kết quả bằng mắt thường nên có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến kết quả Một ý tưởng hợp lý là sử dụng chất chỉ thị màu để dịch kết quả dễ dàng hơn và tránh nhầm lẫn Chất chỉ thị này thường có sẵn trong kháng thể mẫu

1.7 MỘT SỐ NGUYÊN NHÂN GÂY BẤT THƯỜNG TRONG XÁC ĐỊNH NHÓM MÁU BẰNG PHƯƠNG PHÁP HUYẾT THANH MẪU

1.7.1 Phản ứng yếu

không phản ứng với kháng thể chống A tuỳ thuộc vào mức độ biểu hiện của từng

ứng yếu với kháng thể chống A) có thể phản ứng với kháng thể chống AB Do đó, một số thẻ định nhóm máu có thêm vị trí phủ kháng thể chống AB Mục đích là làm tăng khả năng xác định nhóm máu, làm dễ dàng hơn cho người đọc kết quả khi gặp phải nhóm máu có phản ứng yếu Trường hợp này cũng có thể xử lý bằng cách rửa

tế bào hồng cầu bằng dung dịch saline rồi ủ với kháng thể 30 phút để tăng khả năng ngưng kết giữa kháng thể và kháng nguyên yếu Kết quả đọc trên kính hiển vi nếu

Kháng nguyên nhóm máu chưa được phát triển đầy đủ khi mới sinh Vì thế hồng cầu trẻ sơ sinh hay máu cuống rốn có thể cho phản ứng yếu Mẫu máu được

lưu trữ cũng có thể cho phản ứng yếu hơn so với máu tươi Các trường hợp này cần lặp lại xét nghiệm và kết hợp thêm với các xét nghiệm khác để kết luận [1]

1.7.2 Bệnh lý

Bệnh nhân mang bệnh bạch cầu hoặc đã được điều trị bằng cấy tủy: Rửa tế bào hồng cầu và ủ với kháng thể anti-A, anti-B, anti-AB trong 30 phút ở nhiệt độ phòng nhằm làm tăng sự kết hợp của kháng thể với một lượng nhỏ kháng nguyên Đọc kết quả dưới kính hiển vi phát hiện sự ngưng kết yếu

Một số bệnh nhân đã được điều trị bệnh như ung thư (dạ dày, tuỵ, ống mật, túi mật, bệnh bạch cầu…) cũng là nguyên nhân gây ra các phản ứng yếu hoặc không phản ứng Các khối mô này có thể sản xuất ra một lượng lớn các chất làm vô hiệu hoá anti-A, anti-B Trường hợp này cũng phải rửa tế bào hồng cầu và lặp lại xét nghiệm

Bệnh nhân đã được điều trị với một số thuốc (dextran) tăng thể tích huyết tương hoặc máu của bệnh nhân bị plasmacytoma (trạng thái protein cao) hoặc bệnh nhân có sự bất thường về đông máu [1]

1.7.3 Các nguyên nhân khác

Phản ứng dương tính giả xảy ra khi có autoantibody phản ứng lạnh trong huyết thanh Trong trường hợp này rửa hồng cầu ở 370C bằng dung dịch saline trước khi thực hiện phản ứng Trường hợp dương tính giả cũng có thể xảy ra do hồng huyết cầu nhiễm khuẩn Đây là những hạn chế trong quá trình xét nghiệm không chỉ trên thẻ mà ngay cả phương pháp thường qui trong phòng xét nghiệm cũng gặp phải

Phản ứng hỗn hợp bao gồm cả sự ngưng kết và không ngưng kết: trường hợp này có thể xảy ra khi bệnh nhân có nhóm máu khác nhóm O được truyền máu nhóm

O Với bệnh nhân cấy tuỷ đôi khi cũng xảy ra trường hợp tương tự khi tế bào hồng cầu của bản thân người đó chưa được sinh ra Kiểm tra lại thông tin về quá trình điều trị trước đó [1]

1.8 NGUYÊN LIỆU TẠO MÀNG TRONG CHẾ TẠO THẺ XÉT NGHIỆM NHÓM MÁU

Để tạo bộ kit đơn giản, việc đầu tiên là phải cố định được kháng thể có bản chất là protein lên một loại màng trơ, đóng vai trò chất mang, không phản ứng với protein, không ảnh hưởng đến hoạt tính của protein

1.8.1 Carboxymethylcellulose (CMC)

Carboxymethylcellulose là một dẫn xuất của cellulose được tạo thành bằng phản ứng của cellulose với alkali và chloroacetic acid, nhóm carboxymethyl(-CH2-COOH) gắn với nhóm hydroxyl của các monomers cấu tạo nên khung của cellolose CMC tinh khiết dạng bột màu trắng hoặc dạng vi sợi có màu hơi vàng, không mùi, không vị, không độc Bột CMC dễ hút ẩm, dễ hòa tan trong nước thành dạng keo, không hòa tan trong nhiều dung môi methanol, ethanol, acetone, chloroform, benzene

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử của màng CMC 1.8.2 Polyvinyl alcohol (PVA)

Hình 1.2 Cấu trúc phân tử của PVA

Polyvinyl alcohol (PVA) (C2H3OH)x là một polimer tổng hợp dễ hòa tan trong nước PVA là dạng màng film lý tưởng, có thể chuyển thành dạng keo bám dính tốt, không mùi, không độc, chịu được dầu mỡ và nhiều dung môi hữu cơ Màng PVA mềm dẻo, có khả năng co dãn tùy thuộc độ ẩm

1.8.3 Màng Cellophane

Cellophane là một dẫn xuất của cellulose được tạo thành bằng phản ứng của cellulose hòa tan trong alkali và carbon disulfide tạo thành dung dịch keo, sau đó ép qua khe nhỏ vào các bể hóa chất làm giảm sulfuric acid, sodium sulfate Màng cellophane mỏng trong suốt, thấm ít đối với không khí, nước Màng cellophane được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực: thực phẩm, y tế, công nghiệp

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử của cellophane

Các loại màng CMC, PVA, cellophane đều dễ phân hủy, có thể coi là loại màng thân thiện với môi trường, là lựa chọn tốt cho nhiều mục đích sử dụng

1.9 CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

1.9.1 CÁC NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC

Ở Việt Nam, nhiều bệnh viện hoặc phòng xét nghiệm đã sử dụng từ các que thử đơn giản cho đến các bộ kit giá thành cao để xác định có nhiễm bệnh hay không hoặc bệnh ở mức độ cần điều trị hay chưa Ví dụ: xét nghiệm lao, HIV, viêm gan

HBV, HCV, bằng ELISA, PCR, Real-Time PCR Các bộ kit này phần lớn là nhập

từ nước ngoài hoặc một số rất ít được sản xuất trong nước [1] Cho đến nay, việc chế tạo các loại kit xét nghiệm nói chung và thẻ xét nghiệm nói riêng ở nước ta còn tương đối mới mẻ, rất ít các bộ kit dạng thẻ được chế tạo và chưa có nghiên cứu tạo thẻ xét nghiệm nhóm máu hệ ABO Nguyên nhân có thể là do đây là một xét nghiệm đơn giản, giá thành cho một xét nhiệm thấp, do đó muốn chế tạo kit dạng thẻ thì phải đáp ứng yêu cầu đầu tiên là giá thành phải thấp hơn nhiều so với giá xét nghiệm thường quy và thấp hơn giá xét nghiệm theo qui định của Bộ Y tế

Trong các phòng xét nghiệm tại các bệnh viện, việc định nhóm máu hệ ABO phần lớn được làm theo phương pháp huyết thanh mẫu và hồng cầu mẫu trên phiến kính, đá men hoặc ống nghiệm Gần đây, các xét nghiệm thực hiện với máy xét nghiệm sinh hóa tự động thường chỉ làm với số mẫu lớn không thích hợp cho xét nghiệm những trường hợp đơn lẻ cần kết quả ngay, giá thành đầu tư mua máy rất cao, cần có xét nghiệm viên được đào tạo chuyên nghiệp Gần đây đã có một số công ty bắt đầu cung cấp các bộ kit dạng thẻ xét nghiệm định nhóm máu nhập ngoại, ví dụ Eldon card của Công ty Giải pháp khỏe Thái Dương, hoặc Bedside card Sifin của Công ty Deka Tuy nhiên, các phòng xét nghiệm sinh hóa chưa thể đưa vào sử dụng xét nghiệm cho bệnh nhân do giá thành còn quá cao so với xét nghiệm bằng phương pháp truyền thống

Kit xét nghiệm dạng thẻ tương đối đơn giản, an toàn cho người sử dụng, hạn chế sự lây nhiễm bệnh cho cả các nhân viên y tế đặc biệt trong thời điểm hiện nay khi nhiều bệnh nguy hiểm truyền nhiễm qua đường máu ngày càng gia tăng Thẻ xét nghiệm định nhóm máu hệ ABO, Rh có thể sử dụng tại nhà nhờ tính đơn giản, dễ sử dụng, đọc kết quả bằng mắt thường không cần đến các trang thiết bị đặc biệt

1.9.2 CÁC NGHIÊN CỨU CỦA NƯỚC NGOÀI

Có nhiều phương pháp xác định nhóm máu trên các mẫu khác nhau: mẫu nước bọt, nước tiểu, các loại mô khác nhau [29] Các xét nghiệm định nhóm máu trên các mẫu nước bọt, nước tiểu, tóc thường được sử dụng trong lĩnh vực hình sự Trong xét nghiệm định nhóm máu tại nhà hoặc kiểm chứng hoà hợp trong truyền

máu, người ta thường dùng các kit xét nhiệm trên mẫu máu Có nhiều phương pháp xác định nhóm máu khác nhau như: phản ứng ngưng kết, ELISA, PCR xác định chính xác kiểu gen qui định nhóm máu [1]

Trên nguyên lý của các phương pháp đó, nhiều loại kit xét nghiệm đã được nghiên cứu và phát triển Loại kit xét nghiệm định nhóm máu đơn giản dựa trên nguyên tắc của phản ứng ngưng kết thường được làm ở dạng thẻ xét nghiệm dạng

PKTM [23], thẻ định nhóm máu Eldon Card [17], hoặc thẻ xét nghiệm dạng ống (Ortho Gelcard của Mỹ [48]) hoặc dạng que nhúng dipstick [46] cũng được nghiên cứu

Thẻ xét nghiệm định nhóm máu đầu tiên được đăng ký bản quyền vào năm

1956 của Knud Erik Harboe Eldon Thẻ Eldon xác định nhóm máu dựa trên phương pháp huyết thanh mẫu, sử dụng kháng thể khô phủ lên màng cellophane, cellulose acetat, polyvinyl chloride, polymethyl acrylates Bề mặt của thẻ xét nghiệm được phủ một lớp màng gelatin để bảo quản thẻ [17]

Lapierre, Y và cs (1990) đã nghiên cứu phương pháp sử dụng hỗn hợp gồm gel, dung dịch đệm và thuốc thử trong tube để xác định phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể của máu Tùy theo từng xét nghiệm cụ thể, các tác giả bổ sung hỗn hợp gel (huyết thanh chứa kháng thể globulin hoặc anti-A, anti-B, anti-D) hoặc hỗn hợp gel trung tính [37] Nhiều loại màng sợi polymer được ứng dụng chế tạo thẻ xét nghiệm nhóm máu trong nghiên cứu của Euan R Tovey (1989) như màng polyvinyldifluoride, polytetrafluoroethylene, modified nilon, nitrocellulose, regenerated cellulose, cellulose [25]

Nghiên cứu của Du Chesne A (1992) cho thấy vai trò của thẻ định nhóm máu không chỉ trong truyền máu mà còn được sử dụng trong công tác điều tra Khi máu tươi không có sẵn trong chiết xuất răng, tóc , mẫu máu trên thẻ định nhóm máu lấy

từ hồ sơ y tế của nạn nhân được sử dụng Sau đó, Du Chesne A sử dụng phương pháp PCR đối với mẫu máu trên, tiến hành so sánh giữa mẫu máu trên thẻ định nhóm máu và một mẫu máu tươi của bệnh nhân và đã thu được kết quả chính xác [19]

Để cải thiện sự an toàn của thu gom máu trong các bệnh viện và phòng xét nghiệm, Anderson DR và cộng sự (2000) đã nghiên cứu chế tạo tube sử dụng poly ethylene terephthalate (PET) Sau đó so sánh độ chính xác giữa xét nghiệm nhóm máu hệ ABO và Rh trong ống tube và ống thủy tinh Nghiên cứu cũng chứng minh mẫu máu được thu thập bằng ống tube, chống đông bằng EDTA và bảo quản lại vẫn

có thể sử dụng sau 28 ngày [11]

Nghiên cứu độ tin cậy khi xử dụng thẻ xét nghiệm nhóm máu, Felix Giebel (2008) đã so sánh khả năng ngưng kết, ghi nhãn, xử lý, và an toàn đối với người sử dụng khi xét nghiệm nhóm máu hệ ABO giữa 4 loại thẻ: ABO-trol®forte I, Eldon®

2511, Medtrokarte® NK4 và Serafol® ABO+D Các nhóm máu ABO được xác định chính xác trong các trường hợp khác nhau Thẻ xét nghiệm ABO-trol®forte I, Medtrokarte® NK4 và Serafol® ABO+D có giá trị hiển thị nổi bật, độ sắc nét của ngưng kết cao (1,7-1,9 so với 2,4 của thẻ Eldon® 2511) Tuy nhiên, khả năng ghi nhãn, xử lý và an toàn đối với người sử dụng của thẻ Eldon® 2511 và Serafol® ABO+D cao hơn 2 thẻ còn lại Khả năng phân tích của 4 loại thẻ xét nghiệm không

có sự khác biệt đáng chú ý Kết quả cho thấy, khả năng ngưng kết, ghi nhãn, xử lý,

và độ an toàn khi sử dụng thẻ Serafol® ABO+D cao nhất trong nghiên cứu [26]

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT

Kháng thể sử dụng cho nghiên cứu này bao gồm huyết thanh mẫu anti-A, anti-B, anti-AB, anti-D của hãng Spinreact (Tây Ban Nha)

Nguyên liệu chế tạo thẻ: Cellophane (dạng băng), Polyvinyl alcohol (PVA) (dạng bột), Cacboxymethylcellulose (CMC) (dạng hạt)

Các loại hóa chất sử dụng: H2O, ethanol, EDTA, heparin, hồng cầu rửa, CPDA, CPD

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp tạo màng

Trong phạm vi phòng thí nghiệm, khi hòa tan màng CMC và PVA cần xác định lượng CMC, PVA thích hợp, hòa tan trong nước, đun cách thủy trong nước cho đến khi tan hoàn toàn Sau đó, nhỏ lượng dung dịch lên giá thể, làm khô trong

tủ sấy Sau khi làm khô tạo một lớp màng film trong suốt trên bề mặt giá thể

Đối với màng cellophane, nghiên cứu sử dụng màng cellophane dạng băng (tape) sẵn có trên thị trường để thử nghiệm Màng trong suốt có chiều dày 0,1mm gồm lớp chất dính bằng cao su tổng hợp

2.2.2 Phương pháp xác định nhóm máu

Phương pháp huyết thanh mẫu

- Dùng huyết thanh mẫu đã biết trước kháng thể để tìm kháng nguyên nhóm máu trên màng hồng cầu

- Trộn huyết thanh mẫu với máu người thử, dựa vào hiện tượng ngưng kết hay không ngưng kết mà người ra tìm ra kháng nguyên trên màng hồng cầu và từ đó xác định được nhóm máu

Phản ứng chéo

Lấy hồng cầu rửa người cho trộn với huyết thanh người nhận vào trong một ống nghiệm và lấy huyết thanh người cho trộn với hồng cầu rửa người nhận vào

trong một ống nghiệm Quan sát trên kính hiển vi hiện tượng ngưng kết hồng cầu Nếu không có hiện tượng ngưng kết hồng cầu trong cả hai ống nghiệm thì kết luận hai nhóm máu là hoà hợp và truyền được cho nhau

2.3.1 Lấy mẫu

Sử dụng máu lấy từ bệnh nhân để xét nghiệm ngay hoặc lấy máu có sử dụng chất chống đông EDTA bảo quản không quá 14 ngày trong oxalate hoặc heparin trong 2 ngày ở 2-80

C Máu rã đông không sử dụng được trong xét nghiệm này Loại

bằng đến nhiệt độ phòng mới sử dụng để xét nghiệm Máu người cho bảo quản trong CPD, CPDA-1

Sử dụng que trộn khuấy đều máu với kháng thể Rửa sạch hoặc thay que trộn mới cho mỗi vị trí phản ứng để tránh lẫn kháng thể

Xoay thẻ chuyển động vòng tròn trong 30 giây để các giọt máu chuyển động quanh vị trí phản ứng

Quan sát sự ngưng kết trên vị trí xét nghiệm và đọc ghi kết quả trên thẻ

2.3.3 Đọc kết quả

Kết quả xét nghiệm: Ngưng kết: phản ứng dương tính (+); không có ngưng kết: phản ứng âm tính (-) Thông thường các mẫu có phản ứng ngưng kết có thể quan sát được kết quả bằng mắt thường ngay sau khi hồng huyết cầu được trộn lẫn với huyết thanh mẫu khoảng 2-3 giây Một số trường hợp phản ứng yếu, quan sát sự ngưng kết sau 1 đến 2 phút hoặc quan sát dưới kính hiển vi

Bảng 2.1 Kết quả kiểm chứng nhóm máu