nghiên cứu một số loại màng sử dụng trong chế tạo kit xác định nhóm máu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM  NGUYỄN ĐỨC HÙNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ LOẠI MÀNG SỬ DỤNG TRONG CHẾ TẠO KIT XÁC ĐỊNH NHÓM MÁU LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN, NĂM 2012 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẬM  NGUYỄN ĐỨC HÙNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ LOẠI MÀNG SỬ DỤNG TRONG CHẾ TẠO KIT XÁC ĐỊNH NHÓM MÁU Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. THẨM THỊ THU NGA THÁI NGUYÊN, NĂM 2012 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Thẩm Thị Thu Nga, phòng Công nghệ Gen động vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã định hƣớng nghiên cứu, hƣớng dẫn thí nghiệm, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện về hóa chất cũng nhƣ trang thiết bị nghiên cứu để tôi hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Công nghệ Gen động vật, Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ tôi tận tình trong suốt quá trình làm luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa Sinh - KTNN, Khoa Sau đại học, trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học Thái Nguyên cùng các thầy cô giáo đã nhiệt tình giảng dạy và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn những ngƣời thân trong gia đình và bạn bè đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập. Thái Nguyên, tháng 4 năm 2012 Học viên Nguyễn Đức Hùng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACD CMC CPD CPDA Cs DEAE EDTA ELISA HBV HCV HIV Ig Nxb PA PCR PLA PVA BSA Axit citrate dextrose Carboxyl methyl cellulose Citrate, phosphat, dextrose Citrate, phosphat, dextrose, adenin Cộng sự Diethylaminoethyl cellulose Ethylene diamine tetraacetic axit Enzyme-linked immuno sorbent assay Hepatitis B virus Hepatitis C virus Human immunodeficiency virus Immunoglobulin Nhà xuất bản Poly acrylate Polymerase chain reaction Polylactic axit Polyvinyl alcohol Bovine serum albumin Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. MÁU VÀ CHỨC NĂNG CỦA MÁU 3 1.1.1. Định nghĩa 3 1.1.2. Khối lƣợng của máu Error! Bookmark not defined. 1.2. PHÂN LOẠI NHÓM MÁU 3 1.2.1. Hệ thống nhóm máu ABO 4 1.2.2. Hệ thống nhóm máuRh 5 1.3. KHÁNG NGUYÊN, KHÁNG THỂ 6 1.3.1. Kháng nguyên (antigen) 6 1.3.2. Kháng thể (antibody) 7 1.4. CÔNG TÁC TRUYỀN MÁU TRÊN THẾ GIỚI 7 1.4.1. Lịch sử công tác truyền máu 8 1.4.2. Truyền máu hiện đại 8 1.5. AN TOÀN TRUYỀN MÁU 8 1.6. CÁC PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH NHÓM MÁU 11 1.7. MỘT SỐ NGUYÊN NHÂN GÂY BẤT THƢỜNG TRONG XÁC ĐỊNH NHÓM MÁU BẰNG PHƢƠNG PHÁP HUYẾT THANH MẪU 12 1.7.1. Phản ứng yếu 12 1.7.2. Bệnh lý 13 1.7.3. Các nguyên nhân khác 13 1.8. NGUYÊN LIỆU TẠO MÀNG TRONG CHẾ TẠO THẺ XÉT NGHIỆM NHÓM MÁU 14 1.9. CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƢỚC 15 1.9.1.CÁC NGHIÊN CỨU TRONG NƢỚC 15 1.9.2.CÁC NGHIÊN CỨU CỦA NƢỚC NGOÀI 16 CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 19 2.1. NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT 19 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.3. HƢỚNG DẪN SỬ DỤNG THẺ XÉT NGHIỆM 20 2.3.1. Lấy mẫu 20 2.3.2. Qui trình xét nghiệm 20 2.3.3. Đọc kết quả 21 2.3.4. Ƣu điểm của xét nghiệm trên thẻ 22 2.3.5. Hạn chế của phƣơng pháp xét nghiệm trên thẻ 22 2.4. HƢỚNG DẪN CỤ THỂ CHO THU THẬP MÁU, CÁC THÀNH PHẦN VÀ CÁC CHẾ PHẨM MÁU 23 2.5. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 25 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1. NGHIÊN CỨU PHỦ KHÁNG THỂ LÊN MỘT SỐ LOẠI MÀNG 26 3.1.1. Màng cellophane 26 3.1.2. Màng Cacboxymethylcellulose (CMC) 28 3.1.3. Màng Polyvinyl alcolhol (PVA) 31 3.2. NGHIÊN CỨU PHỦ KHÁNG THỂ ANTI-A, ANTI-B LÊN MÀNG 35 3.3. NGHIÊN CỨU XÉT NGHIỆM KIỂM CHỨNG TỰ ĐỘNG LÀM SONG SONG VỚI XÉT NGHIỆM TRÊN THẺ 38 3.4. SO SÁNH ĐỘ NHẠY VÀ ĐỘ CHÍNH XÁC CỦA THẺ VỚI CÁC PHƢƠNG PHÁP KHÁC 39 3.5. NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN BẢO QUẢN THẺ, CÁC HÓA CHÁT VÀ DỤNG CỤ KÈM THEO 41 3.6. GIÁ THÀNH SẢN PHẨM 43 3.7. TÍNH MỚI CỦA ĐỀ TÀI 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Đặc điểm các nhóm máu hệ ABO và tỉ lệ ở Việt Nam 4 Bảng 1.2. Đặc điểm nhóm máu hệ Rhesus và tỉ lệ ở Việt Nam 5 Bảng 2.1. Kết quả kiểm chứng nhóm máu 21 Bảng 2.2. Độ nhạy của thẻ xét nghiệm khi xác định với nhóm máu A 23 Bảng 2.3. Độ nhạy của thẻ xét nghiệm khi xác định với nhóm máu B 23 Bảng 2.4. Độ nhạy của thẻ xét nghiệm khi xác định với nhóm máu AB 24 Bảng 2.5. Độ nhạy của thẻ xét nghiệm khi xác định với nhóm máu O 24 Bảng 3.1. Độ nhạy và độ đặc hiệu của thẻ xét nghiệm đƣợc ép màng cellophane 27 Bảng 3.2. Độ nhạy của thẻ xét nghiệm với các nồng độ CMC khác nhau 29 Bảng 3.3. Độ nhạy và độ đặc hiệu của thẻ xét nghiệm đƣợc ép màng CMC 31 Bảng 3.4. Độ nhạy của thẻ xét nghiệm với các nồng độ PVA khác nhau 32 Bảng 3.5. Độ nhạy và độ đặc hiệu của thẻ xét nghiệm đƣợc ép màng PVA 34 Bảng 3.6. Độ nhạy của thẻ sử dụng các loại màng Cellophane, CMC, PVA 35 Bảng 3.7. Độ nhạy của thẻ xét nghiệm với lƣợng kháng thể khác nhau 38 Bảng 3.8. So sánh độ nhạy và độ đặc hiệu của thẻ xét nghiệm với phƣơng pháp xét nghiệm trên phiến kính và xét nghiệm trong tube .40 Bảng 3.9. Thời hạn sử dụng thẻ xét nghiệm 42 Bảng 3.10. Giá thành sản xuất 1 thẻ xét nghiệm nhóm máu do đề tài sản xuất .43 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc phân tử của màng CMC 14 Hình 1.2. Cấu trúc phân tử của PVA 14 Hình 1.3. Cấu trúc phân tử của cellophane 15 Hình 3.1. Phủ kháng thể lên màng cellophane 27 Hình 3.2. Xét nghiệm trên thẻ ép màng cellophane 27 Hình 3.3. Phủ màng CMC lên bề mặt của thẻ xét nghiệm 30 Hình 3.4. Xét nghiệm trên thẻ ép màng CMC 2% 30 Hình 3.5. Xét nghiệm trên thẻ ép màng CMC 3% 30 Hình 3.6. Phủ màng PVA lên bề mặt của thẻ xét nghiệm 32 Hình 3.7. Xét nghiệm trên thẻ ép màng PVA 3% 33 Hình 3.8. Xét nghiệm trên thẻ ép màng PVA 5% 33 Hình 3.10. Phủ kháng thể lên màng CMC 2% 36 Hình 3.11. Xét nghiệm trên màng CMC với 20µl kháng thể 37 Hình 3.12. Xét nghiệm trên màng CMC với 30µl kháng thể 37 Hình 3.13. Xét nghiệm trên màng CMC với 40µl kháng thể 37 Hình 3.14. Mẫu đối chứng không bị vẩn đục. 39 Hình 3.15. Mẫu đối chứng bị vẩn đục. 39 Hình 3.16. Xét nghiệm nhóm máu trên phiến 39 Hình 3.17. Xét nghiệm nhóm máu trong tube 39 Hình 3.18. Xét nghiệm nhóm máu bằng thẻ EldonCard 41 Hình 3.19. Thẻ xét nghiệm nhóm máu ABO+D do đề tài sản xuất 42 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1 MỞ ĐẦU 1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Theo Quy chế truyền máu do Bộ Y tế ban hành ngày 19 tháng 1 năm 2007, định nhóm máu hệ ABO tại giƣờng bệnh là một xét nghiệm bắt buộc nhằm phòng tránh tai biến tan máu cấp trong lòng mạch do truyền nhầm nhóm máu [1]. Trên bề mặt hồng cầu ngƣời có 30 kháng nguyên thƣờng gặp và hàng trăm kháng nguyên khác nhƣng đều là kháng nguyên có tính miễn dịch yếu. Các kháng nguyên xếp thành hệ thống các nhóm máu ABO, Rh, Lewis, MNSs, P, Kell Trong số này có hai hệ thống nhóm máu ABO và Rh đóng vai trò đặc biệt quan trọng trong truyền máu [6]. Sự không tƣơng thích về mặt miễn dịch trong hệ nhóm máu ABO là nguy cơ đe dọa nhiều nhất trong y học truyền máu [49]. Những biến chứng ở ngƣời bệnh do truyền nhầm nhóm máu thƣờng do lỗi xảy ra trong quá trình xét nghiệm máu [35]. Định nhóm máu đầu giƣờng đƣợc thực hiện trƣớc khi truyền máu và nằm trong luật y tế của nhiều nƣớc trên thế giới. Vấn đề quan trọng trong định nhóm máu đầu giƣờng đối với hệ nhóm máu ABO là khả năng tƣơng thích, tính chính xác của các xét nghiệm [15], [20]. Điều này phụ thuộc vào độ chính xác của các thiết bị xét nghiệm. Do vậy, các quyết định truyền nhầm nhóm máu do lỗi kỹ thuật và hiệu suất sử dụng thiết bị nghèo nàn [44]. Để bảo đảm an toàn truyền máu về mặt miễn dịch, mọi phòng xét nghiệm phát máu đều định nhóm máu hệ ABO, hệ Rh và các hệ nhóm máu hồng cầu khác, xác định kháng thể bất thƣờng, tiến hành phản ứng hoà hợp ở các điều kiện, nhiệt độ khác nhau và thực hiện quy trình truyền máu đúng. Ở Việt Nam, chúng ta chỉ định đƣợc nhóm máu hệ ABO, làm phản ứng chéo ở nhiệt độ 22 0 C nên an toàn truyền máu về mặt miễn dịch vẫn còn hạn chế [1]. Trên thế giới, thẻ định nhóm máu Eldoncard A/S bắt đầu đƣợc sử dụng từ năm 1956. Việc định nhóm máu ABO, Rh đƣợc thực hiện dễ dàng và trong thời gian ngắn. Thẻ định nhóm máu cho phép ngƣời sử dụng nhận biết đƣợc nhóm máu họ là A, O, B hay AB, Rh(-) hay Rh(+) [17]. Việc xác định tình trạng nhóm máu Rh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2 ở phụ nữ mang thai cũng rất quan trọng. Nếu phụ nữ mang thai có Rh(-), bào thai có Rh(+), hệ miễn dịch của ngƣời mẹ sẽ tấn công các tế bào hồng cầu của bào thai, dẫn đến làm ngƣng kết hồng cầu của thai nhi. Tùy theo mức độ ngƣng kết dẫn đến sẩy thai hoặc thai chết [23]. Tại Việt Nam, đã có một số công ty bắt đầu cung cấp các bộ kit dạng thẻ xét nghiệm định nhóm máu nhập. Tuy nhiên, các phòng xét nghiệm sinh hóa chƣa thể đƣa vào sử dụng xét nghiệm cho bệnh nhân do giá thành còn quá cao so với xét nghiệm bằng phƣơng pháp truyền thống [1]. Vậy yêu cầu đặt ra là phải tạo ra đƣợc thẻ định máu ABO, Rh, đáp ứng nhu cầu sử dụng trong nƣớc. Để góp phần vào việc tạo ra thẻ định máu ABO, Rh, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “NGHIÊN CỨU MỘT SỐ LOẠI MÀNG SỬ DỤNG TRONG CHẾ TẠO KIT XÁC ĐỊNH NHÓM MÁU ”. 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Tạo đƣợc thẻ xác định nhóm máu hệ ABO và hệ Rh. - Xác định độ nhạy và độ chính xác của thẻ xét nghiệm nhóm máu do đề tài sản xuất. - Xác định điều kiện bảo quản thẻ định nhóm máu. 3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Xác định loại màng thích hợp để gắn kháng thể anti-A, anti-B, anti-D. - Xác định hàm lƣợng kháng thể thích hợp đƣa lên màng. - Nghiên cứu xét nghiệm kiểm chứng tự động làm song song với xét nghiệm trên thẻ để dựa vào đó đánh giá kết quả xét nghiệm. - So sánh độ nhạy và độ chính xác của thẻ với các phƣơng pháp khác. - Nghiên cứu điều kiện bảo quản thẻ, các hóa chất và dụng cụ kèm theo. - Hƣớng dẫn cụ thể cho thu thập máu, các thành phần của máu và các chế phẩm máu. [...]... 2.2.1 Phng phỏp to mng Trong phm vi phũng thớ nghim, khi hũa tan mng CMC v PVA cn xỏc nh lng CMC, PVA thớch hp, hũa tan trong nc, un cỏch thy trong nc cho n khi tan hon ton Sau ú, nh lng dung dch lờn giỏ th, lm khụ trong t sy Sau khi lm khụ to mt lp mng film trong sut trờn b mt giỏ th i vi mng cellophane, nghiờn cu s dng mng cellophane dng bng (tape) sn cú trờn th trng th nghim Mng trong sut cú chiu dy... thng c s dng trong lnh vc hỡnh s Trong xột nghim nh nhúm mỏu ti nh hoc kim chng ho hp trong truyn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 17 mỏu, ngi ta thng dựng cỏc kit xột nhim trờn mu mỏu Cú nhiu phng phỏp xỏc nh nhúm mỏu khỏc nhau nh: phn ng ngng kt, ELISA, PCR xỏc nh chớnh xỏc kiu gen qui nh nhúm mỏu [1] Trờn nguyờn lý ca cỏc phng phỏp ú, nhiu loi kit xột nghim... ngy trong oxalate hoc heparin trong 2 ngy 2-80C Mỏu ró ụng khụng s dng c trong xột nghim ny Loi b nhng mỏu cú vn c, nhim khun hoc b ta Mu gi 2-80C cn cõn bng n nhit phũng mi s dng xột nghim Mỏu ngi cho bo qun trong CPD, CPDA-1 2.3.2 Qui trỡnh xột nghim M bao gúi v ly th xột nghim ra, in y cỏc thụng tin cn thit Nh 1 git nc mui sinh lý 0,9% vo tng v trớ phn ng trờn th Gi th chuyn ng vũng trũn trong. .. b kit ny phn ln l nhp t nc ngoi hoc mt s rt ớt c sn xut trong nc [1] Cho n nay, vic ch to cỏc loi kit xột nghim núi chung v th xột nghim núi riờng nc ta cũn tng i mi m, rt ớt cỏc b kit dng th c ch to v cha cú nghiờn cu to th xột nghim nhúm mỏu h ABO Nguyờn nhõn cú th l do õy l mt xột nghim n gin, giỏ thnh cho mt xột nhim thp, do ú mun ch to kit dng th thỡ phi ỏp ng yờu cu u tiờn l giỏ thnh phi thp... chuyn trong h thng mch Mỏu cựng vi bch huyt, dch gian bo v dch nóo ty to thnh mụi trng trong c th Mỏu l thnh phn quan trng nht ca mụi trng bờn trong c th v m nhim nhiu chc nng sinh lý khỏc nhau [2] 1.1.2 Thnh phn ca mỏu Mỏu gm hai thnh phn: th hu hỡnh (huyt cu) v huyt tng Cỏc th hu hỡnh ca mỏu l hng cu, bch cu v tiu cu, chim 43 - 45% tng s mỏu, ch s ny c gi l hematocrit Hng cu l thnh phn chim ch yu trong. .. 1.7.3 Cỏc nguyờn nhõn khỏc Phn ng dng tớnh gi xy ra khi cú autoantibody phn ng lnh trong huyt thanh Trong trng hp ny ra hng cu 370C bng dung dch saline trc khi thc hin phn ng Trng hp dng tớnh gi cng cú th xy ra do hng huyt cu nhim khun õy l nhng hn ch trong quỏ trỡnh xột nghim khụng ch trờn th m ngay c phng phỏp thng qui trong phũng xột nghim cng gp phi Phn ng hn hp bao gm c s ngng kt v khụng ngng kt:... dng 1.9 CC NGHIấN CU TRONG V NGOI NC 1.9.1 CC NGHIấN CU TRONG NC Vit Nam, nhiu bnh vin hoc phũng xột nghim ó s dng t cỏc que th n gin cho n cỏc b kit giỏ thnh cao xỏc nh cú nhim bnh hay khụng hoc bnh mc cn iu tr hay cha Vớ d: xột nghim lao, HIV, viờm gan S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 16 HBV, HCV, bng ELISA, PCR, Real-Time PCR Cỏc b kit ny phn ln l nhp t... Nam Tờn nhúm Khỏng nguyờn trờn Khỏng th trong T l mỏu mng hng cu huyt thanh A A Chng b 21,5 B B Chng a 29,5 AB A v B Khụng cú a v b 6 O Khụng cú A, B Chng a v chng b 43 Ngun: Trung Phn (2006)[4] C th nhúm mỏu A cú khỏng nguyờn A trờn b mt hng cu v cú khỏng th b (anti-B) trong huyt tng C th nhúm mỏu B cú khỏng nguyờn B trờn b mt hng cu v cú khỏng th a (anti-A) trong huyt tng C th nhúm mỏu AB cú khỏng... cp cỏc b kit dng th xột nghim nh nhúm mỏu nhp ngoi, vớ d Eldon card ca Cụng ty Gii phỏp khe Thỏi Dng, hoc Bedside card Sifin ca Cụng ty Deka Tuy nhiờn, cỏc phũng xột nghim sinh húa cha th a vo s dng xột nghim cho bnh nhõn do giỏ thnh cũn quỏ cao so vi xột nghim bng phng phỏp truyn thng Kit xột nghim dng th tng i n gin, an ton cho ngi s dng, hn ch s lõy nhim bnh cho c cỏc nhõn viờn y t c bit trong thi... khụng c Bt CMC d hỳt m, d hũa tan trong nc thnh dng keo, khụng hũa tan trong nhiu dung mụi methanol, ethanol, acetone, chloroform, benzene Hỡnh 1.1 Cu trỳc phõn t ca mng CMC 1.8.2 Polyvinyl alcohol (PVA) Hỡnh 1.2 Cu trỳc phõn t ca PVA S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 15 Polyvinyl alcohol (PVA) (C2H3OH)x l mt polimer tng hp d hũa tan trong nc PVA l dng mng film lý . MÀNG SỬ DỤNG TRONG CHẾ TẠO KIT XÁC ĐỊNH NHÓM MÁU ”. 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Tạo đƣợc thẻ xác định nhóm máu hệ ABO và hệ Rh. - Xác định độ nhạy và độ chính xác của thẻ xét nghiệm nhóm máu. NGUYỄN ĐỨC HÙNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ LOẠI MÀNG SỬ DỤNG TRONG CHẾ TẠO KIT XÁC ĐỊNH NHÓM MÁU Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH. phải tạo ra đƣợc thẻ định máu ABO, Rh, đáp ứng nhu cầu sử dụng trong nƣớc. Để góp phần vào việc tạo ra thẻ định máu ABO, Rh, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “NGHIÊN CỨU MỘT SỐ LOẠI MÀNG