Polyvinyl alcohol (PVA) ở dạng bột màu trắng không mùi, không vị, có khả năng tan trong nƣớc, dễ tạo màng, chịu dầu mỡ và dung môi, độ bền cao, khả năng kết dính tốt. Vì PVA thƣờng đƣợc hòa tan trong nƣớc trƣớc khi sử dụng nên khả năng tạo màng của PVA rất quan trọng trong hầu hết các ứng dụng. Màng và lớp phủ PVA không cần chu kỳ đóng rắn, sự tạo màng dễ dàng bằng cách cho nƣớc bay hơi khỏi dung dịch.
Hòa tan PVA trong nƣớc ở các nồng độ 1%, 3%, 5%, 7% và 10%. Sau khi làm khô, PVA tạo thành màng film trong suốt, bám dính vào thẻ tốt. Kết quả kiểm tra độ nhạy của thẻ xét nghiệm ở các nồng độ PVA khác nhau với 20 mẫu máu thu đƣợc nhƣ sau.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 3.4. Độ nhạy của thẻ xét nghiệm với các nồng độ PVA khác nhau
Nồng độ (%) Số mẫu (n) Kết quả đúng (n) Độ nhạy (%)
1% 20 18 90,00 3% 20 19 95,00
5% 20 20 100
7% 20 20 100
10% 20 19 95,00
Hình 3.6. Phủ màng PVA lên bề mặt của thẻ xét nghiệm
Khi hòa tan hoàn toàn trong nƣớc, PVA tạo thành dung dịch lỏng, ít nhớt nên thao tác phủ lên màng rất dễ dàng, kể cả dung dịch có nồng độ cao 10%. Tuy nhiên, ở nồng độ 1%, màng PVA dễ dàng thấm qua giá thể do nồng độ thấp, gây ảnh hƣởng đến kết quả. Độ nhạy ở nồng độ PVA 1% đạt 90,00%. Ở các nồng độ khác, kết quả xét nghiệm nhóm máu tốt, độ chính xác đạt 95,00%, thao tác phủ màng PVA nồng độ 5% và 7% tiến hành dễ dàng, thời gian làm khô nhanh và không có hiện tƣợng thấm qua bề mặt giá thể, do đó đạt độ chính xác 100% trong các xét nghiệm. Vì vậy, để đạt hiệu quả cao và tiết kiệm chi phí trong quá trình tạo thẻ, chúng tôi sử dụng màng PVA có nồng độ 5%.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.7. Xét nghiệm trên thẻ ép màng PVA 3%
1. Control; 2. Anti-A; 3- Anti-B; 4. Anti-D
Hình 3.8. Xét nghiệm trên thẻ ép màng PVA 5%
1. Control; 2. Anti-A; 3- Anti-B; 4. Anti-D
Hình 3.9. Xét nghiệm trên thẻ ép màng PVA 10%
1. Control; 2. Anti-A; 3- Anti-B; 4. Anti-D
1 2 3 4
1 2 3 4
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Nghiên cứu độ nhạy và độ đặc hiệu của thẻ xét nghiệm đƣợc phủ màng PVA 5%, kết quả thu đƣợc thể hiện trong bảng 3.5.
Bảng 3.5. Độ nhạy và độ đặc hiệu của thẻ xét nghiệm đƣợc ép màng PVA
Số mẫu (n) Độ nhạy (%) Độ đặc hiệu (%)
Nhóm A 30 100 100 Nhóm B 27 96,30 100 Nhóm AB 18 100 100 Nhóm O 49 91,84 100 Nhóm Rh(+) 20 100 100 Nhóm Rh(-) 4 100 100 Trung bình 98,02 100
Xét nghiệm 49 nhóm máu O trên thẻ ép màng PVA thu đƣợc 45 mẫu dƣơng tính thật, độ nhạy đạt 91,84%. Trong 27 xét nghiệm nhóm máu B, nghiên cứu kiểm chứng đƣợc 26 mẫu dƣơng tính thật, độ nhạy 96,30%. Các xét nghiệm nhóm máu A, AB, Rh(+), Rh(-) đều cho độ nhạy 100%. Lặp lại thí nghiệm cho thấy các kết quả trên chính xác. Do đó, độ đặc hiệu đạt 100%.
Sau khi nghiên cứu gắn kháng thể lên màng cellophane, màng CMC và màng PVA, chúng tôi tiến hành so sánh kết quả thu đƣợc sau khi kiểm tra độ nhạy của thẻ.
Khi nhỏ kháng thể lên màng cellophane, màng CMC và màng PVA, do tính không thấm nƣớc nên kháng thể không thấm rộng ra bên ngoài. Thao tác trên màng CMC khó khăn hơn so với thao tác trên màng PVA. Khi hòa tan trong dung môi, màng CMC có dạng dung dịch keo, do đó cần lƣu ý trong quá trình tạo màng CMC. Tuy nhiên, khi nhỏ kháng thể và huyết thanh mẫu lên màng CMC lại dễ dàng và thuận tiện hơn so với màng PVA. Có thể nhỏ toàn bộ lƣợng kháng thể cần cho lên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
màng cùng một lúc, sau đó làm khô bằng nhiệt hoặc hút chân không. Thời gian làm khô từ 30 đến 50 phút.
Bảng 3.6. Độ nhạy của thẻ sử dụng các loại màng Cellophane, CMC, PVA
Nhóm máu Số mẫu (n) Màng Cellophane (%) CMC (%) PVA (%) Nhóm A 30 96,67 93,33 100 Nhóm B 27 96,30 100 96,30 Nhóm AB 18 94,44 100 100 Nhóm O 49 100 100 91,84 Nhóm Rh(+) 20 100 95,00 100 Nhóm Rh(-) 4 100 100 100 Trung bình 97,90 98,06 98,02
Qua số liệu bảng 3.6, sử dụng màng cellophane, màng CMC và PVA cho độ nhạy lần lƣợt là 97,90%, 98,06%, 98,02%; độ đặc hiệu là 100%. Xét nghiệm nhóm máu trên thẻ phủ màng CMC cho độ nhạy trung bình cao nhất (98,06%), thời gian làm khô nhanh, thao tác dễ dàng và không bị biến tính dƣới nhiệt độ cao. Do đó, tôi sử dụng màng CMC có nồng độ 2%trong các nghiên cứu tiếp theo.
3.2. NGHIÊN CỨU PHỦ KHÁNG THỂ ANTI-A, ANTI-B, ANTI-D LÊN MÀNG
Trên thế giới, nghiên cứu chế tạo thẻ xét nghiệm định nhóm máu ABO đã tiến hành từ năm 1950. Tại Việt Nam, một số công ty bắt đầu cung cấp các bộ kit xét nghiệm định nhóm máu nhập ngoại. Đây là một bộ kit tƣơng đối đơn giản, dễ sử dụng, tuy nhiên giá thành còn cao. Qua nghiên cứu nhiều tài liệu về các bộ kit dạng thẻ và dạng ống, chúng tôi quyết định chế tạo bộ kit này ở dạng thẻ, nhằm đơn giản
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
hoá cho ngƣời sử dụng và hạ giá thành sản phẩm để có thể cạnh tranh với các sản phẩm khác đã có trên thị trƣờng.
Xét nghiệm định nhóm máu ABO, Rh dựa trên phản ứng ngƣng kết của kháng thể với kháng nguyên hữu hình, do đó có thể dễ dàng quan sát bằng mắt thƣờng. Đây là một xét nghiệm nhanh, đơn giản hơn so với nhiều xét nghiệm khác do chỉ cần phủ duy nhất một kháng thể lên màng và phản ứng thực hiện tại chỗ ngay tại điểm tra mẫu không cần sự dịch chuyển bằng mao dẫn tới vị trí đọc kết quả.
Việc phủ kháng thể lên màng có thể sử dụng cách nhỏ trực tiếp kháng thể lên bề mặt màng hoặc chuyển lên màng bằng phƣơng pháp điện di và lai. Chuyển kháng thể lên màng bằng cách lai có ƣu điểm là kháng thể đƣợc phân tách thành các băng riêng biệt qua bƣớc điện di, tách rời đƣợc các băng protein tạp do đó kháng thể đƣa lên màng sẽ sạch hơn. Nhƣng chuyển kháng thể bằng phƣơng pháp này có hạn chế là tăng khả năng biến tính của kháng thể, làm giảm khả năng gây ngƣng kết. Vì vậy chúng tôi sử dụng phƣơng pháp nhỏ trực tiếp kháng thể lên màng. Thực hiện theo phƣơng pháp này nhanh và đơn giản nhƣng phải sử dụng kháng thể đã tinh sạch. Sử dụng micropipette hoặc ống capillary chấm lên màng từng lƣợng nhỏ kháng thể cho đến hết lƣợng kháng thể cần cho lên màng. Không để kháng thể lan rộng quá vòng tròn có đƣờng kính 1cm bằng cách làm khô bằng đèn hồng ngoại hoặc trong tủ sấy.
Hình 3.10. Phủ kháng thể lên màng CMC 2%
1. Control; 2. Anti-A; 3- Anti-B; 4. Anti-D
Việc thử nghiệm phủ kháng thể lên màng đƣợc tiến hành với 3 thể tích khác nhau: 20µl, 30µl, 40µl. Sau đó, tiếp tục phủ 15µl BSA 22% lên màng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.11. Xét nghiệm trên màng CMC với 20µl kháng thể
1. Control; 2. Anti-A; 3- Anti-B; 4. Anti-D
Hình 3.12. Xét nghiệm trên màng CMC với 30µl kháng thể
1. Control; 2. Anti-A; 3- Anti-B; 4. Anti-D
Hình 3.13. Xét nghiệm trên màng CMC với 40µl kháng thể
1. Control; 2. Anti-A; 3- Anti-B; 4. Anti-D
Qua số liệu bảng 3.7, thẻ phủ 20µl kháng thể cho kết quả xét nghiệm ở hệ nhóm máu ABO và Rh đạt 94,07%. Do lƣợng kháng thể phủ lên thẻ quá ít nên kết quả không rõ ràng, khó quan sát bằng mắt thƣờng. Thẻ phủ 40µl kháng thể cho kết quả quan sát bằng mắt thƣờng cho kết quả 96,30%, tuy nhiên thời gian làm khô lâu,
1 2 3 4
1 2 3 4
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
lƣợng huyết thanh nhiều, do đó kết quả thu đƣợc chậm. Đồng thời, lƣợng huyết thanh phủ lên màng nhiều hơn lƣợng kháng thể đã phủ trƣớc đó nên cho kết quả không chính xác. Với thẻ phủ 30µl kháng thể cho kết quả đạt 97,79% do thời gian làm khô nhanh, dễ dàng quan sát kết quả bằng mắt thƣờng, đồng thời tiết kiệm chi phí sản xuất.
Bảng 3.7. Độ nhạy của thẻ xét nghiệm với lƣợng kháng thể khác nhau
Nhóm máu Số mẫu (n) Lƣợng kháng thể phủ lên màng 20µl 30µl 40µl Nhóm A 18 88,89 94,44 83,33 Nhóm B 13 92,31 92,31 100 Nhóm AB 18 94,44 100 94,44 Nhóm O 16 93,75 100 100 Nhóm Rh(+) 20 95,00 100 100 Nhóm Rh(-) 4 100 100 100 Trung bình 94,07 97,79 96,30
Để thuận tiện cho các nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi sử dụng thẻ xét nghiệm CMC 2%, phủ 30µl kháng thể.
3.3. NGHIÊN CỨU XÉT NGHIỆM KIỂM CHỨNG TỰ ĐỘNG LÀM SONG SONG VỚI XÉT NGHIỆM TRÊN THẺ SONG VỚI XÉT NGHIỆM TRÊN THẺ
Mẫu đối chứng âm không có kháng thể đƣợc sử dụng làm kiểm chứng. Vì không cần cung cấp kháng thể nên trên thẻ chỉ dành một vị trí để làm kiểm chứng hoặc nhỏ huyết thanh không chứa kháng thể lên vị trí kiểm chứng trên màng. Khi xét nghiệm, nhỏ 1 giọt nƣớc muối đẳng trƣơng vào vị trí này, sau đó thêm 30µl huyết thanh mẫu. Mẫu đối chứng cho kết quả âm tính thì xét nghiệm mẫu máu này
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
trên thẻ có giá trị. Nếu mẫu đối chứng có hiện tƣợng ngƣng kết hay máu bị vẩn đục thì loại bỏ mẫu máu này.
Hình 3.14. Mẫu đối chứng không bị vẩn đục
1. Control; 2. Anti-A; 3- Anti-B; 4. Anti-D
Hình 3.15. Mẫu đối chứng bị vẩn đục
1. Control; 2. Anti-A; 3- Anti-B; 4. Anti-D
3.4. SO SÁNH ĐỘ NHẠY VÀ ĐỘ CHÍNH XÁC CỦA THẺ VỚI CÁC PHƢƠNG PHÁP KHÁC PHƢƠNG PHÁP KHÁC
Hình 3.16. Xét nghiệm nhóm máu trên phiến
Hình 3.17. Xét nghiệm nhóm máu trong tube
1 2 3 4
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Để kiểm tra độ nhạy của thẻ, làm song song xét nghiệm trên thẻ và xét nghiệm trên phiến kính và xét nghiệm trong tube theo phƣơng pháp huyết thanh mẫu. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
Bảng 3.8. So sánh độ nhạy và độ đặc hiệu của thẻ xét nghiệm với phƣơng pháp
xét nghiệm trên phiến kính và xét nghiệm trong tube
Nhóm máu Số mẫu (n) Độ nhạy (%) Độ đặc hiệu (%) Thẻ xét nghiệm Phiến kính Tube Thẻ xét nghiệm Phiến kính Tube Nhóm A 28 100 100 100 100 100 100 Nhóm B 38 97,37 94,7 100 100 100 100 Nhóm AB 20 100 100 100 100 100 100 Nhóm O 11 100 90,91 100 100 100 100 Rh(+) 20 95,00 100 95,5 100 100 100 Rh(-) 4 100 100 100 100 100 100 Trung bình 98,73 97,60 99,25 100 100 100
Khi tiến hành so sánh độ nhạy của thẻ xét nghiệm nhóm máu do đề tài sản xuất với phƣơng pháp xét nghiệm trên phiến kính và xét nghiệm trong tube, kết quả không có sự khác biệt lớn. Độ nhạy trung bình của thẻ xét nghiệm, xét nghiệm trên phiến kính và xét nghiệm trong tube lần lƣợt là 98,73%, 97,60%, 99,25%. Độ đặc hiệu đều đạt 100%. Kết quả xét nghiệm sử dụng thẻ do đề tài sản xuất có độ nhạy 98,73%, độ đặc hiệu 100%. Mặc dù độ nhạy chƣa đạt đƣợc yêu cầu đặt ra ban đầu là 100%, tuy nhiên, đây là một kết quả tƣơng đối cao ngay cả khi so sánh với phƣơng pháp thƣờng quy trong phòng thí nghiệm. Thông thƣờng có thể đọc kết quả dƣơng tính ngay sau khi khuấy trộn đều mẫu trong thời gian 60 giây. Phản ứng âm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
tính đọc kết quả sau 2 phút. Nếu không chắc chắn về kết quả phải lặp lại xét nghiệm.
Trên thế giới, thẻ xét nghiệm của EldonCard (Đan Mạch) xuất hiện từ năm 1950 cho độ chính xác gần nhƣ tuyệt đối, xuất hiện 0,3‰ lỗi khi xét nghiệm nhóm ABO [17]. Thẻ HealthTEST Rh card cho kết quả Rh(-) có độ nhạy 99,70% và đặc hiệu 98,90% [28]. Độ nhạy và mức độ đặc hiệu đối với nhóm máu hệ ABO là 92,80% và 95,90% trong nghiên cứu của Ingrand và cộng sự [29]. Sai số trong các xét nghiệm kể cả sử dụng bộ kit hay sử dụng phƣơng pháp thƣờng qui do nhiều nguyên nhân khác nhau là điều không thể tránh khỏi. Một điều tra ở Pháp cho thấy xét nghiệm định nhóm máu ở bệnh viện cho kết quả độ nhạy là 93,9% ± 3% [10]. Hai lỗi thƣờng gặp trong xét nghiệm nhóm máu là thực hiện không chính xác quy trình và xét nghiệm viên thiếu kinh nghiệm. Việc đƣa ra kết luận với những mẫu cho kết quả không rõ ràng, trƣớc hết cần lặp lại xét nghiệm và sau đó kết hợp với các xét nghiệm khác.
Hình 3.18. Xét nghiệm nhóm máu bằng thẻ EldonCard
1. Có kết tủa; 2. Không có kết tủa; 3. Có kết tủa; 4. Không có kết tủa
3.5. NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN BẢO QUẢN THẺ, CÁC HÓA CHÁT VÀ DỤNG CỤ KÈM THEO DỤNG CỤ KÈM THEO
Sử dụng chất bảo quản NaN3 nồng độ 0,1%. Đây là chất bảo quản phổ biến thƣờng đƣợc dùng để bảo quản protein. Kháng thể ở dạng dung dịch đƣợc bảo quản trong NaN3 trong điều kiện 2-80C giữ đƣợc hoạt tính sau 5 năm. Kháng thể khô bảo
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
quản trong chân không cũng có độ bền tƣơng đối cao. Thẻ xét nghiệm định nhóm máu đƣợc nghiên cứu bảo quản trong các điều kiện nhiệt độ phòng (20- 280
C), ngăn mát tủ lạnh (2-80C) ở trạng thái đóng gói nguyên trong bao nilon hút chân không và dạng không bao gói. Kiểm tra định kỳ với từng loại thẻ. Kết quả nhƣ sau:
Bảng 3.9. Thời hạn sử dụng thẻ xét nghiệm
Thẻ không bao gói Thẻ có bao gói Nhiệt độ phòng 2-80C Nhiệt độ phòng 2-80C Thời gian còn
hoạt tính
5 ngày 10 ngày 6 tháng 6 tháng
Thẻ đƣợc coi là không còn hoạt tính kháng thể khi không đọc đƣợc kết quả với một trong bốn nhóm máu xét nghiệm hoặc cho kết quả sai sau khi lặp lại xét nghiệm lần thứ hai.
Hình 3.19. Thẻ xét nghiệm nhóm máu ABO+D do đề tài sản xuất
Thời hạn bảo quản thẻ bắt đầu đƣợc nghiên cứu sau khi sản xuất lô mẫu đầu tiên ngày 17/10/2011. Thẻ đã mở bao gói để ở nhiệt độ phòng sau 1 tuần, có hiện tƣợng kháng thể hút ẩm, lan rộng hoặc bám dính vào bao gói. Vì vậy, kết quả xét nghiệm bị ảnh hƣởng nhƣ khó đọc kết quả hay kết quả sai. Với thẻ bảo quản trong bao nilon hút chân không để ngăn mát tủ lạnh giữ nguyên hoạt tính sau 6 tháng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Đến thời điểm hiện nay, mẫu bảo quản ở nhiệt độ 2-80C vẫn còn hoạt tính. So sánh với một số thẻ định nhóm máu có trên thị trƣờng nhƣ Eldon có thời hạn bảo quản 1 năm, thẻ của Sifin có thời hạn bảo quản 2 năm, thẻ xét nghiệm máu do đề tài sản xuất đƣợc chấp nhận về giá thành và thời hạn sử dụng.
3.6. GIÁ THÀNH SẢN PHẨM
Để sản xuất bộ kit có thể cạnh tranh trên thị trƣờng thì giá thành là vấn đề quan trọng thứ 2 sau chất lƣợng. Giá thành sản xuất ra 1 thẻ xét nghiệm nhóm máu đƣợc thể hiện trong bảng 3.10.
Bảng 3.10. Giá thành sản xuất 1 thẻ xét nghiệm nhóm máu do đề tài sản xuất
Nguyên liệu Đơn vị Số lƣợng Giá thành (VNĐ)
CMC µl 4 400 Giá thể Chiếc 1 300