Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy pyrene và khả năng xử lý nước thải ở quy mô phòng thí nghiệm 5 lít

0 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN HƢƠNG QUỲNH PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY PYRENE VÀ KHẢ NĂNG XỬ LÝ NƢỚC THẢI Ở QUY MƠ PHÕNG THÍ NGHIỆM LÍT Chuyên ngành: SINH HỌC THỰC NGHIỆM Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGHIÊM NGỌC MINH THÁI NGUYÊN - 2011 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tôi, số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa có cơng bố cơng trình khác Tác giả Nguyên Hương Quỳnh Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ii LỜI CẢM ƠN Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới: PGS.TS Nghiêm Ngọc Minh, trưởng phịng Cơng nghệ Sinh học Mơi trường, Viện Cơng nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam tận tình hướng dẫn dìu dắt tơi q trình nghiên cứu hồn thành luận án Trong q trình nghiên cứu vừa qua, tơi nhận giúp đỡ bảo tận tình cán phịng Cơng nghệ Sinh học Mơi trường, đặc biệt KS Cung Thị Ngọc Mai, CN Vũ Thị Thanh giúp đỡ tơi q trình thực luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới thầy cô khoa Sinh trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên, lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học tạo điều kiện giúp đõ tơi q trình học tập nghiên cứu trường Viện Bên cạnh tơi xin cảm ơn người thân gia đình, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện động viên giúp đỡ vật chất tinh thần để tơi hồn thành tốt luận văn Một lần xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày tháng năm 2011 Học viên Nguyễn Hương Quỳnh Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iii MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình vii MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm chung PAH 1.1.1 Cấu trúc hóa học số đặc tính PAH 1.1.2 Tính độc ảnh hưởng PAH tới người môi trường 1.2 Nguồn gốc phát sinh PAH 1.3 Tình trạng nhiễm PAH biện pháp xử lý 1.3.1 Tình trạng ô nhiễm PAH 1.3.2 Các biện pháp xử lý tẩy độc PAH 11 1.4 Phân hủy sinh học PAH vi sinh vật 14 1.4.1 Vi sinh vật phân hủy PAH 14 1.4.2 Cơ chế phân hủy PAH vi sinh vật 16 1.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới trình phân hủy PAH 22 1.5 Các phương pháp phân loại vi sinh vật 26 1.5.1 Phân loại theo phương pháp cổ điển 26 1.5.2 Phương pháp phân loại sinh học phân tử 26 1.6 Quá trình xử lý sinh học nước thải thành phần chất nhiễm điển hình nước thải công nghiệp 29 1.6.1 Quá trình xử lý sinh học nước thải 29 1.6.2 Thành phần chất nhiễm điển hình nước thải công nghiệp 31 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 33 2.1 Nguyên liệu, hóa chất thiết bị sử dụng 33 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iv 2.1.1 Nguyên liệu 33 2.1.2 Hóa chất, mơi trường 33 2.1.3 Thiết bị 34 2.2 Phương pháp nghiên cứu 35 2.2.1 Thu thập mẫu nước thải 35 2.2.2 Làm giàu tập đoàn vi sinh vật môi trường chứa hỗn hợp PAH 35 2.2.3 Phân lập số chủng vi khuẩn có khả sử dụng PAH 35 2.2.4 Quan sát hình thái tế bào kính hiển vi điện tử quét 36 2.2.5 Phân loại, định tên xây dựng phát sinh chủng loại 36 2.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng lên phát triển chủng vi khuẩn lựa chọn 37 2.2.7 Xác định khả phân hủy pyrene vi khuẩn 42 2.3 Thử nghiệm quy mô lít 43 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44 3.1 Phân lập tuyển chọn vi khuẩn có khả phát triển môi trường chứa PAH 44 3.2 Đặc điểm khuẩn lạc hình thái tế bào chủng BTL4 47 3.3 Xác định trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA chủng vi khuẩn BTL4 47 3.3.1 Tách chiết DNA tổng số nhân đoạn gen 16S rRNA chủng BTL4 47 3.3.2 Tách dòng gen 16S rRNA chủng BTL4 48 3.3.3 Trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA chủng BTL4 50 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ, pH đến phát triển chủng BTL4 53 3.4.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 53 3.4.2 Ảnh hưởng pH 54 3.5 Khả phân hủy pyrene chủng BTL4 55 3.6 Kết mơ hình xử lý nước thải quy mơ lít 58 3.6.1 Q trình hoạt hóa bùn 58 3.6.2 Xử lý nước thải quy mơ lít 59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp Base pair (cặp bazơ) DNA Deoxyribonucleic acid LB Luria-Bertani PAH Polycyclic aromatic hydrocacbon (hydrocarbon thơm đa nhân) PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp) ppm Đơn vị phần triệu (mg/l) RNA Ribonucleic acid rRNA Ribosomal ribonucleic acid USEPA United State Environmental Protection Agency (Cục bảo vệ môi trường Hoa Kỳ) X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside μl Microlit μm Micromet Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Tính chất vật lý số PAH Bảng 1.2: Một số chủng vi sinh vật có khả phân hủy PAH 15 Bảng 1.3: Một số phương pháp phân loại vi sinh vật 28 Bảng 3.1: Chủng vi khuẩn phát triển môi trường khống có bổ sung hỗn hợp PAH 46 Bảng 3.2: Chủng vi khuẩn phát triển môi trường khống có bổ sung hỗn hợp PAH 0,5% glucose 46 Bảng 3.3: Mức độ tương đồng BTL4 so với số chủng vi khuẩn 52 Bảng 3.4: Kết đo phân tích số tiêu nước thải KCN Từ Liêm trước sau xử lý quy mơ lit phịng thí nghiệm 61 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Cấu trúc hóa học số hydrocarbon thơm đa nhân (PAH) Hình 1.2: Các đường phân hủy hiếu khí PAH vi khuẩn nấm 16 Hình 1.3: Con đường phân hủy napthalene Pseudomonas 19 Hình 1.4: Con đường phân hủy pyrene Mycobacterium sp AP1 20 Hình 1.5: Con đường phân hủy anthracene Mycobacterium sp PYR-1 21 Hình 3.1: Mẫu làm giàu lần mẫu nước thải lấy từ khu cơng nghiệp Từ Liêm 44 Hình 3.2: Tập đồn vi sinh vật mơi trường khống thạch với 50 ppm PAH sau lần làm giàu: (A) có bổ sung glucose, (B) khơng bổ sung glucose 45 Hình 3.3: (A) Hình thái khuẩn lạc (B) hình thái tế bào chủng BTL 47 Hình 3.4: Điện di đồ DNA tổng số chủng BTL4 (A), kiểm tra nhân đoạn gen 16S rRNA kỹ thuật PCR (B) 48 Hình 3.5: Kết biến nạp chủng BTL4(A), điện di đồ DNA plasmid dòng số từ BTL4 gel agarose 1% plasmid chủng lạc mầu xanh (B) 49 Hình 3.6: Sản phẩm cắt DNA plasmid dòng số từ BTL4 50 Hình 3.7: Kết giải trình tự đoạn gen 16S rRNA chủng BTL4 51 Hình 3.8: Cây phát sinh chủng loại chủng BTL4 52 Hình 3.9: Đồ thị thể phát triển chủng BTL4 300C 370C 54 Hình 3.10: Đồ thị mật độ quang phổ chủng BTL4 điều kiện pH khác 54 Hình 3.11: Kết nuôi BTL4 nồng độ pyrene khác 56 Hình 3.12: Kết phân tích khả phân hủy pyrene chủng BTL4 56 Hình 3.13: Q trình hoạt hóa bùn sau tuần 59 Hình 3.14: Màu sắc nước thải trước xử lý (A, C) sau xử lý (B, D) với thời gian lưu nước thải ngày 60 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Nước nguồn tài nguyên quý giá nhân loại, không ai, không sinh vật sống thiếu nước Tuy nhiên với phát triển mình, người ngày làm cho nguồn nước bị ô nhiễm nghiêm trọng phải kể đến nước thải cơng nghiệp Xã hội phát triển, ngành công nghiệp khác phát triển làm cho khu công nghiệp không ngừng tăng số lượng Tính đến tháng 10 năm 2009, tồn quốc có 233 khu cơng nghiệp thành lập theo Quyết định Thủ tướng Chính phủ Trong đó, 171 khu công nghiệp vào hoạt động, với tổng diện tích đất 57264 ha, đạt tỷ lệ lấp đầy trung bình khoảng 46% [2] Khơng phủ nhân độc hại nước thải công nghiệp, việc xử lý chúng vấn đề quan tâm, ý từ lâu, nhiên mức độ ô nhiễm thành phần nước thải khu công nghiệp phụ thuộc vào thành phần nhà máy, làng nghề thuộc khu công nghiệp, làm cho q trình xử lý nước thải cơng nghiệp gặp nhiều khó khăn Một chất gây ô nhiễm nghiêm trọng nước thải công nghiệp hydrocarbon thơm đa vòng (PAH - Polycyclic Aromatic Hydrocarbon) PAHs có nguồn gốc đa dạng từ dầu mỏ, than đá, sản phẩm phụ việc đốt nhiên liệu… [1] PAHs tồn khơng khí có khả phản ứng với ozone tạo thành ozone-alken có khả gây ung thư tồn khí quyển, PAHs xâm nhập vào thể người thông qua đường thực phẩm, tiếp xúc trực tiếp qua da… gây ung thư, giảm tuổi thọ, đột biến thai nhi… Hầu hết PAHs tan nước tan tốt chất béo khả gây ô nhiễm môi trường chúng phụ thuộc vào khả tan chúng môi trường nước Do tác hại PAH với người mà từ lâu người quan tâm nghiên cứu phương pháp phân hủy PAH Các PAH nghiên cứu thường PAH có cấu tạo đơn giản antharacene, naphthalene, phenantherene, pyren … pyren chất có cấu tạo phức tạp, có khả gây độc chất cịn lại, vi Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn khuẩn có khả phân hủy pyren có khả phân hủy loại PAH đơn giản khác Có nhiều phương pháp phân hủy pyren phương pháp vật lý, hóa học nhiên phương pháp vừa đắt lại vừa không triệt để nên khó thực quy mơ lớn Tuy nhiên ngày nhà khoa học thấy khơng sử dụng vi sinh vật để loại bỏ pyren mà cịn phương pháp vừa rẻ, triệt để có khả thực quy mơ cơng nghiệp, tiến hành thuận lợi điều kiện tự nhiên, độ an toàn cao thân thiện với môi trường Do vậy, giới Việt Nam có nhiều nhà khoa học tập trung nghiên cứu điều tra phân bố, cấu trúc tập đoàn vi sinh vật, khả phân hủy pyren chủng đơn tập đoàn vi sinh vật Trong phương pháp này, vi sinh vật đóng vai trị định có khả xử lý chất có nước thải Vì vậy, chúng tơi tiến hành thực đề tài: "Phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả phân hủy pyrene khả xử lý nước thải quy mơ phịng thí nghiệm lít" Mục tiêu đề tài - Phân lập tuyển chọn định tên , kiểm tra khả phân hủy pyrene chủng vi khuẩn phân lập từ nguồn nước thải khu công nghiệp Từ Liêm - Nghiên cứu khả xử lý nước thải tập đoàn vi sinh vật phân lập từ nguồn nước thải khu công nghiệp Từ Liêm quy mô lít Nội dung đề tài: - Phân lập, tuyển chọn số chủng vi sinh vật môi trường chứa PAH - Nghiên cứu khả phân hủy pyrene chủng vi khuẩn đại diện từ chủng vi khuẩn tuyển chọn - Đánh giá ảnh hưởng pH, nhiệt độ lên sinh trưởng… - Thử nghiệm khả xử lý nước thải chủng vi khuẩn phân lập quy mơ lít phịng thí nghiệm Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 56 Hình 3.11: Kết ni BTL4 nồng độ pyrene khác Hình 3.12: Kết phân tích khả phân hủy pyrene chủng BTL4 Dựa vào chiều cao peak điểm hấp thụ pyrene, bước sóng 238,9 nm, chúng tơi tính tốn khả phân hủy pyrene chủng BTL4 25,5% môi trường dịch thể Paracoccus biết đến chi vi khuẩn Gram âm, có hình trịn, có khả sống mơi trường đất, nước [41], [31] [52] Quá trình trao đổi chất chúng diễn điều kiện kỵ khí hiếu khí chúng thường phân lập từ đất Trên giới công bố số nghiên cứu khả phân hủy PAH chi Paracoccus Năm 2009 chủng vi khuẩn Paracoccus aminovorans HPD-2 phân lập từ đất nhiễm PAH có khả phân hủy Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 57 PAH có vịng thơm với hiệu suất 36% mà cịn có khả phân hủy PAH có vịng thơm với hiệu suất 26% sau 14 ngày nuôi cấy [31] Còn theo nghiên Teng Y cộng (2010) khả phân hủy PAH Paracoccus sp strain HPD-2 phân lập từ đất có khả phân hủy 30,7% PAH vòng thơm, 24,3% PAH 5, vịng thơm [41] So với chủng BTL4 có khả phân hủy pyrene mức độ trung bình, điều hợp lý trình thí nghiệm chúng tơi khơng sử dụng chất hoạt động bề mặt, thời gian thí nghiệm ngắn hơn, đồng thời nồng độ ban đầu pyrene 100ppm [40] Ngồi chi Paracoccus, giới có nhiều cơng trình nghiên cứu khả phân hủy PAH chủng vi khuẩn khác công bố Năm 2002, Deborah cộng công bố chủng Mycobacterium sp PYR-1 phân lập từ trầm tích bị nhiễm có khả phân hủy 74% hỗn hợp PAH gồm phenanthrene, anthracene, fluoranthene, pyrene, chrysene benzo[a]pyrene sau ngày nuôi cấy Trong đó, 95% fluoranthene bị loại bỏ sau 24h ni cấy, nhiên nồng độ ban đầu có 17 mg/l (17 ppm) [18] Năm 2007, Xue-Jing Zheng cộng nghiên cứu khả chuyển hóa sinh học tập đồn vi sinh vật hiếu khí có bùn cống bổ sung chất hoạt động bề mặt Tween 80 cho hiệu loại bỏ PAH 95% PAH chứa vòng thơm tăng tốc độ loại bỏ PAH chứa vòng thơm sau 21 ngày [60] Chủng Rhodococcus sp phân lập từ mẫu trầm tích có khả phân hủy 53% anthracene sau 24 nồng độ µg/ml [18] Ở Việt Nam có số cơng bố tác giả nước khả phân hủy PAH chủng vi sinh vật phân lập từ nguồn khác Năm 2003, La Thị Thanh Phương cộng phân lập chủng vi khuẩn Sphingomonas yanoikuyae MXL-9 từ cặn dầu thô mỏ Bạch Hổ (Quảng Ninh) có khả phân hủy 61,4% anthracene sau ngày nuôi cấy nồng độ 12 mg/l [9] Chủng BQN31 phân lập từ mẫu nước nhiễm dầu bể thu gom xí nghiệp than Quảng Ninh có khả phân hủy 69,38% naphthalene 25,9% anthracene mơi trường có bổ sung 100 ppm hai loại PAH [7] Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 58 Năm 2008, Nguyễn Ngọc Bảo cộng phân lập chủng vi khuẩn BDNR1 BDNR4 từ mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ dioxin quân cũ Mỹ sân bay Đà Nẵng Kết nghiên cứu cho thấy chủng BDNR1 phân hủy 50% anthracene, naphthalene, 86,2% pyrene; chủng BDNR4 phân hủy, 23,1% naphthalene, 50% anthracene 61,5% pyrene mơi trường có chứa 100 ppm loại PAH [1] So với chủng vi khuẩn khác chủng Paracoccus có hiệu suất phân hủy thấp hơn, để xử lý nước thải khu công nghiệp cần chủng đơn mà cần phải có tập đồn gồm nhiều loại vi sinh vật khác Chủng BTL4 góp phần làm giàu thêm nguồn vi sinh vật sử dụng xử lý nước thải Để nghiên cứu khả xử lý nước thải thực tế chủng vi sinh vật phân lập tiến hành thử xử lý nước thải khu công nghiệp Từ Liêm quy mơ phịng thí nghiệm lít 3.6 Kết mơ hình xử lý nƣớc thải quy mơ lít Sau lấy mẫu nước thải từ khu công nghiệp Từ Liêm tiến hành phân tích số tiêu nhận thấy nước thải từ khu cơng nghiệp Từ Liêm có nhiều hàm lượng chất vượt tiêu cho phép tiêu chuẩn nước thải khu công nghiệp cần phải xử lý trước thải vào hệ thống nước thải thành phố Thời gian xử lý đến ngày tùy vào lượng nước thải đầu vào lượng vi sinh vật bể lọc Sau khoảng thời gian ngày tiến hành kiểm tra thông số nước thải xem đạt tiêu chuẩn chưa, thơng số đạt tiêu chuẩn nước từ bể xử lý sinh học đưa qua bể lọc bùn bể khử vi sinh vật trước đổ vào bể chứa nước sau xử lý thải hệ thống nước thải thành phố Trong quy mô đề tài tiến hành xử lý thử nghiệm quy mơ lít 3.6.1 Q trình hoạt hóa bùn Tập đồn vi sinh vật từ lần làm giàu thứ tiến hành hoạt hóa mơi trường tự pha có điều kiện gần giống nước thải thật KCN Từ Liêm mô tả chương vật liệu phương pháp Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 59 Bắt đầu hoạt hóa bùn Hoạt hóa sau ngày Hoạt hóa sau 12 ngày Hoạt hóa sau 18-21 ngày Hình 3.13: Q trình hoạt hóa bùn sau tuần Trong thời gian hoạt hóa chúng tơi nhận thấy lượng sinh khối vi sinh vật tăng lên ngày, dịch nuôi dung dịch hoạt hóa ngày đục đi, sang đến ngày 18-21 dịch chuyển sang màu nâu đỏ khơng đổi mầu (hình 3.13), chúng tơi ngừng q trình hoạt hóa vi sinh vật, để lắng loại bỏ nước dịch khơng có bùn, đồng thời giữ lại bùn để tiến hành thí nghiệm xử lý nước thải quy mơ lít 3.6.2 Xử lý nước thải quy mơ lít Lấy lít nước thải khu công nghiệp Từ Liêm cho vào bể 10 lít sau cho bùn hoạt hóa vào bể tiến hành sục khí với độ cấp khí - mg/l, hàm Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 60 lượng chất rắn lơ lửng từ 1000-1500 mg/l, số lắng bùn SVI dao động từ 80 100 mg/l Sau ngày xử lý, nhận thấy nước có chuyển màu rõ rệt, từ màu đen sẫm sang màu trắng hình 3.14 D Sau ngày chúng tơi tiến hành phân tích số tiêu, kết phân tích trình bày bảng 3.4 A B C D Hình 3.14: Màu sắc nƣớc thải trƣớc xử lý (A, C) sau xử lý (B, D) với thời gian lƣu nƣớc thải ngày Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 61 Bảng 3.4: Kết đo phân tích số tiêu nƣớc thải KCN Từ Liêm trƣớc sau xử lý quy mơ lit phịng thí nghiệm Hàm lƣợng chất TT 10 11 12 13 14 15 Chỉ tiêu phân tích TDS COD BOD Tổng lượng N Tổng lượng P phenol Tổng lượng dầu, mỡ Cặn lơ lửng pH Benzo(b)fluoracene Chrysene Fluoranthene Naphthalene Phenantherene Pyrene Đơn vị mg/l mg/l mg/l mgN/l mgP/l mg/ mg/ mg/l -mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l Đầu vào 1162,02 1104,2 615,2 120,7 9,1 8,16 9,18 1190,4 7,78 160,74 5,6 92 474,7 5,11 24 Theo quy chuẩn QCVN24:2009 Đầu Sau ngày 898,6 154,6 80,9 42,7 16,32 0,16 4,705 51,61 8,7 101,6 4,05 81 230 0,1 0,1 Sau 10 ngày 448,8 97,52 63,15 27,52 4,8 0.1 4,1 44,6 8,15 15,25 1,15 15,6 78,2 0,1 0,1 B 100 50 30 0,5 100 5,5-9 - Kết phân tích thực phịng hóa phân tích thuộc Viện Hóa học Từ số liệu phân tích ta nhận thấy hầu hết tiêu nước thải công nghiệp trước xử lý vượt ngưỡng cho phép, nước thải công nghiệp không đảm bảo theo tiêu chuẩn nước thải công nghiệp Việt Nam, sau 10 ngày xử lý phương pháp sử dụng vi sinh vật tiêu giảm nhiều nước thải sau xử lý đạt tiêu chuẩn nước thải công nghiệp loại B Trong quy chuẩn Việt Nam nước thải cơng nghiệp chưa có tiêu chuẩn hàm lượng PAH, nhiên, sau 10 ngày xử lý, so với mẫu ban đầu hàm lượng PAH, đặc biệt pyrene giảm đáng kể Điều khẳng định phần vai trị chủng vi khuẩn BTL4 q trình phân hủy sinh học PAH Chủng BTL4 sử dụng để bổ sung vào nguồn giống làm bùn hoạt tính để xử lý nước thải KCN Từ Liêm trường Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 62 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ nguồn nước thải khu công nghiệp Từ liêm, dựa vào khác hình thái khuẩn lạc phân lập 11 chủng vi khuẩn khác đặt tên từ BTL1 đến BTL11, có chủng BTL4 phát triển tốt mơi trường có chứa hỗn hợp PAH Khuẩn lạc chủng BTL4 có hình trịn, màu trắng đục, nhớt, lồi mặt thạch, có đường kính khoảng 1:2mm tiết sắc tố có mầu vàng Dưới kính hiển vi điện tử quét, tế bào chủng BTL4 có hình trịn, kích thước từ 0,8- 1,2 µm So sánh trình tự gen 16S rRNA cho thấy chủng BTL4 có độ tương đồng cao với chủng thuộc chi Paracoccus, đặc biệt có độ tương đồng tới 97% với lồi Paracoccus bengalensis, đó, chúng tơi đặt tên chủng Paracoccus sp BTL4 Trình tự gen 16Sr RNA chủng Paracoccus sp BTL4 đăng ký ngân hàng gen Nhật Bản DDBJ với mã số AB646256 BTL4 chủng ưa nhiệt có khả phát triển tốt nhiệt độ 370C, pH - BTL4 có khả phân hủy 25,5% pyrene với nồng độ pyrene ban đầu 100 ppm Nước thải công nghiệp sau dùng chủng vi sinh vật phân lập để xử lý đạt tiêu chuẩn nước thải công nghiệp loại B theo quy chuẩn QCVN24: 2009 Kiến nghị Xây dựng quy trình xử lý nước thải cơng nghiệp sở kết đạt quy mô lớn Phát triển nghiên cứu phương pháp sản xuất chế phẩm sinh học xử lý nước thải công nghiệp quy mô công nghiệp Kết luận án viết thành báo khoa học gửi đăng tạp chí CNSH Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Ngun http://www.lrc-tnu.edu.vn 63 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Nghiêm Ngọc Minh , Nguyễn Hương Quỳnh, Cung Thị Ngọc Mai, "Hình thái tế bào, số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng khả phân hủy pyrene chủng btl4 phân lập từ nước thải khu công nghiệp từ liêm", Tạp chí Cơng nghệ sinh học Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Ngọc Bảo, Phan Thị Hoàng Hảo, Nguyễn Bá Hữu, Nguyễn Thanh Thủy, Vũ Đức Lợi, Đặng Thị Cẩm Hà (2008), “Nghiên cứu khả phân hủy sinh học hydrocarbon thơm đa vòng số chủng vi khuẩn phân lập từ bioreactor xử lý đất nhiễm độc hóa học”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 7(1), tr 117-124 Bộ Tài Nguyên Môi Trường (2009), “Môi trường khu công nghiệp Việt Nam”, Báo cáo môi trường quốc gia 2009, chương I, tr 1-20 Đặng Thị Cẩm Hà, Nguyễn Đương Nhã, Nghiêm Ngọc Minh, Nguyễn Thành Đức (2003), “Phân loại xạ khuẩn XKDN11 sử dụng dibenzofuran, hyđrocarbon thơm đa nhân phân lập từ đất nhiễm chất độc hóa học”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 3(1), tr 377-386 Hồng Thị Mỹ Hạnh, Nguyễn Thanh Thủy, Ngơ Xn Q, Nghiêm Xuân Trường, Nghiêm Ngọc Minh, Đặng Thị Cẩm Hà (2004), “Khả phân hủy 2,4-D dibenzofuran chủng nấm sợi FDN20”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 2(4), tr 517-528 Nguyễn Bá Hữu (2002), “Nghiên cứu nhóm vi sinh vật khả phân hủy hydrocacbon thơm đa nhân số chủng vi khuẩn q trình xử lý nhiễm dầu Khe Chè, Quảng Ninh”, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Viện sinh thái tài nguyên sinh vật, Hà Nội Nguyễn Bá Hữu, Trần Thị Tường Vi, Nghiêm Ngọc Minh, Đặng Thị Cẩm Hà (2007), “Phân huỷ sinh học dầu diesel hydrocarbon thơm đa nhân số chủng vi khuẩn phân lập từ nước thải nhiễm dầu kho cảng B12, Quảng Ninh”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ - Đại Học Thái Nguyên, 2(42), tr 61-67 Lê Tiến Mạnh, Nghiêm Ngọc Minh (2007), “Nghiên cứu phân lập khả sử dụng hydrocarbon thơm đa nhân (PAH) chủng vi khuẩn BQN31”, Tạp chí Khoa học Công nghệ Đại học Thái Nguyên, 42(2),tr 59-66 Nghiêm Ngọc Minh, Nguyễn Thành Đức (2004), “Phân loại chủng vi khuẩn HDG1 phân lập từ mẫu nước thải nhà máy giấy Hải Dương”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 2(2), tr 245-252 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 65 La Thị Thanh Phương, Nguyễn Bá Hữu, Đặng Thị Cẩm Hà (2003), “Phân hủy sinh học hydrocarbon thơm đa nhân (PAH) chủng vi khuẩn MLX-9 phân lập từ cặn dầu thô mỏ Bạch Hổ, Vũng Tàu”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 1(1), tr 109-117 10 Mai Anh Tuấn, Nghiêm Ngọc Minh, Đặng Thị Cẩm Hà (2004), “Nghiên cứu phân loại khả sử dụng hydrocarbon thơm đa nhân chủng xạ khuẩn XKDN19 phân lập từ đất nhiễm chất độc hóa học”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 2(3), tr 389-396 11 Lều Thọ Bách, D Xanthouluis, Wang Chengduan (2010), “Xử lý nước thải chi phí thấp”, tr 6-10 Tiếng Anh 12 Ahn Y., Sanseverino J., Sayler G.S (1999), “Analyses of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria isolated from contaminated soil”, Biodegradation, 10, pp 149-157 13 Albert L., Juhasz, Naidu R (2000), “Bioremediation of high molecular weight polycyclic aromatic hydrocarbons: a review of the microbial degradation of benzo[a]pyren”, International Biodeterioration  Biodegradation, 45, pp 57-88 14 Al-Turki A.I (2009), “Microbial polycyclic aromatic hydrocarbon degradation in soil”, Journal of Environment Toxicology, 3(1), pp 1-8 15 Beauregard Printer Limited (1993), “Creosote-impregnated waste materials”, Assessment Report, Canadian Environmental Protection Act, pp 1-25 16 Cerniglia C.E (1993), “Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons”, Current Opinion in Biotechnology, 4, pp 331-338 17 Coates J.D., Anderson R.T., Lovley D.R (1996), “Oxidation of polycyclic aromatic hydrocarbon under sulfate-reducing conditions”, Applied and Environmental Microbiology, 62, pp 1099-1101 18 Deborah D., Moody J., Cerniglia C.E (2002), “Utilization of mixtures of polycyclic aromatic hydrocarbon by bacteria isolated from contaminated sediment”, FEMS Microbial Ecol, 41, pp 1-7 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 66 19 Draper W.M., Stepens R.D., Ruzo L.O (1987), “Solving hazardous waste problem: learning from dioxin”, Journal of the American Chemical Society, pp 350-366 20 Farrelly D., Mason J.R., Smith S (2000), “The bio-availability of polycyclic aromatic hydrocarbons in soil”, Journal of Conference Abstracts, 5(2), pp 394 21 Guangli W., Ji Z., Li W., Bin L., Kai C., Shunpeng L., Jiandong J (2010), “Cometabolism of DDT by the newly isolated bacterium, Pseudoxanthomonas sp Wax”, Brazilian Journal of Microbiology, 41(2), pp 1517-8382 22 Guiraud P., Kadri M., Blake G., Steiman S (2001), “Biodegradation of phenanthrene and fluoranthene by fungi isolated from an experimental constructed wetland for wastewater treatment”, Water Research, 35(17), pp 4126-4136 23 Habe H., Omori T (2003), “Genetics of polycyclic aromatic hydrocarbon metabolism in diverse aerobic bacteria”, Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 67(2), pp 225-243 24 Hamann C., Hegemann J., Ahildebrandt A (1999), “Detection of polycyclic aromatic hydrocarbon degradation genes in different soil bacteria by polymerase chain reaction and DNA hydridization”, FEMS Microbiology Letters, 173, pp 255-263 25 Haugland R A., Schelemm D J., Lyons R P., Sferra P R., Chakrabarty A M (1990), “Degradation of the chlorinated phenoxyacetate herbicides 2,4dichlorophenoxyacetic acid and 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid by pure and mixed bacterial cultures”, Applied and Environmental Microbiology, 56, pp 1357-1362 26 Hideshi Y., Kazuyoshi Z., Keiko K., Satoshi S., Nobuo K (1992), “Degradation of phenol by thermophilic and halophilic bacteria isolated from a marine brine sample”, Journal of Fermentation and bioengineering, 74, pp 297-300 27 Hiroshi A., Stephanie B., David K., Rob P (1998), “Polycyclic aromatic hydrocarbons: properties and environmental fate”, Environmental Organic Chemistry, 2, pp 845 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 67 28 Hughes J.B., Ward C.H., Denise M (1998), “Effect of polycyclic aromatic hydrocarbon and sediment on fluoranthen biodegradation patterns”, Environmental Toxicology and Chemistry, 17(7), pp 1246-1251 29 Hwang S., Cutright T.J (2003), “Effect of expandable clays and cometabolism on PAH biodegradability”, Environmental science and pollution research international, 10(5), pp 277-280 30 Hyung Y.K., Kye H.O (2005), “Molecular detection of catabolic genes for polycyclic aromatic hydrocarbons in the Reed Rhizosphere of Sunchon Bay”, The Journal of Microbiology, 43, No 6, pp 572-576 31 Jian1 MAO, LUO Yong-ming, TENG Ying1, LI Zhen-gao1 (2009), “Biodegradation of PAHs by Paracoccus aminovorans HPD-2 in Contaminated Soil”, Chinese Academy of Sciences, China; Graduate School of the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China) 32 Jang Y., Yang X., Liu B., Zhoa H., Cheng Q., Cai B (2004), “Catechol 2,3Dioxygenase from Pseudomonas sp strain ND6: Gene sequence and enzyme characterization”, Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 68(8), pp 1798 - 1800 33 Jesus G.M., Silvia G.A., Ana I.A., Francisco R.V (1999), “Use of 16S-23S ribosomal gene spacer region in studies of prokaryotic diversity”, Journal Microbiol Methods, 36, pp 55-64 34 Johnsen A.R., Wick L.Y., Harms H (2005), “Principles of microbial PAH degradation in soil”, Environ Poll, 133, pp 71-84 35 Kanaly R A., Harayama S (2000), “Biodegradation of high- molecular-weight polycyclic aromatic hydrocarbons by bacteria”, Jounal of Biotechnology, 182, pp 2059-2067 36 Kastner M., Breuer M and Mahro B (1998), “Impact of innoculation protocols, salinity anh pH on the degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) and survival of PAH - degrading bacteria introduced into soil”, Applied and Environmental Microbiology, 64(1), pp 359 - 362 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 68 37 Komarkova E., Paca J., Klapkova E., Stiborova M., Socco C.R., Sobotka M (2003), “Physiological changes of Candida tropicalis population degrading phenol in fed batch reactor”, Brazilian Archives of Biology and Technology, 46(4), pp 375-421 38 Laha S and Luthy R.G (1992), "Effects of nonionic surfactants on the solubilization and mineralization of phenanthrene in soil-water systems", Biotechnology and Bioengineering, 40, pp 1367-1380 39 Liegega E.W., Cutrightb T.J (1999), “The investigation of enhanced bioremadiation through the addition of macro and micro nutrients in PAH contamiated soil”, International Biodeterioration & Biodegradation, 44, pp 55-64 40 Lin Qiaoa, b and Jian-long Wanga, “Microbial degradation of pyridine by Paracoccus sp isolated from contaminated 41 Liu Z, Teng Y, Luo Y, Sun M, Li Z, Christie P., “Effect of bioaugmentation by Paracoccus sp strain HPD-2 on the soil microbial community and removal of polycyclic aromatic hydrocarbons from an aged contaminated soil”, Bioresour Technol 2010 May ;101(10):3437-43 Epub 2010 Jan 21 42 Meckenstock R.U., Michael S., Christian G (2004), “Anaerobic degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons”, Microbiology Ecology, 49, pp 27-36 43 Mesarch M.B., Nakatsu C H., Nies L (2000), “Development of catechol 2,3dioxygenase-specific primers for monitoring bioremediation by competitive quantitative PCR”, Applied and Environmental Microbiology, 66, pp 678-683 44 Meyer S., Moser R., Neef A., Stahl U., Kampfer P (1999), “Differential detection of key enzymes of polyaromatic hydrocarbon- degrading bacteria using PCR and gene probes”, Microbiol, 145, pp 1731- 1741 45 Moody J.D., Freeman J.P., Doerge D.R., Cerniglia C.E (2001), “Degradation of phenanthrene and anthracene by cell suspensions of Mycobacterium sp strain PYR-1”, Applied and Environmental Microbiology, 67, pp 1476 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 69 46 Mrozik A., Piotrowska Z., Labuzek S (2003), “Bacteria degradation and bioremadiation of polycyclic aromatic hydrocarbons”, Polish Journal of Environmental Studies, 12(1), pp 15-25 47 Okuta A., Ohnishi K., Harayama S (1998), “PCR isolation of catechol 2,3dioxygenase fragments from environments samples and their assembly into funtional genes”, Gene, 212, pp 221-228 48 Rentz J.A., Alvarez P.J., Schnoor J.L (2005), “Benzo[a]pyrene co-metabolism in the presence of plant root extracts and exudates: Implications for phytoremediation”, Environ Pollution, 136(3), pp 477-484 49 Sambrook J., Russell D.W (2001), “Molecular clonning”, A laboratory manual, 3rd ed Cold spring harbor laboratory press, Cold spring habor, NewYork 50 Sinkkonen S., Paasivirta J (2000) “Degradation half-life times of PCDDs, PCDFs and PCBs for environmental fate modeling”, Chemosphere, 40, pp 943-949 51 Srogy K (2007), “Monitoring of environmental exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons: a review”, Environmental Chemistry Letters, 5, pp 169-195 52 Sutherland J B., Rafii F., Khan A A., Cerniglia C E (1995), “Mechanics of polycyclic aromatic hydrocarbon degradation”, Microbial Transformation and Degradation of Toxic Organic Chemicals New York, Wiley-Liss, pp 269-306 53 Tarek A.T., Kassim A., Bernd R.T., Simoneit (2001), “Microbial transformations at aqueous-solid phase”, The Handbook of Environmental Chemistry, 5(E), pp 319-332 54 Thomas A.O., Letster J.N (2009), “Degradation of phenol using bacteria isolated from the subsurface of manufactured gas plants”, Hazasdous Waste and Hazasdous Materials, 10(4), pp 413-430 55 Villa J., Lopez Z., Satabe J., Minguillon C., Solanas A.M., Grifoll M (2001), “Identification of a novel metabolite in th degradation of pyrene by Mycobacterium sp strain AP1: action of isolate on two and three-ring polycyclic aromatic hydrocarbon”, Applied and Environmental Microbiology, 67, pp 5497 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 70 56 Weissenfels W.D., Beyer M., Klein J (1991), “Degradation of phenanthrene, fluorene and fluoranthene by our bacteria cultures”, Applied and Environmental Microbiology, 32, pp 479-484 57 WHO Regional Office for Europe, Copenhagen, Denmark (2000), “Polycyclic aromatic hydrocarbon”, Air Quality Guidelines, Chapter 5.9, pp 1-24 58 Wikstrom P (1996), “DNA recovery and PCR quatification of catechol 2,3dioxygenase genes from diffirenr soil types”, Journal of Biotechnology, 52, pp 107-120 59 Wilson S.C., Jones K.C (1993), “Bioremediation of soils contami-nated with polynuclear aromatic hydrocarbons (PAH): a review”, Environmental Pollution, 88, pp 229-249 60 Xue J.Z., Blais J.F., Mercier G., Bergeron M., Drogui P (2007) “PAH removal from spiked municipal wastewater sewage sludge using biological, chemical and electrochemical treatments”, Chemosphere, 68(6), pp 1143-1152 61 Yuan S.Y., Chang J.S., Yen J.H., Chang B.V (2002), “Biodegradation of phenanthren in river sediments”, Chemosphere, 43, pp 273-278 62 Yuan S.Y., Chang S.W., Chang B.V (2003), “Biodegradation of polyclic aromatic hydrocacbon in sludge”, Bull Environ Contam Toxicol, 71(3), pp 625-632 63 Yuan S.Y., Wei S.H., Chang B.V (2000), “Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons by mixed culture”, Chemosphere, 41, pp 1463-1468 64 Zaidi R., Baquar., Imam H S (1999), “Factors affecting microbial degradation of polycyclic aromatic hydrocarbon phenanthrene in the Caribbean coastal water”, Marine Pollution Bulletin, 38, pp 737 - 742 65 Zhongtang Y., Mohn W.W (2001), “Bacterial diversity and community structure in an aerated lagoon revealed by ribosomal intergenic spacer analyses and 16S Ribosomal DNA sequencing”, Applied and Environmental Microbiology, 67(4), pp 1565-1574 66 Web: http:/tt.pstu.ru/mnp10/mnp10/s7/korshunova.htm Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ... này, vi sinh vật đóng vai trị định có khả xử lý chất có nước thải Vì vậy, chúng tơi tiến hành thực đề tài: "Phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả phân hủy pyrene khả xử lý nước thải quy mô. .. nƣớc thải cơng nghiệp 1.6.1 Q trình xử lý sinh học nước thải Để kiểm tra khả xử lý chủng vi sinh vật phân lập tiến hành xử lý nước thải quy mơ lít phương pháp sinh học Xử lý sinh học nước thải. .. đoàn vi sinh vật phân lập từ nguồn nước thải khu công nghiệp Từ Liêm quy mơ lít Nội dung đề tài: - Phân lập, tuyển chọn số chủng vi sinh vật môi trường chứa PAH - Nghiên cứu khả phân hủy pyrene chủng