Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu hoạt lực của một số chủng vi khuẩn có khả năng phân giải celulose

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ CFU : Colonie foriming unit CMC : Carboxyl metyl cellulose DNS : Acid Dinitro-salicylic CT : Công thức ĐC : Đối chứng VSV : Vi sinh vật MỤC LỤC PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Trong trình hình thành phát triển biến đổi đất, vi sinh vật có vai trò quan trọng Chúng tham gia vào việc tổng hợp mùn, cải thiện kết cấu đất, phân giải chuyển hóa hợp chất hữu cơ, vô khó tan đất, cải thiện chế độ nước, không khí để cung cấp dinh dưỡng cho trồng Trong nhóm sinh vật đất vi sinh, nguyên sinh động vật, giun đất, ấu trùng… vai trò vi sinh vật là quan trọng, có đóng góp lớn nhóm vi khuẩn Vi khuẩn có vai trò lớn trình hình thành đất tạo độ phì nhiêu cho đất Nó đảm nhiệm nhiều chức khác việc làm màu mỡ thêm cho đất, tham gia tích cực trình chuyển hóa phân giải hợp chất hữu phức tạp cellulose, mùn, kitine, lignin…[1] Ở nước ta, phế liệu chứa cellulose phong phú bao gồm rơm rạ, trấu, vỏ lạc, vỏ trái cây, bã mía, lõi ngô, gỗ…phần lớn bị đốt cách phí phạm, phần nhỏ bổ sung vào thức ăn chăn nuôi với hiệu thấp Do vậy, vấn nạn ô nhiễm môi trường nông thôn mối quan tâm lớn toàn nhân loại Rác thải làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe người, môi trường sinh thái Vấn đề đặt phải ứng dụng kịp thời tiến khoa học kỹ thuật nhằm giảm thiểu ô nhiễm môi trườngdựa vào trình phân hủy rác thải thành chất hữu phục vụ nông nghiệp Song hợp chất cellulose bị thủy phân acid enzyme cellulase ngoại bào số nhóm vi sinh vật Trong đó, vi khuẩn phân giải chất hữu phức tạp thành chất hữu đơn giản, đồng thời vi khuẩn có khả phát triển nhanh tiết lượng enzyme lớn với đầy đủ thành phần, có hoạt tính mạnh.[5] Thừa Thiên Huếcũng chịu ảnh hưởng xấu môi trường, nguyên nhân rác thải từ nhiều nguồn khác Trung bình ngày, toàn tỉnh có khoảng 200 rác thải sinh hoạt thải môi trường Trong đó, khoảng 50% rác khu vực trung tâm thu gom, chủ yếu xử lý sơ ban đầu đốt, chôn lấp, rắc vôi bột bãi rác trung chuyển Ở nông thôn, địa phương tổ chức thu gom, xử lý rác thải, chủ yếu người dân tự xử lý theo hình thức chôn lấp, đốt, chí tùy tiện vứt môi trường xung quanh Hiện, toàn tỉnh có 89/152 (58,5%) phường, xã, thị trấn tổ chức thu gom rác hộ dân cư Riêng khu vực nông thôn tỷ lệ đạt 40% Về nông thôn, dễ dàng bắt gặp “dòng sông chết” đầy ứ rác thải, xác xúc vật; bãi rác tự phát đầy ruồi nhặng khiến phải bịt mũi cho nhanh; kênh mương, bờ ruộng, loại bao bì, chai lọ đựng thuốc bảo vệ thực vật bị vứt bỏ tuỳ tiện, gây nguy hiểm cho người dân ô nhiễm nguồn nước phục vụ sản xuất Ngoài đặc điểm địa lý Thừa Thiên Huế có nhiều sông ngòi, ao hồ với hàm lượng bùn đất tích tụ hàng năm cao, số lượng lục bình lớn, che kín ảnh hưởng đến cảnh quan thẩm mỹ làm cân hệ sinh thái nước Việc xử lý rác thải nông thôn địa bàn tỉnh Thừa Thiên - Huế lâu thực chủ yếu theo hình thức chôn lấp, đốt hủy chưa có hệ thống xử lý nên ảnh hưởng đến mạch nước ngầm, ô nhiễm bầu không khí [16] Do đó, việc phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả phân giải cellulose mạnh, thích nghi với điều kiện khí hậu địa Thừa Thiên Huế nhằm bổ sung vào phế thải nông nghiệp góp phần rút ngắn thời gian phân hủy thúc đẩy trình thủy phân phế thải đạt hiệu tốt Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn, thực đề tài: “Phân lập, tuyển chọn nghiên cứu hoạt lực số chủng vi khuẩn có khả phân giải celulose” 1.2.Ý nghĩa đề tài + Việc tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính phân giải cellulose mạnh thích nghi với điều kiện khí hậu thổ nhưỡng Thừa Thiên Huế góp phần đa dạng hóa nguồn giống vi khuẩn cellulose + Kết nghiên cứu sở quan trọng cho nghiên cứu tiếp tục xây dựng quy trình tạo chế phẩm sinh học từ vi khuẩn cellulose để xử lý phế thải nông nghiệp tạo nguồn phân hữu sinh học quan trọng cho trồng + Sử dụng vi khuẩn phân giải cellulose xử lý phế thải nông nghiệp góp phần giảm thiểu vấn nạn ô nhiễm môi trường nông thôn địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế 1.3 Mục đích yêu cầu đề tài *Mục đích Phân lập, tuyển chọn số chủng vi khuẩn phân giải cellulose mạnh nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến trình nuôi cấy chúng nhằm ứng dụng chúng vào việc phân hủy hợp chất hữu nông nghiệp, đông thời chống lại ô nhiễm môi trường góp phần tạo nguồn phân bón hữu phục vụ nông nghiệp *Yêu cầu + Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả phân giải cellulose từ số mẫu đất trồng, rác thải, mùn cưa + Tìm hiểu đặc tính, điều kiện sinh trưởng thích hợp cho chủng vi khuẩn có khả phân giải cellulose mạnh + Đánh giá khả phân giải cellulose chủng vi khuẩn có hoạt lực enzyme mạnh nhằm đưa vào ứng dụng thực tế + Nắm phương pháp nghiên cứu, theo dõi phân tích số liệu PHẦN TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2.1 Cellulose enzyme cellulase 2.2.1 Giới thiệu cellulose Cellulose thành phần thực vật Ngoài người ta thấy chúng có nhiều tế bào số loài vi sinh vật Ở tế bào thực vật số tế bào vi sinh vật chúng tồn dạng sợi.[24] Hình 2.1 Cấu trúc không gian cellulose Cellulose tế bào động vật Chúng homopolimer mạch thẳng cấu tạo β-D-glucose-pyranose Các thành phần liên kết với liên kết glucose, liên kết glucose với liên kết α-1,4glucoside Các gốc glucose cellulose thường lệch góc 1800 có dạng ghế bành Cellulose thường chứa 10.000 - 14.000 gốc đường cấu tạo hình.[24] Hình 2.2 Cấu trúc phân tử cellulose Cellulose chất hữu khó phân hủy Người hầu hết loài động vật khả phân hủy cellulose Do đó, thực vật chết người thải chất hữu có nguồn gốc thực vật để lại môi trường lượng lớn rác thải hữu Tuy nhiên, nhiều chủng vi sinh vật bao gồm nấm, xạ khuẩn, vi khuẩn có khả phân giải cellulose thành sản phẩm dễ phân hủy nhờ enzyme cellulase (Trần Đình Khả cộng sự, 2007) 2.2.2 Enzyme cellulase Cellulase phức hệ enzyme thủy phân cellulose tạo thành phân tử đường β-glucose Theo kết nghiên cứu số tác giả, cellulose bị phân hủy tác dụng hiệp đồng cellulase gồm enzyme Exo-β-(1,4)glucananse hay enzyme C1, Endo-β-glucananse hay endocellulase gọi enzyme CMC-ase hay Cx β-(1,4)-glucosidae hay cellobioase: + Exo-1,4-gluconase (hay cellobiohydrolase, C1 EC 2.3.1.91) giải phóng cellobiose glucose từ đầu không khử cellulose, tác dụng yếu lên CMC tác dụng mạnh lên cellulose vô định hình cellulose bị phân giải phần Tác dụng lên cellulose kết tinh không rõ có mặt endoglucanase có tác dụng hiệp đồng rõ rệt + Endo-1,4-glucanase (hay CMC-ase, Cx, EC 3.2.1.4) thủy phân liên kết β-1,4-glucoside tác động vào chuỗi cellulose cách tùy tiện, sản phẩm trình thủy phân cellobiose glucose Do thủy phân CMC cellulose theo kiểu tùy tiện nên endo-1.4- glucanase làm giảm nhanh chiều dài chuỗi cellulose tăng chậm nhóm khử, enzyme tác dụng mạnh lên cellodextrin Enzym hoạt động mạnh vùng vô định hình lại hoạt động yếu vùng kết tinh cellulose + Β-1,4- glucosidase (hay cellobiase, EC 3.2.1.21) thủy phân cellobiese cellodextrin khác hòa tan nước sinh ra, chúng có hoạt tính cao cellobiose, cellodextrin hoạt tính thấp giảm chiều dài chuỗi tăng lên Chức β-glucosidase có lẽ điều chỉnh tích lũy chất cảm ứng cellulase 2.2.3 Cơ chế tác dụng enzyme cellulase Cellulase hệ enzyme phức tạp xúc tác thủy phân cellulose thành cellobiose cuối thành glucose Sự phân giải cellulose tác dụng hệ enzyme cellulase xảy theo giai đoạn chủ yếu sau: Trong giai đoạn thư nhất, tác dụng tác nhân C 1, cellulose bị thủy phân thành cellulose hòa tan Trong giai đoạn thứ 2, cellulose hòa tan bị thủy phân tác dụng hệ enzyme Cx tạo thành đường cellobiose Ở giai đoạn cuối cùng, tác dụng enzyme β-1,4-glucosidase (hay cellobiase, EC 3.2.1.21), bị thủy phân thành glucose.[24] Hình 2.3 Sự phối hợp hoạt động loại enzyme cellulase Nhiều loài vi khuẩn có khả phân hủy cellulose, nhiên cường độ không mạnh vi nấm Nguyên nhân số lượng enzyme tiết môi trường vi khuẩn thường nhỏ hơn, thành phần loại enzyme không đầy đủ Thường đất có loài vi khuẩn có khả tiết đầy đủ loại enzyme hệ cellulase Nhóm tiết loại enzyme, nhóm khác tiết loại khác, chúng phối hợp với để phân giải mối quan hệ hỗ sinh Nhóm vi khuẩn hiếu khí bao gồm Pseudomonas, Celloulomonas, Achromobacter Nhóm vi khuẩn kị khí bao gồm Clostridiumvà đặc biệt nhóm vi khuẩn sống cỏ động vật nhai lại Chính nhờ nhóm vi khuẩn mà trâu bò sử dụng cellulose có cỏ làm thức ăn Đó cầu khuẩn thuộc chi Ruminococcus có khả phân hủy cellulose thành đường acid hữu cơ[7] Các loài vi sinh vật có khả sinh tổng hợp cellulase điều kiện tự nhiên thường bị ảnh hưởng tác động nhiều mặt yếu tố ngoại cảnh nên có loài phát triển mạnh, có loài phát triển yếu Chính thế, việc phân hủy cellulose tự nhiên tiến hành không đồng bộ, xảy chậm Chất hữu thành phần quan trọng trình hình thành làm thay đổi độ phì đất Sự chuyển hóa chất hữu đất chủ yếu theo hai hướng vô hóa chất hữu mùn hóa vật chất hữu Cenlulose bị vi sinh vật (VSV) phân hủy thành thành phần có phân tử lượng nhỏ Chính thành phần nhỏ kết hợp với thành phần khác đất tạo mùn Khi mùn tạo thành, VSV lại tiếp tục phân hủy mùn trình amon hóa, chuyển háo giúp đất tích lũy NH 3, trình tạo thành NH3 đất xảy chậm chạm, điều có lợi cho trồng trình giải phóng từ từ NH3 cho hấp thụ: Chất mùn + O2 + VSV CO2 + H2O + NH3 2.2 Sơ lược vi khuẩn Vi khuẩn (tiếng anh tiếng La Tinh baterium, số nhiều bacteria) gọi vi trùng, nhóm vi sinh vật nhân sơ đơn bào có kích thước nhỏ; số thuộc loại ký sinh trùng Vi khuẩn nhóm sinh vật đơn bào, có kích thước nhỏ (kích thước hiển vi) thường có cấu trúc tế bào đơn giản nhân, khung tế bào (cytoskeleton) bào quan ty thể lục lạp Cấu trúc tế bào vi khuẩn miêu tả chi tiết mục sinh vật nhân sơ vi khuẩn sinh vật nhân sơ, khác với sinh vật có cấu trúc tế bào phức tạp gọi sinh vật nhân chuẩn[24] Vi khuẩn nhóm diện đông đảo sinh giới Chúng diện khắp nơi đất, nước, chất thải phóng xạ, suối nước nóng, dạng cộng sinh kí sinh với sinh vật khác, biết phát triển mạnh mẽ tàu không gian có người lái Nhiều tác nhân gây bệnh (pathogen) vi khuẩn Hầu hết vi khuẩn có kích thước nhỏ, thường khoảng 0.5-5.0 μm, có loài có đường kính đến 0,3mm (Thiomargarita) Chúng thường có vách tế bào, tế bào thực vật nấm, với thành phần cấu tạo khác biệt (peptidoglycan) Nhiều vi khuẩn di chuyển tiên mao (flagellum) có cấu trúc khác với tiên mao nhóm khác [24] Có khoảng 40 triệu tế bào vi khuẩn gram đất hàng triệu tế bào mm nước Ước tính có khoảng 5×10 30 vi khuẩn Trái Đất, tạo thành lượng sinh khối vượt tất động vật thực vật Vi khuẩn có vai trò quan trọng tái chế chất dinh dưỡng cố định nitơ từ khí gây thối rữa sinh vật khác Trong vùng dinh dưỡng quanh cách mạch nhiệt dịch lỗ phun lạnh, vi khuẩn cung cấp chất dinh dưỡng cần thiết cho sống cách biến đổi hợp chất hòa tan hydro sulphua metan thành lượng, chúng phát triển mạnh nơi sâu Trái Đất rãnh Mariana [24] Vi khuẩn quan sát Antony van Leeuwenhoek năm 1683 kính hiển vi tròng ông tự thiết kế Tên "vi khuẩn" đề nghị sau lâu Christian Gottfried Ehrenberg vào năm 1828, xuất phát từ chữ βακτηριον tiếng Hy Lạp có nghĩa "cái que nhỏ" Louis Pasteur (18221895) Robert Koch (1843-1910) miêu tả vai trò vi khuẩn thể mang gây bệnh hay tác nhân gây bệnh Các vi khuẩn có nhiều kiểu trao đổi chất khác Vi khuẩn dị dưỡng (heterotroph) phải dựa vào nguồn cacbon hữu bên ngoài, tất vi khuẩn gây bệnh vi khuẩn dị dưỡng Trong vi khuẩn tự dưỡng (autotroph) có khả tổng hợp chất hữu từ CO nước Các vi khuẩn tự dưỡng thu nhận lượng từ phản ứng ôxy hóa hợp chất hóa học gọi vi khuẩn hóa dưỡng (chemotroph), nhóm thu lượng từ ánh sáng, thông qua trình quang hợp, gọi vi khuẩn quang dưỡng (phototroph) Có nhiều cách khác để gọi hai nhóm theo thuật ngữ tiếng Anh, ví dụ chemoautotroph photosynthesis autotroph, v.v Ngoài ra, vi khuẩn phân biệt nhờ vào nguồn chất khử mà chúng sử dụng Những nhóm sử dụng hợp chất vô (như nước, khí hidro, sulfua ammonia) làm chất khử gọi vi khuẩn vô dưỡng (lithotroph) nhóm cần hợp chất hữu (như đường, axit hữu cơ) gọi vi khuẩn hữu dưỡng (organotroph) Những kiểu trao đổi chất dựa vào nguồn lượng (quang dưỡng hay hóa dưỡng), nguồn chất khử (vô dưỡng hay hữu dưỡng) nguồn carbon (tự dưỡng hay dị dưỡng) kết hợp khác tế bào, nhiều loài thường xuyên chuyển từ kiểu trao đổi chất sang kiểu trao đổi chất khác[24] Vi khuẩn có ích có hại cho môi trường, động vật, bao gồm người Vai trò vi khuẩn gây bệnh truyền bệnh quan trọng Một số tác nhân gây bệnh gây bệnh uốn ván (tetanus), sốt thương hàn (typhoid fever), giang mai (syphilis), tả (cholera), bệnh lây qua thực phẩm (foodborne illness) lao (tuberculosis) Nhiễm khuẩn huyết (sepsis), hội chứng nhiễm khuẩn toàn thể gây sốc giãn mạch, hay nhiễm khuẩn khu trú (localized infection), gây vi khuẩn streptococcus, staphylococcus, hay nhiều loài Gram âm khác Một số nhiễm khuẩn lan rộng khắp thể trở thành toàn thân Ở thực vật, vi khuẩn gây mụn lá, fireblight héo Các hình thức lây nhiễm gồm qua tiếp xúc, không khí, thực phẩm, nước côn trùng Kí chủ bị nhiễm khuẩn trị thuốc kháng sinh, chia làm hai nhóm diệt khuẩn (bacteriocide) kìm khuẩn (bacteriostasis), với liều III giảm 30-40% Điều chứng tỏ việc xử lý bèo lục bình các chế phẩm vi khuẩn vi khuẩn+ nấm mốc cho hiệu phân giải cellulose cao B A Hình 4.9 Khả phân hủy lục bình lục bình phòng thí nghiệm (A: Thứ tự công thức Đối chứng, 9QN2 + 6NH1, 9QN2; B: Công thức Đối chứng 9QN2 + 6NH1) 4.7 Thử nghiệm khả xử lý phế thải rơm rạ sau trồng nấm chủng vi khuẩn đồng ruộng nhằm tạo phân hữu sinh học Tiếp tục tiến hành thử nghiệm xử lý phế thải rơm rạ sau trồng nấm chủng vi khuẩn 9QN2 điều kiện tự nhiên Sau 21 ngày tiến hành tiến hành cân khối lượng đống ủ Kết thu trình bày bảng 4.8 Công thức Khối lượng tươi (kg) Tỉ lệ vật chất khô (%) Ban đầu Sau xử lý 30 ngày % Giảm Sau xử lý 30 so với ĐC ngày % Giảm so với ĐC Đối chứng 1,77 - 0,69 - Vi khuẩn 9QN2 1,64 7,34 0,58 15,94 Vi khuẩn + nấm mốc 1,66 6,21 0,6 13,04 + Khối lượng tươi sơm rạ sau trồng nấm sau 21 ngày xử lý phòng thí nghiệm giảm từ 2kg xuống 1,77kg công thức đối chứng Các công thức 42 II có bổ sung chế phẩm vi khuẩn 9QN2 công thức III bổ sung chế phẩm vi khuẩn + nấm mốc khối lượng tươi giảm xuống 1,64 1,66kg so với ban đầu Như khối lượng tươi sơm rạ sau trồng nấm CT II CT III giảm xuống 7,34% 6,21% so với đối chứng Tỉ lệ nhìn chung thấp nguyên nhân tích nước mẫu rơm rạ sau trồng nấm công thức II III sau xử lý cao, nên chưa phản ánh hết khả phân giải chất xơ chủng vi sinh thí nghiệm Vì tiến hành sấy khô tuyệt đối mẫu phân tích để đánh giá tỉ lệ vật khô mẫu nghiên cứu + Tỉ lệ vật chất khô: Sau xử lý 21 ngày tỉ lệ vật chất khô công thức đối chứng 6,9% (khối lượng tươi) Trong đó, tỉ lệ mẫu có bổ sung vi khuẩn vi khuẩn+ nấm mốc giảm 7,34% 6,21% (trong lượng tươi) Như vậy, so với công thức đối chứng, tỉ lệ vật chất khô công thức II III giảm 13,04-15,94% Điều chứng tỏ việc xử lý bèo lục bình các chế phẩm vi khuẩn vi khuẩn+ nấm mốc cho hiệu phân giải cellulose cao Phân tích diễn biến mật độ vi sinh vật khối ủ định kỳ ngày/lần vòng 21 ngày sau xử lý Kết thu thể qua bảng bảng 4.7 hình 4.10 hình 4.11 Bảng 4.8 Diễn biến mật độ vi khuẩn sau xử lý phế thải trồng nấm Công thức xử lý Ban đầu ngày SXL 14 ngày SXL 21 ngày SXL 5,29 2,73 0,96 0,48 - Vi khuẩn 9QN2 2,72 1,39 0,46 0,14 - Nấm mốc 6NH1 2,85 1,90 0,52 0,25 I Vi khuẩn - Chủng 9QN2 II Vi khuẩn + Nấm mốc Mật độ tế bào CFU/gam (x 109) 43 Hình 4.10 Đồ thị đường biểu diễn mật độ vi khuẩn theo thời gian công thức thử nghiệm xử lý rơm rạ sau trồng nấm + Công thức xử lý rơm rạ chế phẩm vi khuẩn 9QN2: tiến hành bổ sung chế phẩm vi khuẩn cellulose vào khối ủ (rơm rạ sau trồng nấm) với tỉ lệ cấy giống 5% có mật độ tế bào 5,29 x 109CFU/gam Sau 21 ngày xử lý, mật độ tế bào vi khuẩn giảm dần từ 2,73 x 10 9CFU/g (sau ngày ủ) xuống 0,48 CFU/g (sau 21 ngày ủ) + Công thức xử lý rơm rạ chế phẩm vi khuẩn 9QN2 kết hợp Chúng nấm mốc 6NH1với tỉ lệ cấy giống 2,5% chế phẩm vi khuẩn + 2,5% chế phẩm nấm mốc, mật độ tế bào ban đầu chủng là: 2,72 3,46 x 109CFU/g Sau 21 ngày xử lý, mật độ tế bào vi khuẩn giảm dần từ 1,39 x 109CFU/g (sau ngày ủ) xuống 0,14 x 109 CFU/g (sau 21 ngày ủ) Từ hình 4.11 4.12 cho thấy sau 21 ngày ủ, công thức bổ sung vi khuẩn công thức bổ sung vi khuẩn + nấm mốc (9QN2 + 6NH1) rơm rạ sau trồng nấm bị phân hủy hoai mục hơn, khối lượng giảm rõ rệt 44 Có chứa chủng vi khuẩn 9QN2 Đối chứng Hình 4.11.Phân hữu thu ủ rơm rạ sau trồng nấm chủng vi khuẩn 9QN2 21 ngày Hình 4.12 Phân hữu thu ủ rơm rạ sau trồng nấm công thức 9QN2 + 6NH1 21 ngày 45 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Kết nghiên cứu bước đầu rút kết luận sau: Phân lập 128 chủng vi khuẩn có khả phân giải cellulose Số lượng vi khuẩn mẫu đất phân lập biến động từ 36,24 - 461,60 x 10 CFU/g đất khô, pH đất biến động khoảng 4,4 - 8,7 Xác định hoạt độ enzyme cellulase phương pháp khuếch tán môi trường thạch đĩa Qua sơ tuyển, chọn chủng vi khuẩn có khả phân giải cellulose mạnh Bao gồm 111TH; 114TH; 128TH; 9QN2 tương ứng vòng phân giải 1,3 cm, 1,5 cm, 1,2 cm 1,1 cm Thăm dò điều kiện nuôi cấy tối ưu cho sinh trưởng phát triển vi khuẩn phân giải cellulose: + Thăm dò thời gian thích hợp cho hoạt động sinh tổng hợp enzyme cellulase chủng vi khuẩn tuyển chọn So sánh hoạt độ ezyme cellulase chủng vi khuẩn chọn lọc cho thấy chủng 9QN2 sau ngày nuôi cấy lắc có kích thước vòng phân giải lớn môi trường CMC + agar 0.8 cm Các chủng lại có kích thước vòng thủy phân dao động từ 0,5 - 0,7 cm Vì chọn chủng 9QN2 làm đối tượng nghiên cứu cho cho thí nghiệm + Thăm dò nguồn carbon thích hợp cho hoạt động sinh tổng hợp enzyme cellulase chủng vi khuẩn tuyển chọn Kết cho thấy chủng vi khuẩn 9QN2 có khả phân giải cellulose mạnh nguồn carbon khác Tuy nhiên, hoạt tính cellulase cao CT4 Cám gạo:bột bắp tỷ lệ 1:1, đạt 1,7 cm Xác định hoạt độ enzyme cellulase phương pháp định lượng đường khử DNS (acid Dinitro-salicylic) Từ hàm lượng đường khử đo được, nhận thấy chủng vi khuẩn 9QN2 nuôi môi trường Cám gạo (CT1) cho hoạt lực cellulase mạnh nhất, nhiên không chênh lệch nhiều so với môi trường Cám gạo:Bột bắp (CT4) (thấp 0,02mg/ml) Thử nghiệm khả phân giải bèo lục bình chủng vi khuẩn 9QN2 phòng thí nghiệm xử lý phế thải rơm rạ sau trồng nấm chủngvi khuẩn 9QN2 đồng ruộng nhằm tạo phân hữu sinh học 46 5.2 Đề nghị Qua nghiên cứu nhận thấy chủng vi khuẩn 9QN2 có khả sản sinh enzyme cellulase có hoạt tính tương đối cao Vì cần tiếp tục nghiên cứu thêm đặc tính sinh học chúng tính chất cellulase để ứng dụng vào thực tiễn sản xuất đời sống chế biến phụ phẩm, xử lý chất thải, phối hợp với enzyme khác để sản xuất phân hữu cơ, phân vi sinh… - Tiếp tục phân lập vi khuẩn mẫu đất, số địa phương khác để chọn lọc chủng vi khuẩn có hoạt tính cellulase mạnh - Nghiên cứu số điều kiện nuôi cấy nitrogen, độ ẩm, nhiệt độ, pH… cho hoạt động tổng hợp enzyme chủng 9QN2 47 PHẦN TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Nguyễn Lân Dũng, 1984 Vi sinh vật chuyển hóa hợp chất carbon, nitơ NXB KH & KT Hà Nội [2] Nguyễn Lân Dũng, Phạm Văn Ty, Nguyễn Đăng Đức, Nguyễn Đình Quyết tác giả khác, 1978 Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học tập III NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội [3] Nguyễn Lân Dũng, Phạm Văn Ty, 1980 Vi sinh vật học, Tập II, nhà xuất Đại học Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội [4] Nguyễn Đường, Nguyễn Xuân Thành, 1999 Giáo trình sinh học đất, NXB Nông nghiệp Hà Nội [5] Nghiêm Ngọc Minh, Nguyễn Thị Thịnh, Đàm Thúy Hằng, Đặng Thị Cẩm Hà, 2008 Nghiên cứu đặc điểm phân loại xác định hoạt tính cellulase chủng vi khuẩn chịu nhiệt BSS2 phân lập bãi rác Nam Sơn, Hà Nội Tạp chí Công nghệ sinh học [6] Nguyễn Hoài Nam, 1986 Xác định hoạt lực kháng sinh vi sinh vật, tập I NXB KH & KT Hà Nội [7] Lê Xuân Phương, 2008 Bài giảng vi sinh vật học môi trường Đại học Bách khoa Đà Nẵng [8].Võ Văn Phước Quệ Cao Ngọc Điệp Tạp chí Khoa học 2011:18a 177 - 184 Phân lập nhận diện vi khuẩn phân giải cellulose Trường Đại học Cần Thơ [9] Lê Ngọc Tú tác giả, 1982 Enzym vi sinh vật học, tập II NXB KH & KT Hà Nội [10] Lê Văn Tú tác giả., 1997 Hóa sinh học công nghiệp NXB ĐH THCN Hà Nội [11] Trần Thị Ánh Tuyến, Trương Quốc Huy Đề tài nghiên cứu khoa học, 2010 Khảo sát điều kiên nuôi cấy phương pháp tách chiết enzyme cellulase từ vi khuẩn Bacillus asublitis Đại học Bách khoa Đà Nẵng [12] Phan Thị Mộng Tuyền 2012 Phân lập tuyển chọn số dòng vi khuẩn phân hủy cellulose từ dịch rác thải, luận văn Đại học, Đại học Cần Thơ 48 [13] Ngô Thị Hồng Vạn, 2011 Nghiên cứu tuyển chọn số chủng xạ khuẩn có khả phân giải yếu tố ảnh hưởng đến trình nuôi cấy chúng Khóa luận tốt nghiệp Đại học Nông lân Huế [14] Lý Phương Vũ, Đề tài tốt nghiệp, 2012 Phân lập tuyển chọn vi khuẩn phân hủy cellulose từ bã mía để xử lý chất trồng nấm linh chi Đại học Cần Thơ [15].http://archive.microbelibrary.org/ASMOnly/Details.asp?ID=392 [16].http://www.baothuathienhue.vn/?gd=1&cn=1&id=256&newsid=1-1339004 [17].http://www.botany.utexas.edu/facstaff/facpages/mbrown/movies/movi es.htm [18].http://en.citizendium.org/wiki/File:Bacillus_subtilis_Gram.jp [19].http://encyclopedia2.thefreedictionary.com/Cellulomonas [20] 20.http://genome.jgipsf.org/cythu/cythu.home.html [21].http://www2.hcmuaf.edu.vn/data/quoctuan/Nhom%202_1.pdf [22].http://luanvan.co/luan-van/phan-lap-va-tuyen-chon-mot-so-chung-visinh-vat-co-kha-nang-sinh-enzyme-cellulase-tu-rong-giay-tai-hon-chong-nhatrang-36317/ [23].http://microbewiki.kenyon.edu [24].http://vi.wikipedia.org/wiki/Vi_khu%E1%BA%A9n [25].http://voer.edu.vn/m/su-phan-bo-cua-vi-sinh-vat-trong-moi-truong-tunhien/80ca8bd8 49 PHẦN PHỤ LỤC 7.1 Hình ảnh trình nghiên cứu A B Hình 7.1.Một số thao tác phòng thí nghiệm (A: Cấy chuyền giống; B: Phân lập đất) Hình7.2 Vòng phân giải chủng 9QN2 114TH sau ngày nuôi cấy Hình 7.3.Vòng phân giải chủng 128TH 111TH sau ngày nuôi cấy 7.2 Bảng số liệu Bảng7.1 Nồng độ Glucose chuẩn nồng độ glucose (mg/ml) 0.2 0.4 0.6 0.8 OD 0.151 0.47 0.806 1.078 1.322 Bảng 7.3 Mô tả hình thái chủng vi khuẩn phân lập STT Chủng Mô tả hình thái khuẩn lạc 1 NH2 Vàng nhạt, nhầy nhớt, dẹt, mép không 2 NH2 Vàng nhạt, nhầy nhớt, dẹt, mép không NH2 Trắng sữa, dẹt, vòng tròn đồng tâm QN1 Trắng sữa, nhăn nheo, không QN1 Trắng sữa, nhăn nheo, không NH2 Trắng sữa, tròn không đều, nhầy nhớt NH2 Trắng sữa, tròn không đều, nhầy nhớt NH1 Tia tâm, tròn đều, màu trắng sữa,tia NH1 Trắng sữa, tròn không đều, nhầy nhớt 10 QN2 Màu trắng sữa, mặt gồ ghề, nhăn nheo 11 QN2 Màu trắng sữa, mặt gồ ghề, nhăn nheo 12 QN2 Màu trắng sữa, mặt gồ ghề, nhăn nheo 13 10 QN2 Trắng, rìa không 14 10 QN2 Trắng, rìa không 15 11 QN2 Vàng nhạt, nhăn nheo, nhầy nhớt, dẹt, có vòng đồng tâm 16 12 QN2 Màu vàng nhạt, nhầy nhớt, bờ tròn 17 13 QN2 Tia tâm, tròn đều, màu trắng sữa,tia 18 14 NH2 Hơi vàng, nhầy nhớt, lồi dày, bờ 19 15 NH2 Hơi vàng, nhầy nhớt, lồi dày, bờ 20 16 NH2 Trắng trong, nhầy nhớt, tròn đều, có vòng đồng tâm 21 17 NH2 Trắng sữa, tròn đều, vòng đồng tâm, nhầy nhớt 22 18 NH1 Trắng đục, nhầy nhớt, bờ không 23 19 NH1 Trắng đục, nhầy nhớt, bờ không 24 20 NH1 Nhầy nhớt, trắng sữa, bò lan 25 21 NH1 Trắng sữa, nhầy nhớt, dẹt, bờ không 26 22 NH1 Trắng sữa, nhầy nhớt, dẹt, bờ không 27 23 NH1 Nhầy nhớt, trắng sữa, bò lan 28 24 HS3 Vàng, Nhầy nhớt, lồi, 29 25 HS3 Trắng sữa, nhầy nhớt, dẹt, bờ không 30 26 HS3 Tia tâm, tròn đều, màu trắng sữa,tia 31 27 HS3 Trắng, rìa không 32 28 HS3 Vàng nhạt, nhăn nheo, nhầy nhớt, dẹt, có vòng đồng tâm 33 29 HS5 Trắng sữa, bờ không đều, bò lan 34 30 HS5 Vàng nhạt, nhầy nhớt, dẹt 35 31 HS5 Vàng nhạt, nhầy nhớt, dẹt 36 32 HS5 Màu trắng sữa, không nhây nhớt, có vòng đồng tâm 37 33 HS1 Màu trắng sữa, không nhây nhớt, có vòng đồng tâm 38 34 HS1 Nhầy nhớt, có vòng đồng tâm, màu mỡ gà, tròn 39 35 HS1 Tia tâm, tròn đều, màu trắng sữa,tia 40 36 HS6 Màu vàng nhạt, nhầy nhớt, bờ tròn 41 37 HS6 Màu vàng, nhầy nhớt, có rìa 42 38 HS3 Màu vàng, có vòng đồng tâm, lan rộng 43 39 HS3 Không nhầy nhớt, màu mỡ gà, có ria bờ 44 40 HS2 Hơi vàng, nhầy nhớt, lồi dày, bờ 45 41HS2 Vàng nhạt, vòng đồng tâm, có ria, nhầy nhớt 46 42HS4 Màu vàng tươi, lan đều, nhầy nhớt 47 43HS4 Tia tâm, tròn đều, màu trắng sữa,tia 48 44 NH Nhầy nhớt, màu trắng sữa, bò lan 49 45 NH Màu trắng sữa, tròn, bờ không đều, mặt nhăn nheo 50 46 NH Nhầy nhớt, màu trắng sữa, bò lan 51 47 TH Trắng sữa, bờ không đều, bò lan 52 48 NH Tròn, nhầy nhớt, có vòng tròn đồng tâm 53 49 NH Nhầy nhớt, tròn 54 50 NH Nhầy nhớt, tròn có vòng tròn đông tâm 55 51 NH Trắng đục, nhầy nhớt 56 52 NH Trắng vàng, nhây nhớt, bờ tròn 57 53 NH Nhầy nhớt, lan tròn đều, màu vàng 58 54 TH Nhầy nhớt, lan tròn đều, màu vàng 59 55 TH Vàng nhạt, vòng đồng tâm, có ria, nhầy nhớt 60 56 TH Không nhầy nhớt, màu mỡ gà, có ria bờ 61 57 PY Màu vàng tươi, lan đều, nhầy nhớt 62 58 NH Màu vàng tươi, lan đều, nhầy nhớt 63 59 NH Tròn, nhầy nhớt, có vòng tròn đồng tâm 64 60 PY Nhầy nhớt, tia xung quanh, lan rộng, màu mỡ gà 65 61 TH Nhầy nhớt, tia xung quanh, lan rộng, màu mỡ gà 66 62 PY Vòng tròn đồng tâm, nhầy nhớt, màu mỡ gà, lan 67 63 PY Màu trắng sữa, nhầy nhớt, lan 68 64 TH Nhầy nhớt, tia xung quanh, lan rộng, màu mỡ gà 69 65 TH Nhầy nhớt, rìa không 70 66 PY Lan tròn đều, nhầy nhớt 71 67 TH Nhầy nhớt, tia xung quanh, lan rộng, màu mỡ gà 72 68 PY Nhầy nhớt, lan đều, có vòng đồng tâm 73 69 PY Màu trắng sữa, không nhây nhớt, có vòng đồng tâm 74 70 TH Nhầy nhớt, lan tròn đều, màu vàng 75 71 TH Nhầy nhớt, lan tròn đều, màu vàng 76 72 TH Màu vàng nhạt, tròn lồi 77 73 TH Trắng sữa, dẹt, không nhầy nhớt, có vòng đồng tâm 78 74 TH Tròn đều, nhầy nhớt, màu mỡ gà 79 75 TH Không nhầy nhớt, màu mỡ gà, có ria bờ 80 76 PY Vàng nhạt, vòng đồng tâm, có ria, nhầy nhớt 81 77 PY Màu trắng trong, nhầy nhớt, lan tròn 82 78 TH Màu vàng, có vòng đồng tâm, lan rộng 83 79 TH Nhầy nhớt, tia xung quanh, lan rộng, màu mỡ gà 84 80 TH Màu vàng tươi, lan đều, nhầy nhớt 85 81 TH Màu mỡ gà, nhầy nhớt, lan 86 82 TH Nhầy nhớt, tròn đều, lan rộng, màu mỡ gà 87 83 TH Màu trắng, đồng tâm, có ria 88 84 TH Vòng tròn đồng tâm, nhầy nhớt, lồi 89 85 TH Trắng, không nhầy nhớt, có ria 90 86 TH Trắng, không nhầy nhớt, có ria 91 87 TH Trắng sữa, nhầy nhớt 92 88 TH Vàng nhạt, tròn đều, nhầy nhớt 93 89 TH Màu vàng, tròn đồng tâm, nhầy nhớt tròn 94 90 TH Dỏ gạch, nhầy nhớt, tràn đều, lồi 95 91 PY Lồi, nhầy, rìa không nhầy, màu mỡ gà 96 92 PY Nhầy nhớt, bờ không đều, rìa mọc lan 97 93 PY Nhầy nhớt, dẹt, có rìa bờ 98 94 PY Nhầy nhớt, mỡ gà, lan tròn 99 95 PY Tròn đều, ria từ tâm ngoài, màu vàng 100 96 PY Nhầy nhớt, mỡ gà, ria không 101 97 PY Nhầy nhớt, mỡ gà, ria không 102 98 TH Nhầy nhớt, có vòng đồng tâm, màu mỡ gà, tròn 103 99 TH màu vàng nhạt, có vòng tròn đồng tâm, có rìa bờ 104 100 TH Nhầy nhớt, có vòng đồng tâm, màu mỡ gà, tròn 105 101 TH Bề mặt nhầy nhớt, tròn đều, màu mỡ gà 106 102 TH Màu vàng, lồi, tròn 107 103 TH Nhầy nhớt, có vòng đồng tâm, màu mỡ gà, tròn 108 104 TH Không nhầy nhớt, có ria, lan rộng không 109 105 TH Màu vàng nhạt, có rìa 110 106 TH Trắng sữa, lồi, tròn 111 107 TH Có tâm, viền có rìa, màu trắng xám, nhầy nhớt 112 108 TH Vàng, lan rộng, rìa không 113 109 TH Màu mỡ gà, nhầy nhớt, lan rộng, không 114 110 TH Trắng sữa, lồi, tròn 115 111 TH Trắng đục, nhầy nhớt 116 112 TH Trắng, tròn đều, lồi 117 112 TH Trắng, tròn đều, lồi 118 114 TH Tròn đều, nhầy nhớt, có vòng đồng tâm 119 115 TH Trắng sữa, lồi, tròn 120 116 TH Vàng, nhầy nhớt 121 117 TH Tâm vàng đậm, vàng, có vòng đồng tâm 122 118 TH Màu mỡ gà, nhầy nhớt, lồi, tròn đều, lan rộng 123 119 TH Vàng nhạt, nhầy nhớt, dẹt 124 120 TH Màu trắng sữa, nhầy nhớt, lồi 125 121 PY Màu mỡ gà, lan đều, có ria 126 122 TH Màu trắng sữa, nhầy nhớt, có tâm 127 123 TH Tròn đều, nhầy nhớt, màu trắng đục 128 124 TH Hơi vàng, không tròn, nhầy nhớt 129 125 TH Màu vàng, nhầy nhớt, có rìa 130 126 TH Nhầy nhớt, tròn đều, tâm sẫm màu 131 127 PY Trắng sữa, tròn 132 128 TH Trắng sữa, nhầy nhớt, lồi, tròn 7.3 Kết xử lý thống kê LSD All-Pairwise Comparisons Test of OD for Công Công Mean 0.1430 0.1232 0.1210 0.1093 0.1061 0.1033 0.1004 Homogeneous Groups A AB AB AB B B B Alpha 0.05 Standard Error for Comparison Critical T Value 2.011 Critical Value for Comparison There are groups (A and B) in which the means are not significantly different from one another 0.0168 0.0338 [...]... Vòng phân giải của một số chủng vi khuẩn trên môi trường thạch đĩa (A:vòng phân giải chủng 114TH; B: vòng phân giải chủng 111TH; C: vòng phân giải chủng 128TH; D: vòng phân giải chủng 9QN2) Qua kết quả bảng 4.2 cho thấy, khả năng phân giải cellulose của các chủng vi khuẩn phân lập được không đồng đều, thể hiện ở năng lực sinh trưởng trên nguồn cơ chất CMC Số chủng vi khuẩn có đường kính vòng phân giải. .. hưởng của một số ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến khả năng sinh tổng hợp cellulase Ngoài ra đã có rất nhiều đề tài và nghiên cứu khoa học về ứng dụng của vi khuẩn phân giải cellulose như đề tài phân lập tuyển chọn và vi khuẩn phân hủy cellulose từ bã mía để xử lý cơ chất trồng nấm linh chi; Phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn phân hủy cellulose từ dịch rác thải; Phân lập một số dòng vi. .. cellulase của vi khuẩn 2.5 Tình hình nghiên cứu và sử dụng phân vi sinh phân giải cellulose Phân bón vi sinh vật phân giải cellulose (phân vi sinh phân giải cellulose) là sản phẩm chứa một hay nhiều chủng vi sinh vật sống, đã được tuyển chọn với mật độ đạt theo tiêu chuẩn hiện hành có khả năng phân giải cellulose, để cung cấp chất dinh dưỡng cho đất và cây trồng, tạo điều kiện nâng cao năng xuất và chất... chiếm số lượng lớn 75 chủng, tỷ lệ 58,6% Chỉ có 17 chủng vi khuẩn có đường kính vòng phân giải từ 0,6 - 1cm (13,3%) Mạnh nhất gồm 5 chủng có 32 vòng phân giải lơn hơn 1cm, tỷ lệ 3,9% Trong số các chủng vi khuẩn có hoạt lực rất mạnh, chúng tôi tuyển chọn ra 4 chủng 9QN2, 111TH, 114TH, 128TH có kích thước vòng phân giải lớn Trong đó, chủng 114TH có đường kính vòng phân giải cao nhất 1,5cm, còn lại các chủng. .. Phân lập một số dòng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose trong bã trấu đang hoa mục, 2012 của Đại học Cần Thơ; Phân lập và nhận diện vi khuẩn phân giải cellulose, của Võ Văn Phước Quệ và Cao Ngọc Điệp; Tìm hiểu khả năng phân giải cellulose của vi sinh vật phân lập từ chất thải rắn của nhà máy FOCOCEV của Nguyễn Ngọc Trúc Ngân & Phạm Thị Ngọc Lan năm 2014; Phân lập một số chủng vi sinh vật ứng dụng... enzyme cellulase của vi khuẩn được tuyển chọn 23 - Thử nghiệm khả năng phân giải bèo lục bình của các chủng vi khuẩn trong phòng thí nghiệm - Thử nghiệm khả năng xử lý phế thải rơm rạ sau trồng nấm của chủng chủng vi khuẩn ngoài đồng ruộng nhằm tạo phân hữu cơ sinh học - Đánh giá chất lượng phân hữu cơ tạo thành 3.4.2.Phương pháp nghiên cứu 3.4.2.1 Phương pháp phân lập và xác định số lượng vi khuẩn * Chuẩn... bảng 4.3 Bảng 4.3 Hoạt độ enzyme cellulase của các chủng vi khuẩn chọn lọc Đường kính vòng phân giải Chủng D - d (cm) 111TH 0,5 ± 0,2 114TH 0,7 ± 0,2 128TH 0,5 ± 0,1 9QN2 0,8 ± 0,3 Hình 4.3 Hoạt tính cellulase của 2 chủng vi khuẩn 111TH và 128TH 33 Hình 4.4 Hoạt tính cellulase của 2 chủng vi khuẩn 9QN2 và 128TH So sánh hoạt độ ezyme cellulase của 4 chủng vi khuẩn chọn lọc cho thấy chủng 9QN2 sau 3 ngày... như sự hiện diện của các vi khuẩn cộng sinh trong ruột già giúp ngăn cản sự phát triển của các vi sinh vật có hại Vi khuẩn có khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ một cách đáng kinh ngạc Một số nhóm vi sinh "chuyên hóa" đóng một vai trò rất quan trọng trong vi c hình thành các khoáng chất từ một số nhóm hợp chất hữu cơ Ví dụ, sự phân giải cellulose, một trong những thành phần chiếm đa số trong mô thực... sinh tổng hợp enzyme có trong điều kiện tự nhiên rất phong phú Chúng thuộc nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn và trong một số trường hợp các nhà khoa học còn thấy cả nấm men cũng tham gia vào quá trình phân giải này Sau đây là một số chủng vi sinh vật được các nhà khoa học nghiên cứu kỹ nhất [22] Bảng 2.1 Một số chủng vi sinh vật được các nhà khoa học nghiên cứu kỹ nhất Nấm sợi Xạ khuẩn Vi khuẩn Aspergillus... NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1 Sự phân bố về số lượng của vi khuẩn phân giải cellulose trong các mẫu phân lập Từ các mẫu đất trồng, rác thải, mùn cưa thu trên địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế, và Quản Nam tiến hành phân lập trên môi trường MPA và vinogradski thạch đĩa (bổ sung CMC 10%) Số lượng khuẩn lạc vi khuẩn phân giải cellulose trong các mẫu đất nghiên cứu được trình bày ở bảng 4.1 Bảng 4.1 .Số lượng vi ... 58,6% Chỉ có 17 chủng vi khuẩn có đường kính vòng phân giải từ 0,6 - 1cm (13,3%) Mạnh gồm chủng có 32 vòng phân giải lơn 1cm, tỷ lệ 3,9% Trong số chủng vi khuẩn có hoạt lực mạnh, tuyển chọn chủng. .. chủng vi khuẩn có khả phân giải cellulose mạnh + Đánh giá khả phân giải cellulose chủng vi khuẩn có hoạt lực enzyme mạnh nhằm đưa vào ứng dụng thực tế + Nắm phương pháp nghiên cứu, theo dõi phân. .. Phân lập, tuyển chọn nghiên cứu hoạt lực số chủng vi khuẩn có khả phân giải celulose 1.2.Ý nghĩa đề tài + Vi c tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính phân giải cellulose mạnh thích nghi với điều