Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại đường bổ sung lên khả năng sinh tổng hợp exopolysaccharide bởi vi khuẩn lactic được tuyển chọn từ 4 chủng lactobacillus plantarum w1, w3, w5, n5

PHẦN ĐẶT VẤN ĐỀ Khoa học – công nghệ ngày tiến thúc đẩy người tiếp cận gần với giới sinh vật nói chung hệ vi sinh vật nói riêng Điều tạo nên thành công nghiên cứu ứng dụng vi sinh nhà khoa học Một thành nghiên cứu kể đến ứng dụng đặc tính chế phẩm tạo vi khuẩn lactic vào công nghiệp thực phẩm nhiều lĩnh vực khác Vi khuẩn lactic nhóm vi khuẩn có mặt phổ biến sản phẩm lên men Chúng tác nhân trình lên men lactic, lồi vi khuẩn cịn có tiềm sinh probiotic, có khả tổng hợp bacteriocin exopolysaccharide Trong đó, exopolysaccharide mang lại nhiều ứng dụng quan lĩnh vực khác Bên cạnh, đóng vai trị cho hoạt động sống tế bào, exopolysacchride sử dụng để làm chất phụ gia hoàn thiện cấu trúc sản phẩm như: chất tạo gel, chất làm dày, chất ổn định hồn thiện tính lưu biến sản phẩm thực phẩm [32] Ngồi ra, EPS cịn có hoạt động sinh học hoạt tính chống ung thư, kích thích miễn dịch, hoạt động giảm cholesterol hoạt động chống oxy hóa [40] Exoplysaccharide tách chiết từ nhiều nguồn khác từ thực vật hay vi sinh vật Tuy nhiên việc tách chiết EPS từ nguồn thực vật có nhiều hạn chế, chúng liên kết với số thành phần tế bào thực vật nên q trình tách khó khăn đưa vào sử dụng phải qua xử lí số phương pháp hóa học, ezyme để hồn thiện tính chất chúng Trong việc tách chiết EPS từ vi sinh vật lại có nhiều ưu điểm chu kỳ sinh trưởng phát triển ngắn, môi trường ni cấy tiền, dễ điều khiển q trình sản xuất Nên xác định điều kiện thích hợp để khả sinh exopolysaccharide cao đem lại nguồn polysaccharide dồi mở tiềm ứng dụng polysaccharide từ vi sinh vật vào lĩnh vực khác Sản lượng, kích thước thành phần hố học polysaccharide hình thành exopolysaccharide chủ yếu phụ thuộc vào chủng, điều kiện nuôi cấy thành phần môi trường sử dụng [15] Xuất phát từ thực tế nêu trên, tiến hành để tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng loại đường bổ sung lên khả sinh tổng hợp exopolysaccharide vi khuẩn lactic tuyển chọn từ chủng Lactobacillus plantarum W 1, W3, W5, N5” Nhằm xác định điều kiện tốt để chủng Lactobacillus plantarum sinh tổng hợp EPS, tạo tiền đề cho trình nghiên cứu ứng dụng Nội dung nghiên cứu - Khảo sát khả sinh tổng hợp exopolysaccharide từ bốn chủng Lactobacillus plantarum (W1, W3, W5, N5) để tuyển chọn chủng có khả sinh tổng hợp EPS cao - Khảo sát ảnh hưởng loại đường bổ sung lên khả sinh tổng hợp exopolysaccharide chủng L plantarum tuyển chọn - Khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả sinh tổng hợp EPS chủng L plantarum tuyển chọn PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan vi khuẩn lactic 2.1.1 Đặc điểm chung vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic (LAB) xếp chung vào họ Lactobacteriaceae Chúng khơng đồng mặt hình thái, giống vi khuẩn khác có hình dạng kích thước khác Chúng gồm vi khuẩn dạng hình que dạng hình cầu Đường kính cầu khuẩn lactic từ 0,5- 1,5 µm, tế bào hình cầu dạng đơn xếp thành cặp, đám chuỗi có chiều dài khác Kích thước tế bào trực khuẩn lactic từ 1-8 µm, tế báo đứng riêng lẻ, xếp thành đôi thành chuỗi Tuy nhiên mặt sinh lí, vi khuẩn lactic tương đối đồng Chúng vi khuẩn Gram dương, khơng hình thành bào tử, nhìn chung khơng di động, thử nghiệm catalase âm tính, khơng có cytochrome hơ hấp kỵ khí tùy tiện [1], [2], [13] Vi khuẩn lactic thu nhận lượng nhờ trình phân giải cacrbohydrate tạo thành axit lactic, ngồi sản phẩm axit lactic, chúng sản sinh axit acetic, ethanol, hợp chất thơm, bacteriocin, exopolysaccharide số enzyme quan trọng khác Chúng có khả lên men nhiều loại đường đơn đường đơi khơng có khả lên men loại cacbonhydrate phức tạp tinh bột, có lồi L.delbrueckii đồng hóa tinh bột Một số vi khuẩn lactic dị hình sử dụng pentose axit xitric Sự phát triển vi khuẩn lactic cần có mặt pepton, amino axit hay muối amoni Chúng có yêu cầu đặc biệt chất dinh dưỡng giàu vitamin, amino axit khống chất Vì người ta thường nuôi chúng môi trường dinh dưỡng phức tạp chứa số lượng lớn cao nấm, dịch đường [4] Các lồi vi khuẩn lactic khác tạo thành axit lactic khác môi trường sức chịu axit khác Đa số trực khuẩn lactic đồng hình tạo thành axit lactic cao liên cầu khuẩn Các trực khuẩn phát triển pH 3,8-4,5 hoạt lực lên men tốt trực khuẩn vùng pH 5,5- Các vi khuẩn lactic ưa lạnh phát triển nhiệt độ tương đối thấp (5 0C thấp hơn), loài ưa ấm có nhiệt độ sinh trưởng tối thích 25-35 0C, lồi ưa ấm nhiệt độ tối thích 40-450C Chúng phân bố rộng tìm thấy thực vật, sản phẩm sữa tươi sữa chế biến, sản phẩm thịt chế biến lên men, loại rau lên men đường tiêu hóa người, động vật chim [1] 2.1.2 Phân loại vi khuẩn lactic Orla-Jensen sử dụng đặc điểm sau sở để phân loại vi khuẩn lactic: hình thái, hình thức lên men đường glucose, khả phát triển nhiệt độ khác nhau, mức độ sử dụng đường Ông phân chúng thành bốn chi: Lactobaccillus, Leuconostoc, Pediococcus Streptococcus [13] Ngày người ta bổ sung thêm chi Bifidobacterium có hình dạng biến đổi 2.1.2.1 Lactobacillus Chi Lactobacillus chi lớn nhóm vi khuẩn lactic, có chứa 166 lồi [12] Tế bào chúng có dạng hình que thay đổi từ trực khuẩn ngắn đến dài, mảnh tương đối dày, thường uốn cong đứng dạng tế bào đơn độc đứng thành chuỗi từ ngắn đến dài Chúng kỵ khí khơng bắt buộc hay vi hiếu khí Chúng ưa ấm (nhưng số lồi dinh dưỡng lạnh), nhiệt độ sinh trưởng dao động từ đến 50 0C Nhưng hầu hết loài sử dụng làm giống lên men thực phẩm có kiểm sốt sinh trưởng tốt khoảng 25- 400C Một số loài tham gia vào lên men tự nhiên số loại thực phẩm nhiệt độ thấp, sinh trưởng tốt 10-250C Lactobaccillus lên men lactic đồng hình dị hình.Chúng lên men đường lactose, saccharose, fructose, glucose galactose số lồi len men đường pentose Tùy loài, chúng sinh trưởng nguồn cacbonhydrate làm giảm pH tới 3,5 5, Chúng có vai quan trọng việc trì ổn định cân hệ vi sinh thể, tạo lợi ích sức khỏe cho vật chủ, ức chế số vi sinh vật gây bệnh Nhiều loài sử dụng làm chất bảo quản sinh học cho thực phẩm có lồi gây hư hỏng thực phẩm L delbrueckii subsp bulgaricus, L plantarum, L helveticus sử dụng chế biến sinh học thực phẩm dùng để lên men sữa, rau, thịt sản xuất bột làm bánh L acdophilus, L reuteri, L Casei subsp casei sử dụng làm chế phẩm probiotic L plantarum, L fermentum… tổng hợp exopolysaccharide tạo hương vị, cấu trúc tốt cho sản phẩm sữa khác Một số chủng có khả sinh bacteriocin[1],[13] 2.1.2.2 Leuconostoc Chi Leuconostoc gồm vi khuẩn có tế bào hình cầu đến hình hạt đậu xếp thành cặp chuỗi ngắn, kỵ khí khơng bắt buộc, ưa ấm số lồi chủng sinh trưởng (hoặc dưới)3 0C Các loài sinh trưởng tốt 200C 30 0C, với phạm vi từ tới 37 0C Một số lồi tồn 600C 30 phút Leuconostoc lên men lactic dị hình lên men glucose với pH giảm tới 4,5 đến 5,0 Nhiều lồi (điển hình Leu mesenteroides subsp dextranicum) sản sinh dextran sinh trưởng đường saccharose Chúng không thủy phân arginin sử dụng citrate có trái cây, rau, sữa để sản sinh diaxetyl góp phần hình thành nên hương thơm bơ Leu mesenteroides ứng dụng sản xuất loại bacteriocin có tác dụng chống lại vi khuẩn Listeria monocytogenes (gây ngộ độc thực phẩm) không gây ảnh hưởng đến vi sinh vật hữu ích khác Leu mesenteroides ssp cremoris Leu lactic sử dụng lên men sữa lên men rau [1,], [16] 2.1.2.3 Pediococcus Chi Pediococcus cầu khuẩn, thường dính lại với thành cặp đơi bốn, kỵ khí khơng bắt buộc, ưa ấm sinh trưởng tốt 25 0C 400C Một số loài sinh trưởng 50 0C sống sót sau khử trùng Pauster Chúng lên men lactic đồng hình, lên men glucose tùy thuộc vào lồi, chúng lên men saccharose, arabinose, ribose xylose Một số loài làm giảm pH xuống 3,6 nên chúng xem vi khuẩn chịu axit Nhìn chung, chúng khơng lên men lactose Pediococcus acidilactici Ped pentosaceus dùng để lên men rau, quả, thịt, ngũ cốc loại thực phẩm khác Chúng tham gia vào chín tạo thành hương vị vài loại phomat dạng giống thứ cấp,có khả sinh bacterioxin dùng để sản xuất chế phẩm bảo quản cá Ped damnosus tác nhân làm hỏng bia, phát triển tạo thành diacetyl acetoin làm bia có vị giống bơ [1] 2.1.2.4 Streptococcus Chi Streptococcus vi khuẩn có dạng hình cầu hình trứng, đứng thành cặp thành chuỗi dài, kỵ khí bắt buộc, ưa ấm sinh trưởng tốt 37 tới 40 0C sinh trưởng 52 0C Chúng sống 60 0C 30 phút Streptococcus chủ yếu lên men lactic đồng hình, lên men đường glucose làm giảm pH xuống 4,0 Chúng lên men đường fructose, mannose lactose nói chung khơng lên men galactose saccharose [1] Mặc dù có phân tách tạo thành chi mới, chi Streptococcus chi lớn khó phân loại cách hồn hảo Nhìn chung chi phân thành ba nhóm: sinh mủ, miệng liên cầu khuẩn Streptococci “khác” Nhóm sinh mủ có chữa số tác nhân gây bệnh bật Str pyogenes Str agalactiae Str pyogenes tác nhân gây bệnh liên quan tới bệnh phát sinh từ thưc phầm, có mặt dạng hội sinh đường hô hấp người Một tác nhân khác Str pneumonia trước thuộc nhóm chuyển qua nhóm miệng Streptococcus thermophilus sử dụng lên men sữa, có mặt sữa tươi xếp vào nhóm Streptococcus miệng [19] 2.1.2.5 Bifidobacterium Bifidobacterium trực khuẩn, tế bào có hình dạng kích thước khác nhau, đứng đơn độc thành chuỗi dài ngắn khác nhau, xắp xếp thành dạng chữ V dạng ngơi Chúng hơ hấp kỵ khí, số lồi chịu O2 có mặt CO2 Các lồi sinh trưởng tối ưu 37 đến 410C với biên độ nhiệt sinh trưởng từ 25 đến 45 0C Chúng thường không sinh trưởng pH 4,5 Chúng lên men glucose, lactose, galactose số pentose Chúng có ích đường tiêu hóa Một số lồi sử dụng để tạo chế phẩm probiotic Bif bifidum, Bif infantis, Bif adolescentis Chúng có mặt với số lượng lớn phân trẻ sơ sinh 2-3 ngày tuổi thường có mặt với số lượng lớn trẻ bú mẹ Chúng thường gặp ruột già Một số Bifidobacterium bifidum, Bif infantis, Bif adolescentis, Bif brevis Bif Lomgum [1] 2.1.3 Nhu cầu dinh dưỡng vi khuẩn lactic 2.1.3.1 Nhu cầu dinh dưỡng cacbon Vi khuẩn lactic sử dụng nhiều loại cacbonhydrate từ hexose (glucose, fructose, manose, galactose), đường đôi (saccharose, lactose, maltose) polysaccharide (tinh bột, dextrin) Chúng sử dụng nguồn cacbon để cung cấp lượng, xây dựng cấu trúc tế bào làm chất cho trình lên men tổng hợp axit hữu axit lactic, axit malic, axit pyruvic, axit fumaric, axit acetic, etanol CO2.[6] Một số vi khuẩn lactic lên men dị hình, phân lập từ sản phẩm thực phẩm, sử dụng axit gluconic galacturonic làm nguồn dinh dưỡng cacbon nhờ xúc tác hệ enzyme tương ứng tạo thành CO2, axit axetic axit lactic Quá trình tạo axit lactic, axit axetic CO2 [5] 2.1.3.2 Nhu cầu dinh dưỡng nguồn nitơ: Tất thành phần quan trọng tế bào chứa nitơ (protein, axit nucleic…), nitơ thành phần khơng thể thiếu nuôi cấy vi sinh vật Phần lớn vi khuẩn lactic khơng có khả sinh tổng hợp chất hữu phức tạp có chứa nitơ nên chúng địi hỏi nguồn nitơ có sẵn mơi trường Chỉ có số lồi vi khuẩn có khả sinh tổng hợp chất hữu từ nguồn nitơ vơ Vì để đảm bảo cho sinh trưởng phát triển bình thường, ngồi nitơ dạng hỗn hợp axit amin, vi khuẩn lactic cần dịch thủy phân casein từ sữa, pepton, peptid, cao thịt, cao nấm men… Trong công nghiệp, cao nấm men nguồn nitơ sử dụng nhiều có hiệu [5], [13] 2.1.3.3 Nhu cầu vitamin: Đa số vi khuẩn lactic không tự tổng hợp vitamin vai trò vitamin chúng lại có ý nghĩa Vitamin đóng vai trị coenzyme trình trao đổi chất tế bào, vừa kích thích phát triển vừa điều hịa q trình cân lượng thể Chính mơi trường ni cấy vi khuẩn lactic người ta thường bổ sung nguồn chất chứa nhiều vitamin dịch chiết khoai tây, cà rốt, nước ngô, cao nấm men nhiều chất khác [5] + Nhu cầu muối vô : Để đảm bảo sinh trưởng phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic cần đến nhiều chất vô sắt, đồng, natri, kali, photpho, iot, lưu huỳnh, magie đặc biệt mangan Mangan tác nhân ngăn cản tự phân tế bào cần thiết cho trình sống bình thường vi khuẩn Ion Zn 2+ tham gia vào trình hình thành nhiều protein tế bào (chủ yếu enzyme ) làm tăng hoạt tính xúc tác enzyme Kết xảy tương tự thay Zn2+ ion Mg2+ Ca2+ Các ion kim loại có tác động tương hỗ lẫn Chẳng hạn việc sử dụng nồng độ thích hợp Mn 2+ loại trừ đầu độc ion kim loại nặng ion có mặt mơi trường [13] 2.1.3.4 Nhu cầu chất hữu khác Sự phát triển vi khuẩn lactic cần đến hợp chất hữu bazơ nitơ hay axit hữu Một số axit hữu có ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng vi khuẩn lactic axit citric axit axetic Nên người ta sử dụng muối citrat làm thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập bảo quản chủng vi khuẩn lactic sử dụng axit acetic dạng muối acetat để làm chất đệm cho môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic Các loại axit béo axit oleic, linoleic lionlenic có tác dụng điều hòa sinh trưởng vi khuẩn lactic Chính điều mơi trường đặc hiệu MRS có Tween 80 dẫn xuất axit oleic 2.1.4 Ứng dụng vi khuẩn lactic 2.1.4.1 Ứng dụng cơng nghệ thực phẩm Q trình lên men vi khuẩn lactic đóng vai trị quan trọng ngành cơng nghiệp thực phẩm, chúng đóng góp đáng kể vào hương vị, kết cấu nâng cao giá trị dinh dưỡng sản phẩm (McKay Baldwin, 1990) [38] Chúng sử dụng chế biến sản phẩm sữa (như sữa chua, kefir, phomat, bơ…), muối chua rau quả, sản xuất bánh mỳ đen, sản xuất rượu vang, thịt cá đóng hộp xúc xích Trong chế biến sản phẩm sữa, người ta lợi dụng khả đông tụ sữa vi khuẩn Streptococcus lactic để sản xuất sữa chua hay lợi dụng khả tạo mùi vị, tạo chất thơm chủng Leuconostoc để sản xuất bơ, phomat Trong chế biến rau muối chua, lên men lactic giúp bảo quản, làm tăng giá trị dinh dưỡng, giá trị cảm quan sản phẩm Trong sản xuất bánh mỳ đen, sử dụng trình lên men vi khuẩn lactic để tạo vị chua hương thơm đặc trưng cho bánh mỳ đen Ứng dụng LAB sản phẩm chuyển hóa chúng việc phịng ngừa hư hỏng kéo dài hạn sử dụng thực phẩm tăng lên thập kỉ qua (Stiles, 1996) [38] Chúng lên men nguồn cacbonhydrate có nguyên liệu tạo axit lactic nên làm tăng nồng độ axit nguyên liệu nên có tác dụng ức chế hoạt động vi sinh vật gây hư hỏng kéo dài thời gian bảo quản Vi khuẩn lactic cịn có khả tạo bacteriocin, loại kháng sinh, bền nhiệt có khả ức chế mạnh với vi khuẩn gây Gram dương gây bệnh hư hỏng thực phẩm nấm men Bên cạnh đó, bacteriocin ức chế tăng trưởng vi khuẩn Gram âm (Arihara et al 1996,; Cardi, 2002; Stevens et al., 1991) sử dụng rộng rãi chất bảo quản sinh học thực phẩm lên men lẫn không lên men Một số chủng LAB probiotic có khả cải thiện sức khỏe người đặc biệt hệ tiêu hóa, chúng thường bổ sung vào sản phẩm sữa [38,] LAB có khả sinh exopolysaccharide mà chúng thường coi an tồn (GRAS) Do đó, EPS tiết LAB xem polymer sinh học an toàn cung cấp nguồn thay cho polysaccharide sử dụng thực phẩm ngành công nghiệp khác [43] Ngồi ra, người ta cịn sử dụng LAB Lactobacillus delbrueckii để sản xuất lượng lớn axit lactic muối lactate làm chất phụ gia thực phẩm 2.1.4.2 Ứng dụng chăn nuôi Ủ chua thức ăn rau xanh mà thực chất trình lên men lactic tự nhiên, vừa có tác dụng chế biến, bảo quản, giảm tổn thất chất dinh dưỡng thức ăn bổ sung số vitamin vi sinh vật tổng hợp Ủ thức ăn thức ăn thô xanh xếp vào hố kín khơng có khơng khí Trong trình ủ, vi khuẩn biến đổi đường saccharose, fructose, pentose thành axit lactic, axit acetic axit hữu khác Chính axit làm hạ môi trường pH thức ăn xuống khoảng 3,8- 4,5 nên loại vi khuẩn enzyme thực vật bị ức chế Do bảo quản thức ăn lâu Ủ xanh thức ăn có ý nghĩa kinh tế lớn, nhờ thu hoạch thức ăn vào thời điểm nào, ngồi thức ăn ủ xanh giữ chất dinh dưỡng nhiều so với thức ăn phơi khô [9] 2.1.5.3 Một số ứng dụng khác Bên cạnh ứng dụng nêu trên, vi khuẩn lactic ứng dụng lĩnh vực khác như: y học, công nghiệp vật liệu, sản xuất mỹ phẩm 2.2 Tổng quan Lactobaccillus plantarum Lactobaccillus plantarum loài vi khuẩn thuộc chi lớn tương đối đa dạng Lactobacillus [28] Lactobaccillus plantarum vi gram dương, khơng sinh bào tử, tế bào có dạng hình que thường kết đôi chuỗi, sinh trưởng tốt điều kiện vi hiếu khí [47], [48] L plantarum lên men dị hình khơng bắt buộc lên men nhiều loại cacbonhydrate khác L plantarum có yêu cầu tăng trưởng cao với mangan tích lũy mangan mức cao nội bào (Archibald Fridovich 1981) L plantarum có khả chịu axit (Daeschel Nes 1995) Thực tế, L plantarum chịu axit pH 4,0 thực phẩm lên men tồn điều kiện axit dày người (Johansson cộng sự, 1993) L plantarum có gen tương đối lớn Điều cho thấy khả thích nghi với nhiều điều kiện khác (Kleerebezem cộng sự, 2003) L plantarum thường gặp với số lượng lớn thực phẩm lên men lactic dưa cải muối chua, ô liu muối, kim chi Nó tồn nước bọt đường tiêu hóa người [28] Tính chất đặc trưng L plantarum khả dị hóa arginine sinh nitric oxide L plantarum khơng có khả phân giải amino axit ngoại trừ tyrosine arginine có đến đường khác chuyển hóa arginine điều sinh nitric oxide Việc sinh NO giúp ngăn chặn vi sinh vật gây bệnh Canidida abicans, E Coli, Shigella, Helicobacterpylory, amip kí sinh trùng [48] L plantarum làm giảm nội độc tố E coil tiết ngăn chặn bám dính E coli vào màng nhầy L plantarum có khả giúp tiêu hóa chất xơ có lúa mì, lúa mạch đen men bia… Do chúng cải thiện tốt vấn đề tiêu hóa đầy hơi, chướng bụng [48] L Plantarum sản xuất protein có tính chất kháng khuẩn bacteriocin Bacteriocin có tiềm mở rộng để bảo quản thực phẩm nhu cầu ngày tăng cho sản phẩm thực phẩm tự nhiên an toàn vi sinh, để điều trị bệnh người bổ sung thay tiềm cho thuốc kháng sinh sử dụng L plantarum sử dụng pobiotic làm giảm vi khuẩn có hại để ngăn chặn mầm bệnh cách cạnh tranh chất dinh dưỡng, khả bám dính vào đường ruột tiết chất kháng khuẩn để ức chế tiêu diệt vi khuẩn cạnh tranh [28] 2.3 Tổng quan exopolysaccharide 2.3.1 Khái niệm Vi sinh vật tổng hợp nhiều loại polysaccharide đa chức bao gồm polysaccharide nội bào, polysaccharide tạo cấu trúc cho thành tế bào (lipopolysaccharide, peptidoglycan…) polysaccharide ngoại bào hay gọi exopolysaccharide [30], [35] Exopolysaccharide (EPS) polymer có trọng lượng phân tử cao bao gồm dư lượng đường tiết vi sinh vật vào môi trường xung quanh Exopolysaccharide thường cấu tạo monosaccharide số nhóm cacbonhydrate (như acetate, pyruvate, succinate phosphate) [46] EPS thường tồn hai dạng tùy thuộc vào vị trí nó: dạng liên kết, EPS vỏ bao (c-EPS) liên kết với bề mặt tế bào vi khuẩn dạng tự do, EPS vi khuẩn tiết môi trường chất nhờn (r-EPS)[20] Các vi khuẩn lactic, tảo, nấm thực vật có khả tổng hợp polysaccharides ngoại bào tiết khỏi tế bào polymer hịa tan polymer khơng hịa tan [ 47] Vi khuẩn vi tảo có khả tiết EPS tốt so với nấm men nấm mốc.Vi khuẩn lactic (LAB) thường coi an tồn Do đó, EPS tiết LAB coi polymer sinh học 10 Hình 4.12 Khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả sinh tổng hợp EPS chủng L Plantarum W1 tuyển chọn Chú thích: Các chữ (a, b, c, d,e) thể sai khác hàm lượng EPS trung bình chủng Lactobacillus plan arum W1qua mốc thời gian, xử lý Duncan mức ý nghĩa thống kê α = 0,05 Dựa vào đồ thị 4.3 cho thấy hàm lượng EPS tăng theo thời gian từ 12 đến 48 Cụ thể hàm lượng EPS mốc 12 giờ, 24 giờ, 36 68,292 µg/ml, 119,125 µg/ml, 154,471 µg/ml đạt cực đại mốc 48 giờ, với hàm lượng EPS 184,208 µg/ml Nếu tiếp tục kéo dài thời gian ni q 48 hàm lượng EPS giảm, hàm lượng EPS giảm từ 184,208 µg/ml xuống cịn 179,542 µg/ml ni đến 60 hàm lượng EPS tiếp tục giảm cịn 156,375 µg/ml kéo dài thời gian nuôi đến 72 Kết phù hợp với nghiên cứu Emaneul cộng (2010) xác định ảnh hưởng glucide khác sản xuất exopolysaccharide chủng Lactobacillus paracasei IL2 Lactobacillus plantarum IL3 Tác giả nuôi cấy chủng Lactobacillus paracasei IL2 Lactobacillus plantarum IL3 môi trường MRS bổ sung glucose mốc thời gian 24 giờ, 48 72 giờ, kết cho thấy hàm lượng EPS đạt cao 48 giờ, hàm lượng EPS hai chủng L paracasei IL2 L plantarum IL3 sau 48 nuôi 201 mg/l 92 mg/l Nếu kéo dài thời gian 48 hàm lượng EPS giảm, cụ thể 72 hàm lượng EPS hai chủng L paracasei IL2 L plantarum IL3 giảm xuống tương ứng 63 mg/l, 31 mg/l Tương tự tác giả tiến hành ni chủng L Plantarum IL3 MRS có bổ sung lactose hàm lượng EPS 48 33 mg/l giảm xuống g/ml kéo dài thời gian nuôi đến 72 [18] Trong nghiên cứu khác, Fukuda cộng (2010) nghiên cứu ảnh hưởng nguồn carbonhydrate vào đặc tính exopolysaccharide sản xuất Lactobacillus fermentum TDS030603 Khi ni chủng mơi trường MRS CDM có bổ sung loại đường sau với nồng độ 1% glucose (CDMGlc), galactose (CDMGal) hàm lượng EPS đạt đến mức cao 24-48 h, giảm sản lượng EPS quan sát thấy 72 h suy thối enzyme [21] 51 Còn theo nghiên cứu Zang cộng (2013) hoạt động chống oxy hóa EPS phân lập từ Lactobacillus plantarum C88, cho thấy sản xuất EPS chủng L plantarum C88 môi trường SDM bổ sung g/l glucose 37 ◦C Sản xuất EPS tăng dần theo tăng trường vi khuẩn Hàm lượng EPS sản xuất tối đa 69 mg / l giai cuối tăng trưởng (32 h) sau giai đoạn hảm lượng EPS giảm dần Sự giảm hàm lượng EPS tác động enzyme glycohydrolase lên chuỗi polymer kéo dài thời gian nuôi cấy [46] Pham cộng (2000) nghiên cứu sản xuất exopolysaccharide Lactobacillus rhamnosus R phân tích suy thối từ enzyme q trình lên men, tác giả tiến hành nghiên cứu môi trường BMM (buffer minimal medium: mơi trường đệm tối thiểu) có bổ sung glucose lactose 20g/l Kết cho thấy, môi trường chứa lactose, sản xuất EPS chủ yếu giai đoạn tăng trưởng theo cấp số nhân hàm lượng EPS đạt mức cao giai đoạn suy giảm đầu tăng trưởng giảm dần Trong môi trường nuôi cấy bổ sung glucose, sản xuất EPS tiếp tục giai đoạn suy giảm, đạt tối đa 36 Từ thấy, lượng EPS giảm giai đoạn suy giảm đầu Khi lên men kéo dài đến 48 hàm lượng EPS giảm đáng kể Tác cho rằng, nguyên nhân suy giảm hàm lượng EPS diện glycohydrolase khác tế bào Mặc dù vai trò glycohydrolase EPS chưa xác định nghiên cứu có mặt enzyme làm giảm độ nhớt EPS Sự giảm độ nhớt cho thấy phân tách khối lượng phân tử polymer dẫn đến giảm hàm lượng EPS Thời gian lên men kéo dài (72 giờ), độ giảm độ nhớt tăng lên đến 33% Mặc khác, ông nhận định sụt giảm EPS phần thay đổi thông số vật lý môi trường [31] 52 Hình 4.13 Hình ảnh tạo màu phương pháp phenol-sunfuric khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp exopolysaccharide chủng Lactobacillus plantarum W1 tuyển chọn PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu cho phép rút số kết luận sau: Kết khảo sát khả sinh EPS chủng Lactobacillus plantarum ( W1, W3, W5, N1) cho thấy tất chủng khảo sát sinh EPS hàm lượng dao động từ 63,375- 108,083 µg/ml Khả sinh tổng hợp EPS mạnh chủng Lactobacillus plantarum W1 với hàm lượng EPS 108,083 µg/ml Khi khảo sát ảnh hưởng bổ sung loại đường khac vào môi trường nuôi cấy đến khả sinh EPS chủng Lactobacillus plantarum W1 kết cho thấy lactose nguồn carbon hiệu để chủng sử dụng để 53 sinh tổng hợp EPS Trong đó, bổ sung lactose 5% vào mơi trường chủng L Plantarum W1 sinh EPS nhiều 183,412 µg/ml Khi khảo sát ảnh hưởng thời gian thời gian thích hợp cho chủng L Plantarum W1 sinh EPS 48 5.2 Kiến nghị Do thời gian tiến hành nghiên cứu điều kiện vật chất có giới hạn nên đề tài cịn có hạn chế chưa thực hiện, chúng tơi xin đề nghị số vấn đề sau: Tiếp tục khảo sát thành phần tỷ lệ khác môi trường ảnh hưởng tới khả sinh tổng hợp EPS chủng Lactobacillus plantảum Khảo sát yếu tố ảnh hưởng tới khả sinh tổng hợp EPS chủng như: nhiệt độ, pH, mật độ nuôi cấy… Nghiên cứu ảnh hưởng tới trình tách chiết EPS TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1] Ảnh Kiều Hữu, (2000), “Giáo trình Vi sinh vật học công nghiệp”, NXB giáo dục Việt Nam [2] Dung Ngô Thị Phương, Huỳnh Thị Yến Ly Huỳnh Xuân Phong, (2011), “Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả sinh chất kháng khuẩn”, Tạp chí Khoa học [3] Dũng Nguyễn Lân,(2002)Thực tập vi sinh vật học, NXB Đại học trung học chuyên nghiệp Hà Nội [4] Minh Biển Văn, (2006), “Giáo trình vi sinh vật học, Nhà xuất Đại học Huế” [5] Phương Lê Văn, Nguyễn Văn Cách, “Công nghệ vi sinh học- Công nghệ vi sinh”, NXB giáo dục, tập 54 [6] Phương Lê Xuân, (2001), “Vi sinh vật công nghiệp”, NXB xây dựng Hà Nội [7] Thủy Đỗ Thị Bích, (2009), “Bài giảng thực hành hóa sinh”, Trường Đại học Nơng Lâm Huế [8] Thủy Đỗ Thị Bích, (2005), “Thu nhận chế phẩm protease từ số nguồn khác ứng dụng cong nghiệp chế biến thực phẩm”, Luận án tiến sĩ kỹ thuật, Bộ Giáo dục Đào tạo, Đại học Đà Nẵng [9] Trạch Nguyễn Xuân, (2003), “Sử dụng phụ phẩm nuôi gia súc nhai lại”, Nhà xuất nông nghiệp TÀI LIỆU TIẾNG ANH [10] Adebayo-Tayo B., Onilude A., (2008),” Comparative influence of medium composition on biomass growth, lactic acid and Exopolysaccharides Production by some Strains of Lactic Acid Bacteria”, The Internet Journal of Microbiology, Volume Number [11] Ahmed Z., Wang Y., Anjum N., Ahmad A., Khan T.S., (2013), “Characterization of exopolysaccharide produced by Lactobacillus kefiranofaciens ZW3 isolated from Tibet kefirePart II”, Journal homepage: www.elsevier.com/locate/foodhyd, pp 343 – 350 [12] Angelis M D and Gobbetti M.(2011), “Lactobacillus spp.: General Characteristics”,This article is a revision of the previous edition article by B Curry and V Crow, Volume 3, pp 1479–1484 [13] Axeslson L., (2004), “Lactic acid bacteria: Classification and Physiology”, Agricultural University of Norway, Masfork, Norwergian Food Research Institute Aas, Norway, pp – 67 [14] Cerning J (1995), “Production of exopolysaccharides by lactic acid bacteria and dairy propionibacteria”, pp 463 – 472 [15] Cerning J., Renard C M G C., Thibault J F., Bouillanne C., Landon M., Desmazeaud M., Topisirovic L (1994), “Carbon Source Requirements for Exopolysaccharide Production by Lactobacillus casei CG11 and Partial Structure Analysis of the Polymer”, Appl Environ Microbiol, 60:3914–3919 [16] Daba H., Pandian S., Gosselin J F., Simard R.E., Huang J., and Lacroxix C., (1991) Detection and activity of bacteriocin producted by Leuconostoc mesenteroides Appl Environ Microbiol 57(12), pp 3450-3455 55 [17] Dupont I., Roy D and Lapointe G., (2000), “Comparison of exopolysaccharide production by strains of Lactobacillus rhamnosus and Lactobacillus paracasei grown in chemically defined medium and milk”, Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 24, pp 251-255 [18] Emaneul V., Diana P., Ionela A., Adrian V., Gheorghe C., Ovidiu P., Narcisa B., (2010),“The identification and the influence of different glucides on the production of exopolysaccharides at the strains Lactobacillus sp IL2 and Lactobacillussp IL3”, Romanian Biotechnological Letters, vol [19] Farnworth E R., (2008 )“Hanhbook of Fermented Functional Foods, Second Edition (Functional Foods and Nutraceutical)” [20] Fukuda K., Shi T., Nagami K., Leo F., Nakamura T., Yasuda K., Senda A., Motoshima H., Urashima T.,(2010), Effects of carbohydrate source on physicochemical properties of the exopolysaccharide produced by Lactobacillus fermentum TDS030603 in achemically defined medium, journal homepage: www.elsevier.com/locate/carbpol, pp 1040-1045 [21] Fukuda K.,Shi T., Nagami K., Leo F., Nakamura T.,Yasuda K., Senda A., Motoshima H.,MUrashima T., (2010), “Effects of carbohydrate source on physicochemical properties of the exopolysaccharide produced by Lactobacillus fermentumTDS030603 in a chemically defined medium”, pp 1040–1045 [22] Haroun B M., El- Menoufy H A., Amin H A., El-Waseif A A., (2013), “Biosynthesis and Morphology of an Exopolysaccharide from a Probiotic Lactobacillus plantarum under different growth conditions”, Journal of Applied Sciences Research, pp 1256-1265 [23] Harutoshi T., Exopolysaccharides of Lactic Acid Bacteria for Food and Colon Health Applications [24] Ismail B and Nampoothiri K M., (2013), “Molecular characterization of an exopolysaccharide from a probiotic Lactobacillus plantarum MTCC 9510 and ts efficacy to improve the texture of starchy food” [25] Korakli M., (2012), “Sucrose metabolism and exopolysaccharide production by Lactobacillus sanfranciscensis”, Doctoral thesis [26] Kuntiya A., Hanmoungjai P., Techapun C., Sasaki K., Seesuriyachan P., (2010), Influence of pH, sucrose concentration and agitation speed on exopolysaccharide production by Lactobacillus confusus TISTR 1498 using coconut water as a raw material substitute, Maejo International Journal of Science and Technology, 318-330 56 [27] Lynch K M., McSweeney P L.H., Arendt E K., Uniacke-Lowe T., Galle S., Coffey A., (2014), Isolation and characterisation of exopolysaccharide-producingWeissella and Lactobacillus and their application as adjunct cultures in Cheddar cheese, International Dairy Journal [28]Molin G., (2010), “Lactobacillus plantarum 299v” [29] Patel A.and Prajapati J B., (2013), “Food and Health Applications of Exopolysaccharides produced by Lactic acid Bacteria”, Advances in Dairy Research, pp 1-7 [30] Patel A K., Michaud P., Singhania R R., Soccol C R and Pandey A, (2010), polysaccharides from Probiotics: New Developmentsas Food Additives [31] Pham P L., Dupont I., Roy D., Lapointe G and Cerning J., (2000), “Production of Exopolysaccharide by Lactobacillus rhamnosus R and Analysis of Its Enzymatic Degradation during Prolonged Fermentation”, Applied and Environmental Microbiology, pp 2302 – 2310 [32] Robijna Gerard W., Thomas a Jerry R., Haasb H., van den Bergb Dick J.C., Kamerlinga Johannis P., Johannes F.G (1995), “The structure of the exopolysaccharide produced by Lactobacillus helveticus 766”, Carbohydrate Research 276, pp 137-154 [33] Seesuriyachan P., Kuntiya A., Hanmoungjai P and Techapun C (2011), “Exopolysaccharide production by Lactobacillus confusus TISTR 1498 using coconut water as an alternative carbon source: the effect of peptone, yeast extract and beef extract”, Journal of Science & Technology 33 (4), pp 379-387 [34] Shivakumar S and Vijayendra S V N (2005), “Production of exopolysaccharides by Agrobacterium sp CFR-24 using coconut water – a by product of food industry”, Department of Food Microbiology, Central Food Technological Research Institute, Mysore, India doi:10.1111/j.1472765X.2006.01881 [35] Singha T K,(2012), Microbial Extracellular Polymeric Substances: Production, Isolation and Applications, Journal of Pharmacy, Vol 2, pp 276281 [36] Staudt A., “ Identification of environmental factors critical of exopolysaccharides by Rhizobium Tropici” 57 [37] Tallon R, Bressollier P, Urdaci M C.,( 2003), "Isolation and characterization of two exopolysaccharides produced by Lactobacillus plantarum EP56”, Research in Microbiology 154,pp 705–712 [38] Topisirovic L., Kojic M., Fira D., Golic N., Strahinic I., Lozo J., (2006), “Potential of lactic acid bacteria isolated from specific natural niches in food production and preservation”, Intrenational Journal of Food Microbiology, Volume 112, pp 230-235 [39] Torino M I., Mozzi F and Font de Valdez G., (2005), “Exopolysaccharide biosynthesis by Lactobacillus helveticus ATCC 15807”, Appl Microbiol Biotechnol 68, pp 259-265 [40] Vuyst L D., Degeest B., (1998), Heteropolysaccharides from lactic acid bacteria, FEMS Microbiology Reviews [41] Wang K., Li W., Rui X, Chen X., Jiang M., Dong M (2014), [46] “Characterization of a novel exopolysaccharide with antitumor activityfrom Lactobacillus plantarum 70810”, International Journal of Biological Macromolecules 63, pp 133– 139 [42] Wang Y., Ahmed Z., Feng W, Li C., Song S., (2008), Physicochemical properties of exopolysaccharide produced by Lactobacillus kefiranofaciens ZW3 isolated from Tibet kefir, International Journal of Biological Macromolecules 43, pp 283–288 [43] Wang Y., Li C., Liu P., Ahmed Z., Xiao P., Bai X., (2010) , Physical characterization of exopolysaccharide produced by Lactobacillus plantarum KF5 isolated from Tibet Kefir, Carbohydrate Polymers 82, pp 895–903 [44] Weel Y J., Kim J N and Ryu H.W (2006), “Biotechnological Production of Lactic Acid anh Its Recent Applications, School of Biological Sciences and Technology”, Chonnam National University, Gwangju, pp 500757, Republic of Korea [45] Yuksekdag Z N., Aslim B (2008), “Influence of different carbon sources on exopolysaccharide production by Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus (B3, G12) and Streptococcus thermophilus (W22)”, Brazilian Archives of Biology and Technology [46] Zhang L., Liu C., Li D., Zhao Y., Zhang X.,Zeng X., Yang Y., Li S.,] (2013) “Antioxidant activity of an exopolysaccharide isolated from 58 Lactobacillus plantarum C88”, International Macromolecules, 54, pp 270– 275 Journal of Biological Trang WEB [47] http://www.probion.eu/files/2012/01/TM_Lp-115_June20101.pdf, ngày 12/04/2015 [48] http://bioone.vn/content/dac-tinh-dieu-tri-cua-chung-vi-khuan-sinhaxit-lactic, ngày 12/04/2015 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Cách tiến hành dựng đường chuẩn glucose phương pháp phenol-sulphuric phương pháp DNS 59 1.1 Cách tiến hành dựng đường chuẩn glucose phương pháp phenolsulphuric - Cân xác 0,2500 g D-glucose cho vào bình định mức 250 mL định mức nước cất ta dung dịch A Như vậy, nồng độ dung dịch Dglucose mg/mL (1000 μg/mL) - Lấy 50 mL dung dịch A pha thành 500 mL thu dung dịch Dglucose có nồng độ 100 μg/mL (dung dịch B) - Lần lượt lấy 0; 25; 50; 75; 100 mL dung dịch B pha thành 100 mL thu dung dịch D-glucose có nồng độ 0; 25; 50; 75; 100 μg/mL - Lấy 125 mL dung dịch A pha thành 500 mL thu dung dịch D -glucose có nồng độ 250 μg/mL (dung dịch C) - Lần lượt lấy 50; 60; 70; 80 mL dung dịch C pha thành 100 mL thu dung dịch D-glucose có nồng độ 125; 150; 175; 200 μg/mL - Mỗi mẫu lấy mL cho vào ống nghiệm có nút, thêm vào ống nghiệm 1mL dung dịch phenol 5%, mL dung dịch H 2SO4 đậm đặc, lắc ống nghiệm - Đặt ống nghiệm vào cốc nước sơi phút, sau làm lạnh ống nghiệm nhiệt độ phòng 30 phút - Đo độ hấp thụ quang dung dịch bước sóng 490 nm, thu giá trị độ hấp thụ quang - Từ kết thu bảng sau, ta tiến hành xây dựng đường chuẩn Nồng (µg/ml) độ glucose OD409nm 0 25 0.251 50 0.474 75 0.732 100 0.896 125 1.128 150 1.260 175 1.482 200 1.661 60 1.2 Cách tiến hành dựng đường chuẩn glucose phương pháp DNS – Sử dụng dung dịch chuẩn glucose 0,1 % (10mg/ ml) để pha dãy chuẩn – Chuẩn bị dãy ống nghiệm theo bảng sau (ml): Đ C C Dung dịch chuẩn Nước cất ,2 ,8 C ,4 C C ,6 ,6 C ,8 ,4 9 ,2 -Để các ống nghiệm vào nồi cách thủy sôi phút - Lấy ra, làm nguội đến nhiệt độ phòng - Đo độ hấp thu quang dung dịch bước sóng 540nm, với mẫu blank 1ml nước cất 1ml DNS - Từ kết thu bảng sau, ta tiến hành xây dựng đường chuẩn Glucose 0,1 % (10mg/ ml) OD 490 nm 0,2 0,4 0,6 0,8 0,1 0,27 0,44 0,64 0,78 24 Phụ lục 2: Thành phần môi trường MRS Pepton 10 Beef extract 8.0 Yeast extract 4.0 Glucose 20.0 Sorbitan monooleate (Tween 80) 1.0 Di-potassium hydrogen orthophosphate 2.0 Magnesium sulphate 7H2O 0.2 Manganese (II) sulphate 4H2O 0.05 Ammonium citrate 2.0 Sodium acetate-3H2O 5.0 61 Agar 15.0 Nước cất Đủ lít Phụ lục 3: Số liệu thống kê Kết khảo sát khả sinh tổng hợp EPS chủng vi khuẩn L plantarum N5, L plantarum W1, L plantarum W3, L plantarum W5 Kết khảo sát ảnh hưởng hàm lượng đường saccharose bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp exopolysaccharide chủng Lactobacillus plantarum W1 tuyển chọn 62 Kết khảo sát ảnh hưởng hàm lượng đường glucose bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp exopolysaccharide chủng Lactobacillus plantarum W1 tuyển chọn Kết khảo sát ảnh hưởng hàm lượng đường lactose bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp exopolysaccharide chủng Lactobacillus plantarum W1 tuyển chọn 63 Kết khảo sát ảnh hưởng hàm lượng đường nước dừa bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp exopolysaccharide chủng Lactobacillus plantarum W1 tuyển chọn Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả sinh tổng hợp EPS chủng L Plantarum W1 tuyển chọn 64 65 ... dung nghiên cứu - Khảo sát khả sinh tổng hợp exopolysaccharide từ bốn chủng Lactobacillus plantarum (W1, W3, W5, N5) để tuyển chọn chủng có khả sinh tổng hợp EPS cao - Khảo sát ảnh hưởng loại đường. .. loại đường bổ sung lên khả sinh tổng hợp exopolysaccharide chủng L plantarum tuyển chọn - Khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả sinh tổng hợp EPS chủng L plantarum tuyển chọn PHẦN TỔNG QUAN... thực theo sơ đồ sau: Khảo sát tuyển chọn chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum W1, W3,W5 ,N5 có khả sinh tổng hợp EPS cao Chủng thích hợp Khảo sát ảnh hưởng bổ sung loại đường khác với nồng độ