3.4.1. Phương pháp vi sinh vật [43],[ 3]
(1) (2) (3)
Hình 3.2. Sơ đồ quy trình nuôi cấy để chủng Lactobaccillus plantarum sinh EPS
Thuyết minh quy trình: Các chủng gốc của vi khuẩn L. Plantarum được ria lên đĩa MRS agar, nuôi cấy trong 24 giờ ở 370C, pH = 6-6,2, để thu khuẩn lạc đơn. Sau đó, khuẩn lạc đơn từ đĩa thạch của các chủng được cấy sang 3 ống eppendorf, mỗi ống có chứa 1ml môi trường MRS lỏng, rồi nuôi trong tủ ấm ở 370C trong 24 giờ. Sau 24 giờ nuôi, eppendorf được ly tâm ở 10000 vòng/phút ở 40C trong vòng 10 phút nhằm mục đích thu sinh khối, loại dịch nuôi cấy. Sinh khối được rửa hai lần và tái huyền phù bằng dung dịch 1% pepton và 0,85%
NaCl. Dung dịch pepton và NaCl có chứa tế bào vi khuẩn được đem đi đo OD với bước sóng 600nm để xác định mật độ tế bào. Dung dịch này sau đó được
Nuôi cấy tăng sinh (MRS lỏng, ở 370C,24h)
Nuôi cấy theo các điều kiện khác nhau
Ly tâm thu sinh khối, tái huyền phù (dung dịch 1% pepton và 0.85%
NaCl)
Chủng Lactobaccillus plantarum
Nuôi cấy trong môi trường MRS có bổ sung 1 % glucose +
2% lactose (37oC, 48h)
Nuôi cấy trong môi trường MRS có bổ sung lần lượt các loại đường saccharose,
glucose, lactose, đường trong nước dừa với nồng độ
thay đổi
Nuôi cấy ở trong môi trường đã tuyển
chọn ở 370C trong các khoảng thời gian
khác nhau: 12 h, 24 h, 36 h, 48h, 50 h, 60
h
đưa vào môi trường nuôi cấy sinh EPS sao cho mật độ tế bào là 106 CFU/ml dịch nuôi cấy. Thực hiện nuôi cấy theo các điều kiện khác nhau như sơ đồ (1), (2) và (3) để chủng sinh EPS. Sơ đồ (1): tiến hành như mục 3.3.1, để khảo sát tìm ra chủng L. plantarum có khả năng sinh EPS cao nhất. Sơ đồ (2): từ chủng L. plantarum đã tuyển chọn, tiến hành nuôi cấy như mục 3.3.2, để khảo sát ảnh hưởng khi bổ sung các loại đường khác nhau với nồng độ khác nhau vào môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp EPS của chủng Lactobacillus plantarum này và chọn được môi trường nuôi cấy thích hợp. Sơ đồ (3): tiến hành nuôi cấy như mục 3.3.3 để khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp EPS của chủng vi khuẩn L. platarum đã tuyển chọn.
3.4.2. Phương pháp tách chiết EPS [3],[ 43]
Hình 3.3. Sơ đồ quy trình tách chiết EPS Fancol chứa dịch nuôi cấy đã đủ
giờ nuôi
Ly tâm (5000 vòng/phút, 10 phút, 40C) thu kết tủa EPS
Ly tâm (5000 vòng/phút, 10 phút, 40C) thu kết tủa EPS
Ly tâm (5000 vòng/phút, 10 phút, 40C) thu dịch nổi
Kết tủa EPS lần 1 bởi ethanol lạnh, tỷ lệ dịch nổi: ethanol = 1:2
Kết tủa protein bởi 30% TCA
Hòa tan tủa trong nước cất 500C, khoảng 2 ml
1ml dd trên + 1ml dd phenol 5%
+ 5 ml dd H2SO4 đđ, vortex và cho vào nước sôi 2 phút
Đo OD 490 nm
Hòa tan tủa trong nước cất 500C
Tính hàm lượng EPS dựa trên đường chuẩn glucose Ly tâm (5000 vòng/phút, 10 phút,
40C) thu dịch nổi
Kết tủa EPS lần 2 bởi ethanol lạnh, tỷ lệ dịch nổi: ethanol = 1:2
Làm nguội ở nhiệt độ phòng 30 phút
Thuyết minh quy trình (hình 4.3): Sau thời gian nuôi, dịch nuôi cấy được ly tâm tách sinh khối tế bào ở 5000 vòng/phút, nhiệt độ 40C trong vòng 10 phút để thu dịch nổi có chứa EPS. Dịch có chứa EPS được kết tủa protein bởi 30% TCA, để qua đêm ở nhiệt độ phòng. Sau đó, tiến hành ly tâm dịch ở 5000 vòng/phút, nhiệt độ 40C trong vòng 10 phút để loại bỏ kết tủa protein, thu dịch nổi. Sau khi loại bỏ protein dịch có chứa EPS được bổ sung thêm ethanol lạnh 990 để kết tủa EPS lần 1, tỷ lệ dịch nổi: ethanol = 1: 2, để qua đêm ở 40C, rồi tiến hành ly tâm ở 5000 vòng/phút, nhiệt độ 4oC trong vòng 10 phút để thu kết tủa EPS.
Sau đó, EPS được hòa tan lại một lẫn nữa bằng 2ml nước cất 500C, mục đích để loại bỏ các đường dư của môi trường trong quá trình nuôi cấy và làm cho EPS tinh sạch hơn. Sau khi hòa tan tủa thêm ethanol lạnh 990 vào dung dịch đó với tỷ lệ dịch có chứa EPS: ethanol= 1:2 để qua đêm ở 40C để kết tủa EPS lần 2, rồi tiến hành ly tâm 5000 vòng/phút, nhiệt độ 4oC trong vòng 10 phút thu được EPS thô. Sau cùng, tiến hành xác định hàm lượng EPS bằng phương pháp phenol-sunfuric.
3.4.3. Phương pháp hóa học
3.4.3.1. Phương pháp phenol-sunfuric để xác định hàm lượng EPS tinh khiết [3]
Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng thuỷ phân polysaccharide thành monosaccharide, monosaccharide tạo màu với phenol, dung dịch tạo thành có độ hấp thụ cực đại tại bước sóng λ = 490nm.
Cách tiến hành:
Xây dựng đường chuẩn : xem chi tiết ở mục 1.1,phụ lục 1.
Hình 3.4. Đường chuẩn glucose được dựng bằng phương pháp phenol-sunfuric Phương trình đường chuẩn: Y1= 0,008X1+ 0,055.
Trong đó: X1: là hàm lượng đường
Y1: là độ hấp thụ quang 490nm
Xác định hàm lượng EPS : Để xác định hàm lượng EPS tinh khiết có chứa trong mỗi mẫu EPS tổng thô. Mẫu EPS thô thu được hòa tan bằng nước cất 500C. Lấy 1ml dung dịch trên rồi cho vào ống nghiệm có đậy nút kín. Thêm vào mỗi ống nghiệm 1ml dung dịch phenol 5%, 5ml dung dịch H2SO4 đậm đặc, lắc đều các ống nghiệm. Đặt các ống nghiệm vào cốc nước sôi trong 2 phút, sau đó để nguội các ống nghiệm ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Đo độ hấp thu quang của các dung dịch này ở bước sóng 490nm,với mẫu trằng (blank) có chứa 1ml nước cất 1ml dung dịch phenol 5%, 5ml dung dịch H2SO4 đậm đặc, thu được các giá trị độ hấp thụ quang suy ra hàm lượng EPS tinh khiết có chứa trong mỗi mẫu EPS tổng thô.
3.4.3.2 Xác định hàm lượng đường trong nước dừa bằng phương pháp DNS [7]
Nguyên tắc: Dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử dinitrosalicylic (DNS). Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. So màu tiến hành ở bước sóng 540nm. Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nước dừa.
Cách tiến hành:
- Chuẩn bị thuốc thử DNS: Hòa tan 16 g NaOH trong 600 ml nước cất, thêm vào 10 g axit dinitrosalicylic và khuấy đều. Sau đó, hòa tan 30 g muối kalinatritartrate (KNaC4H4O6.4H2O) trong 300 ml nước cất. Cuối cùng, hòa tan 2 dung dịch trên vào nhau và khuấy đều cho đến khi tan hoàn toàn, định mức bằng nước cất đến 1000 ml, bảo quản trong lọ tối màu ở 40C.
- Chuẩn bị mẫu:
Mẫu không thủy phân: Lấy 5ml nước dừa cho vào bình tam giác 100ml, sau đó thêm 50ml nước cất.
Mẫu thủy phân: Lấy 5ml nước dừa cho vào bình tam giác 100ml, sau đó thêm 50ml nước cất và 5ml HCl tinh khiết và thực hiện thủy phân trên nồi cách thủy duy trì ở nhiệt độ 700C trong 5 phút. Trung hòa lại, trước bằng NaOH 30%,
sau bằng NaOH 1N, rồi NaOH 0,1N thử với phenolphthalein cho đến khi có dung dịch màu hồng.
Mẫu không thủy phân và mẫu thủy phân lần lượt được cho vào bình định mức dung tích 100ml, cùng với nước rửa. Sau đó cho 2-5ml dung dịch chì acetat 30% lắc đều và để lắng trong 5 phút, nếu thấy xuất hiện một lớp chất lỏng trong suốt ở bên trên lớp cặn thì việc khử tạp chất đã xong. Dùng Na2SO4 để loại chì acetat thừa. Lắc đều và để tủa lắng xuống. Thêm nước cất để định mức lên 100ml. Lắc đều và lọc qua giấy lọc.
Dựng đường chuẩn glucose : xem chi tiết mục 1.2, phụ lục 1.
Hình 3.5. Đường chuẩn glucose được dựng bằng phương pháp DNS Phương trình đường chuẩn: Y2= 0,838 X2- 0,048
Trong đó X2: hàm lượng đường khử trong dung dịch đường pha loãng Y2: độ hấp thụ quang OD 540nm
Hút 1ml dung dịch mẫu thủy phân và mẫu không thủy phân đã pha loãng cho vào 2 ống nghiệm, thêm 1ml DNS vào mỗi ống nghiệm, đun sôi 5 phút, lấy ra để nguội ở nhiệt độ phòng. Đo độ hấp thu quang của các dung dịch này ở bước sóng 540nm, với mẫu blank là 1ml nước cất và 1ml DNS. Kết hợp với phương trình đường chuẩn, suy ra hàm lượng đường có trong mẫu nước dừa thủy phân và mẫu nước dừa không thủy phân.
3.4.4. Phương pháp vật lý
3.4.4..1. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đo mật độ quang (OD) [8]
Nguyên tắc: Khi ánh sáng đi qua môi trường lỏng có nhiều hạt rắn lơ lửng sẽ bị tán xạ trở lại và dẫn đến cường độ tia sáng ló ra thấp hơn so với cường độ tia sáng đi vào, việc so sánh độ chênh lệch cường độ tia sáng sẽ phản ánh một cách tương đối lượng chất rắn lơ lửng trong môi trường. Ngoài ra, chính bản thân chất lỏng cũng hấp thụ một phần ánh sáng. Do đó, lượng ánh sáng đi qua cũng bị ảnh hưởng bởi bản chất của môi trường lỏng. Để đánh giá mật độ tế bào trong dịch nuôi cấy, ta có thể xem tế bào như các hạt rắn lơ lửng, và tiến hành đo mức hấp thụ của dịch tế bào nuôi cấy, đối chiếu với môi trường lỏng không có sinh khối sẽ cho ra lượng tương đối của sinh khối vi khuẩn.
Cách tiến hành: Chủng vi khuẩn được nuôi trong eppendorf có chứa 1ml môi trường MRS lỏng, ủ 37oC, 24 giờ. Sau thời gian nuôi tiến hành ly tâm ở 10000 vòng/phút ở 40C trong vòng 10 phút để tách dịch thu sinh khối. Sinh khối được rửa hai lần và tái huyền phù bằng dung dịch 1% pepton và 0,85% NaCl.
Dung dịch pepton và NaCl có chứa tế bào vi khuẩn được pha loãng (nếu cần ) rồi đem đi đo OD với bước sóng 600nm để xác định mật độ tế bào, với mẫu blank là nước muối sinh lí vô trùng.
3.4.5. Phương pháp đo nồng độ pH.
Xác định PH của môi trường nuôi cấy bằng máy đo PH điện tử.
3.4.6. Phương pháp xử lý số liệu
Phương pháp xử lý số liệu sử dụng phần mềm xử lý số liệu SPSS 20.0
PHẦN 4
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả khảo sát khả năng sinh tổng hợp EPS của các chủng vi khuẩn L. plantarum N5, L. plantarum W1, L. plantarum W3, L. plantarum W5
Để khảo sát khả năng sinh tổng hợp exopolysaccharide của các chủng L.
plantarum N5, L. plantarum W1, L. plantarum W3, L. plantarum W5 nhằm chọn ra chủng có khả năng sinh EPS cao nhất, chúng tôi tiến hành đưa sinh khối của vi khuẩn đã được chuẩn bị vào môi trường dinh dưỡng MRS có bổ sung 2%
lactose, 1% glucose , sao cho mật độ tế bào trong môi trường là 106 CFU/ml và tiến hành nuôi ở 48 giờ, nhiệt độ 37oC, pH trong khoảng 6-6,2. Sau 48h nuôi, dịch nuôi cấy đem đi ly tâm loại bỏ sinh khối, dịch nổi được kết tủa protein bằng TCA. Sau đó ly tâm loại bỏ kết tủa protein, thu dịch nổi. Dịch nổi được kết tủa cồn 2 lần, rồi ly tâm để thu tủa EPS. Để xác định hàm lượng EPS tiến hành so màu bằng phương pháp phenol-sunfuric. Kết quả được thể hiện trong hình 4.1
Hình 4.1. Kết quả khảo sát khả năng sinh exopolysaccharide của các chủng Lactobacillus plantarum (N5, W1, W3, W5) trên môi trường MRS bổ sung 2%
lactose, 1% glucose.
Ghi chú:
Các chữ cái (a, b, c, d) thể hiện sự sai khác về hàm lượng EPS trung bình của chủng L.plantarum qua các mốc thời gian, xử lý Duncan ở mức ý nghĩa thống kê α = 0,05
N5: L. plantarum N5 W3: L. plantarum W3 W1: L. plantarum W1 W5: L. plantaum W5
Đồ thị 4.1 cho thấy, cả 4 chủng vi khuẩn Lactobaccillus plantarum được chọn để khảo sát đều có khả năng tổng hợp EPS và các chủng khác nhau thì sinh hàm lượng EPS khác nhau. Trong đó, chủng Lactobaccillus plantarum W1 là chủng sinh EPS cao nhất với hàm lượng EPS là 108,083 àg/ml, hai chủng L.
plantarum W5, L. plantarum N5 tổng hợp được hàm lượng EPS tương ứng là 93,708 àg/ml, 87,000 àg/ml và chủng L. plantarum W3 cú khả năng sinh tổng hợp EPS yếu nhất trong 4 chủng được chọn để tiến hành thí nghiệm, với hàm lượng EPS 63,375àg/ml.
Hình 4.2. Hình ảnh tạo màu bằng phương pháp phenol-sunfuric khi khảo sát chọn chủng sinh EPS cao nhất
Dung dịch có chứa EPS sinh tổng hợp từ 4 chủng L. plantarum N5, L.
plantarum W1, L. plantarum W3, L. plantarum W5 phản ứng bằng phương pháp phenol – sunfuric cho màu sắc được thể hiện trên hình 4.2. Ống nghiệm thể hiện màu sắc càng đậm có nghĩa là hàm lượng EPS càng cao.
Nhiều kết quả nghiên cứu về hàm lượng EPS được sinh tổng hợp bởi các chủng vi khuẩn lactic khác nhau đã được công bố. Hàm lượng heteropolysaccharide được sản xuất bởi các vi khuẩn lactic khác nhau rất nhiều.
Hàm lượng EPS là 50-350 mg / l cho Str. thermophilus, 80-600 mg / l cho Lc.
lactis subsp. cremoris, 60-150 mg / l cho Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus, 50-60 mg / l cho Lactobacillus casei và khoảng 140 mg / l cho Lactobacillus plantarum [23].
Năm 2000, Dupont và cộng sự cho thấy chủng Lactobacillus rhamnosus 9595M sinh exopolysaccharide cực đại ở giá trị 1275 mg/l khi nghiên cứu so sánh khả năng sinh tổng hợp exopolysaccharide bởi hai chủng Lactobacillus rhamnosus 9595M and Lactobacillus paracasei Type V trong các môi trường có thành phần khác nhau. Trong môi trường sữa Lactobacillus rhamnosus 9595M có khả năng sinh exopolysaccharide mạnh hơn (280 mg /l) so với Lactobacillus paracasei Type V (80 mg /l) [17]
Haroun và cộng sự (2013) tiến hành nuôi cấy 5 chủng sau L. acidophilus NRRL B-4495, L. delbrueckii NRRL B-4525, L. plantarum NRRL B-227, L.
plantarum NRRL B-4496 và L. plantarum NRRL B-14768 trong 25 ml môi trường lỏng MRS, nuôi trong 24 giờ ở 300C. Sau 24 giờ nuôi, hai chủng L.
plantarum NRRL B-227, L. plantarum NRRL B-4496 có khả năng sinh EPS hiệu quả nhất, ba chủng còn lại không sinh EPS. Trong đó, chủng L. plantarum NRRL B-4496 tạo ra lượng EPS lớn nhất [22].
Onilude và cộng sự (2008) nghiên cứu so sánh ảnh hưởng của môi trường đến khả năng sinh tổng hợp EPS của một số chủng vi khuẩn lactic Tác giả cho rằng hàm lượng EPS được tạo ra có sự khác nhau giữa các loài khác nhau và trong cùng một loài LAB, sự khác nhau này còn phụ thuộc vào môi trường phát triển. Tác giả còn cho thấy khi nuôi cấy các chủng L. plantarum LPN1, L.
plantarum LPN3, L. platarum LPN6, L. plantarum LPW010 trong môi trường MRS thì hàm lượng EPS được tạo ra từ các chủng là khác nhau, hàm lượng EPS tương ứng là 165 mg/l, 89,65 mg/ml, 189,4 mg/ml, 185mg/ml. Tương tự khi nuôi chủng L. fermentum LFFN3, L. casei LCN1, L. platarum LPW010 trong môi trường MRS, hàm lượng EPS tạo thành khác nhau giữa các loài, hàm lượng EPS tương ứng 158,25 mg/ml, 189,3 mg/ml, 185 mg/ml. Tác giả tiến hành nuôi cấy các chủng này trong các môi trường khác (Whey, SDM…), kết quả cho thấy cho thấy hàm lượng EPS được tạo thành từ các chủng, loài và loại môi trường khác nhau là không giống nhau [10].
Đối chiếu với các kết quả nghiên cứu của các tác giả cho thấy hàm lượng EPS được tạo thành bởi chủng các L. plantarum N5, L. plantarum W1, L.
plantarum W3, L. plantarum W5 trong cùng điều kiện nuôi cấy là khác nhau, tương đương với các kết quả nghiên cứu của các tác giả.
Qua thí nghiêm trên, chúng tôi thấy L. platarum W1 là chủng có khả năng sinh tổng hợp EPS cao nhất. Chính vì vậy, chúng tôi chọn chủng L. plantarum W1 để tiến hành thí nghiệm tiếp theo.
4.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng khi bổ sung các loại đường khác nhau vào