chủng Lactobacillus plantarum W1 đã tuyển chọn.
Nhiều nghiên cứu cho thấy sản lượng và đặc tính của EPS được tạo thành phụ thuộc rất nhiều vào vi sinh vật, điều kiện nuôi cấy và thành phần môi trường nuôi [43]. Cacbon là một trong những nguồn dinh dưỡng quan trọng trong thành phần nuôi cấy của vi sinh vật. Nguồn cacbon (monosaccharide, disaccharide, polysaccharide ) khác nhau thì ảnh hưởng khác nhau đến khả năng sinh tổng hợp expolysaccharide của vi sinh vật. Để khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường, chúng tôi tiến hành bổ sung các loại đường khác nhau vào MRS:
glucose, saccharose, lactose, đường trong nước dừa và nuôi cấy ở nhiệt độ 370C, trong 48h, với pH môi trường trong khoảng 6-6,2.
4.2.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường saccharose bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp exopolysaccharide bởi chủng Lactobacillus plantarum W1 đã tuyển chọn
Để khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường saccharose đến khả năng sinh tổng hợp EPS bởi chủng Lactobacillus plantarum W1, chúng tôi tiến hành nuôi cấy chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum W1 trong trong các môi trường MRS có bổ sung saccharose với các nồng độ khác nhau (2%, 3%, 4%, 5%, 6%) và môi trường đối chứng (ĐC) là môi trường MRS có chứa 2% glucose. Sau 48h nuôi cấy ở 370C, dịch nuôi cấy được tiến hành các bước tách chiết để thu nhận EPS. Hàm lượng EPS được xác định bằng phương pháp phenol-sunfuric. Kết quả được thể hiện trong hình 4.3
Hình 4.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường saccharose bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp exopolysaccharide
bởi chủng Lactobacillus plantarum W1 đã tuyển chọn
Ghi chú:
Các chữ cái (a, b, c, d) thể hiện sự sai khác về hàm lượng EPS trung bình của chủng L.plantarum qua các mốc thời gian, xử lý Duncan ở mức ý nghĩa thống kê α = 0,05
Kí hiệu Môi trường nuôi cấy ĐC MRS
MT1 MRS bổ sung 2% saccharose.
MT2 MRS bổ sung 3% saccharose.
MT3 MRS bổ sung 4% saccharose.
MT4 MRS bổ sung 5% saccharose.
MT5 MRS bổ sung 6% saccharose
Dựa vào đồ thị 4.3 cho thấy, khi bổ sung hàm lượng saccharose với nồng độ 2%, 3%, 4%, 5%, 6% thì hàm lượng EPS tạo bởi chủng L. Plantarum W1 có xu hướng tăng với sự tăng nồng độ saccharose . Cụ thể, hàm lượng EPS từ môi trường ĐC 78,958 àg/ml tăng lờn 108,412 àg/ml khi bổ sung 2% saccharose.
Khi tiếp tục bổ sung 3%, 4%, 5% saccharose hàm lượng EPS tiếp tục tăng lên tương ứng là 122,875 àg/ml, 129,250 àg/ml và đạt giỏ trị cao nhất 131,833 àg/ml. Nếu tiếp tục bổ sung thờm saccharose với nồng độ cao hơn 5% thỡ hàm lượng EPS xuống 125,541 àg/ml, cú thể giải thớch là do khả năng sinh tổng hợp EPS của chủng L. Plantarum W1 bị ức chế vì nồng độ đường quá cao. Kết quả chứng tỏ khả năng sinh tổng hợp EPS của chủng L. platarum chịu ảnh hưởng từ nguồn carbon và hàm lượng cacbon có trong môi trường nuôi cấy. So với nguồn carbon khác thì đường saccharose kém hiệu quả cho sinh tổng hợp vì hàm lượng EPS tạo thành, tuy rằng khi tăng nồng độ saccharose thì hàm lượng EPS tăng, nhưng tăng không đáng kể.
Kết quả phân tích ANOVA cho thấy sự sai giữa các giá trị hàm lượng EPS của môi trường MT3 (129,250 μg/ml) và MT4(131,833 μg/ml) không có ý nghĩa (p < 0,05). Do đó, để đạt được hiệu quả về mặt kinh tế, cũng như vẫn sản xuất được sản lương EPS cao thì nên chọn bổ sung 4% hàm lượng saccharose vào môi trường MRS để sản sinh được lượng EPS mong muốn và tiết kiện chi phí.
Điều này đúng với nghiên cứu của Cerning và cộng sự (1994) về yêu cầu của nguồn carbon đối với quá trình sinh tổng hợp exopolysaccharide bởi Lactobacillus casei CG11 và phân tích cấu trúc polymer của nó. Sản xuất EPS bởi Lactobacillus casei CG11 đã được nghiên cứu trong môi cơ bản chứa nhiều nguồn carbon (galactose, glucose, lactose, saccharose, maltose, melibiose) với nồng độ 2, 5, 10 và 20g / lít, ở 250C, trong 48 giờ. Kết quả cho thấy rằng, sản
lượng và thành phần của EPS phụ thuộc nhiều vào hàm lượng và nguồn carbon có trong môi trường. Khi bổ sung saccharose với nồng độ tăng từ 2-20g/l thì hàm lượng EPS tạo thành tăng từ 35- 50 mg/l. Tác giả cũng cho thấy hàm lượng EPS tạo ra từ môi trường chứa saccharose thấp hơn nhiều với các môi trường khác đặc biệt là glucose và saccharose cũng không phải là nguồn cacbon tốt cho sản xuất với EPS. Ở cùng nồng độ đường là 20 g/l, nếu sử dụng glucose thì hàm lượng EPS là 160mg/l, còn với môi trường bổ sung saccharose thì hàm lượng EPS là 50mg/l. Ở nồng độ đường thấp nhất là 2g/l, thì sẽ glucose cho hàm lượng EPS là 70mg/l, còn saccharoe cho hàm lượng EPS là 35 mg/l [15]. Fukuda và cộng sự (2010) nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn carbohydrate vào đặc tính của các exopolysaccharide sản xuất bởi L.fermentum TDS030603 trong một môi trường được xác định về mặt hóa học cũng cho thấy saccharose không phải là nguồn carbon tối ưu để vi khuẩn sử dụng tổng hợp EPS và nếu ở một lượng lớn thì saccharose có thể là nguồn carbon ức chế sự tổng hợp EPS [21].
Theo Korakli (2012) nghiên cứu về chuyển hóa saccharose và sản xuất exopolysaccharide, để chuyển hóa sacccharose bởi vi khuẩn lactic, chúng có thể sử dụng dextransucrase hoặc phosphorylase sucrose hay phosphotransferase hay invertase. Khác với các đường khác thì chỉ một phần saccharose được chuyển hóa [ 25]. Điều này lý giải tại sao saccharose không phải là nguồn cacbon thích hợp cho sản xuất EPS. Một lí do khác, có thể là do chủng L. Platarum W1 có khả năng phân hủy đường saccharose không cao, nên lượng glucose và fructose tạo thành thấp, dẫn đến sinh tổng hợp EPS kém. Từ đây có thể thấy hàm lượng saccharose có ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp EPS bởi vi khuẩn L.
Plantarum W1, nếu nồng độ saccharose trong môi trưởng nuôi cấy quá cao sẽ ức chế quá trình sinh tổng hợp EPS và saccharose không phải là nguồn cacbon thích hợp cho chủng L. Plantarum W1 sinh EPS.
Hình 4.4. Hình ảnh tạo màu bằng phương pháp phenol-sunfuric khi khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường saccharose bổ sung vào môi trường nuôi cấy
đến khả năng sinh tổng hợp exopolysaccharide bởi chủng Lactobacillus plantarum W1 đã tuyển chọn
4.2.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởngg của hàm lượng đường glucose bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp exopolysaccharide bởi chủng Lactobacillus plantarum W1 đã tuyển chọn
Để khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường glucose đến khả năng sinh tổng hợp EPS bởi chủng Lactobacillus plantarum W1, chúng tôi tiến hành nuôi cấy chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum W1 trong trong các môi trường MRS có bổ sung glucose với các nồng độ khác nhau (2%, 3%, 4%, 5%, 6%) với môi trường đối chứng (ĐC) là môi trường MRS có chứa 2% glucose. Rồi tiến hành thu nhận EPS và xác đinh hàm lượng EPS bằng phương pháp phenol- sunfuric. Kết quả được thể hiện trong hình 4.5
Hình 4.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường glucose bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp exopolysaccharide bởi
chủng Lactobacillus plantarum W1 đã tuyển chọn Ghi chú:
Các chữ cái (a, b, c, d) thể hiện sự sai khác về hàm lượng EPS trung bình của chủng Lactobacillus plan arum W1qua các mốc thời gian, xử lý Duncan ở mức ý nghĩa thống kê α = 0,05
Kí hiệu Môi trường nuôi cấy ĐC MRS
MT6 MRS bổ sung 2% glucose.
MT7 MRS bổ sung 3% glucose.
MT8 MRS bổ sung 4% glucose.
MT9 MRS bổ sung 5% glucose.
MT10 MRS bổ sung 6% glucose
Kết quả cho thấy khi bổ sung glucose với nồng độ tăng dần (2%, 3%, 4%, 5%, 6%) thì hàm lượng EPS tạo thành khác nhau. Cụ thể, khi bổ sung glucose vào MRS với nồng độ 2% (MT6), 3%(MT7), 4%(MT8) thì hàm lượng EPS được tạo thành bởi chủng L. plantarum W1 tăng đáng kể so với môi trường ĐC (80,250 àg/ ml), hàm lượng EPS tương ứng lần lượt là 120,083 àg/ ml, 137,458 àg/ ml, 151,917 àg/ ml. Kết quả cho thấy hàm lượng EPS đạt cực đại ở mụi trường MT8 và cú xu hướng giảm dần ở mụi trường MT9 ( 141,500 àg/ ml), MT10 (117,125 àg/ ml). Điều này cú nghĩa là bổ sung glucose với nồng độ 4%
vào môi trường nuôi cấy là thích hợp nhất cho chủng L. plantarum W1 sinh tổng hợp tạo nhiều EPS nhất, nếu bổ sung glucose với nồng độ lớn hơn 4 % thì có thể làm ức chế khả năng sinh tổng hợp của chủng L. plantarum W1 làm giảm sản lượng EPS tạo thành.
Hình 4.6. Hình ảnh tạo màu phương pháp phenol-sunfuric khi khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng glucose bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến khả năng
sinh tổng hợp exopolysaccharide bởi chủng Lactobacillus plantarum W1 đã tuyển chọn
Kết quả nghiên cứu sự ảnh hưởng của hàm lượng glucose bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp EPS của chủng L. Plantarum W1 hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu của Haroun và cộng sự (2013) sinh tổng hợp và hình thái học của exopolysaccharide từ một probiotic Lactobacillus plantarum dưới điều kiện phát triển khác nhau. Tác giả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ glucose khác nhau đến sản lượng EPS tạo thành bằng nuôi chủng L.
plantarum NRRL B-4496 trong môi trường MRS có bổ sung glucose với nồng độ 10, 15, 20, 25 và 30 g/l. Kết quả cho thấy hàm lượng EPS tăng với sự tăng
của nồng độ glucose và đạt giá trị cao nhất là 650 mg/l khi bổ sung glucose với nồng độ 20 g/l, nó cũng cho thấy nếu tiếp tục bổ sung glucose với nồng độ cao hơn 20 g/l thì sản lượng EPS giảm dần. Tác giả cũng đã chứng minh glucose là nguồn cacbon tốt nhất trong các loại đường (glucose, fructose, galctose) được sử dụng cho L. plantarum NRRL B-4496 sinh tổng EPS, với hàm lượng là 159,2 mg/l cao hơn so với galactose (477,6 mg/l), fructose (159,2 mg/l) [22]
Tương tự Yuksekdag và cộng sự (2008) nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon khác nhau lên khả năng sản xuất exopolysaccharide bởi Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (B3, G12) và Streptococcus thermophilus (W22).
Tác giả bổ sung glucose với nồng độ 5, 10, 15, 20, 25, 30 g / l vào môi trường MRS, nuôi ở 420C, trong18 giờ để nghiên cứu ảnh hường của nồng độ glucose đến khả năng sản xuất EPS của Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (B3, G12) và Streptococcus thermophilus (W22). Kết quả cho thấy sản lượng EPS tăng lên đáng kể và cao nhất ở nồng độ glucose 30g/l với hàm lượng EPS là 255 mg/l, 224 mg/l, 174 mg/l tương ứng với các chủng Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus B3, L. delbrueckii subsp. Bulgaricus G12 và Streptococcus thermophilus W22. Khi nghiên cứu ảnh hường của nguồn cabon khác nhau (glucose, fructose, sucrose hay lactose) đến khả năng sinh EPS của ba chủng này, tác giả cho rằng glucose nguồn cacbon hiệu quả nhất cho Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus B3, G12 và Streptococcus thermophilus W22 sản xuất EPS với hàm lượng tương ứng là 211mg/l, 175 mg/l và 120 mg/l EPS. Còn khi sử dụng fructose, lactose thì chủng L. delbrueckii subsp. bulgaricus B3 chỉ sinh 180mg/l, 203 mg / l EPS tương ứng, còn chủng L. delbrueckii subsp.
bulgaricus G12 sản xuất là 69 mg/l, 113 mg/l, tương ứng với fructose, glucose.
Khi fructose được sử dụng làm nguồn carbon, EPS sản xuất giảm đáng kể. Đối với S. thermophilus W22, với sucrose, fructose, lactose và glucose hàm lượng EPS tương ứng là 34 mg/l, 40 mg/l, 114 mg/l [45]
Như vậy, sau khi nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến khả năng sing tổng hợp exopolysaccharide bởi chủng L. plantarum W1, chúng tôi kết luận rằng, hàm lượng glucose khác nhau trong môi trường nuôi cấy ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh tổng hợp EPS của vi khuẩn L. platarum W1 và các vi khuẩn khác, glucose cũng là nguồn cacbon thích hợp cho sản xuất đạt sản lượng EPS cao và để chủng L. plantarum sinh EPS cao nhất trong môi trường bổ sung glucose thì nên tiến hành bổ sung glucose với nồng độ 4%.
4.2.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng lactose bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp exopolysaccharide bởi chủng Lactobacillus plantarum W1 đã tuyển chọn
Lactose là một disaccarit bao gồm galactose và glucose. Nhiều tác giả đã công bố rằng galactose và glucose là một trong những thành phần có mặt trong cấu trúc của EPS. Vì vậy, chúng tôi đã chọn lactose bổ sung vào môi trường nuôi cấy để khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng lactose đến khả năng sinh tổng hợp exopolysaccharide bởi chủng Lactobacillus plantarum W1 đã tuyển chọn.
Chúng tôi tiến hành nuôi cấy chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum W1 trong trong các môi trường MRS có bổ sung lactose với các nồng độ khác nhau (2%, 3%, 4%, 5%, 6%), với môi trường đối chứng (ĐC) là môi trường MRS có chứa 2% glucose. Sau đó thực hiện tách chiết EPS theo quy trình sản xuất EPS đã nêu trên.
Hình 4.7. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường lactose bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp exopolysaccharide bởi
chủng Lactobacillus plantarum W1 đã tuyển chọn Ghi chú:
Các chữ cái (a, b, c, d, e) thể hiện sự sai khác về hàm lượng EPS trung bình của chủng Lactobacillus plan arum W1qua các mốc thời gian, xử lý Duncan ở mức ý nghĩa thống kê α = 0,05
Kí hiệu Môi trường nuôi cấy ĐC MRS
MT6 MRS bổ sung 2% lactose.
MT7 MRS bổ sung 3% lactose.
MT8 MRS bổ sung 4% lactose.
MT9 MRS bổ sung 5% lactose.
MT10 MRS bổ sung 6% lactose
Hình 4.8. Kết quả tạo màu phương pháp phenol-sunfuric khi khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng lactose bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến khả năng
sinh tổng hợp exopolysaccharide bởi chủng Lactobacillus plantarum W1 đã tuyển chọn
Đồ thị 4.3 cho thấy, hàm lượng EPS sản xuất bởi chủng L. plantarum W1 tăng theo hàm lượng lactose (2%, 3%, 4%, 5%, 6%) bổ sung vào môi trường và bắt đầu giảm ở nồng độ 6% lactose( MT10). Cụ thể, hàm lượng EPS được sinh bởi chủng L. plantarum W1 trong môi trường MRS bổ sung lactose cao hơn rất nhiều so với môi trường MRS (ĐC), khi bổ sung lactose 2%, 3%, 4%. 5% hàm lượng EPS tạo thành lần lượt là 133,583 àg/ml, 149,492 àg/ml , 170,458 àg/ml và 183,412 àg/ml, trong khi mụi trường ĐC chỉ đạt hàm lượng EPS 78,915 àg/ml. Kết quả cho thấy hàm lượng EPS tăng theo sự tăng nồng độ đường lactose bổ sung và đạt giá trị lớn nhất với nồng độ 5% lactose (MT14). Tuy nhiên, khi bổ sung tiếp tục 6% lactose vào môi trường nuôi thì hàm lượng EPS giảm xuống 167,875 àg/ml. Điều này cú thể là do hàm lượng lactose quỏ cao sẽ làm hạn chế khả năng sinh tổng hợp EPS của L. plantarum W1. Kết quả nghiên cứu cho thấy khi bổ sung hàm lượng lactose thì sẽ giúp tăng sản lượng EPS
nhưng nếu bổ sung lactose vượt quá nồng độ 5% thì sẽ ức chế khả năng tổng hợp EPS của chủng L. plantarum W1. Vì vậy để sản xuất hiệu quả thì nên bổ sung lactose nồng độ thích hợp và đối với chủng L. plantarum W1 thì 5%
lactose là thích hợp nhất. Qua đó, có thể thấy lactose là một nguồn cacbon hiệu quả cho chủng này sinh EPS.
Kết quả này cũng phù hợp với kết quả của Tallon và cộng sự (2013) khi nghiên phân lập và đặc tính của hai exopolysaccharides sản xuất bởi Lactobacillus plantarum EP56 đã cho thấy, khi nuôi cấy L. Plantarum EP56 trong môi trường xác định về mặt hóa học (CMD) có bổ sung 20 g/l các loại glucose, galactose, fructose, lactose và saccharose. Tác giả cho thấy lactose là nguồn cacbon hiệu quả nhất cho sản xuất EPS trong năm nguồn cacbon được thử nghiệm. Hàm lượng EPS tối đa trong môi trường bổ sung glucose là 114,5 mg/l, trong môi trường bổ sung galactose là 129,2 mg/l,trong môi trường bổ sung fructose hàm lượng EPS thấp nhất 46,3 mg/l và trong môi trường bổ sung lactose hàm lượng EPS là cao nhất 140,2 mg/l [37]. Tương tự Torino và cộng sự (2005) nghiên cứu về khả năng tổng hợp EPS của chủng L. helveticus ATCC 15807 đã phát hiện rằng quá trình sản xuất EPS bởi L. htftelveticus ATCC 15807 khi sử dụng nguồn carbon là đường lactose hiệu quả hơn cả [39]. Như vậy lactose là một nguồn cacbon thích hợp cho chủng L. plantarum W1 sinh EPS cao nhất và nếu bổ sung lacotose với nồng độ thích hợp sẽ mang lại hiệu quả cho sản xuất EPS.
4.2.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường trong nước dừa bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp exopolysaccharide bởi chủng Lactobacillus planarum W1 đã tuyển chọn
Để khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường trong nước dừa bổ sung vào môi trường nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp exopolysaccharide bởi chủng Lactobacillus plan arum W1, trước tiên chúng tôi xá định hàm lượng đường trong nước dừa. Chúng tôi chọn quả dừa tươi, non đem hòa trộn với nhau và lọc để đảm bảo độ sạch và đồng đều. Rồi đem đi xác định hàm lượng đường khử trong nước dừa bằng phương pháp DNS.
Kết quả cho thấy hàm đường trung bình trong nước dừa của mẫu nước dừa thủy phân và mẫu nước dừa không thủy phân lần lượt là 22,205 mg/ml và 20,105 mg/ml. Điều này có nghĩa là nước dừa sau khi được thủy phân thì hàm lượng đường trong nước dừa tăng nhưng không đáng kể và đường trong nước dừa chủ yếu là đường đơn, hàm lượng saccharose rất ít. Do đó, chúng tôi đã sử
dụng nước dừa không thủy phân (20,105 mg/ml) để tiến hành khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường nước dừa đến khả năng sinh tổng hợp EPS. Tổng hàm lượng đường trong nước dừa thay đổi từ 10,675 – 11,592 mg/ml.
Trong khi đó Seesuriyachan và cộng sự (2011) khi nghiên cứu quá trình sản xuất exopolysaccharide bởi L. confusus TISTR 1498 bằng cách sử dụng nước dừa như một nguồn carbon thay thế tác dụng của các thành phần khác như pepton, cao thịt, cao nấm. Tác giả cho thấy hàm lượng đường trong nước dừa giả là từ 26,5-42,5 g /l và có nghĩa là tổng số đường là khoảng 40 g/l. Hàm lượng đường theo tác giả này công bố lớn hơn hàm lượng đường mà chúng tôi xác định được là do nguyên liệu dừa mà chúng tôi dùng để khảo sát là dừa non nên hàm lượng đường ít hơn.
Khi đã xác định được hàm lượng đường khử, chúng tôi tiến hành thí nghiêm bằng cách sử dụng mẫu đối chứng là môi trường MRS và bổ sung đường trong nước dừa vào môi trường MRS với nồng độ 5%, 10%, 15%, 20%.
Sau 48 giờ nuôi, tiến hành thu nhận EPS và xác định hàm lượng EPS bằng phương pháp phenol-sunfuric, kết quả được thể hiện trong hình 4.9
Hình 4.9. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường trong nước dừa bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp
exopolysaccharide bởi chủng Lactobacillus plantarum W1 đã tuyển chọn Các chữ cái (a, b, c, d) thể hiện sự sai khác về hàm lượng EPS trung bình của chủng Lactobacillus plan arum W1qua các mốc thời gian, xử lý Duncan ở mức ý nghĩa thống kê α = 0,05