Phân lập, tuyển chọn và khảo sát các điều kiện nuôi cấy của chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase để ứng dụng trong xử lý chất thải làng nghề sản xuất miến dong

Đồ án tốt nghiệp Phạm Thị Hằng Nga – Kĩ thuật sinh học K56 Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Đồ án tốt nghiệp Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH Phạm Thị Hằng Nga – Kĩ thuật sinh học K56 Đồ án tốt nghiệp Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội DANH MỤC VIẾT TẮT CMC : Cacboxyl methyl cellulose BHM : Bushnell Haas medium EG : Endo-β-1,4-cellulase CBH : Cellobiohydrolase BG : β-glucosidase kDa : Kilo Dalton v/p : w/v : Weight/volume – trọng lượng/thể tích BOD : Biochemical Oxygen Demand COD : Chemical Oxygen Demand SS : Suspended Solids DNS : 3,5-dinitrosalicylic Vòng/ phút QCVN : Quy chuẩn Việt Nam QHTN : Quy hoạch thực nghiệm TCCP : Tiêu chuẩn cho phép Phạm Thị Hằng Nga – Kĩ thuật sinh học K56 Đồ án tốt nghiệp Phạm Thị Hằng Nga – Kĩ thuật sinh học K56 Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Đồ án tốt nghiệp Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Trần Liên Hà - Giảng viên bộmôn Vi Sinh - Hóa Sinh - Sinh Học Phân Tử, Viện Công nghệ Sinh học Công nghệThực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội tận tình hướng dẫn suốt trình em thực đề tài hoàn thành khoá luận Em xin chân thành cảm ơn tới thầy cô giáo cán công tác Viện Công NghệSinh Học - Công nghệThực phẩm - Trường Đại học Bách khoa Hà Nội dạydỗvà tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt thời gian học tập trường Em xin cảm ơn gia đình, anh chị, bạn bè làm việc phòng thí nghiệm môn Vi sinh – Hóa sinh – Sinh học phân tử C4 - 401 tập thể lớp Kỹ thuật Sinh học - K56 động viên, khuyến khích, giúp đỡ em thời gian thực đề tài Trong trình thực hoàn thành đề tài tốt nghiệp thời gian kiến thức hạn chế nên tránh khỏi thiếu sót Em mong nhận đóng góp ý kiến bảo tận tình quý thầy cô để khóa luận hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 26 tháng năm 2016 Sinh viên Phạm Thị Hằng Nga Phạm Thị Hằng Nga – Kĩ thuật sinh học K56 Đồ án tốt nghiệp Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội TÓM TẮT Hằng năm có khoảng 230 tỉ chất hữu tạo từ trình quang hợp thực vật, có khoảng 70 tỉ (30%) cellulose có nguồn gốc từ sản xuất nông nghiệp, chất thải nhà máy giấy, đường dệt may Cellulose không tan nước bị thuỷ phân đun nóng với kiềm hay acid bị thủy phân enzyme cellulase Hiện nay, lượng phế phụ phẩm nông nghiệp chất thải từ nhà máy gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi trường Ngoài ra, Việt Nam nước nông nghiệp, hàng năm lượng phụ phẩm nông nghiệp tạo từ ngành chế biến nông sản vô lớn đa dạng, phong phú như: rơm, rạ, ngô, bã mía, bã dong riềng, bã sắn Miến dong loại sản phẩm số đó, miến dong sản xuất từ dong riềng ưa chuộng giá trị dinh dưỡng mùi vị Quá trình chế biến tinh bột dong từ củ dong riềng tạo lượng chất thải lớn bã dong Lượng bã số làng nghề sản xuất tận thu tái sử dụng lại xả thẳng môi trường mà không qua xử lý gây ô nhiễm nguồn nước mặt, nước ngầm, ô nhiễm đất bầu không khí làng nghề Tuy nhiên với thành phần chủ yếu cellulose, bã dong tận dụng làm nguồn nguyên liệu để tạo sản phẩm có giá trị kinh tế đồng thời giúp giảm thiểu ô nhiễm môi trường Để giải vấn đề trên, việc phân lập chủng vi sinh vật có hoạt tính phân huỷ cellulose có ý nghĩa quan trọng việc phát triển chế phẩm vi sinh vật để xử lý ô nhiễm môi trường Hiện có nhiều phương pháp đưa áp dụng để xử lý nước thải như: vật lý, hóa học, sinh học, kết hợp phương pháp Tuy nhiên, phương pháp sinh học chiếm nhiều quan tâm ưu điểm mặt kinh tế xã hội.Vì em chọn đề tài “Phân lập, tuyển chọn khảo sát điều kiện nuôi cấy chủng vi sinh vật có khả sinh tổng hợp cellulase để ứng dụng xử lý chất thải làng nghề sản xuất miến dong” Từ mẫu phân vi sinh, mẫu đất, rơm rạ mủn, bã dong huyện Dương Liễu, Hà Nội Ta tiến hành phân lập, tuyển chọn định tên chủng Bacillus subtilis strain BD5có khả phân hủy cellulose cao Từ chủng tiến hành khảo sát điều kiện nuôi cấy chủng, nhận thấy chủng phát triển tốt pH = 6, nồng độ CMC 1% tỷ lệ cấp giống 5%, nguồn nitơ, cacbon pepton cao thịt Phạm Thị Hằng Nga – Kĩ thuật sinh học K56 Đồ án tốt nghiệp Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội LỜI MỞ ĐẦU Hiện nay, ngành chế biến nông sản thực phẩm nước ta trọng lợi nguyên liệu nước nông nghiệp mang lại.Tuy nhiên qua trình chế biến tạo lượng chất thải Việc không tận thu, tái sử dụng không xử lý nguồn thải gây lãng phí gây ô nhiễm môi trường từ đòi hỏi khoản tiền lớn để giải triệt để Miến dong sản phẩm dạng sợi sản xuất từ tinh bột dong riềng tiếng với nhiều làng nghề Bắc Kạn, Tuyên Quang, Hưng Yên, Hà Nội,… Việc sản xuất tinh bột dong tạo lượng bã thải khoảng 80% so với lượng nguyên liệu [10].Thành phần bã thải chủ yếu cellulose – dạng hợp chất hữu cấu trúc phức tạp, tự nhiên phân hủy với tốc độ chậm không hoàn toàn nên nên lâu dài nguồn thải có nguy gây ô nhiễm môi trườngnghiêm trọng Một giải pháp hiệu quảvà kinh tế nhằm chuyển hóa nguồn chất cellulose thành sản phẩm có giá trị sử dụng enzyme cellulase loại enzyme có khả phân cắt cellulose Từ lý trên, em lựa chọn đề tài: “Phân lập, tuyển chọn khảo sát điều kiện nuôi cấy chủng vi sinh vật có khả sinh tổng hợp cellulase để ứng dụng xử lý chất thải làng nghề sản xuất miến dong” Đề tài em tiến hành nghiên cứu với mục đích: - Phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả sinh tổng hợp cellulase cao Khảo sát, tối ưu điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến sinh tổng hợp cellulase chủ Phạm Thị Hằng Nga – Kĩ thuật sinh học K56 Đồ án tốt nghiệp Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội PHẦN I: TỔNG QUAN 1.1 Tình hình sử dụng dong riềng Việt Nam: Xu hướng trồng lương thực lúa, ngô mì nhằm mục đích đảm bảo an ninh lương thực quan tâm không Việt Nam, mà nhiều nước giới Trong hàng loạt lương thực, có tiềm phát triển lương thực dạng củ chứa nhiều bột lớn Có chục loài với hàng trăm giống khác trồng Cây có củ thích hợp trồng đất tốt, xấu; đất pha cát, thịt; khí hậu nóng, lạnh; vùng sườn núi, đồi; vùng trung du, đồng bằng; nơi hạn, úng; vùng chuyên canh, mảnh đất "đầu thừa đuôi thẹo"; ven bờ rào, bóng râm… Việc phát triển ăn củ đạt suất cao chất lượng tốt làm giảm lượng gạo tiêu dùng nước để dành cho xuất Trong tập đoàn có củ Dong riềng cho suất cao phù hợp nhiều vùng sinh thái, dễ trồng có hàm lượng tinh bột cao, chế biến nhiều mặt hàng lương thực thực phẩm có giá trị kinh tế cao người tiêu dùng nước ưu thích Dong riềng có tên khoa học Canna edulis Ker Gawl, thuộc họ Chuối hoa - Cannaceae Cây cao 1,2-1,5m, tới 2m Thân rễ phình to thành củ, chứa nhiều tinh bột Lá có phiến thuôn dài, thường có màu tía, bẹ tía, gân to, gân phụ song song Hoa xếp thành cụm thân; đài 3, cánh hoa 3; nhị lép màu đỏ son, rộng 1cm; nhị vàng, môi vàng Ra hoa quanh năm Củ dong riềng chứa nhiều tinh bột, có vị ngọt, nhạt, tính mát; có tác dụng nhiệt, lợi thấp, an thần, giáng áp Củ luộc ăn ngon chế bột làm miến nhiều vùng nước ta[32] Tại xã Lực Hành (Yên Sơn), nhiều năm dong riềng coi mạnh, người dân trồng từ năm 70 kỷ trước Xã coi dong riềng xóa đói giảm nghèo.Cây dong riềng trồng khắp vườn đồi 12 thôn Bên cạnh việc thu mua dong riềng củ xã, nhiều hộ nông dân xã Lực Hành tổ chức thu mua dong riềng xã lân cận để sản xuất, chế biến thành bột dong riềng cung cấp cho thị trường Theo thống kê từ Trung tâm khuyến nông tỉnh, toàn tỉnh có 600 dong riềng; diện tích dong riềng phân bố tập trung chủ yếu huyện: Yên Sơn 300 ha, Chiêm Hóa 160 ha, huyện Lâm Bình 40 ha; suất bình quân đạt 80 tấn/ha; sản lượng 48.000 củ tươi/năm[33] Phạm Thị Hằng Nga – Kĩ thuật sinh học K56 Đồ án tốt nghiệp Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Và theo thống kê sở Công thương, diện tích trồng dong riềng Bắc Kạn tăng đột biến lên tới khoảng 2.900ha (tăng 56,97% so với năm 2012 đạt 138,14% kế hoạch năm) Với dự ước suất thu hoạch đạt từ 50-70 củ/ha tổng sản lượng củ dong riềng thu hoạch năm 2013 địa bàn tỉnh ước đạt 182.166 Sau để giống cho vụ trồng dong năm 2014 khoảng 3.400 tương đương 1.700ha (theo kế hoạch trồng dong riềng năm 2014 địa bàn tỉnh Sở Nông nghiệp Phát triển nông thông xây dựng) sản lượng củ dong riềng đưa vào chế biến tiêu thụ năm 2013 địa bàn tỉnh Bắc Kạn ước khoảng 178.766 Hiện địa bàn tỉnh Bắc Kạn có 112 sở, hộ gia đình hoạt động chế biến dong riềng (bao gồm sở, hộ gia đình đầu tư mới, nâng công suất năm 2013) Trong đó, 24 sở, hộ gia đình vừa chế biến tinh bột, vừa sản xuất miến; 14 sở, hộ gia đình chuyên sản xuất miến; 74 sở, hộ gia đình chuyên chế biến tinh bột Đối với 98 sở, hộ gia đình (vừa sản xuất bột, miến chuyên sản xuất bột cộng lại) có tổng công suất chế biến tinh bột dong riềng địa bàn tỉnh khoảng 1.170 củ/ngày tương đương sản lượng củ dong riềng chế biến khoảng 117.000 (tính thời gian 100 ngày), đáp ứng 65,5% sản lượng củ dong riềng năm 2013 Với tỷ lệ thu hồi tinh bột 18% thu khoảng 21.000 tinh bột thương phẩm, lại sản lượng củ dong riềng xuất bán tỉnh khoảng 61.760 [32] Mỗi năm tỉnh Bắc Kạn sản xuất khoảng 180.000 củ dong riềng, số hầu hết đưa vào để chế biến miến dong tinh bột dong làng nghề tỉnh, số củ dong nguyên liệu thô bán cho nhu cầu sản xuất miến dong vùng khác Tại làng nghề Minh Hồng, Minh Quang, Ba Vì, Hà Nội với lợi diện tích đất đồi rộng lớn, gần chân núi Ba Vì nên dong riềng Minh Hồng phát triển, tổng diện tích dong riềng là250ha, sản lượng bột thu hàng năm khoảng 20.000 [29], phần bột sử dụng làm nguyên liệu sản xuất miến dong làng nghề Bên cạnh làng nghề sản xuất miến dong từ nguyên liệu củ dong, số làng nghề sản xuất miến dong Cát Quế, Minh Khai (Hoài Đức, Hà Nội), Cự Đà (Thanh Oai, Hà Nội) chủ yếu mua tinh bột dong từ làng nghề khác tiến hành chế biến Từ việc sử dụng dong riềng số lượng lớn trải rộng khắp nhiều tỉnh thành nước Đặt vấn đề lượng nước thải bã thải rắn dư thừa không xử lý Phạm Thị Hằng Nga – Kĩ thuật sinh học K56 Đồ án tốt nghiệp Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội kịp thời gây ô nhiễm môi trường đất, nước, không khí… Và gây hại cho sức khỏe người dân 1.2 Quy trình sản xuất miến dong: Từ củ dong riềng, thông qua trình chế biến, thu tinh bột dong riềng Có hai loại tinh bột dong riềng tinh bột khô tinh bột ướt Hiện nay, miến sản xuất chủ yếu từ tinh bột dong riềng ướt.Thông thường, tinh bột dong riềng ướt sản xuất vùng người dân làm nghề sản xuất miến vùng nguyên liệu trồng củ dong Tinh bột dong riềng ướt bảo quản kín bao hầm kín sử dụng để làm miến năm Tính trung bình, 1000 kg củ dong riềng sau chế biến thu 250- 300 kg tinh bột ướt Từ tinh bột ướt, đem phơi nắng sấy khô thu tinh bột dong riềng khô, bảo quản thời gian dài • Quy trình chế biến tinh bột dong: Công nghệ chế biến loại củ, đặc biệt củ dong riềng có tính chất truyền thống tương đối phổ biến, làm tăng giá trị sử dụng dong riềng đồng thời góp phần làm tăng thu nhập cho bà nông dân Sản phẩm thu tinh bột dong riềng Phạm Thị Hằng Nga – Kĩ thuật sinh học K56 10 Đồ án tốt nghiệp Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Hình 3.10: Ảnh hưởng pH đến phát triển chủng BD5 Nhìn vào biểu đồ ta thấy pH 7, pH 8, pH chủng B.subtilis BD5 có khả sinh trưởng với mật độ thấp, hoạt động tốt khoảng pH rộng từ – 9, đặc biệt pH = cho lượng sinh khối đạt cao đạt 2,29 Dựa vào đặc điểm chủng B subtilis BD5 hoạt động tốt dải pH rộng phù hợp với đặc điểm chất thải, nên ứng dụng vào xử lý chất thải không cần tốn hóa chất để điều chỉnh pH, tiết kiệm chi phí xử lý Chọn pH = để khảo sát yếu tố 3.5.2 Ảnh hưởng yếu tố nhiệt độ Nhiệt độ yếu tố quan trọng giúp ta biết thời điểm chủng phát triển mạnh cho lượng sinh khối lớn nhiệt độ Để nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng chủng BD5, tiến hành nuôi cấy chủng bình tam giác 250ml có chứa 99ml môi trường lỏng NA + 1%CMC, nuôi tĩnh, pH tiến hành lấy mẫu thời điểm 0h, 12h, 24h, 36h, 48h, 60h nhiệt độ 30oC, 35oC, 37oC, 40oC đo bước sóng 600nm Kết ta thấy chủng B subtilis BD5 thời điểm khác biểu diễn hình 3.11 Phạm Thị Hằng Nga – Kĩ thuật sinh học K56 49 Đồ án tốt nghiệp Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Hình 3.11: Ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển chủng BD5 Nhìn biểu đồ ta thấy nhiệt độ 30 oC, 35oC, 40oC chủng B.subtilis BD5 có khả sinh trưởng với mật độ thấp 37 oC, đặc biệt nhiệt độ 37oC cho lượng sinh khối đạt cao 2,6 Chọn nhiệt độ 37oC để nghiên cứu tiếp 3.5.3 Tỷ lệ cấp giống Tỷ lệ cấp giống yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men Khi tỷ lệ cấp giống cao, lượng vi khuẩn ban đầu nhiều, khả tiêu thụ chất lớn, sản sinh nhiều chất gây ức chế trình sinh trưởng vi khuẩn Trong trường hợp tỷ lệ cấp giống thấp dẫn đến kéo dài thời gian lên men, dễ nhiễm tạp Khảo sát tỷ lệ cấp giống ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp cellulase chủng B.subtilis BD5, kết theo hình 3.12 Phạm Thị Hằng Nga – Kĩ thuật sinh học K56 50 Đồ án tốt nghiệp Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Hình 12: Ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống đến phát triển chủng BD5 Nhận xét: Ta thấy nồng độ cấp giống từ 1% đến 5% chủng BD5 phát triển tăng dần đạt cao nồng độ giống 5%, đến tăng nồng độ giống cấp lên 7% 10% chủng bắt đầu phát triển chậm giảm Do ta lựa chọn nồng độ giống 5% để nghiên cứu 3.5.4 Nồng độ CMC Nồng độ CMC nguồn cảm ứng hệ gen vi sinh vật tổng hợp chất mong muốn Nếu môi trường hàm lượng chất cảm ứng ít, trình tổng hợp chất yếu, nhiều ức chế trình tổng hợp Chính lựa chọn nồng độ nguồn chất quan trọng Kết khảo sát ảnh hưởng nồng độ CMC đến khả sinh tổng hợp cellulase theo hình 3.13 Phạm Thị Hằng Nga – Kĩ thuật sinh học K56 51 Đồ án tốt nghiệp Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Hình3.13: Ảnh hưởng nồng độ CMC đến phát triển chủng BD5 Nhận xét: dựa vào đồ thị ta thấy nồng độ CMC 1% cho hàm lượng sinh khối lớn đạt 3,6 cao nhiều so với nồng độ CMC 1,5% từ nồng độ 2% đến 3,5% ta thấy chủng phát triển thấp không thay đổi nhiều Chọn nồng độ CMC 1% để nghiên cứu tiếp 3.5.5 Ảnh hưởng tốc độ lắc Tốc độ lắc ảnh hưởng lớn tới chủng vi sinh vật hiếu khí Tốc độ lắc lớn, khả hòa tan oxy vào môi trường lớn, cung cấp oxy cho vi sinh vật sinh trưởng phát triển tạo sản phẩm trao đổi chất tăng tốc độ lắc lớn khiến trình đảo trộn lớn gây va chạm tác động mạnh làm ảnh hưởng tổng hợp tế bào Tuy nhiên, tốc độ lắc nhỏ khả hòa tan oxy làm ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển vi sinh vật Khảo sát tốc độ lắc trình nuôi cấy khảo sát khả sử dụng oxy chủng Kết ảnh hưởng tốc độ lắc đến khả sinh tổng hợp cellulase chủng B subtilis BD5 theo hình 3.14 Phạm Thị Hằng Nga – Kĩ thuật sinh học K56 52 Đồ án tốt nghiệp Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Hình 14: Ảnh hưởng tốc độ lắc đến phát triển chủng BD5 Nhận xét: Từ đồ thị ta thấy tốc độ lắc có ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp cellulase chủng BD5 Với tốc độ lắc 0-50v/p chủng sinh phát triển sinh khối không cao, B subtilis BD5 chủng hiếu khí, nên lượng oxi hòa tan thấp, khả sinh enzyme chủng giảm Tại tốc độ lắc 100-150 v/p chủng sinh có sinh khối cao đạt giá trị cao 150v/p với sinh khối đạt 11,3 Nhưng tốc độ lắc 200 v/p sinh khối lại giảm Do chọn chế độ lắc 150 v/p cho nghiên cứu 3.6 Đường cong sinh trưởng chủng BD5 theo điều kiện tối ưu Hình 15: Đồ thị biểu diễn tăng trưởng vi khuẩn BD5 theo thời gian Phạm Thị Hằng Nga – Kĩ thuật sinh học K56 53 Đồ án tốt nghiệp Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Kết cho thấy trình sinh trưởng chủng B Subtilis BD5 theo pha Pha thích nghi giờ, sinh khối tế bào tăng chậm, giai đoạn chủng B subtilis BD5 thích ứng dần với môi trường Pha log từ đến 36 giờ, sinh khối tế bào tăng mạnh, chất dinh dưỡng chủ yếu dùng để tổng hợp sinh khối Trong khoảng thời gian từ 36 đến 48 giờ, quần thể vào pha cân bằng, sinh khối tế bào giữ mức ổn định Giai đoạn từ sau 48 sinh khối tế bào bắt đầu giảm, môi trường chất dinh dưỡng bắt đầu cạn kiệt Phạm Thị Hằng Nga – Kĩ thuật sinh học K56 54 Đồ án tốt nghiệp Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu em rút số kết luận sau: - - - Từ nguồn phân lập khác phân lập 22 chủng có khả sinh tổng hợp cellulase chọn chủng có khả tổng hợp cellulase cao (với tỷ lệ phòng phân giải D/d ≥ 3,8) Với phương pháp tuyển chọn, từ chủng phân lập kết hợp với sưu tập giống môn Hóa sinh – Vi sinh – Sinh học phân tử chọn chủng Bacillus subtilis BD5 có khả sinh tổng hợp cellulase cao Tiến hành khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp cellulase chủng B subtilis BD5 nhiệt độ 37°C, pH 6, nồng độ CMC 10 g/l, tỷ lệ cấp giống 5%, lắc 150 vòng/phútthì sau ngày nuôi cấy cho sinh khối 11,34 Phạm Thị Hằng Nga – Kĩ thuật sinh học K56 55 Đồ án tốt nghiệp Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội KIẾN NGHỊ Từ kết luận em xin đưa số kiến nghị sau: - Tiến hành nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học để ứng dụng Tiếp tục khảo sát thêm điều kiện nuôi cấy chủng Bacillus subtilis BD5 nhằm tìm điều kiện tối ưu cho chủng sinh trưởng phát triển tốt mang lại lợi ích kinh tế Phạm Thị Hằng Nga – Kĩ thuật sinh học K56 56 Đồ án tốt nghiệp Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Đặng Kim Chi (2005), Làng nghề Việt Nam môi trường, Nhà xuất 10 11 Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Tăng Thị Chính, Lý Kim Bảng, Lê Gia Hy (1999),Nghiên cứu sản xuất cellulase số chủng vi sinh vật ưu nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội pp 790-797 Đặng Minh Hằng (1999),Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp cellulase số chủng vi sinh vật để xử lý rác Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội pp 333-339 Lưu Khắc Hiếu, Nguyễn Công Uẩn, Đỗ Thị Kim Loan, Nguyễn Quang Ánh (2013), Giáo trình modun “Sản xuất miến dong theo phương pháp ép đùn”, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn Nguyễn Hoài Hương, Bùi Văn Thế Vinh (2009), Bài giảng Thực hành Hóa sinh, Trường Đại học Kỹ thuật công nghệ Tp Hồ Chí Minh Trịnh Đình Khá, Quyền Đình Thi, Nguyễn Sỹ Lê Thanh (2007), Tuyển chọn nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố môi trường lên khả sinh tổng hợp cellulase chủng Penicillium SP DTQ-HK1, tạp chí công nghệ sinh học 5(3): 355-362 Nguyễn Đức Lượng số tác giả (2004) Công nghệ enzyme NXB Đại học quốc gia TP.HCM Đỗ Thị Quý (2013), Giáo trình modun “Sản xuất tinh bột dong riềng”, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn Nguyễn Thị Thu Sang (2011) Bài giảng Hóa Sinh học thực phẩm, Đại học Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM Hoàng Toàn Thắng Cs (2013), Đề tài nghiên cứu cấp Bộ Giáo dục Đào tạo: “Nghiên cứu sử dụng bã dong riềng làm thức ăn chăn nuôi trâu, bò làng nghề vùng núi Đông Bắc Việt Nam” Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Xuân Sâm (2004), Công nghệ enzyme, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Tài liệu tiếng anh Phạm Thị Hằng Nga – Kĩ thuật sinh học K56 57 Đồ án tốt nghiệp Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội 12 Ariffim 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 H., Abdulah N., Kalsom M.S., Shirai Y., Hassam M.A (2006),Production and characterisation of cellulase by Bacillus pulmilus EB3 International Journal of Engineering and Technology, 3(1), pp 47-53 Basavaraj I.P., Shivasharan C.T., Kaliwwal B.B.(2014),Isolation and Characterization of Cellulase producing bacteria from Soil International Journal of Current Microboilogy and Applied Sciences, 3(5), pp 59 – 69 Bguin P., Aubert J.P (1994), The biological degradation of cellulose, FEMS Microbiol Rev, 13, pp 25-58 Domingues F.C., Queiroz J.A., Cabral J.M.S., Fonseca L.P (2000),The influence of culture conditions on mycelial structure and cellulase production by Trichoderma reesei RUT C-30, Enzyme Microbial Technol, 26; 394-401 Doppelbauer R., Esterbauer H., Steiner W., Lafferty R., Steinmuller H (1987),The use of cellulosic wastes for production of cellulases by Trichoderma reesei, Appl Microbiol Biotechnol , 26,pp 485–494 Howard R.L., Abotsi E., Rensburg E.L.J., Howard S (2003), "Lignocellulose biotechnology: issues of bioconversion and enzyme production", Afr J Biotechnol, 2(12),pp 602-619 Immanuel G., Dhanusa R., Prema P., Palavesam A (2006), Effect of different growth parameters on endoglucanase enzyme activity by bacteria isolated from coir retting effluents of estuarine environment Int J Environ Sci Tech 3(1), pp 25-34 Klemm D., Schmauder H.P., Heinze T.(2002),Biopolymers , Wiley-VCH, Weinheim,6, pp.290-292 Landaud S., Piquerel P., Pourquie’ J (1995), Screening for bacillus producing cellulolytic enzyme active in the neutral pH range Letters in Applied Microbiology, 21, pp 319-321 Lo Y.C., Saratal G.D., Chen W.M., Bai M.D., Chang J.S (2009),Isolation of cellulose – hydrolytic bacteria and applications of the cellulotytic enzymes for cellulosic biohydrogen production, Enzyme and Microbial Technology, Elsevier 44,pp 417 – 425 Lynd L.R., Weimer p.J., Zyl W.H.V., Pretorius I.S (2002),Microbial cellulose utilization: Fundamentals and biotechnology Microbiol Mol Biol Rev 66, pp 506-577 Miller G.L (1959), Analytical Chemistry 31, pp 426 Phạm Thị Hằng Nga – Kĩ thuật sinh học K56 58 Đồ án tốt nghiệp Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội 24 Nguyen P.H., Chu T.T.H.(2012),Investigation of the pollution status and the waste reusing ability in trade village Duong Lieu, Hoai Duc, Hanoi Journal of Vietnamese Enviroment, 3(2), pp 87 – 91 25 Rajoka M.I., Malik K.A (1997),Cellulase production by Cellulomonas biazotea cultured in media containing different cellulosic substrates, Biores Technol, 59, pp 21-27 26 Vipul V., Alpika V., Akhilesh K.(2012), Isolation & production of cellulase enzyme from bacteria isolated from agricultural fields in district Hardoi, Uttar Pradesh, India, Pelagia Research Library Advances in Applied Science Research,3(1), pp 171-174 Tài liệu internet 27 http://www.backan.gov.vn/Pages/tin-tuc-su-kien-215/tin-trong-tinh- 289/khoa-hoc-154/bac-kan-nghien-cuu-thanh-cong-xu-lb7bc661229f1c79f9.aspx 28 http://text.123doc.org/document/1290340-de-tai-nghien-cuu-hoan-thien-quytrinh-su-dung-ba-san-truoc-va-sau-len-men-thu-enzyme-de-nuoi-trong-naman-va-nam-duoc-lieu.htm 29 http://danviet.vn/kinh-te-nong-nghiep/lang-trieu-phu-dong-rieng-515893.html 30 http://www.mrsach.com.vn/tin-tuc/tac-dung-cua-mien-dong-voi-suc-khoe-n125 31 http://ast.apmb.gov.vn/Upload/Download/Baocaotongketdetai/9.%20Ho %C3%A0ng%20V%C4%83n%20Hi%E1%BB%87n.pdf 32 http://www.baobackan.org.vn/channel/1121/201311/chu-dong-tieu-thu-dongrieng-2272510/ 33 http://www.baotuyenquang.com.vn/kinh-te/nong-lam-nghiep/nguoi-dantrong-che-bien-dong-rieng-can-duoc-tu-van-ho-tro-32727.html Phạm Thị Hằng Nga – Kĩ thuật sinh học K56 59 Đồ án tốt nghiệp Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội PHỤ LỤC Bảng PL1: Xây dựng đồ thị đường chuẩn Nồng độ Glucose (mg/ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 OD (540) 0,462 0,679 0,934 1,172 1,457 0,189 HÌnh PL1: Đường chuẩn biểu mối quan hệ nồng độ glucose OD540nm Bảng PL2: Ảnh hưởng pH đến khả sinh tăng sinh khối Thời gian pH (giờ) pH5 pH6 pH7 pH8 pH9 0h 0.025 0.020 0.030 0.025 0.020 12h 0.920 0.980 0.870 0.700 0.650 24h 1.760 1.820 1.600 1.490 1.350 36h 2.100 2.140 1.980 1.890 1.700 48h 2.200 2.290 2.100 1.980 1.840 60h 1.900 1.950 1.850 1.780 1.590 Bảng PL3: Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh tăng sinh khối Phạm Thị Hằng Nga – Kĩ thuật sinh học K56 60 Đồ án tốt nghiệp Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Thời gian (giờ) Nhiệt độ 30°C 35°C 37°C 40°C 0.030 0.025 0.030 0.030 12 0.49 0.654 0.985 0.989 24 0.99 1.947 2.188 1.828 36 2.07 2.224 2.394 2.150 48 2.18 2.304 2.600 2.300 60 2.00 2.120 2.450 1.950 Bảng PL4: Ảnh hưởng nồng độ CMC đến khả tăng sinh khối Nồng độ CMC Thời gian (giờ) g/l 10g/l 15g/l 20g/l 25g/l 30g/l 0.030 0.025 0.040 0.025 0.030 0.030 12 1.200 1.260 1.150 1.000 0.910 0.940 24 2.200 2.490 2.100 1.980 1.800 1.700 36 2.600 2.800 2.410 2.250 2.200 2.170 48 2.950 3.280 2.800 2.720 2.530 2.300 60 2.760 2.950 2.500 2.290 2.190 2.000 Bảng PL5: Ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống đến khả tăng sinh khối Phạm Thị Hằng Nga – Kĩ thuật sinh học K56 61 Đồ án tốt nghiệp Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Nồng độ cấp giống Thời gian (giờ) 1% 3% 5% 10% 15% 20% 0.030 0.03 0.025 0.025 0.03 0.025 12 0.97 1.011 1.255 1.210 1.356 1.275 24 2.200 2.300 2.490 2.300 2.000 1.910 36 2.400 2.500 2.800 2.670 2.450 2.200 48 2.620 2.760 3.260 2.890 2.360 2.010 60 2.460 2.600 2.950 2.570 2.290 1.800 Bảng PL6: Ảnh hưởng vòng lắc đến khả tăng sinh khối Vòng lắc Thời gian (giờ) 0v/p 50v/p 100v/p 150v/p 200v/p 0.025 0.030 0.030 0.025 0.030 12 1.255 2.190 3.160 3.760 3.000 24 2.490 3.450 5.500 6.850 5.320 36 2.800 4.890 8.560 10.200 8.000 48 3.280 6.000 9.980 11.300 9.340 60 2.950 5.400 8.650 9.620 8.340 Bảng PL 7: Đường cong sinh trưởng B subtilis BD5 Phạm Thị Hằng Nga – Kĩ thuật sinh học K56 62 Đồ án tốt nghiệp Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Thờigian (giờ) Log (CFU/ml) 3.10 12 3.76 20 5.57 24 6.85 28 7.90 36 10.20 40 11.10 44 11.32 48 11.34 52 10.40 56 10.10 60 9.65 64 9.12 68 8.91 Phạm Thị Hằng Nga – Kĩ thuật sinh học K56 63