tuyển chọn và khảo sát các điều kiện lên men ethanol bằng nấm men chịu nhiệt từ thái lan

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC TUYỂN CHỌN VÀ KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN LÊN MEN ETHANOL BẰNG NẤM MEN CHỊU NHIỆT TỪ THÁI LAN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGs.Ts. NGÔ THỊ PHƯƠNG DUNG SINH VIÊN THỰC HIỆN NGUYỄN ÁNH DƯƠNG MSSV: 3108483 LỚP: Vi Sinh Vật Học K36 Cần Thơ, Tháng 12/2013 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013 Trường Đại học Cần Thơ PHẦN KÝ DUYỆT ---------- CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN PGs.Ts.NGÔ THỊ PHƯƠNG DUNG NGUYỄN ÁNH DƯƠNG XÉT DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013 Trường Đại học Cần Thơ LỜI CẢM TẠ ---------- Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, cùng Quý Thầy Cô đã tận tình giảng dạy em trong thời gian học tập vừa qua. Xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình đến cô Ngô Thị Phương Dung – người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất để em thực hiện đề tài nghiên cứu. Xin gửi lời biết ơn chân thành đến thầy và cô cố vấn học tập lớp Vi sinh vật học khóa 36, thầy Võ Văn Song Toàn và cô Nguyễn Thị Pha. Sự hỗ trợ nhiệt tình của thầy và cô đã giúp cho chúng em hoàn thành tốt quá trình học tập của mình. Xin chân thành cảm ơn thầy Huỳnh Xuân Phong, thầy Phạm Hồng Quang và anh Nguyễn Ngọc Thạnh – Cán bộ phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm, đã đóng góp ý kiến và hỗ trợ điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu này. Xin ghi ơn gia đình, anh chị cán bộ các phòng thí nghiệm của Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học và tất cả bạn bè đã động viên, giúp đỡ trong suốt thời gian qua. Kính chúc Quý Thầy Cô được nhiều sức khỏe, thành đạt trên nhiều lĩnh vực và luôn có những cống hiến quý báu cho sự nghiệp giáo dục và đào tạo. Xin chân thành cảm ơn! Cần Thơ ngày 15 tháng 11 năm 2013 Sinh viên thực hiện Nguyễn Ánh Dương Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013 Trường Đại học Cần Thơ TÓM TẮT ---------- Trong nghiên cứu này, 5 dòng nấm men (K1-1, K2-4, R24-1, Y102, MY2-1) được thử khả năng chịu nhiệt ở các mức nhiệt độ khác nhau (40, 43, 45 và 47ºC) và khảo sát khả năng chịu ethanol ở các nồng độ 8, 10, 12, 14 và 15% (v/v). Tất cả các dòng nấm men trên tiếp tục được khảo sát khả năng lên men đường glucose 2% và khả năng sinh ethanol ở nhiệt độ cao (nhiệt độ phòng, 35, 40 và 45ºC). Nghiên cứu khả năng lên men trong môi trường rỉ đường ở những điều kiện khác nhau đã được thực hiện gồm có: mật số giống chủng (104, 105 và 106 tế bào/mL), nồng độ đường ban đầu (15, 20, 25 và 30ºBrix), thời gian lên men (3, 5 và 7 ngày) và pH của môi trường (tự nhiên (pH 4,22), 4, 5 và 6). Kết quả cho thấy có 4 dòng nấm men chịu được nhiệt độ ở 43ºC (MY2-1, Y102, K1-1, R24-1) và 1 dòng phát triển được ở nhiệt độ 45ºC (Y102). Tất cả 5 dòng nấm men đều phát triển được trên môi trường bổ sung 12% ethanol. Riêng dòng nấm men MY2-1 và Y102 phát triển được trên môi trường có bổ sung 15% ethanol. Tất cả các dòng nấm men đều có khả năng lên men nhanh và mạnh trong môi trường glucose 2%. Điều kiện thích hợp cho dòng nấm men MY2-1 phát triển và lên men ethanol trên môi trường rỉ đường ở 40ºC là mật số giống chủng ban đầu 105 tế bào/mL, nồng độ đường 25ºBrix, thời gian lên men 3 ngày và pH môi trường tự nhiên (4,22). Từ khóa: khả năng chịu ethanol, khả năng chịu nhiệt, lên men ethanol, nấm men chịu nhiệt. Chuyên ngành Vi sinh vật học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013 Trường Đại học Cần Thơ MỤC LỤC ---------Trang PHẦN KÝ DUYỆT ...................................................................................................... LỜI CẢM TẠ............................................................................................................... TÓM TẮT .................................................................................................................. i MỤC LỤC................................................................................................................. ii DANH SÁCH BẢNG ............................................................................................... iv DANH SÁCH HÌNH .................................................................................................v DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT........................................................................ vi CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU ...................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................. 1 1.2. Mục tiêu đề tài ..........................................................................................2 CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ..................................................................3 2.1. Giới thiệu chung về nấm men.................................................................... 3 2.2 Nấm men chịu nhiệt ...................................................................................6 2.3. Một số dòng nấm men chịu nhiệt quan trọng .............................................8 2.4 Sự lên men ethanol ...................................................................................10 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................14 3.1. Phương tiện nghiên cứu........................................................................... 14 3.2. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................... 14 3.2.1. Thử nghiệm khả năng chịu nhiệt ..................................................... 14 3.2.2. Thử nghiệm khả năng chịu ethanol ..................................................15 3.2.3. Khảo sát khả năng lên men đường glucose ......................................16 3.2.4. Khảo sát khả năng sinh ethanol ở nhiệt độ cao ................................16 3.2.5. Khảo sát các điều kiện lên men .......................................................17 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..........................................................19 4.1. Khả năng chịu nhiệt của 5 dòng nấm men ...............................................19 Chuyên ngành Vi sinh vật học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013 Trường Đại học Cần Thơ 4.2. Khả năng chịu ethanol .............................................................................20 4.3. Khả năng lên men đường glucose............................................................ 21 4.4. Khả năng sinh ethanol ở nhiệt độ cao ...................................................... 22 4.5. Các điều kiện lên men ở 40ºC của dòng nấm men MY2-1 .......................24 4.5.1. Ảnh hưởng của mật số giống chủng và nồng độ đường ...................24 4.5.2. Ảnh hưởng của thời gian lên men và pH môi trường .......................27 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..............................................................30 5.1. Kết luận ...................................................................................................30 5.2. Đề nghị ...................................................................................................30 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 31 PHỤ LỤC..................................................................................................................... Phụ lục 1. Hình ảnh các thiết bị sử dụng trong phòng thí nghiệm ........................ Phụ lục 2. Số liệu kết quả thí nghiệm .................................................................. Phụ lục 3. Kết quả phân tích thống kê ................................................................. Chuyên ngành Vi sinh vật học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH BẢNG ---------- Tên bảng Trang Bảng 1. Sự hiện diện và ứng dụng của nấm men trong một số thực phẩm, thức uống có cồn và sản phẩm lên men .......................................................................................6 Bảng 2. Những dòng nấm men được khảo sát có khả năng phát triển và sản sinh ethanol ở nhiệt độ 37 – 45°C....................................................................................... 8 Bảng 3. Khả năng chịu nhiệt của 5 dòng nấm men sau 48 giờ ...................................19 Bảng 4. Khả năng chịu ethanol của 5 dòng nấm men sau 48 giờ ...............................20 Bảng 5. Chiều cao cột khí CO2 (mm) trong ống Durham .......................................... 22 Chuyên ngành Vi sinh vật học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH HÌNH ---------- Tên hình Trang Hình 1. Tế bào nấm men quan sát dưới kính hiển vi điện tử ........................................3 Hình 2. Các dạng tế bào nấm men khác nhau quan sát dưới kính hiển vi điện tử......... 4 Hình 3. Nấm men Kluyveromyces lactis (a) và Kluyveromyces marxianus (b) ............ 8 Hình 4. Nấm men Saccharomyces cerevisiae ..............................................................9 Hình 5. Nấm men Candida spp. ................................................................................10 Hình 6. Cơ chế lên men glucose của nấm men tạo ethanol và CO2 ............................12 Hình 7. Khuẩn lạc của dòng nấm men Y102 ở 45ºC sau 48 giờ ủ.............................. 20 Hình 8. Khuẩn lạc dòng Y102 và MY2-1 ở môi trường bổ sung 15% ethanol ...........21 Hình 9. Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ ủ lên nồng độ ethanol sinh ra .....................23 Hình 10. Biểu đồ ảnh hưởng của mật số giống chủng và nồng độ đường ..................25 Hình 11. Biểu đồ hàm lượng đường sử dụng trong quá trình lên men .......................27 Hình 12. Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian lên men và pH môi trường ......................28 Hình 13. Giá trị pH sau khi lên men ..........................................................................29 Chuyên ngành Vi sinh vật học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ---------- DNA Deoxyribose nucleic acid mL milliliter PGY Potato – Glucose – Yeast extract YM agar Yeast extract – Malt extract – agar YPD Yeast extract – Malt extract – D-Glucose w/v Weight/volume Chuyên ngành Vi sinh vật học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Rượu là thức uống có từ lâu đời. Từ xưa, con người đã biết làm ra rượu ethylic (ethanol) từ nguồn nguyên liệu là các sản phẩm nông nghiệp có hàm lượng tinh bột cao bằng phương pháp lên men truyền thống. Nhìn chung, ethanol rất quan trọng trong đời sống con người và đối với nhiều ngành công nghiệp. Chúng được ứng dụng để sản xuất một số thành phần dược phẩm y tế, nhiên liệu trong tổng hợp hữu cơ, sắc tố sơn,… Hiện nay, nhu cầu về ethanol công nghiệp với độ tinh sạch cao ngày càng cấp thiết, bởi ethanol được chứng minh là một loại nhiên liệu sinh học có tiềm năng thay thế những nguồn nhiên liệu hóa thạch đang dần cạn kiệt (Alfenore et al., 2002). Đây là nguồn nguyên liệu có tiềm năng phát triển mạnh, có thể pha vào xăng với một tỷ lệ thích hợp và được sử dụng trong các động cơ đốt trong để thay thế xăng nguyên chất nhằm tăng tính thân thiện với môi trường, đồng thời hạ giá thành. Ở các nước có công nghiệp rượu vang phát triển như: Ý, Pháp, Tây Ban Nha,... ethanol còn được dùng để tăng thêm nồng độ rượu. Nhu cầu sử dụng ethanol ngày một tăng với nhiều mục đích khác nhau như: nguồn năng lượng thay thế, dung môi công nghiệp, chất tẩy rữa và chất bảo quản,... đòi hỏi phải đẩy mạnh quy trình sản xuất. Trong công nghiệp, ethanol có thể được sản xuất bằng hóa tổng hợp và sinh tổng hợp. Trong tổng hợp sinh học, nấm men được sử dụng để chuyển hóa đường thành ethanol trong điều kiện kỵ khí. Tuy nhiên có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của nấm men như nguồn carbon, nguồn nitơ, pH, đặc biệt là nhiệt độ và nồng độ ethanol. Do đó đặc tính chịu nhiệt và chịu ethanol của nấm men rất quan trọng trong quá trình lên men sinh ethanol. Theo Brooks (2008), một vi sinh vật lý tưởng được sử dụng để tổng hợp ethanol phải có khả năng lên men mạnh, sinh trưởng tốt, sức chống chịu cao, đặc biệt là khả năng chịu nhiệt. Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến quá trình lên men sinh ethanol của nấm men đặc biệt với tình trạng biến đổi khí hậu toàn cầu trong những năm gần đây. Vì thế, việc tăng sản lượng ethanol bằng cách sử dụng nấm men có đặc tính chịu nhiệt tốt, thích hợp với dây chuyền sản xuất công nghệ sẽ mang tính ứng dụng thực tiễn cao. Vì chi phí dùng cho làm lạnh rất tốn kém, nên việc chọn lọc các dòng nấm men mang đặc tính này có thể giúp hạ giá thành sản phẩm, tận dụng được một số thuận lợi khi thực hiện lên men ở nhiệt độ cao như: độ tan của oxy và các chất Chuyên ngành Vi sinh vật học 1 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ khí khác giảm, tạo điều kiện kỵ khí tốt; cơ hội bị nhiễm được giảm thiểu (Roehr, 2001). Bằng cách sử dụng nấm men chịu nhiệt, quá trình lên men ethanol ở nhiệt độ cao sẽ có nhiều lợi ích hơn các quá trình chuyển hóa xảy ra ở nhiệt độ trung bình (Sree et al., 1999; Ueno et al., 2002). Nồng độ ethanol trong môi trường cũng có tác động đáng kể đến năng suất lên men của nấm men. Nấm men không chịu được nồng độ ethanol cao sẽ dễ bị ức chế trong quá trình lên men dẫn đến hiệu quả lên men thấp. Thành phần dinh dưỡng của môi trường cũng như pH cũng ảnh hưởng nhất định đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm men. Các chất bổ sung vào môi trường sinh trưởng có chứa maltose hoặc glucose cùng với nguồn nitơ như peptone sẽ làm tăng sinh khối và sự sản sinh ethanol (Helena da Cruz et al., 2003). Giá trị pH không thích hợp sẽ hạn chế khả năng tạo ethanol của nấm men. Do đó, việc nghiên cứu ảnh hưởng của dinh dưỡng và pH đến khả năng lên men của nấm men là rất quan trọng nhằm tìm ra điều kiện tối ưu cho quá trình lên men. Từ những lý do trên, việc khảo sát và tuyển chọn một số dòng nấm men có khả năng lên men mạnh và chịu được nhiệt độ, nồng độ ethanol cao đang là vấn đề cần quan tâm. Bởi điều này có ý nghĩa quan trọng là tiền đề cho việc đưa ra các dòng nấm men có triển vọng cao vào ứng dụng trong sản xuất ethanol sinh học. Luận văn tốt nghiệp đại học “Tuyển chọn và khảo sát các điều kiện lên men ethanol bằng nấm men chịu nhiệt” của Nguyễn Hữu Tường (2013) đã khảo sát 44 dòng nấm men và chọn được 7 dòng có khả năng chịu được nhiệt độ và nồng độ ethanol cao. Để góp phần làm phong phú hơn nữa nguồn nấm men có triển vọng đưa vào sản xuất cũng như nhằm so sánh các điều kiện lên men của các nguồn nấm men khác nhau để tìm ra dòng nấm men chịu nhiệt tối ưu cho quá trình lên men ethanol quy mô lớn, đề tài nghiên cứu “Tuyển chọn và khảo sát các điều kiện lên men bằng nấm men chịu nhiệt từ Thái Lan” được thực hiện. Đề tài sử dụng 5 dòng nấm men có nguồn gốc từ Trung tâm nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Công nghệ Lên men sản phẩm Nông nghiệp, Khoa Công Nghệ, Trường Đại học Khon Kaen, Thái Lan. 1.2. Mục tiêu đề tài Mục tiêu của đề tài là chọn lọc dòng nấm men có khả năng chịu nhiệt và nồng độ ethanol cao đồng thời có khả năng lên men mạnh; xác định điều kiện lên men thích hợp trên môi trường rỉ đường. Chuyên ngành Vi sinh vật học 2 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu chung về nấm men Nấm men là tên gọi chung của nhóm nấm có những đặc điểm như cấu tạo đơn bào, đa số sinh sôi nảy nở bằng cách nảy chồi hoặc phân cắt tế bào, nhiều loại có khả năng lên men đường. Nấm men phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên, nhất là trong các môi trường có chứa đường, pH thấp, chẳng hạn như trong hoa quả, mật mía, rỉ đường, mật ong, trong đất ruộng trồng mía, đất vườn cây ăn quả, trong các đất có nhiễm dầu mỏ (Nguyễn Lân Dũng, 1999). Nấm men có nhiều ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực thực phẩm. Từ lâu, con người đã biết ứng dụng nấm men vào sản xuất các loại thực phẩm truyền thống như rượu, bia, bánh mì,… Hình 1. Tế bào nấm men quan sát dưới kính hiển vi điện tử (Nguồn: http://techmart.cesti.gov.vn/images/image/2011/30_6_11/30_06_11_1.JPG, ngày 29/07/2013) 2.1.1. Hình dạng và kích thước của nấm men Hình dạng tế bào: Nấm men thường có hình cầu, hình elip, hình ovan và có cả dạng hình dài. Chúng hầu hết tồn tại dưới dạng đơn bào, một số loài như Candida albicans không chỉ nảy chồi mà các tế bào nối lại với nhau tạo thành khuẩn ty giả và Eremothecium gossypii hình thành khuẩn ty thật (Kurtzman và Piskur, 2006). Kích thước tế bào: Kích thước của nấm men khác nhau tùy theo loài và thời kỳ sinh trưởng của nấm men. Saccharomyces cerevisiae là nấm men thường được sử dụng trong lên men rượu, bia có kích thước chiều rộng khoảng 2,5 – 10 μm và chiều dài 4,5 – 21 μm, có thể thấy rõ dưới kính hiển vi quang học (Nguyễn Lân Dũng, 1999). Chuyên ngành Vi sinh vật học 3 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Hình 2. Các dạng tế bào nấm men khác nhau quan sát dưới kính hiển vi điện tử (Nguồn: http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/nammen01.htm, ngày 29/07/2013) 2.1.2. Cấu tạo của nấm men Thành tế bào: Thành tế bào nấm men dày khoảng 25 nm, chiếm 15 – 30% trọng lượng khô của tế bào nấm men, được cấu tạo chủ yếu từ glucan (60% khối lượng thành tế bào), mannoprotein, chitin và một lượng nhỏ lipid. Màng nguyên sinh chất: Màng nguyên sinh chất có 3 tầng kết cấu khác nhau, được cấu tạo chủ yếu từ protein (50% khối lượng khô), phần còn lại là lipid và một ít polysaccharide (Nguyễn Lân Dũng, 1999). Chất nguyên sinh: Chất nguyên sinh của nấm men cũng tương tự như chất nguyên sinh của vi khuẩn, thành phần chủ yếu là nước, protein, glucid, lipid, enzyme. Nhân tế bào: Nhân tế bào nấm men là nhân điển hình, có màng nhân, bên trong là chất dịch nhân có chứa hạch nhân. Nhân tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae có chứa 17 đôi nhiễm sắc thể. Các bào quan và thành phần khác: ty thể, không bào, ribosome,… 2.1.3. Sự sinh sản và phát triển của nấm men Theo Nguyễn Lân Dũng (1999), nấm men có hai hình thức sinh sản là sinh sản hữu tính và sinh sản vô tính. + Sinh sản hữu tính: nấm men hình thành bào tử túi ở các chi Saccharomyces, Zygosaccharomyces và nhiều chi nấm men khác thuộc bộ Endomycetales. Chuyên ngành Vi sinh vật học 4 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ + Sinh sản vô tính: chủ yếu bằng hình thức nảy chồi (diễn ra ở hầu hết các chi nấm men), hình thức phân cắt (ở chi Schizosaccharomyces), bằng bào tử (ở chi Geotrichum, Sporobolomyces, Candida albicans). Nấm men là các vi sinh vật hóa dị dưỡng vì chúng sử dụng các hợp chất hữu cơ làm nguồn cung cấp năng lượng cho sự sinh trưởng và phát triển. Một số nguồn dinh dưỡng cần cho sự phát triển của nấm men: + Nguồn carbon: Nấm men hấp thu tốt các loại đường như: D-glucose, Fructose, sucrose, maltose,… Sự biến dưỡng các chất đường này được thực hiện bởi quá trình đường phân, tiếp theo bởi chu trình Krebs trong điều kiện hiếu khí. Trong điều kiện khác, sự biến dưỡng được thực hiện qua lộ trình pentose-phosphate và lộ trình EntnerDoudoroff, tiếp theo bởi sự hô hấp hiếu khí hoặc sự lên men yếm khí. + Nguồn nitơ: Nấm men không có enzyme ngoại bào để phân giải protein, nên không thể phân cắt albumin của môi trường mà phải cung cấp nitơ ở dạng hòa tan, có thể là đạm hữu cơ hoặc vô cơ. Dạng hữu cơ thường dùng là acid amin, peptone, urea. Đạm vô cơ là các muối amon khử nitrate, sulfate,… Ngoài ra nấm men còn cần được cung cấp các acid amin để xây dựng protein và tế bào mới, chúng cũng cần các vitamin và khoáng để sản xuất enzyme (Nguyễn Công Hà, 2000). + Phospho: có trong thành phần nucleoprotein, polyphosphate của nhiều enzyme và sản phẩm trung gian của quá trình lên men rượu, chúng tạo ra liên kết có năng lượng lớn. + Lưu huỳnh: tham gia vào thành phần một số acid amin, albumin, vitamin và enzyme. + Magie: tham gia vào nhiều phản ứng trung gian của sự lên men. + Sắt: tham gia vào các thành phần enzyme, sự hô hấp và các quy trình khác. + Kali: chứa nhiều trong nấm men, nó thúc đẩy sự phát triển của nấm men, tham gia vào sự lên men rượu, tạo điều kiện phục hồi phosphoryl hóa của acid pyruvic. + Mangan: đóng vai trò tương tự như magie. Nấm men có thể tồn tại được trong điều hiện hiếu khí lẫn kỵ khí với khoảng nhiệt độ tương đối rộng và pH acid thích hợp cho sự phát triển của nấm men. Chuyên ngành Vi sinh vật học 5 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ 2.1.4. Vai trò và ứng dụng của nấm men Nấm men có nhiều ứng dụng quan trọng trong công nghiệp thực phẩm như dùng trong sản xuất ethanol, bánh mì, rượu vang, bia,… Trong đó, việc ứng dụng nấm men vào quá trình lên men các sản phẩm nông nghiệp để sản xuất ethanol là vấn đề đáng quan tâm. Nguồn ethanol giá thành rẻ sẽ đóng góp đáng kể vào việc giải quyết vấn đề về nhiên liệu và ô nhiễm môi trường. Một số sản phẩm ứng dụng của từng dòng nấm men cụ thể được liệt kê trong Bảng 1 (Jacobson và Jolly, 1989). Bảng 1. Sự hiện diện và ứng dụng của nấm men trong một số thực phẩm, thức uống có cồn và sản phẩm lên men Sản phẩm, ứng dụng Nấm men Rượu bia Saccharomyces cerevisiae Bánh mì và bột nhão bánh mì S. cerevisiae, S. exiguous, S.rosei D-Arabitol (chất làm ngọt) Candida diddensiae Chất tạo nhũ hương C. lipolytica Thức ăn gia cầm và cá Phaffia rhodozyma Lactose và sữa lên men C. pseudotropicalis, Kluyveromyces fragilis, K. lactis Lên men bia lager S. carlsbergensis Manitol (chất hút ẩm) Torulopsis manitofaciens Shoyu, Miso Zygosaccharomyces rouxii Lên men rượu vang S. cerevisiae Xylitol (chất làm ngọt) T. candida Lên men D-xylose C. shehatae, Pachysolen tannophilus, Pichia stipitis, Pichia segobiensis 2.2 Nấm men chịu nhiệt Ngày nay, nấm men được sử dụng trong nhiều quy trình công nghiệp như sản xuất đồ uống có cồn, sinh khối và các sản phẩm trao đổi chất khác nhau. Một số sản phẩm đã được sản xuất thương mại, có giá trị trong công nghệ sinh học (Kurtzman và Fell, 1997). Lên men ethanol ở nhiệt độ cao là chìa khóa cần thiết cho việc sản xuất ethanol có hiệu quả ở các quốc gia nhiệt đới, nơi mà nhiệt độ trung bình trong năm luôn ở mức rất cao. Để đạt được quá trình lên men ở nhiệt độ cao, cần có những chủng nấm men lên men hiệu quả, có khả năng chịu nhiệt cao (Limtong et al., 2009). Chuyên ngành Vi sinh vật học 6 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Nhiệt độ là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt động của nấm men. Arthur và Watson (1976) đã xác định nhiệt độ phát triển của nấm men ưa lạnh (psychrophilic) trong khoảng 2 – 20ºC; nấm men ưa nhiệt trung bình (mesophilic) là 5 – 35ºC; nấm men chịu nhiệt (thermotolerant) là 8 – 42ºC; ưa nhiệt (thermophilic) là 28 – 45ºC. Theo Roehr (2001), nấm men chịu nhiệt có một số thuận lợi trong việc sản xuất ethanol ở điều kiện nhiệt độ cao bao gồm: hoạt động trao đổi chất vẫn tốt và tốc độ lên men cao tạo ra nhiều sản phẩm; độ tan của oxy và các khí khác trong nước giảm khi nhiệt độ tăng đảm bảo điều kiện kỵ khí cho quá trình lên men của nấm men; độ nhớt của môi trường giảm khi nhiệt độ tăng nên năng lượng cần thiết cho việc trộn môi trường được giảm đi; cơ hội bị nhiễm được giảm thiểu. Trong những nghiên cứu gần đây, nấm men Kluyveromyces marxianus có thể phát triển ở nhiệt độ 47ºC (Anderson et al., 1986), 40ºC (Hughes et al., 1984), thậm chí là 52ºC (Banat et al., 1992) và sản sinh ethanol ở nhiệt độ cao trên 40ºC (Fonseca et al., 2008). Hơn thế nữa, K. marxianus còn có thuận lợi là tốc độ phát triển cao (Pecota et al., 2007) và khả năng sử dụng rộng rãi các cơ chất trong công nghiệp như đường mía, bắp, nước trái cây, rỉ đường,… (Nonkalang et al., 2008). Ngoài Kluyveromyces marxianus, quá trình lên men ở nhiệt độ cao còn có thể kể đến Saccharomyces uvarum với khả năng phát triển phát triển tối ưu ở khoảng nhiệt độ 25 – 43ºC và loài Candida spp. với khả năng lên men glucose ở nhiệt độ 40ºC (McCracken và Gong, 1982). Quá trình lên men ở những vùng nhiệt đới gặp nhiều khó khăn vì những dòng nấm men công nghiệp không có tính chịu nhiệt. Đặc biệt vào mùa hè, nhiệt độ tăng cao cùng với phản ứng lên men tỏa nhiệt sẽ ức chế khả năng lên men của nấm men. Gần đây, đã có nhiều nghiên cứu thành công trong việc phân lập và chọn lọc nấm men có khả năng sinh trưởng và lên men mạnh ở nhiệt độ lớn hơn 40ºC. Từ đề tài nghiên cứu khoa học “Phân lập và tuyển chọn các dòng nấm men chịu nhiệt có khả năng lên men ethanol mạnh”, Nguyễn Vân Anh et al. (2011) đã phân lập được 31 dòng nấm men từ nguồn trái cây chín, men rượu, men bánh mì,… và tuyển chọn được 4 dòng có khả năng lên men mạnh và phát triển ở 42ºC. Trong đó, có một dòng nấm men (được định danh là Torulaspora globosa chủng SSK9) vừa có khả năng lên men tốt vừa chịu được nhiệt độ cao đến 45ºC. Chuyên ngành Vi sinh vật học 7 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Những dòng nấm men khác nhau chịu ảnh hưởng của nhiệt độ không giống nhau. Số lượng dòng nấm men sinh ethanol cũng giảm theo nhiệt độ (Bảng 2). Bảng 2. Những dòng nấm men được khảo sát có khả năng phát triển và sản sinh ethanol ở nhiệt độ 37 – 45ºC Số lượng dòng Nấm men Tổng số Có hiệu suất Có hiệu suất Phát triển và được lên men lên men sản sinh khảo sát ethanol trên ethanol trên ethanol ở ở 37ºC 50% ở 37ºC 50% ở 40ºC 45ºC Candida 15 5 4 1 Hansenula 7 1 0 0 Kluyveromyces 12 8 5 5 Pichia 4 0 0 0 Saccharomyces 14 13 3 0 Schizosaccharomyces 2 1 0 0 (Nguồn: Hacking et al., 1984) 2.3. Một số dòng nấm men chịu nhiệt quan trọng 2.3.1. Nấm men Kluyveromyces spp. a b Hình 3. Nấm men Kluyveromyces lactis (a) và Kluyveromyces marxianus (b) (Nguồn :http://www.visualphotos.com/image/1x3745113/kluyveromyces_lactis_yeast_cell_klu yveromyces và http://www.deskuenvis.nic.in/fungi.htm, ngày 29/07/2013) Kurtzman và Fell (1997) đã mô tả đặc điểm hình thái của Kluyveromyces spp. là tế bào có hình ovan, hình elip và hình trụ kéo dài. Theo Bảng 2, Kluyveromyces spp. là những dòng nấm men có khả năng chịu nhiệt cao nhất trong số 7 dòng nấm men được khảo sát (Hacking et al., 1984). Banat et Chuyên ngành Vi sinh vật học 8 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ al. (1992) đã phân lập được dòng K. marxianus có khả năng phát triển và lên men ở nhiệt độ 52ºC từ mẫu đất ở một nhà máy chưng cất rượu tại Ấn Độ. Một chủng nấm men K. marxianus là IMB3 đã được báo cáo là có khả năng sản sinh ethanol ở 45ºC trong môi trường có glucose, cellobiose (Barron et al., 1994), sucrose (Fleming et al., 1993) và lactose (Brady et al., 1994). Brady et al. (1995) nhận thấy rằng khi K. marxianus IMB3 phát triển trên môi trường 2% glucose thì nấm men này sản sinh ra ethanol với nồng độ cao nhất là 8,5 g/L và năng suất trên lý thuyết là 83%. 2.3.2 Nấm men Saccharomyces spp. Hình 4. Nấm men Saccharomyces cerevisiae (Nguồn: http://microbewiki.kenyon.edu/images/9/9a/Saccromyces.jpg, ngày 29/07/2013) Tế bào nấm men Saccharomyces spp. có dạng hình cầu, hình elip hoặc hình trụ (Kurtzman và Fell, 1997). Theo Torija et al. (2003) sự phát triển và lên men của S. cerivisiae biến đổi theo mức nhiệt độ là 15 – 35ºC. Đường tăng trưởng của vi sinh vật gồm các giai đoạn: pha tiềm phát (lag phase), pha chỉ số (log phase), pha cân bằng (stationary phase) và pha tử vong (death phase) khi quan sát ở nhiệt độ 25ºC và 30ºC, nhưng ở 35ºC mật số nấm men giảm nhiều, đặc biệt ở cuối giai đoạn lên men. Kết quả này cũng tương tự như những báo cáo trước cho rằng mật số nấm men sẽ giảm khi nhiệt độ tăng. Nhiệt độ cao có thể làm cho quá trình lên men kết thúc sớm, có nghĩa là lên men không hoàn toàn và nồng độ ethanol thấp (Larue et al., 1980). Hơn thế nữa, Lee et al (1980) đã khảo sát quá trình lên men bởi S. uvarum (hay S. carlsbergensis) trong mẻ nuôi cấy với nhiệt độ giữa 25 oC và 43ºC, kết quả thí nghiệm cho thấy nhiệt độ tối ưu cho sự tăng trưởng là 33 oC trong khi mức nhiệt độ phù hợp cho sản xuất ethanol cực đại từ 37ºC đến 43ºC và nồng độ ethanol gia tăng ức chế sự sinh trưởng. Chuyên ngành Vi sinh vật học 9 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Trong suốt quá trình lên men, mật số tế bào thay đổi đáng kể do chúng nhạy cảm với ethanol, một số dòng không thể sống sót khi nồng độ ethanol cao. Đồng thời, khả năng chịu ethanol còn phụ thuộc vào nhiệt độ. Điều này cho thấy một vài dòng với mật số giảm ở một vài nhiệt độ nhưng có thể hoàn tất quá trình lên men ở nhiệt độ khác (Torija et al., 2003). 2.3.3. Nấm men Candida spp. Hình 5. Nấm men Candida spp. (Nguồn: http://lanisisland.com/wp-content/uploads/2011/10/candida.jpg, ngày 29/07/2013) Tế bào nấm men Candida spp. có dạng hình cầu, hình elip, hình trụ hoặc trụ kéo dài, đặc biệt có các tế bào hình dài nối với nhau tạo thành những sợi gọi là khuẩn ty giả (Kurtzman và Fell, 1997) (Hình 5). McCracken và Gong (1982) đã khảo sát sự lên men glucose ở 40ºC của tám dòng nấm men Candida spp. được phân lập từ bã mía. Kết quả có ba dòng cho hiệu suất lên men cao nhất. Trong đó một dòng được khảo sát cẩn thận với nhiệt độ cao nhất khoảng 48ºC vì đây là nhiệt độ thích hợp cho sự đường hóa liên tục cellulose và lên men hoặc một trong hai quá trình sẽ kết hợp với enzyme isomerase xylose để thực hiện tiến trình đồng phân hóa và lên men xylose. Ở 45ºC, từ 10% (w/v) glucose sẽ tạo ra 4,3% (w/v) ethanol trong 2 ngày. Tốc độ lên men ban đầu gần như không đổi trong khoảng nhiệt độ từ 30ºC – 50ºC. Ở 50ºC có khoảng 2% (w/v) ethanol được tạo ra từ 4,5% (w/v) glucose trong 6 giờ (Sripiromrak et al., 2006). 2.4 Sự lên men ethanol Lên men ethanol là quá trình chuyển hóa đường thành ethanol được thực hiện bởi nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau nhưng chủ yếu là nấm men. Trong công nghiệp cồn, bia, rượu, các loại nước uống có cồn, người ta sử dụng nấm men Saccharomyces Chuyên ngành Vi sinh vật học 10 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces trong quá trình lên men tạo thành ethanol. Ethanol được sản xuất chủ yếu từ các loại nguyên liệu thực vật có chứa đường hoặc tinh bột và cellulose thông qua phản ứng trung gian tạo đường. - Các cơ chất có hàm lượng đường cao thường được dùng để lên men ethanol là: rỉ đường, nước mía, củ cải đường, nước trái cây chín; sự lên men từ các nguyên liệu này được thực hiện trực tiếp mà không thông qua quá trình thủy phân tạo đường. - Những cơ chất giàu tinh bột như: gạo, lúa mì, ngô, khoai mì, khoai tây, khoai lang,… Đối với các loại nguyên liệu này cần phải có quá trình thủy phân tinh bột tạo đường cho nấm men sử dụng để lên men tạo ethanol. (C6H10O5)n + nH2O  nC6H12O6 (tinh bột) (glucose) C6H12O6  2CH3CH2OH + 2CO2 (glucose) (ethanol) Các nguồn nguyên liêu chứa cellulose như: gỗ, giấy, xác mía,... cũng có thể sử dụng để sản xuất ethanol nhưng việc xử lý để phân cắt cellulose tạo glucose rất khó khăn và tốn kém. 2.4.1. Cơ chế của quá trình lên men ethanol từ glucose Lên men ethanol là quá trình trao đổi chất dưới tác dụng của chất xúc tác thích hợp là enzyme. Đây là quá trình lên men kỵ khí dưới sự có mặt của nấm men tạo thành ethanol và giải phóng khí CO2. Quá trình lên men rượu của nấm men gồm hai giai đoạn chính: - Tăng sinh khối nấm men: tế bào nấm men phát triển và tăng sinh khối, giai đoạn này cần sự hiện diện của oxy. - Lên men chuyển hóa đường thành rượu: quá trình này xảy ra dưới điều kiện kỵ khí theo sơ đồ Hình 6. Chuyên ngành Vi sinh vật học 11 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Hình 6. Cơ chế lên men glucose của nấm men tạo ethanol và CO2 (Norr et al., 2003) 2.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men ethanol của nấm men + Dinh dưỡng Nitơ và carbon là yếu tố dinh dưỡng chính trong môi trường lên men. Sự tương tác lẫn nhau của các chất dinh dưỡng có thể đóng vai trò quan trọng trong trao đổi chất của nấm men. Các chất bổ sung vào môi trường sinh trưởng có chứa maltose hoặc glucose cùng với nguồn nitơ như peptone sẽ làm tăng sinh khối và sự sản sinh ethanol (Helena de Cruz et al., 2003). + Nhiệt độ Nhiệt độ là yếu tố cần thiết ảnh hưởng lớn đến hoạt tính của nấm men. Thông thường nhiệt độ phù hợp cho lên men là 28 – 30ºC. Nhiệt độ khoảng hơn 50ºC và dưới 0ºC thì sự lên men hầu như bị đình trệ. Thông thường quá trình lên men ở nhiệt độ thấp sẽ kéo dài hơn, nhưng lên men ở nhiệt độ quá cao sẽ làm tổn thất sản phẩm, cũng như ảnh hưởng đến mùi vị sản phẩm. Trong công nghiệp lên men thực phẩm, nhiệt độ tối ưu của quá trình lên men có thể không trùng khớp với nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của vi sinh vật. + pH Nồng độ ion H+ có ảnh hưởng đáng kể đến sự lên men trong công nghiệp do pH đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát các vi khuẩn có thể bị nhiễm và ảnh hưởng lên sự phát triển của nấm men. Năng suất lên men ethanol cao nhất thường dao động ở pH 4,5 – 4,7. Khi pH được diều chỉnh lên 7 hoặc cao hơn thì acid acetic được tạo thành từ acetaldehyde dựa vào sự gia tăng hoạt động của enzyme aldehyde dehydrogenase, glycerol được sản sinh và ức chế sự lên men (Wang et al., 2001). + Khí oxy và carbonic Chuyên ngành Vi sinh vật học 12 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Nấm men là vi sinh vật vừa kỵ khí vừa hiếu khí. Trong điều kiện kỵ khí, chúng lên men đường tạo thành rượu và khí carbonic (CO2). Còn trong điều kiện đầy đủ oxy, chúng có khả năng oxy hóa đường thành CO2 và nước, đồng thời sinh sản và phát triển mạnh. Hàm lượng CO2 hình thành trong quá trình lên men thường hạn chế mạnh sự sinh sản của nấm men. Trong điều kiện nhiệt độ cao, lượng khí hòa tan trong dung dịch lên men sẽ giảm xuống, tạo điều kiện kỵ khí cho quá trình lên men của nấm men. + Nồng độ ethanol Nồng độ ethanol cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men, nồng độ ethanol cao có thể ức chế khả năng sinh sản tế bào và khả năng sống sót của nấm men. Việc chọn lọc dòng nấm men có khả năng chịu được nồng độ ethanol cao sẽ mang lại lợi ích đáng kể cho quá trình lên men vì các dòng nấm men này có thể nâng cao hiệu suất của quá trình lên men. Ngô Thị Phương Dung (2009) đã phân lập được 50 dòng nấm men từ viên men rượu, chín dòng được chọn để khảo sát khả năng chịu cồn. Kết quả thử khả năng chịu đựng độ cồn cho thấy bảy dòng có khả năng chịu độ cồn trong khoảng 5 – 6% (w/v) ethanol và hai dòng có khả năng chịu độ cồn thấp hơn từ 2,4 – 3 % (w/v) ethanol. + Nồng độ dịch lên men Nồng độ dịch lên men được xác định bằng khối lượng đường sucrose trong dung dịch (độ Brix). Nồng độ dịch đường quá cao sẽ làm thay đổi độ nhớt của môi trường, tăng áp suất dẫn đến mất cân bằng trạng thái sinh lý của nấm men. Nồng độ ethanol được sản sinh tăng cao cũng gây ức chế nấm men. Tuy nhiên, nếu nồng độ dịch đường quá thấp thì không mang tính kinh tế vì sẽ là giảm năng suất lên men, hao phí trong quá trình chưng cất. Chuyên ngành Vi sinh vật học 13 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Phương tiện nghiên cứu 3.1.1. Dụng cụ, thiết bị - Buồng đếm hồng cầu - Cân phân tích (Ohaus Corp, ARA520, Mỹ) - Kính hiển vi quang học (Olympus Optical, BH-2, Nhật) - Máy vortex (HEIPOLPH, Đức) - Nồi thanh trùng (Breukelen, Hà Lan) - Tủ cấy (Totelstar Bio-II-A, Tây Ban Nha) - Tủ ủ (Henrich, Đức) - Water bath & Shaker (GESELLSCHAFT, Đức) - Các dụng cụ thông dụng như: Ống nghiệm, pipet, bình tam giác, ống đong,... 3.1.2. Nguyên vật liệu - Dịch rỉ đường. - 5 dòng nấm men (K1-1 TL, Y102 TL, R24-1 TL, K2-4 TL và MY2-1 TL) từ Trung tâm nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Công nghệ Lên men sản phẩm Nông nghiệp, Khoa Công Nghệ, Trường Đại học Khon Kaen, Thái Lan. 3.1.3. Hóa chất a. Môi trường - Môi trường YM agar: 0,3% yeast extract; 0,3% malt extract; 1% D-glucose; 0,5% peptone; 1,5% agar. - Môi trường YPD agar: 1% yeast extract; 2% peptone; 2% D-glucose; 2% agar. - Môi trường PGY: 20% khoai tây; 2% D-glucose; 0,2% yeast extract. b. Các hóa chất khác C2H5OH, NaCl, NaHSO3, NaOH, HCl,… 3.2. Phương pháp nghiên cứu 3.2.1. Thử nghiệm khả năng chịu nhiệt Mục đích: Tuyển chọn những dòng nấm men có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt ở nhiệt độ cao. Chuyên ngành Vi sinh vật học 14 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Phương pháp tiến hành - Thí nghiệm 2 nhân tố (dòng nấm men và nhiệt độ) với 3 lần lặp. - Nuôi sinh khối 5 dòng nấm men trong môi trường PGY trong 24 giờ. - Cấy ria 5 dòng nấm men trên đĩa Petri có chứa môi trường YM agar. - Ủ các đĩa petri ở các nhiệt độ khác nhau: 40, 43, 45 và 47°C từ 1 đến 4 ngày. - Quan sát sự tạo thành khuẩn lạc của các dòng nấm men khác nhau trên thạch. Chỉ có các dòng nấm men chịu nhiệt mới có khả năng phát triển thành khuẩn lạc ở nhiệt độ cao. - Chỉ tiêu đánh giá: khả năng phát triển tốt thành khuẩn lạc to, tròn của các dòng nấm men ở điều kiện nhiệt độ cao trong thời gian từ 1 đến 4 ngày. - Tuyển chọn các dòng nấm men có khả năng phát triển ở nhiệt độ cao. 3.2.2. Thử nghiệm khả năng chịu ethanol Mục đích: Tuyển chọn những dòng nấm men phát triển tốt trong môi trường có ethanol. Phương pháp tiến hành - Thí nghiệm 2 nhân tố (dòng nấm men và nồng độ ethanol) với 3 lần lặp. - Nuôi sinh khối 5 dòng nấm men trong môi trường PGY trong 24 giờ. - Cấy ria các dòng nấm men trên đĩa Petri chứa môi trường YM agar có bổ sung các nồng độ ethanol tinh khiết khác nhau 8, 10, 12, 14 và 15%. Ethanol được bổ sung trong quá trình đổ môi trường agar vào đĩa. - Ủ các đĩa Petri ở nhiệt độ 30ºC từ 1 đến 4 ngày. - Quan sát sự tạo thành khuẩn lạc của các dòng nấm men khác nhau trên thạch. Chỉ có các dòng nấm men chịu ethanol mới có khả năng phát triển thành khuẩn lạc trên môi trường có nồng độ ethanol cao. - Chỉ tiêu đánh giá: khả năng phát triển tốt thành khuẩn lạc to, tròn của các dòng nấm men ở điều kiện nồng độ ethanol cao trong thời gian từ 1 đến 4 ngày. - Tuyển chọn các dòng nấm men có khả năng phát triển trên môi trường có nồng độ ethanol cao. Chuyên ngành Vi sinh vật học 15 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ 3.2.3. Khảo sát khả năng lên men đường glucose Mục đích: Tuyển chọn các dòng nấm men có khả năng lên men mạnh bằng phương pháp lên men dung dịch đường glucose 2% trong ống Durham. Phương pháp tiến hành - Thí nghiệm 1 nhân tố (dòng nấm men) 3 lần lặp. - Nuôi sinh khối 5 dòng nấm men trong môi trường PGY trong 24 giờ. - Chủng 1 mL dung dịch tế bào nấm men mật số 107 tế bào/mL vào ống Durham có chứa 9 mL dung dịch glucose 2% đã được khử trùng ở 115ºC trong 10 phút. Lắc thật đều để dung dịch đường tràn đầy vào ống thủy tinh úp ngược nằm bên trong ống Durham chiều cao 30 mm, ủ ở nhiệt độ phòng. - Chỉ tiêu đánh giá: Chiều cao cột khí CO2 sinh ra trong ống thủy tinh úp ngược tại các thời điểm: 4, 8, 12, 16, 20 và 24 giờ ủ. - Chọn lọc những dòng nấm men có khả năng lên men nhanh và mạnh. 3.2.4. Khảo sát khả năng sinh ethanol ở nhiệt độ cao Mục đích: Tuyển chọn những dòng nấm men có khả năng tạo ethanol cao ở nhiệt độ cao. Phương pháp tiến hành - Thí nghiệm 2 nhân tố (dòng nấm men và nhiệt độ) với 3 lần lặp lại. - Nuôi cấy nấm men trong môi trường nuôi sinh khối đến khi mật số tế bào nấm men đạt 108 tế bào/ mL. - Cho 99 mL dung dịch rỉ đường nồng độ 20ºBrix vào bình tam giác 250 mL, khử trùng ở 115ºC trong 10 phút. - Chủng 1 mL dung dịch nấm men đã nuôi cấy vào các bình tam giác, mật số nấm men sau khi chủng là 106 tế bào/ mL. - Ủ 5 – 7 ngày trong điều kiện kỵ khí (đậy bằng waterlock) ở các nhiệt độ khác nhau: 35, 40 và 45ºC. Đếm số bọt khí sinh ra trong 2 phút sau mỗi 24 giờ. - Chưng cất để thu ethanol và đo nồng độ ethanol thu được, qui về nồng độ ethanol ở 20ºC. - Chỉ tiêu đánh giá: Khả năng lên men tạo ethanol ở các nhiệt độ khác nhau: nồng độ ethanol thu được sau lên men. Tuyển chọn các dòng nấm men cho nồng độ ethanol cao ở nhiệt độ cao. Chuyên ngành Vi sinh vật học 16 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ 3.2.5. Khảo sát các điều kiện lên men a. Ảnh hưởng của mật số giống chủng và hàm lượng đường ban đầu Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ giống chủng và hàm lượng đường ban đầu lên khả năng lên men tạo ethanol của các dòng nấm men. Phương pháp tiến hành - Thí nghiệm 2 nhân tố (nồng độ giống chủng và hàm lượng đường ban đầu) với 3 lần lặp lại. - Nuôi cấy dòng nấm men tuyển chọn từ thí nghiệm 3.2.4 trong môi trường YPD đến khi mật số tế bào nấm men đạt 106, 107 và 108 tế bào/ mL. - Cho 100 mL dung dịch rỉ đường ở 4 độ Brix khác nhau: 15, 20, 25 và 30ºBrix vào bình tam giác 250 mL, khử trùng ở 115ºC trong 10 phút. - Chủng 1 mL dung dịch nấm men đã nuôi cấy vào bình tam giác 250 mL, mật số nấm men sau khi chủng lần lượt là 104, 105 và 106 tế bào/mL. - Ủ 5 – 7 ngày trong điều kiện kỵ khí (đậy bằng waterlock) ở nhiệt độ được chọn từ thí nghiệm 3.2.4. Đếm bọt khí sinh ra trong 2 phút sau mỗi 24 giờ. - Sau thời gian ủ, đem chưng cất dịch lên men để thu ethanol và đo nồng độ ethanol thu được qui về nồng độ ethanol ở 20ºC. - Chỉ tiêu đánh giá: khả năng lên men tạo ethanol ở các nồng độ giống chủng và hàm lượng đường khác nhau: nồng độ ethanol thu được sau lên men, hàm lượng đường sót. b. Ảnh hưởng của pH môi trường và thời gian lên men Mục đích: Khảo sát khả năng lên men của nấm men ở các môi trường có giá trị pH khác nhau và thời gian lên men. Phương pháp tiến hành - Thí nghiệm 2 nhân tố (pH môi trường và thời gian lên men) với 3 lần lặp lại. - Nuôi cấy dòng nấm men tuyển chọn từ thí nghiệm 3.2.4 trong ống môi trường YPD điều chỉnh cho mật số tế bào nấm men thích hợp (chọn từ thí nghiệm 3.2.5a). - Cho 100 mL dung dịch rỉ đường có hàm lượng đường ban đầu thích hợp (được chọn từ thí nghiệm 3.2.5a) vào bình tam giác 250 mL. Điều chỉnh giá trị pH ở các bình khác nhau 4,0; 5,0; 6,0 và pH tự nhiên. Khử trùng các bình tam giác trên ở 115oC trong 10 phút. Chuyên ngành Vi sinh vật học 17 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ - Chủng nấm men đã nuôi cấy vào các bình tam giác - Ủ 3, 5 và 7 ngày trong điều kiện kỵ khí (đậy bằng waterlock) ở nhiệt độ được chọn từ thí nghiệm 3.2.4. Đếm bọt khí sinh ra trong 2 phút sau mỗi 24 giờ. - Chưng cất để thu ethanol và đo nồng độ ethanol thu được, qui về nồng độ ethanol ở 20ºC. - Chỉ tiêu đánh giá khả năng lên men tạo ethanol ở các môi trường có giá trị pH và thời gian lên men khác nhau: nồng độ ethanol thu được sau lên men, giá trị pH sau lên men. Xử lý số liệu, phân tích thống kê: Số liệu được xử lý bằng chương trình Microsoft Office Excel 2003 và Minitab 16. Chuyên ngành Vi sinh vật học 18 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Khả năng chịu nhiệt của 5 dòng nấm men Khả năng sinh trưởng ở các mức nhiệt độ khác nhau của 5 dòng nấm men được thể hiện ở Bảng 3. Bảng 3. Khả năng chịu nhiệt của 5 dòng nấm men sau 48 giờ Dòng nấm STT men 1 Nhiệt độ khảo sát 40ºC 43ºC 45ºC 47ºC MY2-1 + + - - 2 Y102 + + + - 3 R24-1 + + - - 4 K1-1 + + - - 5 K2-4 + - - - Ghi chú: Dấu “+”: có khuẩn lạc, dấu “-”: không có khuẩn lạc Sau 48 giờ cấy nấm men trên môi trường dinh dưỡng, tất cả các dòng nấm men đều phát triển ở nhiệt độ 40ºC. Ở mức 43ºC, tất cả các dòng nấm men đều xuất hiện khuẩn lạc ngoại trừ dòng K2-4. Chỉ có dòng nấm men Y102 phát triển được ở nhiệt độ 45ºC. Không có dòng nấm men nào phát triển và tạo khuẩn lạc ở 47ºC sau 48 giờ ủ. So với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Hữu Tường (Luận văn tốt nghiệp đại học năm 2013) thì 5 dòng nấm men này có khả năng chịu nhiệt tốt hơn. Kết quả nghiên cứu trên 44 dòng nấm men, chỉ có 16 dòng phát triển ở nhiệt độ 42ºC, 7 dòng phát triển ở 43ºC và 1 dòng phát triển ở 44ºC. Không có dòng nấm men nào tạo khuẩn lạc ở nhiệt độ 45ºC sau 48 giờ ủ. Trong khi kết quả Nghiên cứu Khoa học của Nguyễn Vân Anh năm 2011 cho thấy khả năng chịu nhiệt của các dòng nấm men trong nghiên cứu này cao hơn kết quả của Nguyễn Hữu Tường. Trong 39 dòng nấm men được phân lập, có 11 dòng phát triển ở 42ºC và 4 dòng phát triển ở 45ºC sau 48 giờ ủ. Điều này chứng tỏ nhiệt độ là một trong những yếu tố ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của các dòng nấm men. Nhiệt độ càng cao, số dòng nấm men phát triển phát triển càng ít. Chuyên ngành Vi sinh vật học 19 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Y102 45ºC Hình 7. Khuẩn lạc của dòng nấm men Y102 ở 45ºC sau 48 giờ ủ 4.2. Khả năng chịu ethanol Khả năng sinh trưởng ở môi trường có bổ sung nồng độ ethanol khác nhau của 5 dòng nấm men được thể hiện ở Bảng 4. Bảng 4. Khả năng chịu ethanol của 5 dòng nấm men sau 48 giờ Dòng nấm STT men 1 Nồng độ ethanol bổ sung 8% 10% 12% 14% 15% MY2-1 + + + + + 2 Y102 + + + + + 3 R24-1 + + + - - 4 K1-1 + + + - - 5 K2-4 + + + - - Ghi chú: Dấu “+” có khuẩn lạc, dấu “–” không có khuẩn lạc Sau 48 giờ cấy nấm men trên môi trường dinh dưỡng, tất cả các dòng nấm men đều phát triển trong môi trường có bổ sung 8%, 10% và 12% ethanol. Ở mức 14% ethanol, ngoại trừ dòng MY2-1 và Y102, các dòng còn lại đều không phát triển được. Chuyên ngành Vi sinh vật học 20 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Khi tăng nồng độ ethanol lên 15%, dòng nấm men MY2-1 và Y102 vẫn hình thành khuẩn lạc trên môi trường nuôi cấy. Từ hai thí nghiệm trên cho thấy Y102 là dòng nấm men duy nhất trong 5 dòng khảo sát có khả năng chịu nhiệt ở 45ºC và hình thành khuẩn lạc trên môi trường có bổ sung 15% ethanol. Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Hữu Tường (Luận văn tốt nghiệp đại học2013), trong 44 dòng nấm men phân lập, chỉ có 38 dòng phát triển được ở nồng độ ethanol bổ sung 10%, 25 trên 44 dòng tạo được khuẩn lạc ở môi trường có bổ sung 12% ethanol. Từ đây cho thấy, 5 dòng nấm men từ Thái Lan có khả năng chịu ethanol cao hơn các dòng nấm men trong nghiên cứu của Nguyễn Hữu Tường. Nhìn chung, số dòng nấm men có thể phát triển giảm khi nồng độ ethanol bổ sung tăng. Điều này chứng tỏ ethanol là một trong những yếu tố ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của các dòng nấm men. Ethanol ức chế quá trình phát triển của nấm men, nồng độ ethanol cao sẽ gây ngộ độc nấm men. Hình 8. Khuẩn lạc dòng Y102 và MY2-1 ở môi trường bổ sung 15% ethanol 4.3. Khả năng lên men đường glucose Khả năng lên men của 5 dòng nấm men được theo dõi và xác định ở các thời điểm 4, 8, 12, 16, 20 và 24 giờ sau khi chủng. Kết quả chiều cao cột khí CO2 sinh ra trong ống thủy tinh úp ngược được trình bày trong Bảng 5. Chuyên ngành Vi sinh vật học 21 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 5. Chiều cao cột khí CO 2 (mm) trong ống Durham Dòng STT nấm men 1 Chiều cao cột khí CO 2 (mm) 4 giờ 8 giờ 12 giờ 16 giờ 20 giờ 24 giờ MY2-1 10,33b 24,67a 26,33 a 27,00a 27,33a 27,33a 2 Y102 7,33 b 26,33a 30,00 a - - - 3 R24-1 10,00b 29,33a 30,00a - - - 4 K1-1 11,33b 28,33a 30,00a - - - 5 K2-4 22,67a 30,00a - - - - Ghi chú: Chiều cao tối đa của cột khí trong ống Durham là 30 mm. Giá trị trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp. Các trị trung bình trong cùng một cột theo sau có các mẫu tự giống nhau thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95%. Phương pháp lên men đường glucose trong ống Durham giúp đánh giá sơ bộ khả năng lên men của 5 dòng nấm men khảo sát. Số liệu trong Bảng 5 cho thấy thời gian khởi đầu và khả năng lên men của các dòng nấm men tương đối đồng nhất. Duy nhất chỉ có dòng K2-4 thể hiện sự khác biệt ở thời điểm 4 giờ sau chủng giống. Kết quả tại thời điểm này cho thấy dòng nấm men K2-4 lên men sớm và tốc độ lên men nhanh hơn so với các dòng còn lại. Cụ thể là giá trị trung bình chiều cao cột khí CO2 ở 3 lần lặp lại của dòng nấm men này là cao nhất và thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở độ tin cậy 95%. Đến thời điểm 8 giờ, chiều cao cột khí CO2 của dòng nấm men này đạt cực đại (30mm) trong khi 3 dòng Y102, K1-1, và R24-1 đạt được giá trị này sau 12 giờ. Tuy nhiên kết quả phân tích thống kê kể từ thời điểm 8 giờ trở đi không cho thấy sự khác biệt giữa các giá trị được ghi nhận do chiều cao của durham dài tối đa 30mm. Tuy nhiên, số liệu ở Bảng 5 còn cho thấy dòng nấm men MY2-1 kết thúc lên men ở thời điểm 20 giờ sau chủng bởi vì đến mốc 24 giờ, giá trị trung bình chiều cao cột khí CO2 của dòng nấm men này không thay đổi. 4.4. Khả năng sinh ethanol ở nhiệt độ cao Chuyên ngành Vi sinh vật học 22 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Khả năng sinh ethanol ở các mức độ nhiệt độ khác nhau của 5 dòng nấm men được thể hiện ở Hình 9. Hình 9. Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ ủ lên nồng độ ethanol sinh ra Ghi chú: Số liệu trong biểu đồ là giá trị trung bình của 3 lần lặp. Các giá trị theo sau có các mẫu tự giống nhau thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95%. Nhìn chung, khả năng sinh ethanol của các dòng nấm men tương đối đồng nhất. Kết quả khảo sát cho thấy tất cả 5 dòng nấm men đều có khả năng lên men và sinh được ethanol ở hai nghiệm thức Nhiệt độ phòng(28-32ºC) và 35ºC. Hai giá trị ethanol thu được ở từng dòng nấm men không có khác biệt mang nghĩa thống kê. Nghĩa là, khả năng lên men và sinh ethanol của từng dòng nấm men trong điều kiện nhiệt độ phòng (28-32ºC) và ở 35ºC là giống nhau. Khi tăng nhiệt độ lên 40ºC và 45ºC khả năng lên men của các dòng nấm men bị hạn chế biều hiện bằng sự giảm giá trị nồng độ ethanol do chính các dòng nấm men này sản sinh ra. Theo nghiên cứu của Ghorbani et al. (2011), ở nhiệt độ bình thường, dòng nấm men Saccharomyces cerevisiae có thể tạo ra 1,915% (w/v) ethanol trong môi trường rỉ đường. Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến sự lên men tạo ethanol của nấm men. Theo Navarro và Durand (1978) khi nhiệt độ tăng cao thì lượng ethanol tích lũy nội Chuyên ngành Vi sinh vật học 23 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ bào trong tế bào nấm men tăng cao làm ngưng trệ sự phát triển của nấm men. Vì vậy lượng ethanol sinh ra giảm khi nhiệt độ môi trường tăng. Ba dòng nấm men K1-1, K2-4 và R24-1 lên men và sinh ra ethanol với nồng độ tương đối cao ở hai nghiệm thức Nhiệt độ phòng(28-32ºC) và 35ºC. Điển hình là dòng K1-1, giá trị ethanol thu được ở hai nghiệm thức nói trên lần lượt là 3,27% w/v và 2,99% w/v. Tuy nhiên khi nhiệt độ được tăng lên 40ºC và 45ºC, cả ba dòng nấm men này đều không thể lên men do không nhận được lượng ethanol sinh ra sau khi tiến hành chưng cất các sản phẩm lên men. Giá trị nồng độ ethanol nhận được ở hai nghiệm thức này là 0% w/v. Do đó có thể nói, nhiệt độ 40ºC đã ức chế khả năng lên men của ba dòng nấm men K1-1, K2-4 và R24-1. Kết quả còn cho thấy một số điểm khác biệt về khả năng lên men và sinh ethanol của các dòng nấm men. Y102 và MY2-1 là hai trong số năm dòng nấm men có khả năng sinh ethanol ở tất cả các nghiệm thức. Tuy nhiên giữa hai dòng này có sự khác biệt. Dòng Y102 lên men sinh ra lượng ethanol nồng độ cao ở điều kiện nhiệt độ phòng (3,37% w/v) và 35ºC (3,08% w/v) nhưng khi nhiệt độ tăng lên 40ºC và 45ºC giá trị nồng độ ethanol thu được bị giảm mạnh và kết quả phân tích thống kê cho thấy hai giá trị này khác biệt có ý nghĩa so với các giá trị thu được ở hai nghiệm thức Y102 nhiệt độ phòng và Y102 – 35ºC. Kết quả còn cho thấy dòng MY2-1 sản sinh lượng ethanol cao nhất ở tất cả các mức nhiệt độ (35, 40, 45ºC, nhiệt độ phòng) so với 4 dòng nấm men còn lại. Đây cũng là dòng nấm men duy nhất có khả năng sinh ethanol ở nhiệt độ 40ºC và giá trị nồng độ ethanol thu được không có khác biệt mang nghĩa thống kê so với giá trị thu được ở hai nghiệm thức MY2-1 – Nhiệt độ phòng và MY2-1 – 35ºC. Khi tăng nhiệt độ lên 45ºC độ rượu sinh ra bị giảm mạnh (từ 2,89 xuống 1,02% w/v). Từ các kết quả trên, dòng MY2-1 được chọn để tiến hành thí nghiệm tiếp theo. Vì thí nghiệm được tiến hành nhằm khảo sát khả năng lên men ở nhiệt độ cao của nấm men nên nhiệt độ ủ cho các thí nghiệm sau được chọn là 40ºC. 4.5. Các điều kiện lên men ở 40ºC của dòng nấm men MY2-1 4.5.1. Ảnh hưởng của mật số giống chủng và nồng độ đường Khả năng sinh ethanol của dòng nấm men MY2-1 với mật số giống chủng và nồng độ đường khác nhau được ghi nhận qua Hình 10. Chuyên ngành Vi sinh vật học 24 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Hình 10. Biểu đồ ảnh hưởng của mật số giống chủng và nồng độ đường lên nồng độ ethanol sinh ra Ghi chú: Số liệu trong biểu đồ là giá trị trung bình của 3 lần lặp. Các giá trị theo sau có các mẫu tự giống nhau thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95%. Kết quả cho thấy ba nghiệm thức 105 tế bào/mL – 25ºBrix và 106 tế bào/mL – 25ºBrix và 105 tế bào/mL – 30ºBrix cho kết quả nồng độ ethanol cao nhất (lần lượt là 3,56 ; 3,71 và 3,46% w/v) và không khác biệt có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Với nồng độ đường ban đầu 15ºBrix thì nồng độ ethanol sinh ra ở ba nghiệm thức 10 4, 105, 106 đều thấp hơn các nghiệm thức còn lại. Các giá trị này lần lượt là 1,68; 1,62; 1,87% w/v và giữa các giá trị trên không có khác biệt mang ý nghĩa thống kê ở mức tin cậy 95%. Khi nồng độ đường tăng lên 20ºBrix, thì nồng độ ethanol ở ba nghiệm thức mật số cũng tăng tương ứng. Nhưng các giá trị nhận được ở ba nghiệm thức này vẫn không có khác biệt mang ý nghĩa thống kê so với các giá trị ethanol ở nghiệm thức 15ºBrix. Ở nghiệm thức 105 và 106 tế bào/mL, nồng độ ethanol tăng mạnh khi nồng độ đường tăng từ 20 lên 25ºBrix. Cụ thể là ở nghiệm thức 105 tế bào/mL, nồng độ ethanol tăng từ 2,32 lên 3,56% w/v; còn ở nghiệm thức 106 tế bào/mL, giá trị này tăng 1,20% từ 2,51 lên 3,71% w/v. Chuyên ngành Vi sinh vật học 25 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Tuy nhiên khi nồng độ đường được tăng lên 30ºBrix thì nồng độ ethanol sinh ra đã không tăng tương ứng mà còn giảm đáng kể ở nghiệm thức mật số 106 tế bào/mL. Do nồng độ ethanol sinh ra ở nghiệm thức mật số cao nhất (10 6 tế bào/mL) và nồng độ đường cao nhất (30ºBrix) lại không phải là giá trị lớn nhất (2,36% w/v). Điều này chứng tỏ, mật số giống chủng và nồng độ đường ban đầu cao sẽ làm hạn chế nhất định lượng ethanol sinh ra của nấm men. Tóm lại, nồng độ ethanol thu được có xu hướng thay đổi không tương ứng với sự thay đổi của nồng độ đường. Nồng độ ethanol luôn đạt cao nhất ở nghiệm thức 25ºBrix trong cả ba trường hợp mật số giống chủng khác nhau. Nồng độ đường là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng sinh ethanol của nấm men. Nồng độ đường ban đầu thấp sẽ làm giảm năng suất lên men trong khi nồng độ dịch đường quá cao sẽ làm thay đổi áp suất thẩm thấu gây nguy hiểm đối với tế bào nấm men (Pereira et al., 2010). Bên cạnh đó, nồng độ ethanol cũng có xu hướng thay đổi không tương ứng với sự thay đổi mật số giống chủng: trong 3 nghiệm thức 15, 20, 25ºBrix, giá trị nồng độ ethanol ở nghiệm thức mật số 10 5 và 106 tế bào/mL khác biệt không có ý nghĩa ở mức tin cậy 95%. Trong trường hợp nồng độ đường ban đầu là 30ºBrix thì nồng độ ethanol ở nghiệm thức 106 tế bào/mL thậm chí còn thấp hơn nhiều so với nghiệm thức 105 tế bào/mL. Trong quá trình lên men, mật số giống chủng ban đầu sẽ ảnh hưởng đến nồng độ ethanol sinh ra. Khi tỷ lệ nấm men bổ sung càng cao thì tốc độ lên men ở thời gian đầu càng nhanh và có thể cản trở quá trình lên men tiếp theo (Lương Đức Phẩm, 2006). Vậy mật số giống chủng và nồng độ đường được lựa chọn cho thí nghiệm tiếp theo lần lượt là 105 tế bào/mL và 25ºBrix. Chuyên ngành Vi sinh vật học 26 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Khả năng sử dụng đường Hình 11. Biểu đồ hàm lượng đường sử dụng trong quá trình lên men Ghi chú: Số liệu trong biểu đồ là giá trị trung bình của 3 lần lặp. Nhìn chung, lượng đường sử dụng tăng theo mật số tế bào nấm men và tương ứng với sự tăng nồng độ ethanol thu được. Lượng đường sử dụng nhiều ở nghiệm thức 105 tế bào/mL – 30ºBrix (4,00ºBrix), 105 tế bào/mL – 25ºBrix (3,83ºBrix) và 10 6 tế bào/mL – 25ºBrix (3,67ºBrix), tương ứng ở các nghiệm thức này lượng ethanol thu được từ kết quả phân tích cũng cao hơn các nghiệm thức còn lại. Tỷ lệ sử dụng đường của dòng nấm men MY2-1 trong dịch rỉ đường không cao do trong rỉ đường có chứa rất nhiều loại đường, nấm men không thể sử dụng tất cả để chuyển hóa thành ethanol được. 4.5.2. Ảnh hưởng của thời gian lên men và pH môi trường Khả năng sinh ethanol của dòng nấm men MY2-1 với thời gian lên men và pH khác nhau được ghi nhận qua Hình 12. Chuyên ngành Vi sinh vật học 27 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Hình 12. Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian lên men và pH môi trường lên nồng độ ethanol sinh ra Ghi chú: Số liệu trong biểu đồ là giá trị trung bình của 3 lần lặp. Các giá trị theo sau có các mẫu tự giống nhau thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95%. Nhìn chung, ở các thời gian lên men khác nhau (3, 5 và 7 ngày) giá trị nồng độ ethanol thu được ở các nghiệm thức pH giống nhau không có sự khác biệt ở độ tin cậy 95%. Hay nói cách khác, nồng độ ethanol sinh ra sau 3, 5 và 7 ngày lên men thì giống nhau. Điển hình là sau 3 ngày lên men, nghiệm thức pH4 cho kết quả nồng độ ethanol cao nhất (3,74% w/v) và không có khác biệt so với giá trị thu được ở cùng nghiệm thức pH4 sau 5 và 7 ngày. Kết quả còn cho thấy nghiệm thức pH4 cho kết quả nồng độ ethanol cao nhất và không có khác biệt với kết quả thu được ở các nghiệm thức của pH tự nhiên. Tuy nhiên, nồng độ ethanol thu được ở nghiệm thức pH5 sau 7 ngày lên men cũng không có khác biệt so với giá trị nhận được ở các nghiệm thức pH4 và pH tự nhiên. Với 3 ngày lên men trong môi trường pH6, dòng nấm men MY2-1 sinh ra nồng độ ethanol thấp nhất (1,80% w/v). Kết quả này không khác biệt với nồng độ ethanol thu được so với thời gian lên men là 5 và 7 ngày. Kết quả cũng thể hiện rõ khi pH môi trường càng tăng thì nồng độ ethanol sinh ra càng giảm. Nghiệm thức pH4 cho kết quả độ rượu thu được cao nhất, tiếp theo là pH Chuyên ngành Vi sinh vật học 28 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ tự nhiên (4,22), pH5, pH6. Nếu pH cao thì sẽ có nhiều glycerol và acid hữu cơ tạo thành làm hạn chế ethanol (Wang et al., 2001). Điều này chứng tỏ pH của môi trường là một trong những yếu tố ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của các dòng nấm men. Nồng độ ethanol thu được không có xu hướng tăng sau thời gian lên men 5 và 7 ngày. Vì nồng độ ethanol ở ba nghiệm thức thời gian không thể hiện sự khác biệt qua kết quả phân tích thống kê. Vậy thời gian và pH thích hợp cho quá trình lên men của dòng nấm men MY2-1 trong môi trường rỉ đường ở nhiệt độ cao lần lượt là 3 ngày và pH tự nhiên (4,22). Sự thay đổi của pH trong quá trình lên men Sự thay đổi của pH trong quá trình lên men của dòng nấm men MY2-1 được thể hiện qua Hình 13. 6 5 Giá trị pH 4 3 2 1 0 pH tự nhiên pH4 pH5 pH6 Hình 13. Giá trị pH sau khi lên men Ghi chú: Số liệu trong biểu đồ là giá trị trung bình của 12 lần lặp. Trong nghiệm thức pH4, giá trị pH không có sự chênh lệch lớn giữa trước (pH 4,00) và sau khi lên men (pH 4,07). Kết quả cũng tương tự với nghiệm thức pH tự nhiên (4,22). Trong nghiên cứu này giá trị pH thích hợp cho quá trình lên men của dòng nấm men MY2-1 là pH4 và pH tự nhiên (4,22). Nghiệm thức pH tự nhiên được chọn cho các thí nghiệm lên men bởi độ rượu không có khác biệt so với nghiệm thức pH4, đồng thời không phải mất thời gian điều chỉnh pH. Chuyên ngành Vi sinh vật học 29 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận - Tất cả các dòng nấm men đều phát triển được ở 40ºC. Ngoại trừ dòng K2-4, 4 dòng còn lại đều hình thành khuẩn lạc ở nhiệt độ 43ºC. Chỉ có dòng Y10-2 phát triển được ở 45ºC và không có dòng nấm men nào phát triển ở 47ºC. - Tất cả đều phát triển được trên môi trường có bổ sung 12% ethanol. MY2-1 là dòng nấm men duy nhất hình thành khuẩn lạc trên môi trường bổ sung 14 và 15% ethanol. - Khả năng lên men trong môi trường glucose 2% của 5 dòng nấm men tương đối đồng nhất. Chỉ có dòng K2-4 lên men sớm và nhanh hơn các dòng còn lại ở thời điểm 4 giờ sau chủng. - Ở 40ºC, trên môi trường rỉ đường, dòng MY2-1 sản sinh ra lượng ethanol là 2,89% w/v, khác biệt không có ý nghĩa ở độ tin cậy 95% so với nhiệt độ 35ºC (3,63% w/v) và nhiệt độ tự nhiên (28 – 32ºC) (3,91% w/v). - Điều kiện lên men tốt của dòng MY2-1 trên môi trường rỉ đường ở 40ºC là: mật số giống chủng 105 tế bào/mL, nồng độ đường ban đầu 25ºBrix (3,71% w/v), thời gian lên men 3 ngày và pH môi trường (4,22) (3,74% w/v). 5.2. Đề nghị - Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng lên men của nấm men như: hàm lượng nitơ, hàm lượng MgSO4,… - Khảo sát khả năng lên men của dòng nấm men MY2-1 trên các loại môi trường khác nhau: nước trái cây, nước mía,… Chuyên ngành Vi sinh vật học 30 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ TÀI LIỆU THAM KHẢO ---------Tiếng Việt Lương Đức Phẩm, 2006. Nấm men công nghiệp. Nhà xuất bản Khoa học Kỹ Thuật, Hà Nội. Ngô Thị Phương Dung, 2009. Khảo sát khả năng lên men và tính chịu cồn của nấm men. Tạp chí Khoa học Trường ĐHCT 2009: 11 374-382. Nguyễn Công Hà, 2000. Bài giảng Kỷ thuật lên men rượu bia. Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ. Nguyễn Hữu Tường, 2013. Tuyển chọn và khảo sát điều kiện lên men ethanol bằng nấm men chịu nhiệt. Luận văn tốt nghiệp Đại học, Ngành Công nghệ Sinh học Tiên tiến khóa 34, Viện NC&PT Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ. Nguyễn Hữu Tường, Nguyễn Minh Đời, Hồ Thị Bé Thảo, Nguyễn Thị Ái Xuân, Nguyễn Ngọc Thạnh và Phạm Hồng Quang, 2012. Thử nghiệm lên men ethanol ở nhiệt độ cao bằng nấm men chịu nhiệt. Đề tài nghiên cứu khoa học sinh viên cấp Trường, Trường Đại học Cần Thơ. Nguyễn Lân Dũng, 1999. Vi sinh vật học, Nhà xuất bản Giáo dục. Nguyễn Thị Ngọc Mai, 2011. Khảo sát khả năng lên men và tuyển chọn nấm men có khả năng chịu cồn cao. Luận văn tốt nghiệp Đại học, Trường Đại học Cần Thơ. Nguyễn Vân Anh, Phạm Minh Tú, Hứa Hữu Danh, Nguyễn Bình Duy Anh, Huỳnh Xuân Phong và Ngô Thị Phương Dung, 2011. Phân lập và tuyển chọn các dòng nấm men chịu nhiệt có khả năng lên men ethanol mạnh. Đề tài nghiên cứu khoa học sinh viên cấp Trường, Trường Đại học Cần Thơ. Tiếng Anh Alfenore, S., C. Molina, S.E. Guillouet, J.L. Uribelarrea, G. Goma and L.Benbadis. 2002. Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process. Applied Microbiology and Biotechnology. 60: 67-72. Anderson, P. J., K. McNeil, and K. Watson. 1986. High-efficiency carbohydrate fermentation to ethanol at temperatures above 40 degrees C by Kluyveromyces Chuyên ngành Vi sinh vật học 31 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ marxianus var. marxianus isolated from sugar mills. Appl. Environ. Microbiol. 51: 1314-1320. Arthur, H. and K. Watson. 1976. Thermal adaptation in yeast: growth temperatures, membrane lipid, and cytochrome composition of psychrophilic, mesophilic, and thermophilic yeasts. Journal of Bacteriology. 128(1): 58-68. Banat, I. M., P. Nigram, and R. Marchant.1992. Isolation of thermotolerant, fermentative yeasts growing at 52ºC and producing ethanol at 45ºC and 50ºC. World J. Microbiol. Biotechnol. 8: 259-263. Barron, N., R. Marchant, L.McHale and A.P. McHale. 1994. Growth of thermotolerant ethanol-producing strain of Kluyveromyces marxianus on cellobiose-containing media. Biotechnology Letter. 16: 625-630. Brady, D., R. Marchant, L. McHale and A.P McHale. 1994. Production of ethanol by thermotolerant yeast, Kluyveromyces marxianus IMB3 during growth on lactosecontaining media. Biotechnology Letter. 16: 737-740. Brady, D., R. Marchant, L. McHale and A.P McHale. 1995. Isolation and partial characterization of β-galactosidase activity produced by a thermotolerant strain of Kluyveromyces marxianus during growth on lactose-containing media. Enzyme and Microbial Technology. 17: 696-699. Dung, M., N.T.P., P. Thanonkeo and H.X.Phong. 2012. Screening useful isolated yeasts for ethanol fermentation at high temperature. International Journal of Applied Sience and Technology. 2:68. Fleming, M., N. Barron, R. Marchant, L. McHale and A.P. McHale. 1993. Studies on the growth of a thermotolerant yeast, Kluyveromyces marxianus IMB3 during growth on lactose-containing media. Biotechnology Letter. 16: 1195-1198. Ghorbani, F., H. Younesi, A. E. Sri and G. Najafpour. 2011. Cane molasses fermentation for continuous ethanol production in an immobilized cells reactor by Saccharomyces cerevisiae. Renewable Energy, 36 (2): 503-509. Hacking, A.J., I.W.F Taylor and C.M. Hanas. 1984. Selection of yeast able to produce ethanol from glucose at 40ºC. Applied Microbiology and Biotechnology. 19:361. Chuyên ngành Vi sinh vật học 32 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Helena da Cruz, S., M. Batistote and J.K. Ernandes, 2003. Effect of sugar catabolite repression in correlation with the structure complexity of nitrogen source on yeast growth and fermentation. Journal of Industrial and Brewing.109(4): 349-355. Hughes, D. B., N. J. Tudroszen, and C. J. Moye. 1984. The effect of temperature on the kinetics of ethanol production by a thermotolerant strain of Kluyveromyces marxianus. Biotechnol. Lett. 6: 1-6. Jacobson, G.K. and S.O. Jolly. 1989. Yeast, molds and algae. Biotechnology.7: 279314. Kurtzman, C.P. and J. Piskur. 2006. Taxonomy and phylogenetic diversity among the yeasts. Topics in Current Genetic. 15: 29-46. Lee, J.H., D. Williamson and P.L. Rogers. 1980. The effect of temperature on the kinetics of ethanol production by Saccharomyces uvarum. Biotechnology Letter. 2(4): 141-146. McCracken, L.D. and C.S. Gong, C.S. 1982. Fermentation of cellulose and hemicellulose carbohydrates by thermotolerant yeasts. Biotechnology Bioengineering. 25: 253-300. Navarro, J.M. and G. Durand. 1978. Alcohol fermentation: effect of temperature on ethanol accumulation within yeast cells. Annals of Microbiology 129B: 215-224. Nonklang S., B.M. A. Abdel-Banat, K. Cha-aim, N. Moonjai, H. Hoshida, S. Limtong, M. Yamada, and R. Akada. 2008. High-temperature ethanol fermentation and transformation with linear DNA in the thermotolerant yeast Kluyveromyces marxianus DMKU3-1042. Applied and Environmental Microbiology. 74(24): 7514-7521. Norr, A.A., A. Hameed, K.P. Bhatti, and S.A. Tunio. 2003. Bio-ethanol fermentation by the bioconversion of sugar from dates by Saccharomyces cerevisiae strain ASN-3 and HA-4. Biotechnology. 2(1): 8-17. Pecota, D.C., V. Rajgarhia, and N. A. Da Silva. 2007. Sequential gene integration for the engineering of Kluyveromyces marxianus. J. Biotechnol.127: 408-416. Roehr, M. 2001. The Biotechnology of Ethanol: Classical and Future Applications. Chichester: Wiley-VCH, pp.232. Chuyên ngành Vi sinh vật học 33 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Sripiromrak, A. 2006. Isolation and characterization of thermotolerant yeast for ethanol production. Thesis of Master of Science in Biotechnology. Suranaree University of Technology, Thailand. Torija, M.J., N. Rozes, M. Poblet, J.M. Guillamon, and A. Mas. (2003). Effects of fermentation temperature on the strain population of Saccharomyces cerevisiae. International Journal of Food Microbiology. 80: 47-53. Wang, Z.X., J. Zhuge, H. Fang and B.A. Prior. (2001). Glycerol production by microbial fermentation: A review. Biotechnology Advances. 19: 201-223. Trang Web http://techmart.cesti.gov.vn/images/image/2011/30_6_11/30_06_11_1.JPG, ngày 29/07/2013. http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/nammen01.htm, ngày 29/07/2013. http://www.visualphotos.com/image/1x3745113/kluyveromyces_lactis_yeast_cell_kluy veromyces, ngày 29/07/2013. http://www.deskuenvis.nic.in/fungi.htm, ngày 29/07/2013. http://microbewiki.kenyon.edu/images/9/9a/Saccromyces.jpg, ngày 29/07/2013. http://lanisisland.com/wp-content/uploads/2011/10/candida.jpg, ngày 29/07/2013. Chuyên ngành Vi sinh vật học 34 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC ---------Phụ lục 1. Hình ảnh các thiết bị sử dụng trong phòng thí nghiệm Hình 14. Cân phân tích Hình 16. Khúc xạ kế Hình 15. Hệ thống chưng cất rượu Hình 17. Kính hiển vi Hình 18. Máy vortex Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Hình 19. pH kế Trường Đại học Cần Thơ Hình 20. Nồi khử trùng nhiệt ướt Hình 21. Water bath Hình 22. Tủ ủ Hình 23. Tủ cấy Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Phụ lục 2. Số liệu kết quả thí nghiệm Bảng 6. Kết quả khảo sát lên men đường glucose Dòng nấm men Lần lặp Y102 Y102 Y102 K2-4 K2-4 K2-4 MY2-1 MY2-1 MY2-1 K1-1 K1-1 K1-1 R24-1 R24-1 R24-1 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Chiều cao cột khí CO2 (mm) 4 giờ 8 giờ 12 giờ 16 giờ 20 giờ 24 giờ 6 8 8 21 17 30 8 14 9 12 14 8 7 14 9 24 30 25 30 30 30 14 30 30 30 30 25 28 30 30 30 30 30 30 30 30 19 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 21 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 22 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 22 30 30 30 30 30 30 30 30 Bảng 7. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng lên men của 5 dòng nấm men Dòng nấm men – Nhiệt độ Lần lặp Y102 – tº phòng Y102 – tº phòng Y102 – tº phòng Y102 – 35ºC Y102 – 35ºC Y102 – 35ºC Y102 – 40ºC Y102 – 40ºC Y102 – 40ºC Y102 – 45ºC Y102 – 45ºC Y102 – 45ºC K2-4 – tº phòng K2-4 – tº phòng K2-4 – tº phòng K2-4 – 35ºC K2-4 – 35ºC K2-4 – 35ºC 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Chuyên ngành Vi sinh vật học Nồng độ đường Nồng độ đường trước lên men sau lên men (ºBrix) (ºBrix) 20 17 20 17,5 20 17,5 20 16,5 20 15 20 15 20 18,5 20 18,5 20 18,5 20 19 20 19 20 18,5 20 16 20 16 20 16 20 17,5 20 16 20 17,5 Nồng độ ethanol ở 20ºC (%w/v) 3,01 3,53 3,58 3,42 3,4 2,42 1,68 1,66 1,66 0,56 0,56 0,56 2,51 1,55 3,4 2,01 2,1 2,16 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 7. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng lên men của 5 dòng nấm men (tiếp theo) Dòng nấm men – Nhiệt độ Lần lặp K2-4 – 40ºC K2-4 – 40ºC K2-4 – 40ºC K2-4 – 45ºC K2-4 – 45ºC K2-4 – 45ºC MY2-1 – tº phòng MY2-1 – tº phòng MY2-1 – tº phòng MY2-1 – 35ºC MY2-1 – 35ºC MY2-1 – 35ºC MY2-1 – 40ºC MY2-1 – 40ºC MY2-1 – 40ºC MY2-1 – 45ºC MY2-1 – 45ºC MY2-1 – 45ºC K1-1 – tº phòng K1-1 – tº phòng K1-1 – tº phòng K1-1 – 35ºC K1-1 – 35ºC K1-1 – 35ºC K1-1 – 40ºC K1-1 – 40ºC K1-1 – 40ºC K1-1 – 45ºC K1-1 – 45ºC K1-1 – 45ºC R24-1 – tº phòng R24-1 – tº phòng R24-1 – tº phòng R24-1 – 35ºC R24-1 – 35ºC R24-1 – 35ºC R24-1 –40ºC R24-1 –40ºC R24-1 –40ºC 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 R24-1 –45ºC R24-1 –45ºC R24-1 –45ºC 1 2 3 Chuyên ngành Vi sinh vật học Nồng độ đường Nồng độ đường trước lên men sau lên men (ºBrix) (ºBrix) 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 15 20 16 20 16 20 16 20 16 20 16 20 17 20 17 20 16,5 20 19 20 19 20 19 20 16 20 15,5 20 15,5 20 15 20 15 20 15 20 19 20 17,5 20 18,5 20 19 20 19 20 19 20 16 20 15 20 15,5 20 15 20 15 20 15 20 19,5 20 19,5 20 20 20 20 20 20 20 20 Nồng độ ethanol ở 20ºC (%w/v) 0 0 0 0 0 0 4,42 3,6 3,7 3,36 3,75 3,77 2,83 2,89 2,95 0,68 1,68 0,7 3,16 3,57 3,1 3,04 3,00 3,00 0 0 0 0 0 0 2,67 3,71 2,53 3,24 2,32 3,16 0 0 0 0 0 0 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 8. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của mật số giống chủng và hàm lượng đường Mật số tế bào (tb/ mL)- Nồng độ đường (ºBrix) 10 4 - 15 10 4 - 15 10 4 - 15 10 4 - 20 10 4 - 20 10 4 - 20 10 4 - 25 10 4 - 25 10 4 - 25 10 4 - 30 10 4 - 30 10 4 - 30 10 5 - 15 10 5 - 15 10 5 - 15 10 5 - 20 10 5 - 20 10 5 - 20 10 5 - 25 10 5 - 25 10 5 - 25 10 5 - 30 10 5 - 30 10 5 - 30 10 6 - 15 10 6 - 15 10 6 - 15 10 6 - 20 10 6 - 20 10 6 - 20 10 6 - 25 10 6 - 25 10 6 - 25 10 6 - 30 10 6 - 30 10 6 - 30 Chuyên ngành Vi sinh vật học Lần lặp 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Nồng độ đường sau lên men (ºBrix) 13 14 13 17 17,5 18 22 22 23 28 27,5 28 12,5 13 12,5 17,5 17 17,5 21 21,5 21 26 26 26 12,5 12,5 12,5 17 17 17 21,5 21 21 27 27 26 Lượng đường sử dụng (ºBrix) 2 1 2 3 2,5 2 3 3 2 2 2,5 2 2,5 2 2,5 2,5 3 2,5 4 3,5 4 4 4 4 2,5 2,5 2,5 3 3 3 3,5 4 3,5 3 3 4 Nồng độ ethanol ở 20ºC (% w/v) 1,81 1,78 1,44 2,79 2,65 2,24 2,42 2,77 2,32 1,87 2,71 2,26 1,83 1,65 1,38 2,73 1,87 2,36 3,67 3,3 3,71 3,57 3,59 3,23 1,78 1,91 1,91 2,71 2,32 2,49 3,48 3,81 3,85 1,64 2,09 3,36 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 9. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men và pH của môi trường Thời gian lên men (ngày)- pH môi trường 3- pH tự nhiên 3- pH tự nhiên 3- pH tự nhiên 3- pH4 3- pH4 3- pH4 3- pH5 3- pH5 3- pH5 3- pH6 3- pH6 3- pH6 5- pH tự nhiên 5- pH tự nhiên 5- pH tự nhiên 5- pH4 5- pH4 5- pH4 5- pH5 5- pH5 5- pH5 5- pH6 5- pH6 5- pH6 7- pH tự nhiên 7- pH tự nhiên 7- pH tự nhiên 7- pH4 7- pH4 7- pH4 7- pH5 7- pH5 7- pH5 7- pH6 7- pH6 7- pH6 Chuyên ngành Vi sinh vật học Lần lặp 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Giá trị pH sau lên men 4,18 4,18 4,18 4,08 4,08 4,08 4,71 4,71 4,71 5,27 5,27 5,32 4,18 4,18 4,17 4,09 4,1 4,08 4,7 4,75 4,7 5,31 5,31 5,29 4,14 4,16 4,16 4,04 4,05 4,05 4,69 4,65 4,64 5,26 5,27 5,27 Nồng độ ethanol ở 20ºC (%w/v) 3,24 3,24 2,86 3,76 3,65 3,8 2,6 2,67 2,6 1,8 1,8 1,79 3,85 3,35 2,87 3,46 3,92 3,71 2,65 2,8 2,32 2,02 2,02 1,96 2,85 3,06 3,18 3,79 3,06 3,18 2,81 3,18 3,14 2,3 1,8 1,8 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Phụ lục 3. Kết quả phân tích thống kê Hình 24. Kết quả phân tích ANOVA khả năng lên men glucose 2% sau 4 giờ Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36– 2013 Trường Đại học Cần Thơ Hình 25. Kết quả phân tích ANOVA khả năng lên men glucose 2% sau 8 giờ Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36– 2013 Trường Đại học Cần Thơ Hình 26. Kết quả phân tích ANOVA khả năng lên men glucose 2% sau 12 giờ Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36– 2013 Trường Đại học Cần Thơ Hình 27. Kết quả phân tích ANOVA khả năng lên men glucose 2% sau 16 giờ Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36– 2013 Trường Đại học Cần Thơ Hình 28. Phân tích ANOVA khả năng lên men glucose 2% sau 20 giờ Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36– 2013 Trường Đại học Cần Thơ Hình 29. Phân tích ANOVA khả năng lên men glucose 2% sau 24 giờ Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36– 2013 Trường Đại học Cần Thơ Hình 30. Kết quả phân tích ANOVA ảnh hưởng của nhiệt độ Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36– 2013 Trường Đại học Cần Thơ Hình 31. Kết quả phân tích ANOVA ảnh hưởng của mật số giống chủng và nồng độ đường Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36– 2013 Trường Đại học Cần Thơ Hình 32. Kết quả phân tích ANOVA hàm lượng đường sử dụng trong quá trình lên men Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36– 2013 Trường Đại học Cần Thơ Hình 33. Kết quả phân tích ANOVA ảnh hưởng của thời gian lên men và pH của môi trường Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học [...]... cao vào ứng dụng trong sản xuất ethanol sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học Tuyển chọn và khảo sát các điều kiện lên men ethanol bằng nấm men chịu nhiệt của Nguyễn Hữu Tường (2013) đã khảo sát 44 dòng nấm men và chọn được 7 dòng có khả năng chịu được nhiệt độ và nồng độ ethanol cao Để góp phần làm phong phú hơn nữa nguồn nấm men có triển vọng đưa vào sản xuất cũng như nhằm so sánh các điều kiện lên. .. nhằm so sánh các điều kiện lên men của các nguồn nấm men khác nhau để tìm ra dòng nấm men chịu nhiệt tối ưu cho quá trình lên men ethanol quy mô lớn, đề tài nghiên cứu Tuyển chọn và khảo sát các điều kiện lên men bằng nấm men chịu nhiệt từ Thái Lan được thực hiện Đề tài sử dụng 5 dòng nấm men có nguồn gốc từ Trung tâm nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Công nghệ Lên men sản phẩm Nông nghiệp, Khoa Công... tính chịu nhiệt Đặc biệt vào mùa hè, nhiệt độ tăng cao cùng với phản ứng lên men tỏa nhiệt sẽ ức chế khả năng lên men của nấm men Gần đây, đã có nhiều nghiên cứu thành công trong việc phân lập và chọn lọc nấm men có khả năng sinh trưởng và lên men mạnh ở nhiệt độ lớn hơn 40ºC Từ đề tài nghiên cứu khoa học “Phân lập và tuyển chọn các dòng nấm men chịu nhiệt có khả năng lên men ethanol mạnh”, Nguyễn Vân... quả khảo sát cho thấy tất cả 5 dòng nấm men đều có khả năng lên men và sinh được ethanol ở hai nghiệm thức Nhiệt độ phòng(28-32ºC) và 35ºC Hai giá trị ethanol thu được ở từng dòng nấm men không có khác biệt mang nghĩa thống kê Nghĩa là, khả năng lên men và sinh ethanol của từng dòng nấm men trong điều kiện nhiệt độ phòng (28-32ºC) và ở 35ºC là giống nhau Khi tăng nhiệt độ lên 40ºC và 45ºC khả năng lên. .. men Do đó, việc nghiên cứu ảnh hưởng của dinh dưỡng và pH đến khả năng lên men của nấm men là rất quan trọng nhằm tìm ra điều kiện tối ưu cho quá trình lên men Từ những lý do trên, việc khảo sát và tuyển chọn một số dòng nấm men có khả năng lên men mạnh và chịu được nhiệt độ, nồng độ ethanol cao đang là vấn đề cần quan tâm Bởi điều này có ý nghĩa quan trọng là tiền đề cho việc đưa ra các dòng nấm men. .. Thơ Những dòng nấm men khác nhau chịu ảnh hưởng của nhiệt độ không giống nhau Số lượng dòng nấm men sinh ethanol cũng giảm theo nhiệt độ (Bảng 2) Bảng 2 Những dòng nấm men được khảo sát có khả năng phát triển và sản sinh ethanol ở nhiệt độ 37 – 45ºC Số lượng dòng Nấm men Tổng số Có hiệu suất Có hiệu suất Phát triển và được lên men lên men sản sinh khảo sát ethanol trên ethanol trên ethanol ở ở 37ºC... cất dịch lên men để thu ethanol và đo nồng độ ethanol thu được qui về nồng độ ethanol ở 20ºC - Chỉ tiêu đánh giá: khả năng lên men tạo ethanol ở các nồng độ giống chủng và hàm lượng đường khác nhau: nồng độ ethanol thu được sau lên men, hàm lượng đường sót b Ảnh hưởng của pH môi trường và thời gian lên men Mục đích: Khảo sát khả năng lên men của nấm men ở các môi trường có giá trị pH khác nhau và thời... ngày trong điều kiện kỵ khí (đậy bằng waterlock) ở các nhiệt độ khác nhau: 35, 40 và 45ºC Đếm số bọt khí sinh ra trong 2 phút sau mỗi 24 giờ - Chưng cất để thu ethanol và đo nồng độ ethanol thu được, qui về nồng độ ethanol ở 20ºC - Chỉ tiêu đánh giá: Khả năng lên men tạo ethanol ở các nhiệt độ khác nhau: nồng độ ethanol thu được sau lên men Tuyển chọn các dòng nấm men cho nồng độ ethanol cao ở nhiệt độ... trình lên men ethanol từ glucose Lên men ethanol là quá trình trao đổi chất dưới tác dụng của chất xúc tác thích hợp là enzyme Đây là quá trình lên men kỵ khí dưới sự có mặt của nấm men tạo thành ethanol và giải phóng khí CO2 Quá trình lên men rượu của nấm men gồm hai giai đoạn chính: - Tăng sinh khối nấm men: tế bào nấm men phát triển và tăng sinh khối, giai đoạn này cần sự hiện diện của oxy - Lên men. .. Cần Thơ 3.2.5 Khảo sát các điều kiện lên men a Ảnh hưởng của mật số giống chủng và hàm lượng đường ban đầu Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ giống chủng và hàm lượng đường ban đầu lên khả năng lên men tạo ethanol của các dòng nấm men Phương pháp tiến hành - Thí nghiệm 2 nhân tố (nồng độ giống chủng và hàm lượng đường ban đầu) với 3 lần lặp lại - Nuôi cấy dòng nấm men tuyển chọn từ thí nghiệm