4.5.1. Ảnh hưởng của mật số giống chủng và nồng độ đường
Khả năng sinh ethanol của dòng nấm men MY2-1 với mật số giống chủng và nồng độ đường khác nhau được ghi nhận qua Hình 10.
Hình 10. Biểu đồ ảnh hưởng của mật số giống chủng và nồng độ đường
lên nồng độ ethanol sinh ra
Ghi chú: Số liệu trong biểu đồ là giá trị trung bình của 3 lần lặp. Các giá trị theo sau có các
mẫu tự giống nhau thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95%.
Kết quả cho thấy ba nghiệm thức 105tế bào/mL – 25ºBrix và 106tế bào/mL – 25ºBrix và 105tế bào/mL – 30ºBrix cho kết quả nồng độ ethanol cao nhất (lần lượt là 3,56 ; 3,71 và 3,46% w/v) và không khác biệt có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%.
Với nồng độ đường ban đầu 15ºBrix thì nồng độ ethanol sinh ra ở ba nghiệm thức 104, 105, 106 đều thấp hơn các nghiệm thức còn lại. Các giá trị này lần lượt là 1,68; 1,62; 1,87% w/v và giữa các giá trị trên không có khác biệt mang ý nghĩa thống kê ở mức tin cậy 95%.
Khi nồng độ đường tăng lên 20ºBrix, thì nồng độ ethanol ở ba nghiệm thức mật số cũng tăng tương ứng. Nhưng các giá trị nhận được ở ba nghiệm thức này vẫn không có khác biệt mang ý nghĩa thống kê so với các giá trị ethanol ở nghiệm thức 15ºBrix.
Ở nghiệm thức 105 và 106 tế bào/mL, nồng độ ethanol tăng mạnh khi nồng độ đường tăng từ 20 lên 25ºBrix. Cụ thể là ở nghiệm thức 105 tế bào/mL, nồng độ ethanol
tăng từ 2,32 lên 3,56% w/v; còn ở nghiệm thức 106 tế bào/mL, giá trị này tăng 1,20% từ 2,51 lên 3,71% w/v.
Tuy nhiên khi nồng độ đường được tăng lên 30ºBrix thì nồng độ ethanol sinh ra
đã không tăng tương ứng mà còn giảm đáng kể ở nghiệm thức mật số 106 tế bào/mL. Do nồng độ ethanol sinh ra ở nghiệm thức mật số cao nhất (106tế bào/mL) và nồng độ đường cao nhất (30ºBrix) lại không phải là giá trị lớn nhất (2,36% w/v). Điều này chứng tỏ, mật số giống chủng và nồng độ đường ban đầu cao sẽ làm hạn chế nhất định
lượng ethanol sinh ra của nấm men.
Tóm lại, nồng độ ethanol thu được có xu hướng thay đổi không tương ứng với sự
thay đổi của nồng độ đường. Nồng độ ethanol luôn đạt cao nhất ở nghiệm thức 25ºBrix trong cả ba trường hợp mật số giống chủng khác nhau.
Nồng độ đường là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng
sinh ethanol của nấm men. Nồng độ đường ban đầu thấp sẽ làm giảm năng suất lên men trong khi nồng độ dịch đường quá cao sẽ làm thay đổi áp suất thẩm thấu gây nguy hiểm đối với tế bào nấm men (Pereira et al., 2010).
Bên cạnh đó, nồng độ ethanol cũng có xu hướng thay đổi không tương ứng với
sự thay đổi mật số giống chủng: trong 3 nghiệm thức 15, 20, 25ºBrix, giá trị nồng độ
ethanol ở nghiệm thức mật số 105 và 106 tế bào/mL khác biệt không có ý nghĩa ở mức tin cậy 95%. Trong trường hợp nồng độ đường ban đầu là 30ºBrix thì nồng độ ethanol
ở nghiệm thức 106 tế bào/mL thậm chí còn thấp hơn nhiều so với nghiệm thức 105 tế
bào/mL. Trong quá trình lên men, mật số giống chủng ban đầu sẽảnh hưởng đến nồng
độ ethanol sinh ra. Khi tỷ lệ nấm men bổ sung càng cao thì tốc độ lên men ở thời gian
đầu càng nhanh và có thể cản trở quá trình lên men tiếp theo (Lương Đức Phẩm, 2006).
Vậy mật số giống chủng và nồng độ đường được lựa chọn cho thí nghiệm tiếp theo lần lượt là 105tế bào/mL và 25ºBrix.
Khả năng sử dụng đường
Hình 11. Biểu đồ hàm lượng đường sử dụng trong quá trình lên men
Ghi chú: Số liệu trong biểu đồ là giá trị trung bình của 3 lần lặp.
Nhìn chung, lượng đường sử dụng tăng theo mật số tế bào nấm men và tương
ứng với sự tăng nồng độ ethanol thu được. Lượng đường sử dụng nhiều ở nghiệm thức
105tế bào/mL – 30ºBrix (4,00ºBrix), 105 tế bào/mL – 25ºBrix (3,83ºBrix) và 106tế
bào/mL – 25ºBrix (3,67ºBrix), tương ứng ở các nghiệm thức này lượng ethanol thu được từ kết quả phân tích cũng cao hơn các nghiệm thức còn lại.
Tỷ lệ sử dụng đường của dòng nấm men MY2-1 trong dịch rỉ đường không cao
do trong rỉ đường có chứa rất nhiều loại đường, nấm men không thể sử dụng tất cả để
chuyển hóa thành ethanol được.
4.5.2. Ảnh hưởng của thời gian lên men và pH môi trường
Khả năng sinh ethanol của dòng nấm men MY2-1 với thời gian lên men và pH
Hình 12. Biểu đồảnh hưởng của thời gian lên men và pH môi trường lên nồng độ ethanol sinh ra
Ghi chú: Số liệu trong biểu đồ là giá trị trung bình của 3 lần lặp. Các giá trị theo sau có các mẫu tự giống nhau thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95%.
Nhìn chung, ở các thời gian lên men khác nhau (3, 5 và 7 ngày) giá trị nồng độ ethanol thu được ở các nghiệm thức pH giống nhau không có sự khác biệt ở độ tin cậy
95%. Hay nói cách khác, nồng độ ethanol sinh ra sau 3, 5 và 7 ngày lên men thì giống
nhau.
Điển hình là sau 3 ngày lên men, nghiệm thức pH4 cho kết quả nồng độ ethanol cao nhất (3,74% w/v) và không có khác biệt so với giá trị thu được ở cùng nghiệm thức pH4 sau 5 và 7 ngày.
Kết quả còn cho thấy nghiệm thức pH4 cho kết quả nồng độ ethanol cao nhất và không có khác biệt với kết quả thu được ở các nghiệm thức của pH tự nhiên. Tuy
nhiên, nồng độ ethanol thu được ở nghiệm thức pH5 sau 7 ngày lên men cũng không
có khác biệt so với giá trị nhận được ở các nghiệm thức pH4 và pH tự nhiên.
Với 3 ngày lên men trong môi trường pH6, dòng nấm men MY2-1 sinh ra nồng
độ ethanol thấp nhất (1,80% w/v). Kết quả này không khác biệt với nồng độ ethanol
thu được so với thời gian lên men là 5 và 7 ngày.
Kết quả cũng thể hiện rõ khi pH môi trường càng tăng thì nồng độ ethanol sinh ra càng giảm. Nghiệm thức pH4 cho kết quả độ rượu thu được cao nhất, tiếp theo là pH
tự nhiên (4,22), pH5, pH6. Nếu pH cao thì sẽ có nhiều glycerol và acid hữu cơ tạo thành làm hạn chế ethanol (Wang et al., 2001). Điều này chứng tỏ pH của môi trường là một trong những yếu tốảnh hưởng lớn đến sự phát triển của các dòng nấm men.
Nồng độ ethanol thu được không có xu hướng tăng sau thời gian lên men 5 và 7 ngày. Vì nồng độ ethanol ở ba nghiệm thức thời gian không thể hiện sự khác biệt qua kết quả phân tích thống kê.
Vậy thời gian và pH thích hợp cho quá trình lên men của dòng nấm men MY2-1
trong môi trường rỉ đường ở nhiệt độ cao lần lượt là 3 ngày và pH tự nhiên (4,22).
Sự thay đổi của pH trong quá trình lên men
Sự thay đổi của pH trong quá trình lên men của dòng nấm men MY2-1 được thể
hiện qua Hình 13. 0 1 2 3 4 5 6 pH tự nhiên pH4 pH5 pH6 G iá t rị p H
Hình 13. Giá trị pH sau khi lên men
Ghi chú: Số liệu trong biểu đồ là giá trị trung bình của 12 lần lặp.
Trong nghiệm thức pH4, giá trị pH không có sự chênh lệch lớn giữa trước (pH
4,00) và sau khi lên men (pH 4,07). Kết quả cũng tương tự với nghiệm thức pH tự
nhiên (4,22).
Trong nghiên cứu này giá trị pH thích hợp cho quá trình lên men của dòng nấm
men MY2-1 là pH4 và pH tự nhiên (4,22). Nghiệm thức pH tự nhiên được chọn cho
các thí nghiệm lên men bởi độ rượu không có khác biệt so với nghiệm thức pH4, đồng
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận
- Tất cả các dòng nấm men đều phát triển được ở 40ºC. Ngoại trừ dòng K2-4, 4 dòng còn lại đều hình thành khuẩn lạc ở nhiệt độ 43ºC. Chỉ có dòng Y10-2 phát triển
được ở 45ºC và không có dòng nấm men nào phát triển ở 47ºC.
- Tất cả đều phát triển được trên môi trường có bổ sung 12% ethanol. MY2-1 là dòng nấm men duy nhất hình thành khuẩn lạc trên môi trường bổ sung 14 và 15% ethanol.
- Khả năng lên men trong môi trường glucose 2% của 5 dòng nấm men tương đối
đồng nhất. Chỉ có dòng K2-4 lên men sớm và nhanh hơn các dòng còn lại ở thời điểm 4 giờ sau chủng.
- Ở 40ºC, trên môi trường rỉ đường, dòng MY2-1 sản sinh ra lượng ethanol là 2,89% w/v, khác biệt không có ý nghĩa ở độ tin cậy 95% so với nhiệt độ 35ºC (3,63% w/v) và nhiệt độ tự nhiên (28 – 32ºC) (3,91% w/v).
- Điều kiện lên men tốt của dòng MY2-1 trên môi trường rỉ đường ở 40ºC là: mật số giống chủng 105tế bào/mL, nồng độ đường ban đầu 25ºBrix (3,71% w/v), thời gian
lên men 3 ngày và pH môi trường (4,22) (3,74% w/v).
5.2. Đề nghị
- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng lên men của nấm men như: hàm
lượng nitơ, hàm lượng MgSO4,…
- Khảo sát khả năng lên men của dòng nấm men MY2-1 trên các loại môi trường khác nhau: nước trái cây, nước mía,…
TÀI LIỆU THAM KHẢO ------
Tiếng Việt
Lương Đức Phẩm, 2006. Nấm men công nghiệp. Nhà xuất bản Khoa học Kỹ Thuật, Hà Nội.
Ngô Thị Phương Dung, 2009. Khảo sát khả năng lên men và tính chịu cồn của nấm
men. Tạp chí Khoa học Trường ĐHCT 2009: 11 374-382.
Nguyễn Công Hà, 2000. Bài giảng Kỷ thuật lên men rượu bia. Khoa Nông nghiệp và
Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ.
Nguyễn Hữu Tường, 2013. Tuyển chọn và khảo sát điều kiện lên men ethanol bằng
nấm men chịu nhiệt. Luận văn tốt nghiệp Đại học, Ngành Công nghệ Sinh học
Tiên tiến khóa 34, Viện NC&PT Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
Nguyễn Hữu Tường, Nguyễn Minh Đời, Hồ Thị Bé Thảo, Nguyễn Thị Ái Xuân,
Nguyễn Ngọc Thạnh và Phạm Hồng Quang, 2012. Thử nghiệm lên men ethanol ở
nhiệt độ cao bằng nấm men chịu nhiệt. Đề tài nghiên cứu khoa học sinh viên cấp Trường, Trường Đại học Cần Thơ.
Nguyễn Lân Dũng, 1999. Vi sinh vật học, Nhà xuất bản Giáo dục.
Nguyễn Thị Ngọc Mai, 2011. Khảo sát khả năng lên men và tuyển chọn nấm men có
khả năng chịu cồn cao. Luận văn tốt nghiệp Đại học, Trường Đại học Cần Thơ.
Nguyễn Vân Anh, Phạm Minh Tú, Hứa Hữu Danh, Nguyễn Bình Duy Anh, Huỳnh
Xuân Phong và Ngô Thị Phương Dung, 2011. Phân lập và tuyển chọn các dòng
nấm men chịu nhiệt có khả năng lên men ethanol mạnh. Đề tài nghiên cứu khoa
học sinh viên cấp Trường, Trường Đại học Cần Thơ.
Tiếng Anh
Alfenore, S., C. Molina, S.E. Guillouet, J.L. Uribelarrea, G. Goma and L.Benbadis.
2002. Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae
by a vitamin feeding strategy during fed-batch process. Applied Microbiology and Biotechnology. 60: 67-72.
Anderson, P. J., K. McNeil, and K. Watson. 1986. High-efficiency carbohydrate fermentation to ethanol at temperatures above 40 degrees C by Kluyveromyces
marxianus var. marxianus isolated from sugar mills. Appl. Environ. Microbiol. 51: 1314-1320.
Arthur, H. and K. Watson. 1976. Thermal adaptation in yeast: growth temperatures, membrane lipid, and cytochrome composition of psychrophilic, mesophilic, and thermophilic yeasts. Journal of Bacteriology. 128(1): 58-68.
Banat, I. M., P. Nigram, and R. Marchant.1992. Isolation of thermotolerant, fermentative yeasts growing at 52ºC and producing ethanol at 45ºC and 50ºC.
World J. Microbiol. Biotechnol. 8: 259-263.
Barron, N., R. Marchant, L.McHale and A.P. McHale. 1994. Growth of thermotolerant
ethanol-producing strain of Kluyveromyces marxianus on cellobiose-containing
media. Biotechnology Letter. 16: 625-630.
Brady, D., R. Marchant, L. McHale and A.P McHale. 1994. Production of ethanol by
thermotolerant yeast, Kluyveromyces marxianus IMB3 during growth on lactose-
containing media. Biotechnology Letter. 16: 737-740.
Brady, D., R. Marchant, L. McHale and A.P McHale. 1995. Isolation and partial characterization of β-galactosidase activity produced by a thermotolerant strain of
Kluyveromyces marxianus during growth on lactose-containing media. Enzyme and Microbial Technology. 17: 696-699.
Dung, M., N.T.P., P. Thanonkeo and H.X.Phong. 2012. Screening useful isolated yeasts for ethanol fermentation at high temperature. International Journal of Applied Sience and Technology. 2:68.
Fleming, M., N. Barron, R. Marchant, L. McHale and A.P. McHale. 1993. Studies on
the growth of a thermotolerant yeast, Kluyveromyces marxianus IMB3 during
growth on lactose-containing media. Biotechnology Letter. 16: 1195-1198.
Ghorbani, F., H. Younesi, A. E. Sri and G. Najafpour. 2011. Cane molasses fermentation for continuous ethanol production in an immobilized cells reactor by Saccharomyces cerevisiae. Renewable Energy, 36 (2): 503-509.
Hacking, A.J., I.W.F Taylor and C.M. Hanas. 1984. Selection of yeast able to produce
Helena da Cruz, S., M. Batistote and J.K. Ernandes, 2003. Effect of sugar catabolite repression in correlation with the structure complexity of nitrogen source on yeast
growth and fermentation. Journal of Industrial and Brewing.109(4): 349-355.
Hughes, D. B., N. J. Tudroszen, and C. J. Moye. 1984. The effect of temperature on the kinetics of ethanol production by a thermotolerant strain of Kluyveromyces marxianus. Biotechnol. Lett. 6: 1-6.
Jacobson, G.K. and S.O. Jolly. 1989. Yeast, molds and algae. Biotechnology.7: 279- 314.
Kurtzman, C.P. and J. Piskur. 2006. Taxonomy and phylogenetic diversity among the yeasts. Topics in Current Genetic. 15: 29-46.
Lee, J.H., D. Williamson and P.L. Rogers. 1980. The effect of temperature on the
kinetics of ethanol production by Saccharomyces uvarum. Biotechnology Letter.
2(4): 141-146.
McCracken, L.D. and C.S. Gong, C.S. 1982. Fermentation of cellulose and
hemicellulose carbohydrates by thermotolerant yeasts. Biotechnology
Bioengineering. 25: 253-300.
Navarro, J.M. and G. Durand. 1978. Alcohol fermentation: effect of temperature on
ethanol accumulation within yeast cells. Annals of Microbiology 129B: 215-224.
Nonklang S., B.M. A. Abdel-Banat, K. Cha-aim, N. Moonjai, H. Hoshida, S. Limtong, M. Yamada, and R. Akada. 2008. High-temperature ethanol fermentation and
transformation with linear DNA in the thermotolerant yeast Kluyveromyces
marxianus DMKU3-1042. Applied and Environmental Microbiology. 74(24): 7514-7521.
Norr, A.A., A. Hameed, K.P. Bhatti, and S.A. Tunio. 2003. Bio-ethanol fermentation by the bioconversion of sugar from dates by Saccharomyces cerevisiae strain
ASN-3 and HA-4. Biotechnology. 2(1): 8-17.
Pecota, D.C., V. Rajgarhia, and N. A. Da Silva. 2007. Sequential gene integration for
the engineering of Kluyveromyces marxianus. J. Biotechnol.127: 408-416.
Roehr, M. 2001. The Biotechnology of Ethanol: Classical and Future Applications. Chichester: Wiley-VCH, pp.232.
Sripiromrak, A. 2006. Isolation and characterization of thermotolerant yeast for ethanol production. Thesis of Master of Science in Biotechnology. Suranaree University of Technology, Thailand.
Torija, M.J., N. Rozes, M. Poblet, J.M. Guillamon, and A. Mas. (2003). Effects of fermentation temperature on the strain population of Saccharomyces cerevisiae. International Journal of Food Microbiology. 80: 47-53.
Wang, Z.X., J. Zhuge, H. Fang and B.A. Prior. (2001). Glycerol production by microbial fermentation: A review. Biotechnology Advances. 19: 201-223.
Trang Web http://techmart.cesti.gov.vn/images/image/2011/30_6_11/30_06_11_1.JPG, ngày 29/07/2013. http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/nammen01.htm, ngày 29/07/2013. http://www.visualphotos.com/image/1x3745113/kluyveromyces_lactis_yeast_cell_kluy veromyces, ngày 29/07/2013. http://www.deskuenvis.nic.in/fungi.htm, ngày 29/07/2013. http://microbewiki.kenyon.edu/images/9/9a/Saccromyces.jpg, ngày 29/07/2013. http://lanisisland.com/wp-content/uploads/2011/10/candida.jpg, ngày 29/07/2013.
PHỤ LỤC ------
Phụ lục 1. Hình ảnh các thiết bị sử dụng trong phòng thí nghiệm
Hình 14. Cân phân tích Hình 15. Hệ thống chưng cất rượu
Hình 16. Khúc xạ kế Hình 17. Kính hiển vi
Hình 19. pH kế Hình 20. Nồi khử trùng nhiệt ướt
Hình 21. Water bath Hình 22. Tủ ủ
Phụ lục 2. Số liệu kết quả thí nghiệm
Bảng 6. Kết quả khảo sát lên men đường glucose
Chiều cao cột khí CO2 (mm) Dòng nấm men Lần lặp 4 giờ 8 giờ 12 giờ 16 giờ 20 giờ 24 giờ Y102 1 6 24 30 30 30 30 Y102 2 8 30 30 30 30 30 Y102 3 8 25 30 30 30 30 K2-4 1 21 30 30 30 30 30 K2-4 2 17 30 30 30 30 30