Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lactobacillus SP có khả năng ức chế vi khuẩn helicobacter pylori

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẶNG ĐÌNH HIỆP PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTOBACILLUS SP CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ VI KHUẨN HELICOBACTER PYLORI Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã số: 60 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP.Hồ Chí Minh, tháng năm 2018 CÔNG TRÌNH ĐƯC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA –ĐHQG-TPHCM Cán hướng dẫn khoa học PGS.TS Nguyễn Thúy Hương Cán phản biện PGS.TS Bùi Văn Lệ Cán phản biện TS Võ Đình Lệ Tâm Luận văn thạc só bảo vệ trường Đại Học Bách Khoa-ĐHQG Tp.HCM, ngày 21 tháng năm 2018 Thành phần hội đồng đánh giá luận văn gồm: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng PGS.TS Bùi Văn Lệ PGS.TS Lê Thị Thủy Tiên TS Võ Đình Lệ Tâm TS Hoàng Anh Hoàng Xác nhận chủ tịch hội đồng đánh giá luận văn trưởng khoa quản lý chuyên ngành sau luận văn sữa chữa CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng GS.TS Phan Thanh Sơn Nam ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Đặng Đình Hiệp MSHV: 7140860 Ngày, tháng, năm sinh: 1/4/1983 Nơi sinh: Hồ Chí Minh Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã số: 60 42 02 01 I TÊN ĐỀ TÀI: Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus sp có khả ức chế vi khuẩn Helicobacter pylori II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: x Phân lập vi khuẩn Lactobacillus từ nguồn lên men Việt nam x Kiểm tra khả ức chế chủng Lactobacillus phân lập với H.pylori, chọn chủng có khả kháng H.pylori cao x Khảo sát số hoạt tính probiotic chủng tuyển chọn x Định danh chủng tuyển chọn phương pháp 16S rDNA x Thử nghiệm tạo chế phẩm probiotic chủng tuyển chọn bước đầu đánh giá độ ổn định chế phẩm III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ 27/2/2017 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ 30/5/2018 V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS.TS Nguyễn Thúy Hương Tp HCM, ngày 31 tháng năm 2018 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Họ tên chữ ký) CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO (Họ tên chữ ký) TRƯỞNG KHOA (Họ tên chữ ký) LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng cám ơn sâu sắc đến tất thầy giáo, cô giáo, người cho kiến thức khuyến khích suốt hai năm học cao học trường đại học Bách Khoa Hồ Chí Minh Đặc biệt, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thúy Hương, Người hỗ trợ, động viên, sửa cho lời khuyên quý giá suốt trình làm đề tài cao học Hơn nữa, cám ơn đến tất thầy cô, nhân viên phòng thí nghiệm, giúp đỡ cho phép sử dụng trang thiết bị phòng thí nghiệm để làm đề tài nghiên cứu Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến bố mẹ, gia đình quan khuyến khích, động viên tạo điều kiện tốt cho hoàn thành đề tài nghiên cứu TÓM TẮT Viêm loét dày tá tràng vấn đề tiêu hóa thường gặp nhất, nguyên nhân lớp nhày bị suy yếu, acid bắt đầu công niêm mạc dày dẫn đến viêm loét gây đau đớn, nóng rát vùng thượng vị Ngày khoa học chứng minh thủ phạm gây tình trạng vi khuẩn H.pylori Phương pháp tiêu diệt H.pylori chủ yếu sử dụng kháng sinh, nhiên trở nên thất bại H.pylori trở nên kháng kháng sinh Vì vậy, việc nghiên cứu sử dụng chế phẩm probiotic để phòng ngừa hỗ trợ điều trị vi khuẩn H.pylori nhà khoa học quan tâm Nghiên cứu thực nhằm phân lập vi khuẩn lactic từ nguồn nguyên liệu lên men Sau phân lập tiến hành khảo sát hoạt tính kháng H.pylori chủng vi khuẩn lactic phân lập, chọn chủng vi khuẩn lactic có tỷ lệ phần trăm kháng H.pylori cao nhất, sau tiến hành khảo sát số hoạt tính probiotic điển hình định danh chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn, cuối bước đầu tiến hành thử nghiệm tạo chế phẩm Kết thí nghiệm phân lập 20 chủng vi khuẩn lactic từ số thực phẩm lên men, chọn chủng Lactobacillus plantarum có khả kháng H.pylori mạnh nhất, có tỷ lệ phần trăm ức chế 70,48%, chịu điều kiện cực đoan pH thấp muối mật với nồng độ 0,3% Định hướng tạo chế phẩm, đề tài xác định số thông số trình sấy phun tạo chế phẩm xác định: lưu lượng dịch phun ml/phút, nhiệt độ đầu vào cho trình sấy phun 1000C Qua kết nghiên cứu trên, ta thấy L.plantarum có đặc điểm sinh học phù hợp với vai trò probiotic, sử dụng để làm chế phẩm probiotic kết hợpù với kháng sinh để hỗ trợ ngăn ngừa H.pylori MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN TÓM TẮT LUẬN VĂN MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vi khuaån Helicobacter pylori 1.1.1 Đặc điểm vi khuẩn Helicobacter pylori 1.1.2 Cơ chế gây bệnh Helicobacter pylori 1.1.3 Helicobacter pylori khaùng khaùng sinh 1.1.4 Tổng quan tình hình đề kháng kháng sinh Helicobacter pylori 1.2.Vi khuẩn lactic probiotic 1.2.1 Đặc điểm chung khuẩn lactic 1.2.2 Quaù trình lên men lactic .8 1.2.3 Tiêu chuẩn chọn chủng vi khuẩn lactic sử dụng làm probiotic .9 1.2.4 Cơ chế kháng khuẩn vi khuaån lactic 11 1.2.5 Tổng quan probiotic Lactobacillus chế phẩm probiotic 13 1.3 Tình hình nghiên cứu nước nước 17 Chương 2.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Thời gian địa điểm 19 2.2 Vật liệu thiết bị sử dụng .19 2.3 Thiết kế thí nghiệm 20 2.4 Phương phaùp 21 2.4.1 Thu thập mẫu phân lập vi khuẩn Lactobacillus 22 2.4.2 Khảo sát đặc điểm sinh hoïc 23 2.4.3 Phương pháp nhân giống Helicobacter pylori, Lactobacillus dựng đường cong sinh trưởng Helicobacter pylori 23 2.4.4 Phương pháp khảo sát khả kháng Helicobacter pylori 23 2.4.5 Khaûo sát tỷ lệ % chủng vi khuẩn tuyển chọn với Helicobacter pylori 25 2.4.6 Phương pháp khảo sát hoạt tính probiotic định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn 25 2.4.7 Xác định số lượng tế bào cách đếm số lượng khuẩn lạc .27 2.4.8 Thử nghiệm tạo chế phẩm Lactobacillus plantarum phương pháp sấy phun 28 2.4.9 Phương pháp xử lý số liệu 31 Chương3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .32 3.1 Kết phân lập vi khuẩn Lactobacillus 34 3.2 Xác định đường cong sinh trưởng Helicobacter pylori khảo sát khả ức chế vi khuẩn Lactobacillus với Helicobacter pylori 35 3.3 Khảo sát hoạt tính probiotic chủng tuyển chọn định danh 38 3.4.Thử nghiệm tạo chế phẩm L.plantarum bước đầu đánh giá độ ổn định chế phẩm 42 3.4.1 Ảnh hưởng lưu lượng dịch phun 42 3.4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ sấy phun đầu vào .43 3.4.3 Tạo chế phẩm sấy phun theo dõi chế phẩm 44 3.4.4 Tái khảo sát khả kháng Helicobacter pylori L.plantarum sau tạo chế phẩm phương pháp sấy phun 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHUÏ LUÏC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT H.pylori Helicobacter pylori LAB (lactic acid bacteria) Vi khuaån lactic GRAS (Generally Recognized As safe) Được công nhận chung an toaøn MRS de Man, Rogosa, Sharpe sp (species) Loaøi OAC Omeprazol, Amoxicillin, Clarithromycin OAM Omeprazol, Amoxicillin, Metronidazol DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Vi khuẩn H pylori Hình 1.2: Sơ đồ chế viêm loét dày H.pylori Hình 1.3: Lactobacillus casei Lactobacillus bulgaricus Hình 1.4: Cơ chế kháng khuẩn cuûa bacteriocin 12 Hình 3.1: Đường cong sinh trưởng H.pylori 34 Hình 3.2: Tỷ lệ % ức chế chủng vi khuẩn lactic H.pylori 35 Hình 3.3: Khả kháng vi khuẩn lactic (L3) H.pylori 37 Hình 3.4: Khảo sát tỷ lệ % chủng vi khuẩn tuyển chọn với H.pylori 37 Hình 3.5: Ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng chủng tuyển chọn 39 Hình 3.6: Kết định danh chuûng L3 41 Hình 3.7: Kích thước hạt chế phẩm L.plantarum sau saáy phun 45 Hình 3.8: Hình ảnh chế phẩm L.plantarum sau saáy phun 46 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Tỉ lệ đề kháng kháng sinh H.pylori khu vực khác giới Bảng 1.2: Vi khuẩn probiotic tính an toàn khả lây nhiễm 10 Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái số dòng vi khuẩn lactic phân lập 33 Bảng 3.2: Tóm tắt thông tin chủng giống 42 Baûng 3.3: Ảnh hưởng lưu lượng dịch phun 43 Bảng 3.4: Ảnh hưởng nhiệt độ sấy phun đầu vào 44 Bảng 3.5: Theo dõi chế phẩm 47 MỞ ĐẦU Viêm loét dày tá tràng vấn đề tiêu hóa thường gặp Thông thường, lớp niêm mạc bên dày ruột non bao phủ lớp chất nhày, bảo vệ niêm mạc tránh tác động acid dịch vị Khi lớp nhày bị suy yếu, acid bắt đầu công niêm mạc dày dẫn đến viêm loét gây đau đớn, nóng rát vùng thượng vị Ngày khoa học chứng minh thủ phạm gây tình trạng vi khuẩn Helicobacter pylori Vi khuẩn tiết độc tố làm phá hủy lớp nhày bảo vệ niêm mạc gây viêm loét [1, 2] Phương pháp tiêu diệt vi khuẩn H pylori chủ yếu sử dụng kháng sinh, nhiên gặp nhiều thất bại H.pylori trở nên kháng với nhiều loại kháng sinh Vì vậy, việc nghiên cứu sử dụng chế phẩm sinh học probiotic bacteriocin để ức chế vi khuẩn H.pylori nhà khoa học quan tâm [20] Probiotic vi sinh vật sống mà tiêu thụ với lượng thích hợp mang lại tác động có ích cho vật chủ Bacteriocin khác với hầu hết kháng sinh dùng y học chúng phân tử protein nên dễ bị phân hủy enzyme protease hệ tiêu hóa Bacteriocin tạo loài Lactobacillus có khả ức chế nhiều loại vi khuẩn gây bệnh [13] Tuy nhiên, chưa có nhiềú nghiên cứu sử dụng Lactobacillus sp hay bacteriocin từ Lactobacillus sp để ức chế lại H pylori Đề tài “Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus sp có khả ức chế vi khuẩn Helicobacter pylori” nhằm mục tiêu phân lập, tuyển chọn dòng Lactobacillus sp có khả ức chế lại vi khuẩn H.pylori để thử nghiệm tạo chế phẩm sinh học ức chế H.pylori gây bệnh dày Nội dung nghiên cứu gồm: - Phân lập vi khuẩn Lactobacillus từ nguồn lên men Việt nam - Kiểm tra khả ức chế chủng Lactobacillus phân lập với H.pylori, chọn chủng có khả kháng H.pylori cao - Khảo sát số hoạt tính probiotic chủng tuyển chọn Hình 3.6 Kết định danh chủng L3 Chủng vi khuẩn tuyển chọn đem định danh phương pháp giải trình tự gen 16S rDNA tra cứu blast search cho kết Lactobacillus plantarum với độ tương đồng 100% Trình tự 16S rDNA chủng tuyển chọn (L3) thể hình 3.6 kết phân tích thể phần phụ lục (D) Chủng vi khuẩn tuyển chọn định danh Lactobacillus plantarum tìm thấy nhiều sản phẩm lên men Việt nam Lactobacillus plantarum phân lập có khả ức chế vi khuẩn H.pylori có hoạt tính probiotic Thông tin chủng giống Tóm tắt thông tin chủng Lactobacillus plantarum thể bảng 3.2 Chủng bảo quản, lưu trữ môn Công nghệ sinh học, trường Đại học Bách Khoa 41 Bảng 3.2 Tóm tắt thông tin chủng giống Tên chủng Hình ảnh đại thể, vi thể Đặc điểm Môi trường nhân Môi trường giữ sinh hóa giống giống L.plantarum Catalase âm MRS: Glycerol: 10g/L phân lập Gram dương Peptone:10g Lactose: 5g/L từ dưa chua Không di Glucose: 20g động Cao thịt: 5g Vi hiếu khí Caonấm men:5g Cao naám men: 0.5g/L Natri acetate: 2g Tween 80: 1ml MgSO4.7H2O:0.2g MnSO4.4H2O:0.2g Khuẩn lạc có hình tròn, KH2PO4: 2g trắng nhỏ, tế bào hình que pH6.5 ngắn, kết chuỗi 3.4 Thử nghiệm tạo chế phẩm L.plantarum bước đầu đánh giá độ ổn định chế phẩm Sau định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn Lactobacillus plantarum, với định hướng tiến hành tạo chế phẩm bước đầu đánh giá độ ổn định chế phẩm L.plantarum Trong trình tạo chế phẩm phương pháp sấy phun, yếu tố độ ẩm, thời gian sấy, nhiệt độ sấy ảnh hưởng trực tiếp chất lượng sản phẩm Trong sấy phun, lưu lượng dịch phun ảnh hưởng lớn đến mật độ độ ẩm chế phẩm L.plantarum Vì vậy, ảnh hưởng lưu lượng dịch phun khảo sát thí nghiệm sau 42 3.4.1 Ảnh hưởng lưu lượng dịch phun Lưu lượng dịch phun có ảnh hưởng lớn đến lưu lượng dòng nhập liệu, suất thiết bị nhiệt độ không khí đầu Lưu lượng dịch phun tăng đồng nghóa với thời gian lưu vật liệu sấy buồng sấy giảm, lượng nước thoát từ dịch huyền phù vi khuẩn làm độ ẩm tăng Bảng 3.3 Ảnh hưởng lưu lượng dòch phun Lưulượng dịchphun 4,5 5,5 6,5 10,21±0,01a 10,85±0,01b 10,96±0,05b 11,32±0,05c 11,43±0,02c 6,01±0,04a 6,71±0,03a 9,15±0,03b 10,86±0,02c 12,01±0,01d (ml/phuùt) Mậtđộ L.plantarum (log CFU/g) Độ ẩm (%) Kết bảng 3.3 cho thấy, lưu lượng dịch phun ảnh hưởng lớn đến mật độ L.plantarum độ ẩm chế phẩm L.plantarum Khi lưu lượng dịch phun thấp, sản phẩm sau sấy có độ ẩm thấp, mật độ L.plantarum không cao so với lưu lượng dịch phun cao Nguyên nhân thời gian lưu dịch huyền phù vi khuẩn L.plantarum buồng sấy lâu, mật độ L.plantarum bị giảm tác động nhiệt độ buồng sấy Lưu lượng dịch phun tăng lên, mật độ L.plantarum tăng lên thời gian lưu dịch huyền phù vi khuẩn L.planatarum buồng sấy giảm làm giảm tác động nhiệt độ lên L.plantarum Lưu lượng dịch phun tiếp tục tăng, thời gian lưu nguyên liệu buồng sấy giảm, sản phẩm sau sấy có độ ẩm tăng lên mật độ L.plantarum tăng lên Vì lưu lượng dịch phun ml/phút thích hợp cho trình sấy phun dịch huyền phù L.plantarum Mật độ L.plantarum lưu lượng dịch phun 5ml/phút sau sấy cao nhiên không cao mật độ L.plantarum lưu lượng dịch 43 phun 5,5; ml/phút Mặc dù vậy, lưu lượng dịch phun 5ml/phút chế phẩm có độ ẩm thấp nên L.plantarum có khả bảo quản tốt có hoạt hóa cao chế phẩm (xét theo tiêu chuẩn bột chế phẩm sinh học với độ ẩm phải nhỏ 7%) Vì vậy, lưu lượng dịch phun ml/phút chọn 3.4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đầu vào Trong trình sấy phun, nhiệt độ ảnh hưởng đến chế phẩm, nhiệt độ cao làm giảm mật độ sống vi khuẩn độ ẩm chế phẩm Vì vậy, ảnh hưởng yếu tố nhiệt độ trình sấy phun khảo sát kết thể bảng 3.4 Bảng 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ sấy phun đầu vào Nhiệt độ (oC) 90 100 110 120 130 11,52±0,11a 11,45±0,06a 10,84±0,02b 9,30±0,01c 8,12±0,01d 11,2 ± 0,04a 6,72± 0,02b 6,01±0,04b 5,95±0,05c 5,78±0,02d Mậtñộ L.plantarum (log CFU/g) Độ ẩm (%) Nhiệt độ không khí sấy thấp hay cao bất lợi cho trình sấy phun dịch huyền phù L.plantarum Kết bảng 3.4 cho thấy, nhiệt độ không khí sấy có ảnh hưởng rõ rệt đến mật độ L.plantarum độ ẩm sản phẩm Nhiệt độ không khí sấy thấp, độ ẩm sản phẩm cao mật độ L.plantarum cao bị ảnh hưởng nhiệt độ Nhiệt độ không khí sấy tăng làm độ ẩm sản phẩm giảm mật độ L.plantarum giảm chịu tác động nhiệt độ Khi nhiệt độ không khí sấy tăng lên 1300C, mật độ L.plantarum giảm xuống nhanh chóng bị tiêu diệt nhiệt độ cao độ ẩm sản phẩm giảm xuống Vì vậy, nhiệt độâ không khí sấy phun 1000C thích hợp cho trình sấy phun dịch huyền phù L.plantarum mật độ L.plantarum cao độ ẩm chế phẩm thích hợp theo nhiều nghiên cứu [31] độ ẩm mẫu sấy phun phải nhỏ 7% để 44 đảm bảo tỷ lệ sống sót vi khuẩn chế phẩm Vì vậy, mẫu sấy phun có độ ẩm lớn 6,72 % đạt yêu cầu 3.4.3 Chế phẩm sấy phun Sau sấy phun, chế phẩm L.plantarum dạng hạt, tế bào L.plantarum sau sấy đóng gói điều kiện vô trùng túi hút chân không có mặt oxi nhanh chóng làm hỏng sản phẩm Hình 3.7.Kích thước hạt chế phẩm L.plantarum sau sấy phun Căn vào hình 3.7, ta thấy hạt chế phẩm L.plantarum có kích thước sau: kích thước hạt chiếm 80% hỗn hợp 10,30 µm, kích thước hạt chiếm 20% hỗn hợp 2,85 µm kích thước hạt trung bình 6,2 µm Kích thước hạt đạt yêu cầu theo tiêu chất lượng nhà sản xuất kích thước hạt từ 1-2mm 45 Hình3.8 Hình ảnh chế phẩm L.plantarum sau sấy phun 3.4.4 Theo dõi chế phẩm đánh giá hoạt tính kháng H.pylori Các chế phẩm tạo thành theo dõi thời gian bảo quản từ đến 12 tuần ởđđiều kiện bảo quản nhiệt độ phòng, túi hút chân không 46 Bảng 3.5.Theo dõi chế phẩm Thời gian (tuần) Mật ñộ L.plantarum Độ ẩm (%) (log CFU/g) Ban ñầu 11,45a 6,70a 11,40a 6,72ab 11,42a 6,68ab 11,19a 6,70a 10,88ab 6,60ab 10,80ab 6.70a 10,80ab 6,65ab 10 10,55ab 6,70a 11 10,18ab 6,75ab 12 9,95ab 6,70a Sản phẩm sau sấy phun có độ ẩm khoảng 6,7%, bảo quản nhiệt độ 2-50C bình bảo quản túi hút chân không Mật độ L.plantarum không thay đổi khác biệt có ý nghóa so với mật độ L.plantarum ban đầu khoảng tuần đầu Từ tuần đến tuần 11, mật độ L.plantarum có giảm so với ban đầu không đáng kể, tuần 12 mật đô L.plantarum giảm chậm so với mật độ L.plantarum ban đầu, mật độ cao Trong 12 tuần khảo sát, mật độ L.plantarum đạt 9,95 (logCFU/g) tuần thứ 12 Tái khảo sát khả kháng H.pylori L.plantarum sau tạo chế phẩm phương pháp sấy phun 12 tuần bảo quản L.plantarum sau sấy phun tạo chế phẩm, tiến hành thử hoạt tính kháng khuẩn L.plantarum H.pylori để kiểm tra hoạt tính đối kháng L.plantarum H.pylori sau tạo thành chế phẩm 47 Hoạt tính kháng khuẩn thực vi khuẩn H.pylori thông qua phương pháp đục lỗ thạch đo vòng kháng khuẩn sinh Kết L.plantarum có khả kháng H.pylori sau tạo thành chế phẩm sau tạo chế phẩm 12 tuần, hai tạo vòng kháng khuẩn với đường kính 12mm Điều chứng tỏ, L.plantarum không bị hoạt tính kháng H.pylori sau tạo chế phẩm phương pháp sấy phun trình bảo quản chế phẩm Vì vậy, sau trình sấy phun tái kiểm tra khả kháng H.pylori hoạt tính bảo toàn Kết nghiên cứu phù hợp với số nghiên cứu giới, L.plantarum có khả ức chế H.pylori [29] Khả kháng khuẩn vi khuẩn Lactobacillus plantarum khảo sát qua nhiều nghiên cứu, bên cạnh kháng H.pylori, Lactobacillus plantarum có khả kháng nhiều loại vi khuẩn khác Lactobacillus plantarum từ sản phẩm cá lên men truyền thống Malaysia có khả kháng lại vi khuẩn gây bệnh Salmonella Sản phẩm dưa chuột lên men chủng L.plantarum điều kiện nồng độ muối cao (4-7%), ức chế phát triển chủng chủng vi khuẩn gây bệnh ứ mặn 48 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ thực phẩm lên men sưu tập vi khuẩn lactic lưu trữ môn Công Nghệ Sinh Học đề tài tuyển chọn định danh chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum có hoạt tính probiotic có khả ức chế H.pylori với tỷ lệ phần trăm ức chế 70,48% Thử nghiệm tạo chế phẩm L.plantarum xác định thông số sấy phun: - Lưu lượng dịch phun L.plantarum ml/phút - Nhiệt độ đầu vào cho trình sấy phun L.plantarum 100oC Chế phẩm có mật độ 9,95 logCFU/g, ẩm độ 6,7% bảo toàn hoạt tính kháng H.pylori sau 12 tuần bảo quản nhiệt độ phòng Kiến nghị - Thực phân lập thêm nhiều chủng vi khuẩn lactic từ nhiều nguồn khác tự nhiên, để chọn vi khuẩn lactic có khả kháng H.pylori cao - Khảo sát thêm số hoạt tính probiotic khác L.plantarum khả kháng oxi hóa, khả kháng khuẩn số chủng vi khuẩn gây bệnh khác, đặc biệt có khả kháng kháng sinh, kết hợp chế phẩm L.plantarum với kháng sinh để ngăn ngừa H.pylori hiệu - Thăm dò khả ứng dụng chế phẩm qua giai đoạn (in vivo) 49 50 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Hoàng Trọng Thắng (2007) Helicobacter pylori bệnh lý liên quan đến dày tá tràng Tạp chí khoa học tiêu hóa Việt nam, 2(6), tr 362-369 Nguyễn Ngọc Lanh (1999) Cơ chế bệnh sinh loét dày tá tràng Bài giảng sau đại học, môn miễn dịch- sinh lý bệnh, trường đại học Y Hà Nội Bùi Hữu Hoàng (2009) Cập nhật thông tin Helicobacter pylori Tạp chí khoa học tiêu hóa Việt nam, 4(17), tr.1109-1112 Phạm Quang Cử (2008) Helicobacter pylori vi khuẩn gây bệnh dày-tá tràng Nhà xuất Y Học Hà Nội Nguyễn Thị Việt Hà Nguyễn Gia Khánh (2010) Nghiên cứu tình trạng kháng kháng sinh trẻ em bị viêm dày tá tràng có nhiễm Helicobacter pylori bệnh viện nhi trung ương Tạp chí nhi khoa, 3(3&4), tr 211-217 Bùi Xuân Trường (2008) Nhiễm Helicobacter pylori tình hình ung thư dày miền bắc, miền nam Việt nam Tạp chí khoa học tiêu hóa Việt nam, 3(13), tr 822 Nguyễn Ngọc Lanh (1999) Cơ chế bệnh sinh loét dày tá tràng Bài giảng sau đại học, môn miễn dịch- sinh lý bệnh, trường đại học Y Hà Nội Lê Thọ (2014) Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học nhiễm Helicobacter pylori trẻ em vùng Tây Nguyên, Việt nam Luận án tiến só y học, đại học Y Hà Nội Kiều Hữu Ảnh (1999) Giáo trình vi sinh vật học công nghiệp Nhà xuất khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr 100 – 108 10 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1997) Giáo trình vi sinh vật học Nhà xuất giáo dục, tr 224-230 11 Trần Thị Mỹ Trang (2006) Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn lactic để sản xuất chế phẩm probiotic phòng trị bệnh đường ruột cho heo Luận văn thạc sỹ sinh học đại học sư phạm Tp HCM 12 Phạm Hùng Vân (2007) Bacilulus clausii vai trò probiotics điều chị tiêu chảy Hội thảo chuyên đề, hội nhi khoa Tp HCM 13 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1997) Vi sinh vật học Nhà xuất giáo dục, tr 224-230 14 Phạm Minh Hương, Hoàng Trọng Thắng (2007) “Nghiên cứu hiệu liệu pháp kết hợp Esomeprazol- Clarithromycine Amoxicilline điều trị loét dày tá tràng có nhiễm Helicobacter pylori” Tạp chí khoa học tiêu hóa Việt nam 2(5), nhà xuất y học, tr 279-283 15 Nguyễn Minh Tuyển (2004) Quy hoạch thực nghiệm Nhà xuất khoa học kỹ thuật, tr 95-115 16 Nguyễn Văn Thanh, Nguyễn Vũ Tường Vy, Trần Thu Hoa (2007) “Khảo sát khả chịu đựng acid, muối mật kháng sinh số vi sinh vật nguyên liệu sản xuất probiotic đường uống” Tạp chí dược học (378) Tiếng Anh 17 Reenen V., Dicks L M., Chikindas M (1998)."Isolation, purification and partial characterization of plantaricin 423, a bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum" Journal of Applied Microbiology, 84 (6), pp 1131 - 1137 18 Do Thi Bich Thuy, Phan Thi Be, Tran Thi Ai Luyen, (2013) “Study on properties of Lactobacillus plantarum DC2 isolated from traditional lactic fermented product Dua Cai” in Hue City, Vietnam Journal of Biotechnology, 11(1): 145-152 19 Daeschel M A., McKenney M C., McDonald L C (1990) "Bacteriocidal activity of Lactobacillus plantarum C-11" Food fermentation, 7, pp.91 – 98 20 Aiba, Y., N Suzuki, A M Kabir, A Takagi, and Y Koga 1998 “Lactic acidmediated suppression of Helicobacter pylori by the oral administration of Lactobacillus salivarius as a probiotic in a gnotobiotic murine model” Am J Gastroenterol 93:20972101 21 Ta Long et al (2010), “Helicobacter pylori infection, peptic ulcer and gastric cancer in Vietnam” Vietnam Journal of Biotechnology 5(20), 1317-1334 22 Boyanova L and Mitov I (2010) "Geographic map and evolution of primary Helicobacter pylori resistance to antibacterial agents" Expert Rev Anti Infect Ther 8(1), pp 59-70 23 Bahremand S, Nematollahi LR, Fourutan H et al (2006) "Evaluation of triple and quadruple Helicobacter pylori eradication therapies in Iranian children: a randomized clinical trial" Eur J Gastroenterol Hepatol 18(5), pp 511-514 24 Frank J C and Nino M (2002) “The Lactic Acid Bacteria” Microbiology, vol 28, pp 281-370 25 Luc De Vuyst, Fre’dri’c Leroy (2007) “Bacteriocins from lactic acid bacteria: production, purification, and food applications”.J Mol Microbiol Biotechnol, pp.194199 26 Luc De Vuyst, FreP , P driP , Pc Leroy (2007) “Bacteriocins from lactic acid bacteria: production, and food applications” J Mol Microbial Biotechnol, pp 194-199 27 Mishra V.,Prasad D.N.,(2005) “Application of invitro methods for selection of Lactobacillus casei strains as potential probiotics” International Journal of Food Microbiology, vol 103, pp.109-115 28 Naidu A.S, Bidlack W.R, and Clemens R.A.,(1999) “Probiotic spectra of lactic acid bacteria (LAB)” Critical Review in Food Science and Nutrition, pp 13-126 29 Rokka S, Pihlanto A, Korhonen H, Joutsjoki V “In vitro growth inhibition of Helicobacter pylori by lactobacilli belonging to the L.plantarum group” Lett Appl Microbiol 2006; 43:508–513 30 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3360445/ 31 Luc De Vuyst, Fre’dri’c Leroy (2007) “Bacteriocins from lactic acid bacteria: production, purification, and food applications” J Mol Microbiol Biotechnol, pp 194199 32 Laukova A, Strompfova V and Ouwehand A (, 2004) “Adhesion properties of Enterococci to intestinal mucus of different hosts” Veterinary Reseach Communication, vol 28, pp 647-655 33 Marcinakova M., Simonova M., Laukova A., (2004) “Probiotic properties of Enterococcus faecium EF9296 strain isolated from silsge” Bull Vet Inst Pulawy, vol 73, pp 513-519 34 Karimi O and Pena A.S (2003), “Probiotic: isolated bacteria strain or mixture of different strain?” Drug of Today, vol 39, pp 565-597 35 Seppo Salminen (1997) “Lactic acid bacteria” Univerof turku, Finland ... Lactobacillus sp hay bacteriocin từ Lactobacillus sp để ức chế lại H pylori Đề tài ? ?Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus sp có khả ức chế vi khuẩn Helicobacter pylori? ?? nhằm mục tiêu phân lập, tuyển. .. Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus sp có khả ức chế vi khuẩn Helicobacter pylori II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: x Phân lập vi khuẩn Lactobacillus từ nguồn lên men Vi? ??t nam x Kiểm tra khả ức. .. lệ % ức chế chủng ức chế với H .pylori Hình 3.4.Khảo sát tỷ lệ phần trăm chủng vi khuẩn tuyển chọn với H .pylori 37 Hình 3.4 cho thấy, chủng vi khuẩn tuyển chọn (L3) có khả ức chế vi khuẩn H.pylori