Nghiên cứu công nghệ lên men sản xuất hoạt chất AVG từ xạ khuẩn streptomyces sp có khả năng ức chế sinh tổng hợp etylen trong quả tươi

Trong các hoạt chất, Aminoethoxy Vinyl Glycine AVG – một amino acid sinh tổng hợp từ xạ khuẩn Streptomyces có khả năng kết hợp, ức chế hoạt động của enzyme ACC synthase – một enzyme quy

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:

“NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ LÊN MEN SẢN XUẤT HOẠT CHẤT

AVG TỪ XẠ KHUẨN STREPTOMYCES SP CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ

SINH TỔNG HỢP ETYLEN TRONG QUẢ TƯƠI”

Giáo viên hướng dẫn: TH.S NGUYỄN VĂN NGUYỆN

Sinh viên thực hiện : LƯƠNG THỊ HỒNG

Lớp : CNSH -1201

Hà Nội, năm 2016

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận tốt nghiệp này được thực hiện tại Bộ môn Nghiên cứu Công nghệ sinh học sau thu hoạch- Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch dưới sự hướng dẫn của ThS Nguyễn Văn Nguyện

Với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS Nguyễn Văn Nguyện, người đã định hướng, giúp đỡ, chỉ bảo tận tình cho tôi trong quá trình hoàn thành khóa luận này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể cán bộ công nhân viên làm việc tại Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch đã luôn tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực tập và thực hiện khóa luận này

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học- Viện Đại học Mở Hà Nội, đã giảng dạy và truyền đạt những kiến thức quý giá trong suốt thời gian tôi học tập tại trường

Cuối cùng tôi xin gửi tới gia đình, bạn bè tôi, những người đã luôn động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận này lời cảm ơn chân thành

Hà Nội, ngày… tháng năm 2016 Người thực hiện

Lương Thị Hồng

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG i

DANH MỤC HÌNH ii

MỞ ĐẦU 1

1.1 Xạ khuẩn Streptomyces.sp 4

1.1.1 Đặc điểm của Streptomyces.sp 4

1.1.1.1 Đặc điểm hình thái 4

1.1.1.2 Cấu trúc tế bào và trao đổi chất 5

1.1.2 Vòng đời 6

1.1.3 Đặc điểm sinh lí, sinh hóa 6

1.1.4 Yêu cầu dinh dưỡng và điều kiện phát triển của Streptomyces.sp 8

1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men sinh tổng hợp các hợp chất amino acid của chủng Streptomyces sp 8

1.2.1 Ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng đến sinh trưởng và tích lũy các sản phẩm amino acid của chủng Streptomyces sp 8

1.2.1.1 Ảnh hưởng của nguồn Carbon 8

1.2.1.2 Ảnh hưởng của nguồn Nitơ 10

1.2.1.3 Ảnh hưởng của nguồn thức ăn khoáng 12

1.2.1.4 Một số môi trường dinh dưỡng thích hợp cho lên men sinh tổng hợp các hoạt chất từ chủng xạ khuẩn Streptomyces.sp 16

1.2.2 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng và tích lũy các sản phẩm amino acid của chủng Streptomyces.sp 18

1.2.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 18

1.2.2.2 Ảnh hưởng của pH 19

1.2.2.3 Nhu cầu về oxy và sự thông khí trong quá trình lên men 20 1.2.2.4 Thời gian nuôi cấy thích hợp cho lên men sản xuất các hợp chất amino

1.3 Công nghệ lên men sản xuất AVG từ chủng Streptomyces sp 22

1.3.1 Một số thông tin cơ bản về hoạt chất AVG 22

1.3.1.1 Lịch sử phát hiện 22

1.3.1.2 Một số thông tin cơ bản của hoạt chất AVG 24

1.3.2 Công nghệ lên men sản xuất chế phẩm AVG từ xạ khuẩn 25

Streptomyces sp 25

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 Vật liệu 27

2.1.1 Đối tượng 27

2.1.2 Môi trường 27

2.1.3 Hóa chất 27

2.1.4 Thiết bị và dụng cụ 27

2.2 Phương pháp nghiên cứu 28

2.2.1 Các phương pháp chung 28

2.2.1.1 Chuẩn bị dịch lên men cho kiểm tra hoạt tính AVG 28

2.2.1.2 Xác định hàm lượng sinh khối khô 29

2.2.1.3 Định tính bằng sắc ký bản mỏng (TLC): 29

2.2.1.4 Định lượng hoạt chất AVG trong dịch lên men bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 30

2.2.2 Bố trí thí nghiệm 31

PHẦN 3: KẾT QUẢ 34

3.1 Xác định môi trường lên men thích hợp cho sản xuất AVG 34

3.1.1 Xác định nguồn Carbon thích hợp cho quá trình lên men sản xuất AVG từ chủng Streptomyces sp.S6 34

3.1.2 Xác định nguồn Nitơ thích hợp cho quá trình lên men sản xuất AVG từ chủng Streptomyces sp S6 36

3.1.2.1 Nguồn Nitơ ảnh hưởng đến sinh trưởng của chủng Streptomyces sp S6. 36

3.1.2.2 Nguồn Nitơ đến khả năng sinh tổng hợp AVG của chủng Streptomyces

sp S6 37

3.1.3 Ảnh hưởng của nguồn chất khoáng đến sinh trưởng và tổng hợp AVG của chủng Streptomyces sp S6 37

3.1.3.1 Ảnh hưởng của các nguồn chất khoáng 37

3.1.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ FeSO4 39

3.1.3.3 Ảnh hưởng của nồng độ MnCl2 40

3.2 Xác định quy trình công nghệ lên men thích hợp cho sản xuất AVG từ chủng Streptomyces sp.S6 42

3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng và sinh tổng hợp AVG của chủng Streptomyces sp S6 42

3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của chủng Streptomyces sp S6 43

3.2.3 Ảnh hưởng của độ oxy hòa tan đến khả năng sinh tổng hợp AVG của chủng Streptomyces sp.S6 45

3.2.4 Xác định thời gian lên men thích hợp cho sinh tổng hợp AVG của chủng Streptomyces sp.S6 46

KẾT LUẬN 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Nguồn C được vi sinh vật sử dụng 9

Bảng 1.2 : Nguồn N được vi sinh vật sử dụng 10

Bảng 1.3 : Muối vô cơ và chức năng sinh lý của chúng 13

Bảng 1.4: Tác dụng sinh lý của nguyên tố vi lượng 15

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của nguồn C đến sinh trưởng 34

Bảng 3.2: Ảnh hưởng của nguồn Nitơ đến khả năng sinh tổng hợp AVG của chủng Streptomyces sp S6 37

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của các nhân tố, muối khoáng đến trưởng và sinh tổng hợp AVG của chủng Streptomyces sp S6 38

Bảng 3.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của chủng Streptomyces sp S6 42

Bảng 3.5: Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của chủng Streptomyces sp S6 44

Bảng 3.6: Khảo sát khoảng thời gian thu hồi thích hợp hoạt chất AVG lên men từ chủng Streptomyces sp.S6 46

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình thái xạ khuẩn Streptomyces 5 Hình 1.2: Khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh cháy lá Erwinia amylovora 23 Hình 1.3 Cấu trúc của hợp chất AVG 24 Hình 3.1: Ảnh hưởng của nguồn Carbon đến sinh tổng hợp AVG của chủng

Streptomyces sp.S6 35

Hình 3.2: Ảnh hưởng của nguồn Nitơ đến sinh trưởng của chủng Streptomyces

sp S6 36 Hình: 3.3: Ảnh hưởng của các nguồn chất khoáng đến sinh tổng hợp AVG 38 Hình 3.4 : Ảnh hưởng của FeSO4 đến sinh trưởng của chủng Streptomyces sp

S6 39 Hình 3.5: Ảnh hưởng của FeSO4 đến sinh tổng hợp AVG của chủng

MỞ ĐẦU

Ở nước ta, sản phẩm trái cây ngày càng đóng vai trò quan trọng đối với nền kinh tế Năm 2010, sản lượng trái cây Việt Nam đạt gần 6,1 triệu tấn,đứng hàng thứ 22 trên thế giới và thứ 8 ở khu vực châu Á, sau Trung Quốc, Ấn Độ, Philippines, Indonesia, Iran, Thái Lan và Pakistan Tuy nhiên hiện nay trong thu hái và bảo quản sau thu hoạch đang gặp rất nhiều khó khăn, nhất là vào chính vụ khi rau quả được thu hoạch ồ ạt khiến giá cả giảm mạnh, tiêu thụ không kịp, trong khi đó khi hết mùa vụ lại không đáp ứng được nhu cầu của người tiêu dùng Theo thống kê, nước ta thiệt hại khoảng 3000 tỉ mỗi năm do hư hỏng nông sản sau thu hoạch Do đó, nhu cầu bảo quản hoa quả tươi lâu đảm bảo an toàn là rất cao

Từ lâu các nghiên cứu đã chỉ ra rằng etylen là một trong những tác nhân kích thích sự chín của quả, sự già hoá của các cơ quan và toàn cây Việc sử dụng các chất chống lại hoạt động của etylen (kháng etylen) sẽ có tác dụng làm chậm

sự chín và già hóa của quả, nhờ đó có thể kéo dài thời gian bảo quản quả tươi sau thu hoạch Rất nhiều chất được ứng dụng để giúp quả chín chậm như các sử dụng các ion kim loại nặng Ag, Ti, Co, Hg, Pd Tuy nhiên tồn dư của các kim loại nặng trong việc bảo quản quả tươi có thể ảnh hưởng xấu đến môi trường và sức khỏe con người Do đó, việc sản xuất ra một hợp chất an toàn, hiệu quả để bảo quản rau quả được rất nhiều nhà khoa học quan tâm Trong các hoạt chất, Aminoethoxy Vinyl Glycine (AVG) – một amino acid sinh tổng hợp từ xạ khuẩn

Streptomyces có khả năng kết hợp, ức chế hoạt động của enzyme ACC synthase –

một enzyme quyết định trên con đường hình thành ehtylene trong quả tươi hiện được ứng dụng rất rộng rãi Ở Việt Nam, AVG được nhập khẩu để sử dụng trong kéo dài thời gian thu hoạch và bảo quản quả tươi dưới tên thương mại là Retain AVG đến nay vẫn được sản xuất bằng quá trình lên men vi sinh vật mà cụ thể

là chủng Streptomyces Trong lên men sản xuất AVG, bên cạnh chủng giống vi

sinh vật thì các yếu tố về môi trường dinh dưỡng (nguồn carbon, nitơ, nguyên tố

khoáng) và các điều kiện lên men (pH, nhiệt độ, oxy…) có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh tổng hợp AVG của chủng vi sinh vật Do đó, để sản xuất được AVG

từ chủng Streptomyces sp với hàm lượng cao, đạt hiệu quả kinh tế cần các thu

hồi sản phẩm là vô cùng cần thiết Nắm bắt được tình hình đó chúng nghiên cứu

để lựa chọn được môi trường dinh dưỡng phù hợp, chi phí thấp và một tập hợp các điều kiện công nghệ được tối ưu hóa như nhiệt độ, pH, độ oxy hòa tan, thời gian thu hồi sản phẩm là vô cùng cần thiết Nắm bắt được tình hình đó chúng tôi

tiến hành nghiên cứu đề tài “ Nghiên cứu công nghệ lên men sản xuất hoạt

chất AVg từ xạ khuẩn Streptomyces sp có khả năng ức chế sinh tổng hợp

etylene trong quả tươi.”

MỤC TIÊU

Xác định được các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men sinh tổng hợp

AVG từ xạ khuẩn Streptomyces sp S6

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng sinh

tổng hợp AVG của chủng Streptomyces sp.S6

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn Cacbon đến khả năng sinh tổng hợp

AVG của chủng Streptomyces sp.S6

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn Nitơ đến khả năng sinh tổng hợp AVG

của chủng Streptomyces sp.S6

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn chất khoáng đến khả năng sinh tổng

hợp AVG của chủng Streptomyces sp.S6

Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện lên men đến khả năng sinh tổng hợp

AVG của chủng Streptomyces sp

- Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh tổng hợp AVG của

chủng Streptomyces sp.S6

- Nghiên cứu ảnh hưởng của độ oxy hòa tan đến khả năng sinh tổng hợp

AVG của chủng Streptomyces sp.S6

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp AVG của

chủng Streptomyces sp.S6

- Nghiên cứu xác định thời gian thu hồi hiệu quả của AVG sản xuất từ

chủng Streptomyces sp.S6

CHƯƠNG I : TỔNG QUAN

1.1 Xạ khuẩn Streptomyces sp

Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi khuẩn nhân thật sống rất phổ

biến trong tự nhiên cũng như trong đất, chúng có nhiều đặc điểm giống với vi khuẩn và khác với nấm mốc như kích thước tế bào nhỏ, thành tế bào không chứa cellulose hay kitin… tuy nhiên xạ khuẩn cũng có nhiều đặc điểm giống với nấm mốc như có hệ sợi khuẩn ty phân nhánh, nhưng ở xạ khuẩn hệ sợi khuẩn ty không có vách ngăn.

Streptomyces là chi lớn nhất của ngành Actinobacteria và là một chi thuộc

nhánh streptomycetaceae, chúng là vi khuẩn Gram dương, có bộ gen với tỉ lệ GC% cao Vi khuẩn này được tìm thấy chủ yếu trong đất và thảm thực vật mục

nát Streptomyces được nghiên cứu rộng rãi và được biết đến nhiều nhất là chi của họ xạ khuẩn Streptomyces thường sống ở đất có vai trò là vi sinh vật phân

hủy rất quan trọng Chủng vi sinh này sản xuất hơn một nửa số thuốc kháng sinh trên thế giới và đó là sản phẩm có giá trị lớn trong lĩnh vực y tế

1.1.1 Đặc điểm của Streptomyces.sp

1.1.1.1 Đặc điểm hình thái

Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh

và không có vách ngăn (chỉ trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử) Hệ sợi xạ khuẩn mảnh hơn của nấm mốc với đường kính thay đổi từ 0,2-2µm, chiều dài có

thể đạt tới vài cm

Kích thước và khối lượng hệ sợi thường không ổn định và phụ thuộc vào điều kiện sinh lý và nuôi cấy Kích thước của hệ sợi xạ khuẩn là một trong những đặc điểm phân biệt khuẩn lạc xạ khuẩn và khuẩn lạc của nấm mốc vì hệ sợi của nấm mốc có đường kính rất lớn, dễ quan sát bằng mắt thường

Khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng tùy thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh

Đường kính mỗi khuẩn lạc chỉ chừng 0,5-2mm nhưng cũng có khuẩn lạc đạt tới đường kính 1cm hoặc lớn hơn

Hình 1.1 Hình thái xạ khuẩn Streptomyces

Theo Procofieva Bengopxkaia (1936), cho rằng khuẩn lạc của xạ khuẩn có

3 lớp: lớp ngoài gồm các sợi bện chặt lại với nhau, lớp trong tương đối xốp hơn,

và lớp giữa có cấu trúc tổ ong

Khuẩn ty trong mỗi lớp có chức năng sinh học khác nhau Các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất như chất kháng sinh, độc tố, enzyme, vitamin, axit hữu cơ có thể được tích lũy trong sinh khối của tế bào xạ khuẩn hay được tiết

ra môi trường

1.1.1.2 Cấu trúc tế bào và trao đổi chất

Streptomyces có cấu trúc giống nấm Nhánh của chúng có sự sắp xếp của

các tế bào hình sợi thành một mạng lưới gọi là sợi nấm Xạ khuẩn thuộc loại vi khuẩn Gram dương nên ngoài yếu tố di truyền trong nhiễm sắc thể còn có các yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể, chúng có thể tự nhân lên được Lederberg

gọi là plasmid Các plasmid đem lại cho tế bào nhiều đặc tính chọn lọc quý giá như có thêm khả năng phân giải một số hợp chất, chống chịu với nhiệt độ bất lợi, chống chịu với các kháng sinh, chuyển gene, sản xuất các chất kháng sinh trong đất và trong môi trường tuyển chọn [24]

Chúng có thể chuyển hóa các hợp chất khác nhau bao gồm:đường, rượu, acid amin, và các hợp chất thơm bằng cách sản xuất các enzyme thủy phân ngoại bào Do gen của chúng lớn nên trao đổi chất của chúng cũng đa dạng, trong đó có hàng trăm nhân tố phiên mã kiểm soát biểu hiện gene, cho phép chúng đáp ứng nhu cầu cụ thể

1.1.2 Vòng đời

Streptomyces có chu kỳ sống phức tạp bao gồm: hình thành các bào tử và

các loại tế bào khác Thông thường, một bào tử nảy mầm trong điều kiện phải có chất nền để tạo ra thực vật hoặc các sợi nấm Điều này bao gồm một mạng lưới các nhánh sợi nấm mọc lên và cắm vào bề mặt để hấp thu được chất dinh dưỡng

Đáng chú ý là vài phân vùng có vách trong bề mặt sợi nấm Kết quả là, nhiều bản sao của bộ gen được chứa trong "một tế bào"

Khi các chất dinh dưỡng đang khan hiếm (hoặc để đáp ứng với các tín hiệu khác), một số sợi nấm bắt đầu phát triển ra khỏi bề mặt và ra ngoài không khí Trong các loại mới của sợi nấm, vách phân vùng được hình thành thường xuyên hơn Đồng thời, các sợi nấm bề mặt bị một quá trình chết tế bào chu kỳ và các sợi chế của nó được tái sử dụng bởi các sợi nấm phát triển Cuối cùng,bào tử hình thành sau quá trình phát triển đầy đủ Mỗi bào tử có chứa một bản sao của

bộ gen

1.1.3 Đặc điểm sinh lí, sinh hóa

Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên, hầu như trong các loại đất đều

có mặt của xạ khuẩn Đa số xạ khuẩn là vi sinh vật hiếu khí, ưa ẩm, một số ít là

xạ khuẩn ưa nhiệt pH phù hợp cho sự phát triển của xạ khuẩn đa số là pH trung

Xạ khuẩn thuộc cơ thể dị dưỡng nên nguồn hidratcacbon mà chúng sử dụng có thể là tinh bột, đường, polysaccharide… nguồn N mà chúng sử dụng bao gồm : muối amon, muối nitrat, protein, pepton, cao ngô…

Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành kháng sinh.Streptomyces là xạ khuẩn được sử dụng để sản xuất phần lớn

các thuốc kháng sinh và thú y, áp dụng trong y học của con người và trong nông nghiệp, cũng như các chất chống ký sinh, chất diệt cỏ, dược chất chuyển hóa hoạt động (ví dụ: Thuốc ức chế miễn dịch) và một số enzym quan trọng trong thực phẩm và một số ngành công nghiệp khác Trong số 8000 kháng sinh hiện nay trên thế giới thì có trên 80% là có nguồn gốc từ xạ khuẩn Kháng sinh ra đời

từ rất sớm như kháng sinh lospomal HA – 92, được tách chiết từ xạ

khuẩn Streptomyces CDRLL – 312 tác dụng ngăn chặn cholesterol, tăng sức đề

kháng đối với các chất độc của chuột, ngoài ra kháng sinh này còn có hoạt tính chống nấm gây bệnh mạnh hay chất kháng sinh yatakemycin được tách chiết từ

xạ khuẩn Streptomyces sp TP – A0356 có khả năng kiềm hãm sự phát triển của

nấm Aspergillus và Candida albicans Các kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn

có tính phổ kháng khá rộng và tính chất chọn lọc Khả năng kháng khuẩn của kháng sinh cũng là một đặc điểm quan trọng để phân loại xạ khuẩn Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời 2 hay nhiều chất kháng sinh có cấu trúc hóa học và có tác dụng tương tự nhau

Ngoài kháng sinh, xạ khuẩn có thể sinh tổng hợp ra rất nhiều hợp chất hóa học như chất khác như enzyme, vitamin, các chất kích thích sinh trưởng… Các

loài xạ khuẩn đáng chú ý như Actomyces olivaceus, Propionibacterium có khả năng sản xuất vitamin B12; xạ khuẩn Streptomyces chrestomyceticus có khả năng sinh tổng hợp tiền vitamin A hay xạ khuẩn Streptomyces olivochromoferus

có khả năng tổng hợp chất kích thích sinh trường IAA

1.1.4 Yêu cầu dinh dưỡng và điều kiện phát triển của Streptomyces.sp

Streptomyces là hiếu khí và chúng cần nguồn cacbon hữu cơ, vô cơ nguồn

nitơ, và các muối khoáng và không cần các vitamin và các yếu tố tăng trưởng

(Lee & Demain 1997) Nhu cầu của Streptomyces đã được điều tra bởi Kutzner

(Kuster & Williams, 1964)

Hầu hết các Streptomyces phát triển ở nhiệt độ 10-370

C (Deeble, Fazeli, Cove, & Baumberg 2005), (James & Edwards, 1989) nhưng có một số ít các loài

như Streptomyces là S.thermovulgaris và S.thermoflavus là chịu nhiệt và phát

triển ở nhiệt độ 45-550

C (Srivibool, Kurakami, Sukchotiratanac, & Tokuyamab,

2004) Streptomycetes mọc ở pH 6,5-8,0 (Cabello, Gonzalez, & Genilloud 2003) Streptomycetes có khả năng chịu hạn dưới dạng bào tử và ít nhạy cảm

(Subbarao 1999) Một số báo cáo mô tả là đất thoát nước tốt (thịt pha cát, đá

vôi) có mật độ Streptomyces nhiều hơn đất sét nặng (Sujatha, RajuB, & Ramana,

2005)

1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men sinh tổng hợp các hợp

chất amino acid của chủng Streptomyces sp

1.2.1 Ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng đến sinh trưởng và tích lũy các sản phẩm amino acid của chủng Streptomyces sp

Theo Rafieenia (2013), các nguồn carbon, nitrogen, oxy, pH, nhiệt độ, ion

và một số các tiền chất có thể ảnh hưởng đến năng lực trao đổi chất của chủng

Streptomyces.sp

1.2.1.1 Ảnh hưởng của nguồn Carbon

Năng lực đồng hoá các nguồn Carbon ở các vi sinh vật khác nhau là không giống nhau Có loài có khả năng sử dụng rộng rãi nhiều nguồn Carbon khác nhau, nhưng có loài khả năng này rất chọn lọc Nguồn Carbon chủ yếu được vi sinh vật sử dụng gồm có đường, acid hữu cơ, rượu, lipid, hydrocarbon, CO2, carbonat

Bảng 1.1: Nguồn C được vi sinh vật sử dụng

Đường glucose, fructose, maltose, saccharose, tinh bột, galactose,

lactose, mannite, cellobiose, cellulose, hemicellulose, chitin

Acid hữu cơ acid lactic, acid citric, acid fumaric, acid béo bậc cao, acid

béo bậc thấp, aminoacid

Hydrocarbon khí thiên nhiên, dầu thô, dầu paraffin

Carbonate NaHCO3, CaCO3, đá phấn

sinh vật Tuy nhiên nguồn carbon này có thể giúp Streptomyces sp sinh trưởng

tốt nhưng chưa chắc đã cho nhiều một sản phẩm mong muốn Sự tăng trưởng nhanh làm tiêu hao nguyên liệu vào sự hình thành tế bào cũng là một nguyên nhân ảnh hưởng tiêu cực đến các hoạt động sinh tổng hợp các hoạt chất (Lounes, Lebrihi, Benslimane, Lefebvre, & Germain, 1996), (Lounes et al., 1996)

Streptomyces sp sử dụng nguồn carbon chọn lọc, thông thường thì nguồn

Carbon tan trong nước là thích hợp đối với Streptomyces sp trong sinh tổng hợp

các hợp chất như axitamin, kháng sinh… Các polysaccharide như tinh bột, glycerol được ghi nhận như là một nguồn C cho khả năng sinh trưởng vừa phải

và thu hồi hoạt chất cao (Jonsbu, McIntyre, & Neilson 2002) Tuy nhiên, một số nghiên cứu trên các nguồn C mới cho thấy khi kết hợp glucose với lactose cho sản xuất tối đa một số hoạt chất trong khi hàm lượng tối thiểu khi sử dụng ribose (Ilić, Konstantinović, Veljković, Savić và Gojgić-Cvijović, 2010; Jonsbu và

cộng sự, 2002) Một số chủng Streptomyces sinh trưởng tốt trên nguồn carbon là

glucose nhưng glucose lại có thể gây ức chế sự hình thành các kháng sinh

β-lactam như Cephamycin C do Streptomyces clavuligerus tổng hợp

1.2.1.2 Ảnh hưởng của nguồn Nitơ

Nguồn Nitơ cung cấp cho vi sinh vật để tổng hợp nên các hợp chất chứa Nitơ trong tế bào Nguồn Nitơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật là NH3

phân giải của protein

Peptone, peptide, aminoacid (một số vi sinh vật tiết men proteinase phân giải protein thành các hợp chất phân tử nhỏ hơn rồi mới hấp thu được vào tế bào)

ammone

NH3, (NH4)2SO4, (dễ được hấp thu)

Các nguồn N khác purine, pyrimidine, urea, amine, amide, cyanide (chỉ

một số nhóm vi sinh vật mới có thể đồng hoá được)

Nguồn Nitơ thường được sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật bao gồm cả

Streptomyces có pepton, bột cá, bột nhộng tằm, bột đậu tương, bột khô lạc, cao

ngô, cao thịt, cao nấm men và một số hợp chất vô cơ như NH4NO3, KNO3, (NH4)2SO4 Streptomyces sử dụng chọn lọc đối với nguồn Nitơ

Trong sử dụng các nguồn N cho sinh tổng hợp các hoạt chất thường có hai khái niệm là Nitơ tốc hiệu (cao ngô) và nguồn Nitơ trì hiệu (khô dầu) Loại Nitơ tốc hiệu là có lợi cho sự sinh trưởng của vi sinh vật, còn loại trì hiệu lại có lợi cho sự hình thành các sản phẩm trao đổi chất Trong sản xuất các hoạt chất, người ta có thể phối hợp sử dụng các nguồn N theo một tỷ lệ nhất định để phối hợp giữa giai đoạn sinh trưởng tạo sinh khối và giai đoạn sinh tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất, nhằm mục tiêu là nâng cao sản lượng sản phẩm trao đổi chất

Các chủng Streptomyces cũng có năng lực hấp thu các nguồn N vô cơ như

muối ammone và nitrate là khá mạnh Ion NH4

+

sau khi được tế bào hấp thu có thể được trực tiếp sử dụng, do đó các nguồn muối ammone được coi là nguồn Nitơ tốc hiệu Còn nitrate sau khi được hấp thụ cần khử thành NH4+ rồi mới được vi sinh vật sử dụng

Một số nghiên cứu cho thấy, loại và nồng độ nguồn N ảnh hưởng rất lớn đến

khả năng sinh tổng hợp các hoạt chất của Streptomyces (Rafieenia, 2013) Như loài Streptomyces coelicolor có thể sử dụng nguồn Nitơ như nitrat cho tăng

trưởng tốt (Vincent W Cochrane and Jean E Conn,1950) Tuy nhiên, một số loài khác không thuận lợi phát triển với nguồn nitrat vì chúng cần tiêu tốn nhiều năng lượng để chuyển nitrat thành dạng khử để sử dụng.Một số nghiên cứu cũng cho thấy rằng tổng hợp kháng sinh liên quan đến loại và nồng độ nguồn nitơ (Rafieenia, 2013) Nguồn nitơ đơn giản và vô cơ thường giảm sản xuất kháng sinh (Young & Kempe, 1985) Nguồn nitơ phức tạp như bột đậu tương, ngô và chiết xuất nấm men có thể là do chúng làm chậm sự phân hủy của các hợp chất

kháng sinh trong môi trường

Một số môi trường thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh từ

Sreptomyces như ISP-4, Gause-I, Gause-II, môi trường A-4, A-4H,A-9 (Porter

và cộng sự ,1995) Theo Sunita Bundale và cộng sự (2015) [ 33], để nghiên cứu

khả năng sinh tổng hợp các chất kháng sinh từ Streptomyces dùng môi trường lên

men cơ bản sau (g/1): glucose-10,0, bột đậu tương-10,0, NaCl-10,0, CaCO3-2,0

1.2.1.3 Ảnh hưởng của nguồn thức ăn khoáng

Các muối vô cơ là nguồn chất dinh dưỡng không thể thiếu đối với

sự sinh trưởng của vi sinh vật nói chung và Streptomyces nói riêng Các chất

khoáng có chức năng sinh lý chủ yếu là: tham gia vào thành phần của các trung tâm hoạt tính ở các enzyme của vi sinh vật, duy trì tính ổn định của kết cấu các đại phân tử và tế bào, điều tiết và duy trì cân bằng áp suất thẩm thấu của tế bào, khống chế điện thế oxy hoá khử của tế bào và là nguồn vật chất sinh năng lượng đối với một số loài vi sinh vật

Bảng 1.3: Muối vô cơ và chức năng sinh lý của chúng Nguyên

S

(NH4)2SO4, MgSO4

Là thành phần của các aminoacid chứa S, một

số vitamin; glutathione có tác dụng điều chỉnh điện thế oxy hoá khử trong tế bào

Mg

MgSO4

Là thành phần trung tâm hoạt tính của enzyme phosphoryl hoá hexose, dehydrogenase của acid isocitric, polymerase của acid nucleic, thành phần của chlorophyll và bacterio-chlorophyll

Ca

CaCl2, Ca(NO3)2

Tạo tính ổn định của một số cofactor, enzyme duy trì, cần cho sự dựng trạng thái cảm thụ của

tế bào

Na

NaCl

Thành phần của hệ thống chuyển vận của tế bào, duy trì áp suất thẩm thấu, duy trì tính ổn định của một số enzyme

Fe

FeS04

Thành phần của sắc tố vi khuẩn và một số enzyme, là vật chất nguồn năng lượng của một

số vi khuẩn sắt, cần thiết để tổng hợp chlorophyll và độc tố vi khuẩn bạch hầu

Photpho bao giờ cũng chiếm tỉ lệ cao nhất trong số các nguyên tố khoáng của tế bào vi sinh vật, nhiều khi P chiếm đến 50% so với tổng số chất khoáng

Để đảm bảo nguồn dinh dưỡng Photpho, thường sử dụng các loại photphat vô

cơ Việc bổ sung photphat ( đặc biệt là photphat kali ) vào các môi trường dinh dưỡng ngoài việc cung cấp P còn giúp tạo ra tính đệm của môi trường Với tỉ lệ thích hợp hỗn hợp K2HPO4 và KH2PO4 có thể tạo ra mức pH ổn định trong khoảng pH= 4,5-8,0 [6]

Lưu huỳnh không những tham gia vào cấu trúc của protein mà còn có vai trò quan trọng trong quá trình oxi hóa khử Việc chuyển nhóm sunphidrin thành nhóm disunphit có vai trò rất lớn trong quá trình chuyển điện tử từ nguyên liệu

hô hấp đến oxi phân tử

Các muối sunphat vô vơ với nguyên tử lưu huỳnh cũng ở trạng thái oxi hóa được cơ thể vi sinh vật đồng hóa rất tốt Một số vi sinh vật có thể dùng tiosunfat làm nguồn thức ăn lưu huỳnh, một số khác lại đòi hỏi các thức ăn chứa lưu huỳnh ở dạng khử ( H2S, xixtin…)

Mg là nguyên tố khoáng được vi sinh vật đòi hỏi khá cao ( 10-3

- 10-4 M) , Magie mang tính chất của một cofactor, tham gia vào nhiều phản ứng enzyme có liên quan đến các quá trình photphoryl hóa

Canxi có vai trò đáng kể trong việc xây dựng các cấu trúc tinh vi của tế bào, chúng rất cần thiết đối với việc hình thành các cấu trúc không gian ổn định của nhiều bào quan như ti thể, riboxom, nhân (Nguyễn Lân Dũng, 2009))

Na và Cl là nguyên tố mà nhiều vi sinh vật yêu cầu với một lượng không nhỏ, nhưng cho đến ngày nay người ta vẫn còn biết rất ít về vai trò sinh lí của chúng

Kali là nguyên tố chiếm tỉ lệ khá lớn trong thành phần khoáng của tế bào

vi sinh vật Kali thường tồn tại ở dạng K+

bên ngoài của cấu trúc tế bào Kali có thể tác dụng như ion các kim loại khác thông qua việc ảnh hưởng đến tính chất hóa keo và hoạt động xúc tác của enzyme

Trong quá trình sinh trưởng vi sinh vật còn cần tới một số nguyên tố vi lượng Những nguyên tố này cũng có vai trò quan trọng mặc dầu chỉ cần với số lượng rất nhỏ, khoảng 10-8

-10-6 mol/ L môi trường nuôi cấy Nguyên tố vi lượng tham gia vào thành phần enzyme và làm hoạt hoá enzyme

Bảng 1.4: Tác dụng sinh lý của nguyên tố vi lượng

Zn Có mặt trong alcohol dehydrogenase, lactodehydrogenase,

phosphatase kiềm, ARNpolymerase, ADNpolymerase

Mn Có mặt trong peroxyd dismutase, carboxylase ciitric

synthetase

Mo Có mặt trong reductase nitrate, nitrogenase, dehydrogenase

formic

Se Có mặt trong reductase glycin, reductase formic

Co Có mặt trong mutase glutamic

Cu Có mặt trong cytochrome oxydase

W Có mặt trong dehydrogenase formic

Br Có mặt trong urease, cần cho sự sinh trưởng của vi khuẩn

hydrogen

Nếu thiếu nguyên tố vi lượng trong quá trình sinh trưởng thì hoạt tính sinh lý của vi sinh vật bị giảm sút, thậm chí ngừng sinh trưởng Bình thường khi nuôi cấy vi sinh vật, người ta thường không cần bổ sung các nguyên tố vi lượng, chúng thường có sẵn trong nước máy, hóa chất dùng làm môi trường, dụng cụ nuôi cấy Chỉ trong những trường hợp đặc biệt mới cần bổ sung nguyên tố vi lượng vào môi trường nuôi cáy vi sinh vật Trong sản xuất các hoạt chất sinh

học từ Streptomyces, các nguyên tố như Mn2+

, Cu2+, Fe2+ thường được bổ sung

để tăng cường sinh tổng hợp và tích lũy các hoạt chất

Các xạ khuẩn Streptomyces có nhu cầu về nguyên tố khoáng rất khác nhau Một số nghiên cứu trên Streptomyces fradiae 3535 cho sản xuất neomycin

cho biết hàm lượng tối ưu của các nguyên tố khoáng trong môi trường sản xuất kháng sinh là Ca: 10,8 mg/ml, Fe: 1,0 mg/ml, Zn: 0,115 mg/ml, K2HPO4 được yêu cầu ở 0,1%, các kim loại Mn, Cu không có bất kì tác dụng nào lên sinh tổng hợp neomycin Khi sử dụng Zn ở liều cao ( lớn hơn 0,23mg/ml) có thể khiến phá

hủy kháng sinh sau 5 ngày lên men [26] Đối với Streptomyces kanamyceticus

ATCC 12.853 thì các nguyên tố Ca, Mn lại không gây ảnh hưởng đến khả năng sản xuất Kanamycin của xạ khuẩn này, Magie sunfat và kali photphat ở nồng độ

0,4g/l và 1,0g/l có lợi cho S kanamyceticus, Fe ở nồng độ 0,25mg/ml, Zn

:0,575mg/ml và Mo: 0,04mg/ml cho tăng trưởng và sinh tổng hợp kháng sinh cực đại Các nguyên tố Cu, Co,Ni, V có thể ức chế sự sinh trưởng của xạ khuẩn này và sự hình thành kháng sinh( Ketaki Basak and S K Majumdar, 1975)

Nhìn chung đối với chủng Streptomyces sp các khoáng chất như phospho

(Martin, 2004), kali, sắt, kẽm và mangan cấp ở mức độ vết (liều lượng nhỏ) làm tăng mức độ sản xuất kháng sinh (Gesheva, Ivanova, & Genava 2005)

1.2.1.4 Một số môi trường dinh dưỡng thích hợp cho lên men sinh tổng hợp

các hoạt chất từ chủng xạ khuẩn Streptomyces.sp

Các nghiên cứu cho thấy, mỗi chủng khác nhau và tùy mỗi mục đích lên men mà môi trường dinh dưỡng cũng khác nhau Như môi trường sản xuất

Streptomycine từ Streptomyces griseus: Để kiểm tra khả năng sinh tổng hợp Streptomycine của chủng Streptomyces griseus, chủng được nuôi trên môi

trường gồm tinh bột, peptone nước chiết thịt, casein (1% ) in trong nước cất sau

đó môi trường được tối ưu hóa bằng cách khảo sát thay đổi nguồn C (Maltose, Sucrose, Lactose, Glucose), bổ sung khoáng (Ca, Zn, Fe, Co.) Sau nghiên cứu, môi trường thích hợp cho sinh tổng hợp Streptomycine là 0.03g Casein, 0.025g Peptone, 0.025g K2HPO4, 0.03g CaCO3, 0.025g Yeast extract, 10g bột rơm, 100ml nước cất và điều chỉnh pH-10

Để tối ưu hóa môi trường sản xuất chất kháng sinh từ Actinomycetes, Basavaraj K Nanjwade và cộng sự (2010) đã nghiên cứu từ môi trường cơ bản 0.3 % yeast extract, 0.35 % CaCO3 và 0.5 % NaCl, sau đó bổ sung để tối ưu nguồn C, N, vi lượng

Theo Myn Uddin và cộng sự (2013), để lựa chọn môi trường thích hợp

cho sinh tổng hợp chất kháng các vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm như E Coli,

Pseudomonas aeruginosa, Shigella sonnei, Salmonella typhi từ chủng Streptomyces albolongus, 4 môi trường đã được kiểm tra gồm: Môi trường A:

Beef extract (3 g), Peptone (5 g), NaCl (5 g), Nước cất (1000 ml); Môi trường B: Yeast extract (0.2%), Glucose (1.0%), K2HPO4 (0.1%), NaCl (0.5%); Môi trường C: Beef extract (0.75%), Peptone (0.25%), NaCl (1.5%), KCl (1.0%), MgCl2(1.0%), FeSO4(1.0%) và Môi trường D: Corn steep liquor (0.2%), Glucose (1.0%), K2HPO4(0.1%), NaCl (0.5%) pH được điều chỉnh đến 7.0 Kết quả cho thấy môi trường D cho khả năng tạo chất kháng khuẩn mạnh nhất

Theo Nguyễn Văn Hiếu và cộng sự (2012), môi trường thích hợp cho sinh

tổng hợp chất kháng sinh là (g/l): Tinh bột tan -15; glucose -2,5; pepton -4; (NH4)2SO4 -2,5; CaCO3 -2, pH 7;

Theo Phạm Thu Trang và cộng sự (2014), môi trường thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh là A4H (g/l): Glucoza 15; bột đậu tương 15; NaCl 5; CaCO3 1; pH=7

Tổng hợp các nghiên cứu trên, ta thấy rằng, môi trường cho sinh tổng hợp

các hoạt chất của chủng Streptomyces ngoài các nguồn Carbon, Nitơ thông

thường như tinh bột tan, glucose, dextrose, pepton, corn steep liquor (cao ngô), beef extract (nước chiết thịt), yeast extract (cao nấm men), casein là các muối khoáng, vi lượng như (NH4)2SO4, CaCO3, NaCl, K2HPO4, MgCl2, FeSO4, MnCl2.

1.2.2 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng và tích lũy các sản

phẩm amino acid của chủng Streptomyces sp

1.2.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn tới sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật trong

đó có xạ khuẩn Không những thế, sự hình thành một số sản phẩm vi sinh vật quan trọng cũng có ảnh hưởng không nhỏ bởi nhiệt độ Tuy nhiên, nhiệt độ tốt cho sinh trưởng lại chưa chắc tốt cho sinh tổng hợp các hợp chất hữu cơ, sinh khối nhiều chưa chắc cho sản phẩm nhiều nhưng sinh khối ít cũng có khả năng giảm sinh tổng hợp các hoạt chất hữu cơ mong muốn Mỗi chủng vi sinh vật khác nhau, mỗi hợp chất hữu cơ tạo thành khác nhau có nhu cầu nhiệt độ khác nhau

Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và khả năng tổng hợp các hoạt chất của xạ khuẩn Ở nhiệt độ thích hợp, các hóa chất và các phản ứng của enzyme trong tế bào tăng nhanh do đó sự sinh trưởng của xạ khuẩn cũng tăng nhanh Khi nhiệt độ tăng cao hoặc giảm thấp, các protein, nucleic acid và các chất khác trong tế bào sẽ nhạy cảm và trở nên bất động Đa số các xạ khuẩn phát triển tốt ở nhiệt độ 28-300C nhưng nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng và tổng hợp các hoạt chất thường nằm trong các khoảng khác nhau Kết quả nghiên cứu của

Lê Thị Thanh Xuân và cộng sự (2007) cho thấy, ở nhiệt độ 300C hai chủng xạ

khuẩn xạ khuẩn Streptomyces cyaneogryceus HD54 và Streptomyces

hygroscopicus HD58 sinh tổng hợp chất kháng sinh chống nấm Fusarium oxysporum FO47 đạt cực đại

Theo nghiên cứu của Đào Thị Lương và cộng sự (2008), chủng

Streptomyces sp L30 sinh tổng hợp chất kháng sinh thích hợp trong khoảng

nhiệt độ từ 28-300C Năm 2006, Bùi Thị Việt Hà đã công bố nhiệt độ 25-350

C là

nhiệt độ tối ưu cho 3 chủng xạ khuẩn Streptomyces T-41, Streptomyces D-42,

Streptomyces TC-54 sinh chất kháng sinh mạnh [2].Theo các nhà khoa học Viện

Công nghệ sinh học-Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam (2011), điều kiện

nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng và sinh tổng hợp kháng sinh Vancomycin từ

chủng xạ khuẩn Streptomyces orientalis 4912 là 280C Cũng có một số xạ khuẩn

thuộc chủng Streptomyces sp là xạ khuẩn ưa nhiệt như S thermoviolaceus có sự

sinh trưởng ở nhiệt độ 25-57oC với khả năng sinh tổng hợp kháng sinh trong khoảng 30-55oC, nhưng tối ưu ở 45o

C (James & Edwards, 1989) Đối với xạ khuẩn Streptomyces.sp là vi sinh vật ưa ấm, nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển vào khoảng 28-32o

C

1.2.2.2 Ảnh hưởng của pH

pH môi trường có ý nghĩa quyết định đối với sự phát triển của vi sinh vật

Sinh tổng hợp các hoạt chất của Streptomyces cũng phụ thuộc rất nhiều vào pH

môi trường pH tác động trưc tiếp đến tính chất hệ keo của tế bào, đến hoạt lực của các enzyme pH thay đổi làm điện tích màng tế bào chất thay đổi, dẫn đến sự thay đổi tính thẩm thấu của màng tế bào và pH cũng làm thay đổi chiều hướng của các phản ứng Không những thế, các nghiên cứu đã chứng minh, pH quá cao hay quá thấp không những hạn chế sinh trưởng, sự tạo thành sản phẩm mà còn dẫn đến phá hủy các sản phẩm mong muốn

Tùy loài xạ khuẩn khác nhau, pH thích hợp cho sinh tổng hợp các hoạt chất có thể là trung tính, pH kiềm hay axit Theo các nghiên cứu và trong thực tế,

hầu hết các hoạt chất sinh tổng hợp từ xạ khuẩn Streptomyces sản xuất tối ưu ở

pH gần 7,0 (Saadoun, Momani, Malkawi và Mohammad, 1999) Theo Lê Thị

Thanh Xuân và cộng sự (2007), pH thích hợp đối với hai chủng Streptomyces

cyaneogryceus HD54 và Streptomyces hygroscopicus HD58 sinh tổng hợp chất

kháng sinh mạnh là 7,0 Nguyễn Hoàng Minh Huy (2006) cũng công bố pH 7,0

là tối ưu cho sinh tổng hợp chất kháng sinh cực đại của chủng Streptomyces

dicklowii [5] Theo các nhà khoa học Viện Công nghệ sinh học-Viện Khoa học

và công nghệ Việt Nam (2011), điều kiện pH thích hợp cho sinh trưởng và sinh

tổng hợp kháng sinh Vancomycin từ chủng xạ khuẩn Streptomyces orientalis

4912 là 6-8 Tuy nhiên, một số loài Streptomyces ưa axit cũng được tìm thấy như S andalkalophilic

Trong lên men sản xuất AVG từ Streptomyces sp X-11085, pH tích hợp cho

sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp AVG là 6,8 (US Patent 3,775,255)

1.2.2.3 Nhu cầu về oxy và sự thông khí trong quá trình lên men

* Độ hòa tan của oxy trong nước

Tế bào sử dụng ôxy để hô hấp và làm giảm lượng ôxy trong môi trường

Vì thế trong nuôi cấy hiếu khí phải cung cấp ôxy một cách đều đặn Thiếu ôxy nhất thời tại một thời điểm nào đó trong môi trường sẽ dẫn đến sự phá vỡ quá trình trao đổi chất của tế bào Vi sinh vật sử dụng ôxy trong môi trường lỏng Lượng ôxy hoà tan trong nước thường là rất ít Phải cung cấp oxy sao cho tốc độ hoà tan của nó bằng tốc độ tiêu thụ oxy của vi sinh vật

Tốc độ hoà tan của ôxy vào môi trường lỏng được tính theo công thức:

Trong đó:

R- tốc độ hoà tan ôxy, C - nồng độ ôxy bảo hoà ở áp suất riêng đã biết, C1- nồng

độ ôxy hoà tan ở thời điểm lựa chọn, K - hằng số tỉ lệ, t - thời gian

Độ hoà tan ôxy còn phụ thuộc vào nhiệt độ khi nuôi cấy, vào nồng độ các chất hợp phần và độ nhớt của môi trường Khi nhiệt độ tăng lên thì độ hoà tan của ôxy giảm Độ hoà tan của ôxy trong môi trường giảm đi 2 lần khi nhiệt độ tăng từ30 - 370C Điều này có thể khắc phục bằng cách cho sục khí mạnh hơn trong quá trình lên men Nồng độ ôxy hoà tan cũng sẽ giảm khi dùng các chất hoạt động

bề mặt, các chất phá bọt và hàm lượng sinh khối vi sinh vật tăng

Trong quá trình nuôi cấy không khí nén được thổi vào thùng lên men có hệ thống cánh khuấy Tốc độ sục khí mạnh sẽ tăng tốc độ hoà tan ôxy và trộn đều cơ chất dinh dưỡng trong môi trường Nhưng không nên khuấy quá mạnh vì có thể dẫn đến sự hư hỏng cơ học các tế bào và dẫn đến hiện tượng tự phân

* Nồng độ oxy giới hạn

Oxy rất cần đối với đời sống của vi sinh vật hiếu khí Tăng thông khí đến giới hạn nhất định thì sự phát triển của vi sinh vật cũng tăng lên theo Đối với nhiều vi sinh vật, thông khí sẽ làm tăng tốc độ sinh trưởng, rút ngắn pha tiềm phát, nâng cao lượng sinh khối Khi tăng tốc độ hoà tan ôxy từ 0 - 5 milimol

O2/l.phút, lượng sinh khối cuối cùng của Serratia marsescens sẽ tăng một cách

đáng kể; sinh khối cực đại đạt được khi cường độ thông khí khoảng 5 milimol

O2/l.phút Nếu tiếp tục tăng thông khí hơn nữa thì lượng sinh khối cuối cùng sẽ giảm Hiện tượng này còn gặp ở rất nhiều giống vi sinh vật

Streptomyces là chủng hiếu khí, do đó việc cấp oxy có ảnh hưởng rất lớn

đến sinh trưởng và sinh tổng hợp các hoạt chất của chúng (Wang et al., 1999) Lượng oxy tới hạn cho vi sinh vật sinh trưởng phát triển là khác nhau, phụ thuộc vào mỗi loại vi sinh vật Nghiên cứu tăng trưởng và sản xuất kháng sinh ở chủng Streptomyces clavuligerus cho thấy khi lượng oxy được kiểm soát ở mức 50% lượng oxy bão hòa (DO) thì sản lượng kháng sinh CephamycinC tăng 2,4 lần ở giai đoạn tăng trưởng so với mức cơ sở( không kiểm soát lượng oxy trong lên men) [38] Tác động tích cực của nồng độ oxy hòa tan cao trên virginiamycin M (Shioya et al., 1999) và tylosin (Chen et al., 1990) sản xuất cũng đã được phát

hiện Trong lên men Streptomyces avermitilis để sản xuất Avermectin B1 cũng

yêu cầu lượng OD đạt mức 30-40% nồng độ oxy bão hòa trong suốt thời gian lên men, ứng với tốc độ lắc 350rpm, tốc độ sục khí 1VVM để đảm bảo lượng kháng sinh được sản xuất là lớn nhất Trong lên men sản xuất AVG từ

Streptomyces sp X-11085, độ oxy hòa tan trong nhân giống cấp 1 tương ứng với

tốc độ lắc 200rpm, trong tank là 85l/phút và khuấy 200rpm (US Patent 3,775,255)

1.2.2.4 Thời gian nuôi cấy thích hợp cho lên men sản xuất các hợp chất

amino acid từ chủng Streptomyces sp

Thời gian nuôi cấy có ảnh hưởng lớn đến sản lượng các hợp chất amino acid thu được.Trong điều kiện thích hợp về dinh dưỡng và các điều kiện nuôi cấy thuận lợi, tế bào vi sinh vật tăng nhanh về kích thước cũng như sự tích lũy sinh khối và sản xuất kháng sinh, tuy nhiên đến một thời gian nhất định, khả năng sản sinh các hợp chất có thể bị hạn chế Tùy vào loài vi sinh vật và mục đích sử dụng

mà thời gian thu hồi hiệu quả khác nhau Loài Streptomyces clavuligerus

DAUFPE-3060 sinh trưởng và cho lượng kháng sinh tốt nhất trong khoảng

24-48h , tuy nhiên với chủng Streptomyces clavuligerus DAUFPE-3133 và

Streptomyces clavuligerus DAUFPE-3094 lại cần thời gian khoảng 72 giờ để đạt

nồng độ sinh khối tối đa Sau 96 giờ các giai đoạn tăng trưởng (logarit) của sinh vật thường dừng lại (Viana et al, 2010; Viana Marques et al, 2011) Trong lên

men sản xuất AVG từ Streptomyces sp X-11085, thời gian nuôi cấy cho sinh

trưởng là 72 giờ, thời gian lên men cho thu hồi AVG là 41 giờ (US Patent 3,775,255)

1.3 Công nghệ lên men sản xuất AVG từ chủng Streptomyces sp

1.3.1 Một số thông tin cơ bản về hoạt chất AVG

AVG (Aminoethoxyvinylglycine) có tên khoa học là (2 acetamidoethoxy)-3-butenoic acid, thuộc nhóm hợp chất tự nhiên

L-trans-2-amino-4-vinylglycine được sản xuất bởi một số vi khuẩn đất như Streptomyces sp,

Pseudomonas aeruginosa (Ruan X cộng sự, 1993)

1.3.1.1 Lịch sử phát hiện

AVG (L-trans-2-amino-4-(2 acetamidoethoxy)-3-butenoic acid) là amino

acid thu được trong quá trình lên men chủng vi khuẩn Streptomyces được phát

hiện đầu tiên bởi nhà khoa học Hoffman LaRoche Inc., Nutley,NJ và được công

bố chính thức trên US Patent 3,751,459 năm 1973 nhờ khả năng kháng mạnh mẽ

nhiều vi sinh vật gây hại như scherichia coli g y ệnh đường ru t nghiêm

tr ng), Bacillus simplex, Staphylococcus aureus, Streptomyces cellulosae, Bacillus cereus, với nồng độ rất thấp (mM) [34], Erwinia amylovora [11] Như

vậy, ngay từ lúc được phát hiện, AVG đã chứng tỏ được khả năng ứng dụng rất cần thiết cho bảo vệ sức khỏe con người và cây trồng

Hình 1.2: Khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh cháy lá

Erwinia amylovora [11]

Nhiều nghiên cứu trong suốt hơn 20 năm sau đó với AVG được thực hiện

ở nhiều trường đại học và các nhà nghiên cứu ngành công nghiệp ở mức độ phân

tử cho thấy tác động đặc biệt của AVG đối với sinh lý của các mô thực vật (Boller, et al, 1979; Yu, et al, 1979) Ngoài khả năng kháng nhiều vi sinh vật gây hại cho người, động vật và thực vật, AVG còn được phát hiện với khả năng

ức chế đặc hiệu và mạnh mẽ sự sinh tổng hợp ethylene (Abeles et al., 1992) AVG đã được sử dụng để nghiên cứu sự tham gia của tổng hợp ethylene trong chồi (Pereira-Netto, 2001), phân vùng vật chất khô trong gạo (Mohapatra và cộng sự, 2000.), trái cây chín (Clayton và cộng sự, 2000; Wang và Dilley,

2001), nấm bệnh (Robison và cộng sự, 2001), những mấu nhỏ ở cây họ đậu (Mann và cộng sự, 2001; Spronsen và cộng sự, 2001), phản ứng với stress lạnh (Hong và Gross, 2000) Đến năm 1997, AVG mới chính thức được đăng ký thương mại bởi tập đoàn Valent BioSciences AVG có khả năng ứng dụng rộng rãi với hiệu quả cao thể hiện cùng tất cả phương thức khác nhau như phun lên lá, tưới vào đất hoặc phương pháp nhúng

1.3.1.2 Một số thông tin cơ bản của hoạt chất AVG [36]

Hình 1.3 Cấu trúc của hợp chất AVG

Công thức ph n tử: C 6 H 12 N 2 O 3

Khối lượng ph n tử trung ình: 160.171097 Da

Khối lượng đồng vị đơn: 160.084793 Da

Tên hệ thống: (2S,3E)-2-Amino-4-(2-aminoethoxy)-3-butenoic acid