Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp Nghiên cứu tạo chế phẩm Aminoethoxyvinylglycine từ Streptomyces spp. có khả năng ức chế sinh tổng hợp ethylene để trì hoãn quá trình chín quả giai đoạn cận và sau thu hoạch

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN VĂN NGUYỆN NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM AMINOETHOXYVINYLGLYCINE TỪ Streptomyces spp CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ SINH TỔNG HỢP ETHYLENE ĐỂ TRÌ HỖN Q TRÌNH CHÍN QUẢ GIAI ĐOẠN CẬN VÀ SAU THU HOẠCH LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI – 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN VĂN NGUYỆN NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM AMINOETHOXYVINYLGLYCINE TỪ Streptomyces spp CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ SINH TỔNG HỢP ETHYLENE ĐỂ TRÌ HỖN Q TRÌNH CHÍN QUẢ GIAI ĐOẠN CẬN VÀ SAU THU HOẠCH Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số : 94 20 201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Trịnh Khắc Quang PGS TS Phạm Anh Tuấn HÀ NỘI – 2020 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2020 Tác giả luận án Nguyễn Văn Nguyện ii LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực cơng trình nghiên cứu, tơi nhận nhiều giúp đỡ, đóng góp ý kiến bảo tận tình thầy, cơ, bạn bè đồng nghiệp quan Đầu tiên, xin trân trọng cảm ơn Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn, Viện Khoa học nông nghiệp Việt Nam, Ban Đào tạo Viện Khoa học nông nghiệp Việt Nam, Viện Cơ điện Nông nghiệp Công nghệ sau thu hoạch, Viện Nghiên cứu rau quan hữu quan, doanh nghiệp, cá nhân tập thể địa phương tạo điều kiện cho tơi hồn thành luận án tiến sĩ Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Trịnh Khắc Quang, PGS.TS Phạm Anh Tuấn tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ suốt trình thực hồn thành luận án Tơi xin chân thành cảm ơn đến anh/chị đồng nghiệp Bộ môn Nghiên cứu Công nghệ sau thu hoạch, Bộ môn Nghiên cứu công nghệ bảo quản nông sản thực phẩm, Bộ mơn Cây ăn nhiệt tình giúp đỡ tơi suốt q trình thực luận án Tôi xin chân thành cảm ơn đến Lãnh đạo cán Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Viện Cơ điện Nông nghiệp Công nghệ Sau thu hoạch, Viện Nghiên cứu rau quả, Ban thông tin đào tạo VAAS động viên, tạo điều kiện giúp đỡ để tơi hồn thành luận án Tơi xin chân thành cảm ơn Giáo sư, Phó Giáo sư, Tiến sĩ chủ tịch hội đồng, ủy viên phản biện, ủy viên hội đồng dành thời gian quý báu để đọc tham gia hội đồng chấm luận án Cuối cùng, tơi xin tỏ lịng biết ơn gia đình nội, ngoại, vợ, tơi bạn bè động viên, cổ vũ, khích lệ suốt trình thực luận án iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN .ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH MỤC BẢNG x DANH MỤC HÌNH xii MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình sản xuất tiêu thụ tươi 1.1.1 Trên giới 1.1.2 Ở Việt Nam 1.1.2.1 Tình hình sản xuất tiêu thụ cam (Citrus sinensis) 1.1.2.2 Tình hình sản xuất tiêu thụ chuối tiêu (Musa cavendish) 1.2 Đặc điểm trình sinh trưởng, phát triển, lão hóa trước sau thu hoạch 1.3 Tác động ethylene nội sinh đến trình sinh trưởng, phát triển lão hóa 1.4 Các nghiên cứu ức chế hoạt động ethylene nội sinh trước sau thu hoạch12 1.4.1 Ức chế sinh tổng hợp 13 1.4.1.1 Kìm hãm enzyme ACS 13 1.4.1.2 Ức chế enzyme ACO 13 1.4.1.3 Cạnh tranh chất SAM 14 1.4.2 Kìm hãm thụ thể nhận biết ethylene 14 1.4.3 Loại bỏ ethylene 15 1.4.3.1 Hấp phụ 15 1.4.3.2 Oxy hóa 15 1.4.3.3 Xúc tác phân hủy 16 iv 1.4.3.4 Bộ lọc sinh học 16 1.5 Hoạt chất AVG 18 1.5.1 Cấu tạo phân tử AVG 18 1.5.2 Tính chất hóa lý AVG 19 1.5.3 Cơ chế kìm hãm sinh tổng hợp ethylene AVG 19 1.5.3.1 ACS tác nhân kìm hãm ACS 19 1.5.3.2 Cơ chế ức chế ACS AVG 20 1.6 Công nghệ sản xuất chế phẩm chứa hoạt chất AVG 21 1.6.1 Sản xuất AVG xạ khuẩn Streptomyces spp 21 1.6.1.1 Đặc điểm xạ khuẩn Streptomyces spp 21 1.6.1.2 Lên men xạ khuẩn Streptomyces spp để sản xuất AVG 25 1.6.1.3 Tách tinh AVG 25 1.6.1.4 Công nghệ tạo chế phẩm AVG 27 1.6.2 Sản xuất AVG tổng hợp hóa học 29 1.6.3 Kỹ thuật tạo sản phẩm điều hòa sinh trưởng 29 1.7 Các cơng trình nghiên cứu ứng dụng hoạt chất AVG 30 1.7.1 Giai đoạn trước thu hoạch 30 1.7.1.1 Trên giới 30 1.7.1.2 Ở Việt Nam 31 1.7.2 Giai đoạn sau thu hoạch 32 1.7.2.1 Trên giới 32 1.7.2.2 Ở Việt Nam 32 1.8 Những ý kiến rút từ tổng quan 33 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.1 Vật liệu nghiên cứu 35 2.1.1 Vật liệu 35 2.1.2 Mơi trường, hóa chất 35 2.1.3 Thiết bị, dụng cụ 36 2.2 Phương pháp nghiên cứu 36 v 2.2.1 Các phương pháp nghiên cứu chung 36 2.2.1.1 Phân tích hàm lượng AVG HPLC 36 2.2.1.2 Xác định pH dịch lỏng 37 2.2.1.3 Xác định sinh khối chủng xạ khuẩn dịch lên men 37 2.2.1.4 Xác định hàm lượng chất khô tổng số dịch lỏng 37 Nhỏ giọt mẫu dịch kiểm tra vào lăng kính khúc xạ kế 37 2.2.2 Các phương pháp nghiên cứu theo nội dung 37 2.2.2.1 Phân lập tuyển chọn chủng Streptomyces sp có khả sinh tổng hợp hoạt chất AVG 37 2.2.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng điều kiện lên men đến sinh trưởng sinh tổng hợp hoạt chất AVG chủng Streptomyces sp lựa chọn 40 2.2.2.3 Nghiên cứu làm sạch, thu hồi tạo chế phẩm AVG có khả ức chế sinh tổng hợp ethylene cho trì hỗn q trình chín 43 2.2.2.4 Nghiên cứu khả ứng dụng chế phẩm AVG 49 2.2.3 Các phương pháp xử lý số liệu 53 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 54 3.1 Phân lập tuyển chọn xạ khuẩn Streptomyces sp có khả sinh tổng hợp hoạt chất AVG 54 3.1.1 Kết phân lập chủng xạ khuẩn có khả sinh tổng hợp AVG 54 3.1.2 Đặc điểm hình thái chủng S6 57 3.1.2 Định tên chủng S6 58 3.2 Ảnh hưởng điều kiện lên men đến sinh trưởng sinh tổng hợp hoạt chất AVG chủng S6 60 3.2.1 Ảnh hưởng nguồn carbon 60 3.2.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ 61 3.2.3 Ảnh hưởng nguyên tố vi lượng 62 3.2.4 Ảnh hưởng nguyên tố đa lượng 63 3.2.5 Ảnh hưởng tỉ lệ tiếp giống 64 vi 3.2.6 Ảnh hưởng nhiệt độ 66 3.2.7 Ảnh hưởng độ oxy hòa tan (DO) 67 3.2.8 Ảnh hưởng pH môi trường 68 3.2.9 Động học sinh trưởng sinh tổng hợp AVG chủng S6 69 3.2.10 Tối ưu hóa số thơng số kỹ thuật cho lên men sinh tổng hợp AVG chủng S6 71 3.3 Làm sạch, thu hồi tạo chế phẩm AVG 77 3.3.1 Làm dịch chứa AVG li tâm 77 3.3.2 Tinh dịch chứa AVG sau li tâm trao đổi ion 78 3.3.2.1 Ảnh hưởng thời gian lưu dịch chứa AVG tốc độ dòng tháo đến hiệu hấp phụ AVG cột trao đổi ion 78 3.3.2.2 Ảnh hưởng thời gian lưu tốc độ dòng rửa giải đến hiệu thu hồi AVG từ cột trao đổi ion 79 3.3.2.3 Ảnh hưởng pH dịch cấp đến khả hấp phụ AVG cột trao đổi ion 81 3.3.2.4 Ảnh hưởng pH dịch rửa giải đến hiệu suất thu hồi AVG từ cột trao đổi ion 83 3.3.2.5 Mức độ tinh AVG dịch thu hồi sau trao đổi ion 83 3.3.2.6 Tăng cường tinh AVG nhiều cột trao đổi ion 84 3.3.3 Cô đặc dịch sau tinh trao đổi ion 87 3.3.4 Thực nghiệm lên men, tinh cô đặc dịch chứa AVG quy mô lên men 100 lít/mẻ 88 3.3.5 Tạo chế phẩm AVG 90 3.3.5.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đầu vào khơng khí sấy đến hiệu suất thu hồi chế phẩm AVG 90 3.3.5.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đầu không khí sấy đến hiệu suất thu hồi chế phẩm AVG 91 3.3.5.3 Ảnh hưởng tốc độ bơm dịch nguyên liệu đến hiệu suất thu hồi chế phẩm AVG 92 vii 3.3.6 Chất lượng chế phẩm AVG 94 3.3.6.1 Các tiêu vật lý chế phẩm AVG 94 3.3.6.2 Các tiêu sinh học chế phẩm AVG 95 3.3.6.3 Khả ức chế sinh tổng hợp ethylene tươi chế phẩm AVG điều kiện thí nghiệm 97 3.3.7 Quy trình tạo chế phẩm AVG 98 3.4 Khả ứng dụng chế phẩm AVG 100 3.4.1 Khả ứng dụng chế phẩm AVG trì hỗn chín, kéo dài thời gian thu hoạch cam (Citrus sinensis) 100 3.4.1.1 Ảnh hưởng chế phẩm AVG đến tiêu sinh hóa cam 100 3.4.1.2 Ảnh hưởng chế phẩm AVG đến tiêu cảm quan cam 102 3.4.1.3 Ảnh hưởng chế phẩm AVG đến sinh trưởng phát triển cam104 3.4.2 Khả ứng dụng chế phẩm AVG trì hỗn chín, kéo dài thời gian thu hoạch bảo quản chuối tiêu hồng (Musa cavendish) 106 3.4.2.1 Khả trì hỗn chín, kéo dài thời gian thu hoạch chuối 106 3.4.2.2 Khả trì hỗn chín, kéo dài thời gian bảo quản chuối 110 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 116 DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 118 TÀI LIỆU THAM KHẢO 119 PHỤ LỤC 139 viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ACC : 1-aminocyclopropane-1-carboxylic axit ACO : 1-aminocyclopropane-1-Carboxylic axit oxidase ACS : Aminocyclopropane-1-cacboxylic axit synthase AOAC : Association of Official Analytical Chemists (Hiệp hội nhà hố phân tích thống) AVG : Aminoethoxyvinylglycine CV : Coefficient of variation (hệ số biến động) DTT : DL-dithiothreitol ĐVTN : Động vật thí nghiệm EDTA : Ethylene diamine tetraacetic axit EIN : Ethylene insensitive (thụ thể chống nhạy cảm ethylene) ERS : Ethylene response sensor (thụ thể cảm biến phản ứng ethylene) ETR : Ethylene response (thụ thể phản ứng ethylene) GDP : Gross domestic product (tổng sản phẩm quốc nội) HEPES : 4-2-hydroxyetyl-1-piperazine etan sulfonic axit HPLC : High performance liquid chromatography LD50 : Lethal dose, 50% (liều gây chết 50% động vật thí nghiệm) LeETR : Ethylene receptor family from tomato (họ thụ thể ethylene cà chua) LSD : Least significant difference (khác biệt nhỏ có ý nghĩa) MES : 2-(N-morpholino) etan sulfonic axit MOPS : 3-(N-morpholino) propan sulfonic axit OECD : Organisation for economic co-operation and development (Tổ chức hợp tác phát triển Kinh tế) ppm : Parts per million (một phần triệu) sp : Species (một loài, chủng thuộc chi) SPE : Solid-phase extraction (chiết pha rắn) ... spp có khả ức chế sinh tổng hợp ethylene để trì hỗn q trình chín giai đoạn cận sau thu hoạch? ?? Mục đích đề tài Phân lập, tuyển chọn số chủng xạ khuẩn Streptomyces spp có khả sinh tổng hợp AVG từ. .. làm sạch, thu hồi tạo chế phẩm AVG có khả ức chế sinh tổng hợp ethylene cho trì hỗn q trình chín Nghiên cứu khả ứng dụng chế phẩm AVG tạo trì hỗn chín để kéo dài thời gian thu hoạch cam (Citrus... DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN VĂN NGUYỆN NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM AMINOETHOXYVINYLGLYCINE TỪ Streptomyces spp CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ SINH TỔNG HỢP ETHYLENE