Mục tiêu của luận án là thẩm định kỹ thuật định lượng steroid niệu bằng GC/MS và thiết lập khoảng tham chiếu steroid niệu ở trẻ em ≤ 11 tuổi. Ứng dụng kỹ thuật định lượng steroid niệu bằng GC/MS trong chẩn đoán một số bệnh lý rối loạn sinh tổng hợp hormon steroid bẩm sinh.
BGIODCVOTO BYT TRNGIHCYHNI TRNTHNGCANH Nghiêncứuđịnhlợngsteroidniệu bằnggc/mstrongchẩnđoánrốiloạn sinhtổnghợpsteroidbẩmsinhởtrẻem LUNNTINSYHC HNIư2019 BGIODCVOTO BYT TRNGIHCYHNI TRNTHNGCANH Nghiêncứuđịnhlợngsteroidniệu bằnggc/mstrongchẩnđoánrốiloạn sinhtổnghợpsteroidbẩmsinhởtrẻem Chuyờnngnh:HúasinhYhc Mós:62720112 LUNNTINSYHC NGIHNGDNKHOAHC: TS. Trần Thị Chi Mai PGS.TS. Trần Minh Điển HÀ NỘI – 2019 LỜI CẢM ƠN Xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc Bệnh viện Hữu Nghị Việt Đức, Ban Giám đốc Bệnh viện Nhi Trung ương, Ban Giám hiệu Trường Đại học Y Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hồn thành khóa học nghiên cứu sinh và bảo vệ luận án tiến sỹ. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Trần Thị Chi Mai, PGS.TS Trần Minh Điển, những người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉnh sửa luận án, giúp đỡ và động viên em trong suốt q trình học tập, nghiên cứu, hồn thành luận án Xin trân trọng cảm ơn các thầy cơ Bộ mơn Hóa SinhTrường Đại học Y Hà Nội, đã hướng dẫn, giảng dạy và đóng góp nhiều ý kiến q báu để em hồn thành luận án. Xin cảm ơn Phòng Quản lý Đào tạo Sau Đại học, các phòng ban trong nhà trường đã tạo điều kiện và giúp đỡ em hồn thành q trình học tập tại trường Xin gửi lời cảm ơn tới các đồng nghiệp tại khoa Xét nghiệm Huyết học – Bệnh viện Hữu Nghị Việt Đức, các anh –chị khoa Hóa sinh và khoa Nội tiết – Chuyển hóa – Di truyền Bệnh viện Nhi trung ương đã hỗ trợ tơi rất nhiều trong cơng việc, lấy mẫu và thực hiện kỹ thuật để tơi hồn thành luận án Xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ, chia sẻ trong cuộc sống và trong cơng việc, giúp tơi hồn thành khóa học Xin cảm ơn tất cả người bệnh, các bé khỏe mạnh đã cung cấp mẫu bệnh phẩm để thực hiện đề tài nghiên cứu này Xin trân trọng cảm ơn! Ngày 17 tháng 7 năm 2019 NCS. Trần Thị Ngọc Anh LỜI CAM ĐOAN Tơi là Trần Thị Ngọc Anh, nghiên cứu sinh khóa 34, Trường Đại học Y Hà Nội, chun ngành Hóa sinh y học, xin cam đoan: Đây là luận án do bản thân tơi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của Tiến sĩ Trần Thị Chi Mai và Phó giáo sư Tiến sĩ Trần Minh Điển, Phó Giám đốc Bệnh viện Nhi Trung ương Cơng trình này khơng trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã công bố Việt Nam Nghiên cứu định lượng steroid niệu bằng kỹ thuật sắc ký khí – khối phổ có giá trị trong chẩn đốn bệnh lý rối loạn sinh tổng hợp hormon steroid b ẩm sinh tr ẻ em, đượ c thực hiện lần đầu tại Việt Nam Các số liệu và thơng tin trong nghiên cứu là hồn tồn chính xác, trung thực và khách quan, đã được xác nhận, chấp thuận của cơ sở nghiên cứu. Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này Hà Nội, ngày 17 tháng 7 năm 2019 NCS. Trần Thị Ngọc Anh CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt 3βHSD 5αDHT 5αTHF 11OH An 11OH Et 11βOH 11 Keto An 17βHSD 17OHP 17OHPN 21OH A’3 ACTH ADN AME An CLSI CMO CXĐ CV DHEA DOC EQA Et FSH GC/MS Tiếng Anh Tiếng Việt 3βHydroxysteroid dehydrogenase 5αDihydrotestosterone 5αTetrahydrocortisol 11Hydroxy androsterone 11Hydroxy etiocholanolone 11βHydroxylase 11Ketoandrosterone 17β Hydroxysteroid dehydrogenase 17αHydroxyprogesterone 17Hydroxypregnanolone 21Hydroxylase Androstenetriol Adrenocorticotropic hormone Hormon kích thượng thận Acid deoxyribonucleic Apparent mineralocorticoid excess Androsterone Clinical & Laboratory Viện tiêu chuẩn lâm sàng và Standards Institute Corticosterone methyl oxidase xét nghiệm Chưa xác định Hệ số biến thiên Coefficient variation Dehydroepiandosterone Deoxycorticosterone External qualificative assurance Ngoại kiểm chất lượng Etiocholanolone Follice stimulating hormone Hormon kích nỗn tố Gas chromatography – mass Sắc ký khí – khối phổ GnRH spectrometry Gonadotropin releasing hormone Human chorionic gonadotropin International Federation of gonadotropin hCG IFCC Clinical Chemistry and Phòng xét nghiệm y học Quốc Laboratory Medecine tế Khơng xác định KXĐ Hormon giải phóng Hiệp hội Hóa sinh lâm sàng và Sắc ký lỏng khối phổ kép LC/MSMS Liquid chromatography LH PD POR PT PTL QC RLPTGT SD SIM SHBG StAR Tandem mass spectrometry Luteinizing hormone Hormon kích hồng thể Pregnanediol Cytochrome P450 oxidoreductase Pregnanetriol Pregnanetriolone Quality control Nội kiểm chất lượng Disorders of sex development Rối loạn phát triển giới tính Standard deviation Độ lệch chuẩn Selected ion monitoring Ion theo dõi chọn lọc Sex hormone binding globulin Globulin gắn hormon sinh dục Steroid acute response protein Protein đáp ứng cấp với steroid THA THB THE THF THS TMSI TSTTBS Tetrahydroaldosterone Tetrahydrocorticosterone Tetrahydrocortisone Tetrahydrocortisol Tetrahydro 11deoxycortisol Ntrimethylsilylimidazole Congenital adrenal hyperplasia Tăng sản thượng thận bẩm sinh MỤC LỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG PHIẾU TÌNH NGUYỆN THAM GIA ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU Họ và tên đối tượng NC:…………………………………………………………… Giới tính: …………………………………………., sinh ngày:…………………… Địa chỉ:…………………………………………………………………………… Họ và tên người được phỏng vấn: ………………………………………………… Điện thoại:………………………………………………………………………… Mối quan hệ với đối tượng NC:……………………………………………………. Sau khi được nghe giải thích về ý nghĩa, tầm quan trọng, quyền lợi, nghĩa vụ cũng như những nguy cơ tiềm tàng và lợi ích mà đối tượng nghiên cứu có được khi tham gia đề tài: “Nghiên cứu định lượng steroid niệu bằng GC/MS trong chẩn đốn rối loạn sinh tổng hợp steroid bẩm sinh ở trẻ em”. Tơi tự nguyện tham gia nghiên cứu, tơi đồng ý lấy mẫu nước tiểu của đối tượng nghiên cứu để làm xét nghiệm Ngày……tháng……năm… Họ và tên người được phỏng vấn (Ký và ghi rõ họ tên) PHIẾU ĐIỀU TRA DÀNH CHO TRẺ KHỎE MẠNH Họ và tên:…………………………………………………………………… Giới tính:…………………………………………………………………… Ngày sinh:…………………………………………………………………… Họ và tên người được phỏng vấn: …………………………………………… Địa chỉ:……………………………………………………………………… Điện thoại:…………………………………………………………………… Mối quan hệ với đối tượng NC:……………………………………………… Khi sinh, trẻ cân nặng:……………………………Tuổi thai:…………… tuần Trẻ hiện khỏe mạnh khơng? Có Khơng Trong vòng 1 tháng qua, trẻ có mắc bệnh gì khơng? Có Khơng Nếu có, trẻ có được dùng thuốc khơng? Có Khơng Nếu có là loại gì? Trong gia đình, họ hàng có người nào mắc bệnh bất thường về giới tính (TSTTBS, RLPTGT) khơng? Có Khơng Nếu có là ai: ………………………………………………………………… Thời điểm lấy mẫu: …………………………………………………………… Chiều cao hiện tại: ……………………………Cân nặng hiện tại: ………… Người phỏng vấn PHIẾU ĐIỀU TRA DÀNH CHO NGƯỜI BỆNH NGHI MẮC TSTTBS, RLPTGT Phần A: Thơng tin hành chính: Họ tên người bệnh:……………………… ……………………………………… Sinh ngày:………….……………………………………… Giới tính: Nam/ Nữ Địa chỉ: ……………………………………………………………………………… Họ tên người vấn: ………………………………………………… Mối quan hệ với BN: ……………………………………………………………… Điện thoại liên hệ: ………………………………………………………………… Ngày vào viện:…………………………………… Số bệnh án: …………………… Phần B: Thơng tin lâm sàng Ngày thăm khám trẻ ……………………, tại địa điểm:…………………………… Chẩn đốn:………………………………………………… ……………………… Thời điểm chẩn đốn: ……………………………………………………………… Điều trị: …………………………………………………………………………… Đặc điểm khi sinh:………………………………………………………………… Sự phát triển: ……………………………………………………………………… Tiền sử gia đình:…………………………………………………………………… Khám lâm sàng hiện tại: Cao cân nặng …………………………… Đặc điểm giới tính:………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… Các dấu hiệu khác:………………………………………………………………… C: Kết quả xét nghiệm Ngày xét nghiệm……………………………… Na+ (mmol/L):…………… K+ (mmol/L)………… Kết quả miễn dịch: 17OHP …………Testosterone: ……FSH…… LH Xét nghiệm khác: ……………………………………………………… Người thực hiện KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG STEROID NIỆU BẰNG GC/MS Họ và tên người bệnh: ……………………………. Giới tính: ………… Tuổi/ Ngày sinh:……………………………………………………………… Địa chỉ:………………………………………………………………………… Ngày lấy mẫu: …… ………………………………………………………… Chẩn đoán:…………………………………………………………………… Xét nghiệm:…………………………………………………………………… KẾT QUẢ GC/MS STT 10 11 Steroids Androsterone Etiocholanolone Dehydroepiandrosterone 11 Keto androsterone 11 OH Androsterone 11 OH Etiocholanolon Prenandiol Prenantriol Androstentriol Tetrahydrocortisone Tetrahydrocortisol Nồng độ (µmol/L) Nồng độ (µmol/mol creatinin) Nhận xét 12 13 14 15 5αTetrahydrocortisol a Cortolone b Cortol 16 b Cortolone aCortol 17 THS Creatinin niệu: …… mmol/L Nhận xét: …………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………… Kết luận: ……………………………………………………………………… Ngày xét nghiệm KẾT QUẢ PHÂN TÍCH GEN NGƯỜI BỆNH THUỘC ĐỀ TÀI Mã NC Họ và tên GC/MS Gen VN03 Ng Văn Hoàng A 21OH CYP21A2 VN08 Phạm Bảo N 21OH CYP21A2 VN17 Phạm Trang L 21OH CYP21A2 VN20 Phạm Vy O 21OH CYP21A2 Đột biến DHT đột biến mất đoạn 30KB c.515T>A (p.Ile172Asn) DHT đột biến đảo đoạn Promoter. DHT g.655A/C>G ĐHT đột biến mất đoạn 30KB DHT p.P459L DHT p.P30L VN22 Thân Thị H 21OH CYP21A2 ĐHT c.737delA VN26 Đặng Phúc Đ 21OH CYP21A2 ĐHT g.655A/C>G VN28 Nguyễn Thu Tr 21OH CYP21A2 VN30 Ng Công Huy Tr 21OH CYP21A2 VN33 Chu Thị H 21OH CYP21A2 21OH CYP21A2 VN43 Cao Lung L (Cao Thị Hòa A) DHT đảo đoạn promoter DHT g.113G>A, g.110T>C DHT g.655A/C>G DHT g.2108C>T (p.Arg356Trp) DHT đột biến mất đoạn 30KB c.515T>A (p.Ile172Asn) ĐHT c.515T>A (p.Ile172Asn) DHT đột biến mất đoạn 30KB VN44 Lữ Thị Yến Nh 21OH CYP21A2 VN45 Lê Mạnh H 21OH CYP21A2 ĐHT đột biến mất đoạn 30KB VN46 Hoàng Như V 21OH CYP21A2 DHT c.368C>T (p.Thr123Ile) VN51 Phạm Gia H 21OH CYP21A2 DHT c.515T>a (p.Ile172Asn) DHT đột biến đảo đoạn Promoter. ĐHT g.655A/C>G DHT đột biến mất đoạn 30KB VN54 Ngô Khánh V 21OH CYP21A2 DHT c.328_335delGAGACTAC VN57 Ng Minh Ch 21OH CYP21A2 ĐHT đột biến mất đoạn 30KB VN58 Phùng Thị Y 21OH CYP21A2 ĐHT c.515T>a (p.Ile172Asn) VN61 Ng Thị Kiều Ng 21OH CYP21A2 ĐHT c.515T>a (p.Ile172Asn) VN62 Hà Thị V 21OH CYP21A2 ĐHT c.515T>A (p.Ile172Asn) VN80 VN85 VN88 VN90 Trần Thị Minh Ng Nguyễn Vũ Thanh V Nguyễn Hồng K Nguyễn Bá Bảo M 21OH CYP11B1 DHT c.128G>A (p.Arg43Gln) CYP21A2 DHT c.515T>A (p.Ile172Asn) DHT đột biến mất đoạn 30KB 21OH CYP21A2 21OH CYP21A2 ĐHT đột biến mất đoạn 30KB 21OH CYP21A2 ĐHT c.515T>A (p.Ile172Asn) DHT c.515T>A (p.Ile172Asn) VN95 Phạm Thị Út Tr 21OH CYP21A2 ĐHT đột biến mất đoạn 30KB VN97 Đinh Xuân L 21OH CYP21A2 DHT c.140A>G (p.Tyr47Cys) VN98 Vương Xuân L 21OH CYP21A2 ĐHT p.R356W VN99 Vương Thị Nh 21OH CYP21A2 ĐHT p.R356W VN110 Hà Thái Kh Chưa XĐ CYP21A2 Không phát hiện đột biến VN111 Lê Tuệ A Chưa XĐ CYP21A2 Không phát hiện đột biến VN112 Nguyễn Đức Tr Chưa XĐ CYP21A2 Khơng phát hiện đột biến VN113 Trịnh Duy H Chưa XĐ CYP21A2 Khơng phát hiện đột biến VN114 Đồn Gia H Chưa XĐ CYP21A2 Khơng phát hiện đột biến VN115 Hồng Hữu B Chưa XĐ CYP21A2 Khơng phát hiện đột biến VN116 Lê Thị B (An L) Chưa XĐ CYP21A2 Khơng phát hiện đột biến VN117 Lò Minh H Chưa XĐ CYP21A2 Khơng phát hiện đột biến VN101 Khuất Thế A 11βOH CYP11B1 ĐHT c.128G>A (p.Arg43Gln) VN102 Nguyễn Thiên T 11βOH CYP11B1 DHT c.128G>A (p.Arg43Gln) DHT c.1157C>T (p.Ala386Val) VN103 Trần Hải Đ Chưa XĐ CYP11B1 DHT c.128G>A (p.Arg43Gln) VN100 Nguyễn Việt H 11βOH DHT c.128G>A (p.Arg43Gln) VD11 Nguyễn Gia B 5α reductase CYP11B1 SRD5A2 DHT c.362G>A (Gly>Glu) DHT c.680G>A (p.Arg227Gln) VD12 Nguyễn Viết H 5α reductase SRD5A2 VD13 Đỗ Tiến Th 5α reductase SRD5A2 VD14 Đỗ Tiến Thg 5α reductase SRD5A2 VD15 VD16 VD17 VN107 Trần Nguyễn H Trần Anh V Đỗ Đăng Qu Vi Thị Th 5α reductase 5α reductase 5α reductase 5α reductase DHT c.674G>A (p.Gly>Glu) ĐHT c.680G>A (p.Arg227Gln) ĐHT c.265G>C (p.Val89Leu) ĐHT c.680G>A (p.Arg227Gln) ĐHT c.265G>C (p.Val89Leu) ĐHT c.680G>A (p.Arg227Gln) ĐHT c.265G>C (p.Val89Leu) SRD5A2 DHT c.680G>A (p.Arg227Gln) DHT c.590A>G (p.Glu197Gly) ĐHT c.265C>G (p.Leu89Val) SRD5A2 DHT c.680G>A (p.Arg227Gln) DHT c.590A>G (p.Glu197Gly) SRD5A2 DHT c.362G>A (p.Gly >Glu) DHT c.607G>A (p.Gly203Ser) ĐHT c.265G>C (p.Val89Leu) SRD5A2 DHT c.607G>A (p.Gly203Ser) DHT c.239G>T (p.Gly80Val) ĐHT: đồng hợp tử 21OH: thiếu 21hydroxylase DHT: dị hợp tử 11OH: thiếu 11βhydroxylase Chưa XĐ: chưa xác định 5αreductase: thiếu 5αreductase type 2 HÌNH ẢNH NGƯỜI BỆNH THUỘC ĐỀ TÀI Hình 1: Người bệnh TSTTBS thiếu 21OH sơ sinh, khơng phân biệt giới tính Hình 2: Người bệnh TSTTBS thể thiếu 21OH (6 tuổi, nữ) Hình 3: Người bệnh thiếu 21OH nam hóa hồn tồn (17 tuổi, NST 46,XX) Hình 4: Người bệnh nam, 2 tuổi thiếu 11βOH có dấu hiệu dậy thì sớm Hình 5: Hình ảnh người bệnh (nam 3 tuổi), thiếu 5αreductase type 2 Hình 6: Hình ảnh người bệnh (nam, 11 tuổi), thiếu 5areductase type 2 Hình 7: Người bệnh 13 tuổi, thiếu 5αreductase type 2 Phụ lục 8. Bảng 1. Khoảng tham chiếu nồng độ 17OHP Nồng độ 17OHP (ng/mL) * Độ tuổi Nam Nữ