Phân lập, tuyển chọn những chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp ENZYME CELLULASE cao ứng dụng vào quá trình ủ phân hữu cơ từ vỏ trái cacao

KHOA HÓA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM ------ ĐỀ TÀI KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN NHỮNG CHỦNG NẤM MỐC CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME CELLULASE CAO - ỨNG DỤNG VÀO QUÁ TRÌNH

Trang 1

KHOA HÓA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

- -

ĐỀ TÀI KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN NHỮNG CHỦNG NẤM MỐC CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME CELLULASE CAO - ỨNG DỤNG VÀO QUÁ TRÌNH Ủ PHÂN HỮU CƠ TỪ VỎ

TRÁI CA CAO

Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Văn Tới GVHD: ThS Trần Thị Duyên ThS Phạm Thị Hữu Hạnh

BÀ RỊA – VŨNG TÀU, 7/2013

Trang 3

Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Văn Tới

GVHD: ThS Trần Thị Duyên

ThS Phạm Thị Hữu Hạnh

Xác nhận đã chỉnh sửa theo ý kiến hội đồng

Cán bộ phản biện 1 Cán bộ phản biện 2 Chủ tịch Hội đồng

BÀ RỊA-VŨNG TÀU - 7/2013

Trang 4

Sv Nguyễn Văn Tới – Lớp DH09H1 i Khoa Hóa học và Công nghệ thực phẩm

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài nghiên cứu này tôi xin chân thành cảm ơn:

- Ban giám hiệu nhà trường, chú Trịnh Văn Thành Giám đốc Cty TNHH Ca Cao Thành Đạt, PGS TS Nguyễn Văn Thông Trưởng Khoa Hóa học và Công nghệ thực phẩm, đã quan tâm và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành đề tài

- ThS Trần Thị Duyên, ThS Phạm Thị Hữu Hạnh đã nhiệt tình hướng dẫn, định hướng cho tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành đề tài này

- Thầy Đỗ Xuân Tâm, các cán bộ phòng thí nghiệm, đã tạo điều kiện tốt nhất về trang thiết bị trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè tôi đã luôn ủng hộ tinh thần, động viên, giúp tôi vượt qua những khó khăn trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Bà Rịa - Vũng Tàu, ngày 12 tháng 7 năm 2013

Sinh Viên

Nguyễn Văn Tới

Trang 5

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan rằng tất cả những kết quả nghiên cứu được nêu trong đề tài này là

do tôi thực hiện, các ý tưởng tham khảo và những kết quả trích dẫn từ các công trình khác đều được nêu rõ trong đề tài

Bà Rịa - Vũng Tàu, ngày 12 tháng 7 năm 2013

Sinh Viên

Nguyễn Văn Tới

Trang 6

Sv Nguyễn Văn Tới – Lớp DH09H1 iii Khoa Hóa học và Công nghệ thực phẩm

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

TỪ VIẾT TẮT viii

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 4

2.1 Giới thiệu cây ca cao 4

2.1.1 Nguồn gốc cây ca cao [11] 4

2.1.2 Đặc điểm của cây ca cao [11] 5

2.2 Thành phần hóa học của vỏ trái ca cao [11, 27] 6

2.3 Một số loại nấm bệnh ký sinh trên vỏ ca cao [11, 24] 7

2.4 Tổng quan về phân hữu cơ [18] 8

2.4.1 Khái niệm phân hữu cơ [18] 8

2.4.2 Ưu nhược điểm của phân hữu cơ [18] 9

2.4.3 Tình hình ứng dụng vi sinh vật xử lí rác thải [14] 9

2.4.4 Một số mô hình ủ phân hữu cơ tại Việt Nam 11

2.4.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình ủ phân 12

2.5 Các chỉ tiêu xác định chất lượng phân thành phẩm 20

2.6 Chế phẩm sinh học [19] 21

2.6.1 Chế phẩm GEM 21

2.6.2 Chế phẩm Trichoderma 22

2.7 Hai chủng nấm mốc được tuyển chọn ứng dụng thực nghiệm 23

2.7.1 Trichoderma viride [3] 23

2.7.2 Aspergillus niger [3] 24

CHƯƠNG III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

3.1 Phương tiện nghiên cứu 25

Trang 7

3.1.2 Nguyên vật liệu 25

3.1.3 Hóa chất 25

3.1.4 Môi trường nghiên cứu phân lập 25

3.1.5 Dụng cụ thí nghiệm 26

3.1.6 Thiết bị sử dụng 27

3.2 Bố trí thí nghiệm 27

3.2.1 Thí nghiệm 1: phân lập, tuyển chọn một số chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp cellulase cao 27

3.2.2 Thí nghiệm 2: Phương pháp xác định ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase 29

3.2.4 Thí nghiệm 4: Xác định thời gian thu nhận bào tử nấm mốc thích hợp 32

3.2.5 Thí nghiệm 5: khảo sát sự biến đổi của các nhân tố chính trong quá trình ủ phân hữu cơ từ vỏ trái ca cao 33

3.3 Phương pháp thống kê và xử lí số liệu 38

CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39

4.1 Kết quả phân lập và tuyển chọn một số chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp cellulase cao [3, 4] 39

4.1.1 Đặc điểm hình thái M1 39

4.1.2 Đặc điểm hình thái chủng M2 [4, 26] 40

4.1.3 Đặc điểm hình thái chủng M3 [4, 26] 41

4.1.4 Kết quả xác định sơ bộ khả năng phân giải của M1, M2,M3 42

4.1.5 Kết quả định danh các chủng giống nấm mốc đã phân lập 44

4.1.6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase 44

4.1.7 Kết quả hoạt độ enzyme cellulase của T.viride và A.niger bằng phương pháp đo đường khử 46

4.1.8 Kết quả xác định môi trường thích hợp cho khả năng sinh tổng enzyme cellulase của hai chủng nấm mốc 48

4.1.9 Kết quả khảo sát khả năng phát triển bào tử của hai chủng nấm mốc trên môi trường bán rắn 49

4.2 Kết quả thực nghiệm quá trình ủ phân 50

4.2.1 Kết quả phân tích một số thành phần nguyên liệu vỏ ca cao 50

4.2.2 Biến thiên nhiệt độ theo thời gian 52

4.2.3 Biến thiên độ ẩm trong thời gian ủ 54

Trang 8

Sv Nguyễn Văn Tới – Lớp DH09H1 v Khoa Hóa học và Công nghệ thực phẩm

4.2.5 Biến thiên hàm lượng cellulose trong đống ủ 57

4.2.6 Biến thiên hàm lượng carbon trong đống ủ 58

4.2.7 Biến thiên hàm lượng nitơ trong quá trình ủ 60

4.2.8 Biến thiên tỷ lệ C:N trong quá trình ủ 62

CHƯƠNG V.KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 64

5.1 Kết luận 64

5.2 Kiến nghị 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 PHỤ LỤC

Trang 9

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần vỏ ca cao – Lớp vỏ cứng 7

Bảng 2.2 Hàm lượng N và tỷ lệ C:N có trong một số phế phẩm 13

Bảng 2.3 Chủng vi sinh vật sinh enzyme cellulase ngoại bào 14

Bảng 2.4 Các chỉ tiêu phân hữu cơ 21

Bảng 3.1 Dụng cụ cần sử dụng 27

Bảng 3.2 Thành phần nguyên liệu cần chuẩn bị 35

Bảng 4.1 Đường kính vòng phân giải theo thời gian của M1, M2, M3 43

Bảng 4.2 Đường kính vòng phân giải trung bình theo thời gian của M1, M2, M3 43

Bảng 4.3 Kết quả định danh các chủng nấm mốc 44

Bảng 4.4 Đường kính vòng phân giải theo thời gian tại các giá trị pH khác nhau 45

Bảng 4.5 Đường kính vòng phân giải theo thời gian của T.viride và A.niger 45

Bảng 4.6 Hoạt tính enzyme cellulase của T viride và A.niger 47

Bảng 4.7 Hoạt tính enzyme cellulase của T viride và A.niger 47

Bảng 4.8 Ảnh hưởng của nguồn cellulose đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase 48

Bảng 4.9 Số lượng bào tử đếm được theo thời gian 50

Bảng 4.10 Các chỉ tiêu đầu vào của vỏ ca cao 51

Bảng 4.11 Các thông số nguyên liệu 51

Bảng 4.12 Biến thiên nhiệt độ (0C) theo thời gian 52

Bảng 4.13 Biến thiên độ ẩm trong quá trình ủ phân 54

Bảng 4.14 Biến thiên giá trị pH theo thời gian ủ 56

Bảng 4.15 Biến thiên hàm lượng cellulose trong đống ủ 57

Bảng 4.16 Biến thiên hàm lượng carbon trong quá trình ủ phân 59

Bảng 4.17 Biến thiên hàm lượng nitơ trong quá trình ủ phân 60

Bảng 4.18 Biến thiên tỷ lệ C:N trong quá trình ủ 62

Bảng 4.19 Đặc tính sản phẩm 63

Trang 10

Sv Nguyễn Văn Tới – Lớp DH09H1 vii Khoa Hóa học và Công nghệ thực phẩm

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Cây ca cao 5

Hình 2.2 Cấu tạo quả ca cao 7

Hình 3.1 Sơ đồ khối bố trí thí nghiệm 1 28

Hình 3.5 Mô hình thí nghiệm 33

Hình 3.6 Sơ đồ khối bố trí quá trình ủ phân hữu cơ từ vỏ trái ca cao 34

Hình 3.7: Mô hình đống ủ 37

Hình 4.2 Sợi chủng M1 39

Hình 4.1 Khuẩn lạc M1 39

Hình 4.3 Bào tử chủng M1 40

Hình 4.4 Cuống sinh bào tử chủng M1 40

Hình 4.5 Khuẩn lạc M2 40

Hình 4.6 Cuống sinh bào tử và hệ sợi chủng M2 41

Hình 4.7 Bào tử chủng M2 41

Hình 4.8 Mặt trước và sau khuẩn lạc M3 42

Hình 4.9 Hệ sợi - bào tử - cuống sinh bào tử M3 42

Hình 4.10 Đồ thị biểu diễn tương quan giữa đường kính vòng phân giải và thời gian của M1, M2, M3 43

Hình 4.11 Đường kính vòng phân giải trên môi trường thạch 44

Hình 4.12 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến hoạt độ enzyme cellulase của T.viride 45

Hình 4.13 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến hoạt độ enzyme cellulase của A.niger 46

Hình 4.14 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến hoạt độ enzyme cellulase theo thời gian của A.niger 47

Hình 4.15 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến hoạt độ enzyme cellulase theo thời gian của T.viride 48

Hình 4.16 Hoạt độ enzyme cellulase của T.viride trên môi trường bán rắn 49

Hình 4.17 Hoạt độ enzyme cellulase của A.niger trên môi trường bán rắn 49

Hình 4.18 Đồ thị biễu diễn lượng bào tử tạo thành trên môi trường ca cao 50

Hình 4.19 Biến thiên nhiệt độ (0C) theo thời gian 53

Hình 4.20 Biến thiên độ ẩm trong quá trình ủ phân 55

Hình 4.21 Biến thiên giá pH trong quá trình ủ phân 56

Hình 4.22 Biến thiên hàm lượng cellulose trong đống ủ 57

Hình 4.23 Biến thiên hàm lượng carbon trong quá trình ủ phân 58

Hình 4.24 Biến thiên hàm lượng nitơ trong quá trình ủ phân 60

Hình 4.25 Biến thiên tỷ lệ C:N trong quá trình ủ 62

Trang 11

TỪ VIẾT TẮT

A.flavus: Aspergillus flavus

A.niger: Aspergillus niger

CMC : Cacboxylmetyl cellulose

CMcase: Enzyme carboxylmethyl cellulase

DNS: Acid 2 hydoxy-3,5-Dinitrosalicylic

T.viride: Trichoderma viride

TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam

VSV: Vi sinh vật

Trang 12

Sv Nguyễn Văn Tới – Lớp DH09H1 1 Khoa Hóa học và Công nghệ thực phẩm

CHƯƠNG I

GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Chỉ tính riêng Tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu theo thống kê của trung tâm thu mua hạt

ca cao lên men Cargill năm 2012 có hơn 3.200 hecta trồng ca cao Mỗi vụ thu hoạch

ước tính sản lượng 70.400 tấn ca cao tươi, trung bình 11 kg trái tươi sẽ cho 1 kg hạt

khô Như vậy, mỗi vụ thu hoạch và chế biến có khoảng hơn 6.400 tấn vỏ trái ca cao

thải ra môi trường Nếu không xử lí nguồn phế phẩm này sẽ gây ô nhiễm môi trường

nghiêm trọng vì thành phần vỏ trái ca cao khá giàu dinh dưỡng và nước tự do tạo điều

kiện thuận cho vi sinh vật phát triển mạnh Bên cạnh đó một số loài nấm bệnh bám

trên vỏ ca cao, hoặc từ những trái ca cao thối rụng như Phytophthora, Fusarium hay

ấu trùng bọ xít muỗi có khả năng sẽ phát tán gây nhiễm cho vườn ca cao và các loại

cây trồng khác [24]

Mặt khác đất canh tác hiện nay đang được khai thác triệt để, đa số là chưa đúng

kỹ thuật nên đã làm suy thoái sức sản xuất của đất, làm sụt giảm hàm lượng chất hữu

cơ trong đất, giảm độ phì, cấu trúc đất cũng bị sụt giảm theo Thực tế sản xuất đã

khẳng định vai trò thiết yếu của phân hữu cơ trong việc duy trì độ phì nhiêu của đất,

ổn định năng suất cây trồng, góp phần vào sản xuất nông nghiệp bền vững Tuy nhiên,

hiện nay nguồn phân hữu cơ từ chất thải của gia súc ngày càng khan hiếm không đủ để

đáp ứng cho canh tác nông nghiệp của tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu nói riêng và cả nước

nói chung Trong khi đó, vỏ quả ca cao là một nguồn nguyên liệu hữu cơ tốt, có sẵn,

có thể sản xuất thành phân hữu cơ để thay thế một phần hay toàn bộ phân chuồng

Tăng giá trị sử dụng của trái ca cao, giúp người nông dân giảm chi phí phân bón

cho vườn ca cao và vườn cây trồng khác Ngoài ra, nấm Trichoderma còn có khả năng

ức chế sự phát triển của nấm Phytophthora, Fusarium đang là nỗi lo của những người

trồng ca cao [24, 25, 26]

Gần đây ở một số địa phương đã xuất hiện một số cơ sở sản xuất phân bón hữu

cơ dựa trên nguyên tắc phối trộn giữa than bùn với các phế thải của nông nghiệp và

phân chuồng, thêm một tỷ lệ thấp phân hóa học đạm, lân, kali Các quy trình ủ và phối

trộn này phụ thuộc vào bản chất của hệ vi sinh vật có sẵn trong phân, rác và một phần

do tác dụng của acid mùn: acid humic, fulvic… có sẵn trong than bùn Tuy nhiên hầu

hết các quy trình ủ trên đều sử dụng chế phẩm vi sinh vật thương mại, theo

Trang 13

TS Nguyễn Đăng Nghĩa - Viện Thổ Nhưỡng Nông Hóa Việt Nam và ThS Nguyễn Thu Hà Trưởng bộ môn Vi sinh vật - Trưởng phòng chủ nghiệm nông nghiệp số 12, các chủng VSV trong các sản phẩm thương mại rất khó hoạt hóa, khả năng thích ứng với môi trường kém Dẫn đến thời gian ủ trộn kéo dài và chất lượng không ổn định Mặt khác, vấn đề an toàn các sản phẩm nông nghiệp trong những thập kỷ tới đang được xếp là một trong những hạng mục ưu tiên hàng đầu, cần thiết phải đảm bảo

an toàn về sử dụng phân bón Vấn đề an toàn trong lĩnh vực này phải đảm bảo an toàn

về số lượng, chủng loại và chất lượng phân bón Nông dân từ lâu đã biết sử dụng nguồn phân bón hữu cơ trong quá trình canh tác Hơn nữa, mục tiêu của tỉnh là mở rộng phát triển diện tích trồng cây ca cao, vì vậy nhu cầu phân bón cho cây ca cao ngày một tăng Cùng với diện tích trồng tăng, khối lượng vỏ ca cao sau thu hoạch ngày một tăng, do đó việc xử lý và tận dụng nguồn hữu cơ giàu dinh dưỡng này như thế nào cho hợp lý là một vấn đề cần được quan tâm

1.2 Mục tiêu của đề tài

Phân lập, tuyển chọn được một số chủng nấm mốc từ môi trường tự nhiên có khả năng phân giải tốt cellulose trong vỏ ca cao

Rút ngắn thời gian ủ

Xác định tỷ lệ phối trộn thích hợp để phân nhanh hoai mục

Kiểm soát và điều chỉnh các yếu tố trong quá trình ủ

Xây dựng quy trình đơn giản có thể chuyển giao cho nông dân nhưng vẫn đảm bảo chất lượng phân thành phẩm

Kiểm tra, đánh giá chất lượng phân thành phẩm

1.3 Nội dung nghiên cứu

- Phân tích một số chỉ tiêu của vỏ ca cao: độ ẩm, hàm lượng carbon, hàm lượng nitơ, hàm lượng cellulose, hàm lượng phospho

- Phân lập và tuyển chọn những chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase tốt từ mẫu đất ở Xà Bang, Châu Đức; Bông Trang, Xuyên Mộc và TP.Vũng Tàu

- Xác định công thức phối trộn các thành phần cho đống ủ

- So sánh tốc độ hoai mục và sự biến đổi của các yếu tố trong quá trình ủ ở 3 nghiệm thức A1, A2, A3:

 A1- Nghiệm thức 1: bổ sung chế phẩm nấm Trichoderma thương mại

Trang 14

 A2 - Nghiệm thức 2: bổ sung nấm mốc được phân lập và tuyển chọn tại phòng thí nghiệm

 A3 - Nghiệm thức 3: không bổ sung nấm mốc

- Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của phân thành phẩm

Trang 15

CHƯƠNG II

LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu cây ca cao

2.1.1 Nguồn gốc cây ca cao [11]

Nguồn gốc của cây ca cao ở lưu vực sông Amazon, Nam Mỹ Từ đó cây ca cao phát tiển sang các nước khác ở Trung và Nam Mỹ với hai loài chính là Criollo và Forastero Criollo có hạt dạng tròn, có hương vị nhẹ nhưng tương đối dễ nhiễm bệnh Forastestero có dạng cây cao, khỏe, hạt to hơn Criollo nhưng hương vị nhạt hơn Hạt Foratestero dạng dẹp, lá mầm bên trong màu tím, chứa nhiều loại chất béo hơn Criollo

Do vậy, hầu hết các vùng trồng ca cao lớn trên thế giới hiện nay đều trồng dạng Foratestero Thổ dân Nam Mĩ dùng ca cao làm đồ uống Hạt ca cao được rang lên, nghiền nhỏ, trộn thêm bột ngô, vanilla và đôi khi cả ớt Ngày nay, ở một số nước như Colombia, Philippin, dạng đồ uống đặc sệt như vậy còn tồn tại, mặc dù có thay đổi chút ít như thêm đường, vanilla hoặc tinh dầu quế Ở Nicaragua, hạt ca cao có lúc được dùng như một thứ tiền tệ trong trao đổi mua bán Ca cao được sử dụng rộng rãi

từ thế kỉ thứ 6 ở các bộ tộc Maya và đến thế kỉ thứ 16 lưu hành rộng rãi ở Trung Mỹ

Từ thế kỉ thứ 16, ca cao bắt đầu phát triển rộng ra các nước khác trên thế giới, trước hết là các nước Nam Mỹ và vùng biển Caribe như Venezuela, Haiti, Jamaica Ca cao vượt Thái Bình Dương và được trồng ở Philippin vào đầu thế kỉ 17, sau đó tiếp tục mở rộng qua Ấn Độ và Scrilanca vài chục năm sau Cho đến thời gian này loại phụ Criollo vẫn chiếm diện tích chủ yếu Brazil và Ecurador là những nước đầu tiên phát triển loại phụ Foratestero và đầu thế kỉ 19 ca cao bắt đầu được xuất khẩu với quy mô 2000-5000 tấn từ các nước Nam Mỹ

Cuối thế kỉ 19 ca cao mới được trồng tại các nước Tây Phi, trước hết là Ghana và Nigieria Ngày nay, ca cao phát triển rất nhanh do có thị trường ở Châu Âu Năm 1900 Châu Phi chỉ chiếm 17 % tổng sản lượng ca cao thế giới nhưng đến năm 1960, tỷ lệ này đã lên đến 73 % Từ năm 1985 trở lại đây, các nước Châu Á bắt đầu phát triển mạnh cây ca cao, trước hết là ở các nước Malaysia, Indonesia, Ấn Độ, SriLanka… Vào đầu thế kỷ 20, người Pháp đã đưa cây ca cao vào miền nam Việt Nam, tuy nhiên do một số yếu tố cây ca cao thời điểm đó chưa thật sự phát triển Khoảng năm

1994, một dự án về trồng cây ca cao với quy mô 10.000 ha được thực hiện, chủ yếu ở

Trang 16

tỉnh Quảng Ngãi tuy nhiên vẫn thất bại không thể phát triển mạnh như cây cao su và cây cà phê

Những năm gần đây, cây ca cao đã được trồng nhiều hơn và bắt đầu gia nhập thị trường thế giới Từ năm 2005, Bộ NN&PTNT đã thành lập Ban điều phối ca cao Việt Nam (VCCC) nhằm hỗ trợ việc xây dựng các chính sách liên quan đến ngành sản xuất

ca cao Việt Nam

Năm 2005, công ty TNHH Cargill Việt Nam, doanh nghiệp 100 % vốn của Mỹ ở Đồng Nai đã chi ra cả tỷ đồng để lập trạm thu mua ca cao ở Bến Tre, sau đó mở tiếp trạm thu mua ở Đaklak, những địa phương có diện tích trồng ca cao lớn hiện nay

Hệ thống tiêu chuẩn cho cây ca cao và sản phẩm ca cao cũng được xây dựng vào năm 2006 Để thúc đẩy ngành sản xuất ca cao phát triển, 14/9/2007 Bộ NN&PTNT đã ban hành Quyết định 2678/2007/QĐ-BNN-KH đề ra mục tiêu đến năm 2015 phải đạt 60.000 ha ca cao và đến năm 2020 diện tích trồng ca cao ở Việt Nam sẽ đạt 80.000 ha Năm 2002, tổ chức Success Alliance có dự án phát triển cây ca cao mà khởi đầu từ tỉnh Bến Tre, sau đó là các tỉnh Tiền Giang, Bình Phước, Bà Rịa Vũng Tàu, Đaklak và

01 bộ giống ca cao gồm 8 dòng thương mại đã được công nhận để nhân giống phục vụ sản xuất Vào thời điểm hiện tại, tính riêng tại địa bàn tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu đã có đến hơn 3.200 ha trồng ca cao, dự án phát triển ca cao đang được đẩy mạnh phát triển Trong tương lai tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu cũng như các tỉnh ĐBSCL, Đaklak sẽ trở thành khu vực có ngành sản xuất ca cao phát triển mạnh

Hình 2.1 Cây ca cao

2.1.2 Đặc điểm của cây ca cao [11]

Ca cao là loài thân gỗ nhỏ có thể cao đến 10-20 m nếu mọc tự nhiên trong rừng Trong sản xuất người ta thường xén bớt để việc thu hoạch có thể dễ dàng hơn và độ

Trang 17

cao của cây khi đã trưởng thành không quá 7,5 m, đường kính thân cây từ 10-15 cm Cây ca cao sinh trưởng tốt dưới bóng che, do đó cây ca cao cần được che chắn để tránh bớt tia nắng mặt trời và gió, đặc biệt là trong những giai đoạn đầu của thời kì phát triển

và có thể trồng xen canh cây ca cao với một số loài cây kinh tế khác Thời kì kinh doanh hiệu quả có thể kéo dài từ 25-40 năm

Mỗi năm cây ca cao cho đến hàng nghìn hoa ở thân chính và cành to nhưng chỉ

có 1-3 % thành trái Sau khi thụ phấn trái tăng trưởng chậm trong khoảng 40 ngày đầu

và đạt tốc độ tối đa sau 75 ngày Sau khi thụ phấn 85 ngày sự tăng trưởng của trái chậm lại, trong khi hạt bên trong trái bắt đầu tăng trưởng nhanh, đây cũng là thời kì hạt tích lũy chất béo Lớp cơm nhầy hình thành khoảng 140 ngày sau khi thụ phấn đến khi trái chín kéo dài từ 5-6 tháng

Trái ca cao có thể đạt chiều dài từ 15-20 cm, khối lượng trung bình từ 200g-1kg Tùy theo từng loài, hình dạng của trái thay đổi từ hình cầu, hình dài nhọn, hình trứng hoặc hình ống Màu sắc của trái khá đa dạng: màu xanh, màu vàng, màu đỏ Mỗi trái chứa khoảng 20-40 hạt

Lớp cơm nhầy chiếm khoảng 15-20 % trọng lượng của hạt ca cao tươi và chứa một trữ lượng đường cao, có thể sử dụng lớp cơm nhầy này làm nước sinh tố, kem hoặc cô đặc làm nước cốt trái cây, hay sử dụng chế biến rượu vang

Vỏ quả ca cao chứa 3-4 % kali trên trọng lượng chất khô, là nguồn phân bón giàu kali Tro đốt từ vỏ đã từng được sử dụng để làm xà phòng Vỏ quả ca cao khô, xay nhỏ

có thể độn vào thức ăn cho bò, cừu, dê Bò có thể ăn trực tiếp vỏ tươi thay thế được cho khẩu phần cỏ voi

2.2 Thành phần hóa học của vỏ trái ca cao [11, 27]

Nước, chất béo, cacbohydrate, nitrogen, acid hữu cơ, muối khoáng,…các thành phần này sẽ có các hàm lượng khác nhau ở chất nhầy, vỏ hạt và thịt hạt

 Chất nhầy (thịt quả) có hàm lượng nước và đường cao nhất, ngoài ra còn có acid citric làm cho pH của thịt quả luôn ở 3,5

 Vỏ hạt có hàm lượng cacbohydrates cao

Hàm lượng khoáng trung bình có trong vỏ quả ca cao vào khoảng 8,2 % trọng lượng vỏ Trong đó đa số là Fe, K, Mg…

Trang 18

Hình 2.2 Cấu tạo quả ca cao

2.3 Một số loại nấm bệnh ký sinh trên vỏ ca cao [11, 24]

Cây ca cao thích hợp trồng ở Việt Nam và có thể trồng xen canh trong vườn dừa, nhãn, sầu riêng…tuy nhiên với điều kiện khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa tại Việt Nam rất thích hợp cho sự phát triển của các loại bệnh gây hại cây ca cao ảnh hưởng đến năng suất thu hoạch rất lớn

Ngoài các loại bệnh do bọ xít, rầy gây nên, bệnh thối thân, cháy lá, thối trái do

Phytophthora gây ra đang là mối lo ngại lớn nhất của nông dân hiện nay Bệnh xuất

hiện ở mọi nơi, mọi bộ phận, qua mọi giai đoạn trong quá trình sinh trưởng của cây ca cao đến khi thu hoạch Bệnh phát tán từ hai nguồn chính là đất và trái bệnh

Trang 19

 Từ đất: nước mưa làm đất có mầm bệnh văng lên cây, lá; kiến và mối tha đất

có mầm bệnh làm tổ trên thân cây

 Từ trái bệnh: bào tử phát tán do gió, nước mưa, côn trùng

Biện pháp phòng trừ:

- Sử dụng nấm đối kháng;

- Hái bỏ ngay những trái bệnh đem chôn để tránh bào tử phát tán;

- Tỉa cành hợp lí tạo thông thoáng, giảm độ ẩm dưới tán lá trong vùng mang trái;

2.4 Tổng quan về phân hữu cơ [18]

2.4.1 Khái niệm phân hữu cơ [18]

Phân hữu cơ là tên gọi chung của các loại phân được sản xuất từ các vật liệu như: phế phẩm trong nông nghiệp, phân chuồng, phân xanh (bèo, cây họ đậu…), than bùn…

Phân hữu cơ chủ yếu gồm hai loại: phân hữu cơ sinh học, phân hữu cơ vi sinh

- Phân hữu cơ sinh học: là loại phân có nguồn gốc hữu cơ được sản xuất bằng công nghệ sinh học (như lên men vi sinh) và phối trộn thêm một số hoạt chất khác để làm tăng độ hữu hiệu của phân, hoặc khi bón vào đất sẽ tạo môi trường cho các quá trình sinh học trong đất diễn ra thuận lợi góp phần làm tăng năng suất cây trồng

- Phân hữu cơ vi sinh: là chế phẩm phân bón được sản xuất bằng cách dùng các loại vi sinh vật hữu ích cấy vào môi trường là chất hữu cơ (như bột than bùn) Khi bón cho đất các chủng loại vi sinh vật sẽ phát huy vai trò của nó phân giải chất dinh dưỡng khó tiêu thành dễ tiêu cho cây hấp thụ, hoặc hút đạm khí trời để bổ sung cho đất và cây

Sản phẩm phân hữu cơ là quá trình phân huỷ mà trong đó cơ chất liên tục bị phân hủy bởi các quần thể vi sinh vật kế tục nhau Sản phẩm của sự phân hủy của quần thể

vi sinh vật này sẽ làm cơ chất cho quần thể vi sinh vật tiếp theo Các quá trình nối tiếp

Trang 20

nhau bắt đầu bằng cách phân hủy những phân tử phức tạp trong cơ chất thô thành các dạng đơn giản hơn bởi các vi sinh vật có sẵn trong cơ chất

2.4.2 Ưu nhược điểm của phân hữu cơ [18]

 Ưu điểm:

- Giảm thiểu ô nhiễm;

- Diệt các mầm bệnh nguy hiểm do trong quá trình phân hủy sinh học, nhiệt độ

có khi lên đến 70-80°C làm tiêu hủy trứng, ấu trùng, nấm bệnh trong chất thải Phân sau khi ủ có thể được sử dụng an toàn hơn phân tươi;

- Tăng độ ẩm cần thiết cho đất trồng, giảm thiểu sự rửa trôi khoáng chất do các thành phần vô cơ không hòa tan trong phân;

- Phân khô ráo, thể tích nhỏ thuận lợi vận chuyển, thu gom

 Nhược điểm:

- Phần lớn vi khuẩn bị tiêu diệt nhưng không phải hoàn toàn, đặc biệt khi ủ phân hữu cơ không đồng đều về thời gian, phương pháp, lượng ủ… Một số mầm bệnh tồn tại có thể gây nguy hiểm cho người dùng;

- Thành phần phân ủ thường không ổn định về chất lượng do thành phần nguyên liệu đưa vào không đồng đều;

- Phải tốn thêm công ủ và diện tích, việc ủ phân thường ở dạng thủ công và lộ thiên tạo sự phản cảm về mỹ quan và phát tán mùi hôi

2.4.3 Tình hình ứng dụng vi sinh vật xử lí rác thải [14]

2.4.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới [14]

Hiện nay rác thải sinh hoạt và phế phẩm nông nghiệp là một thảm họa khó lường trong sự phát triển mạnh mẽ của quá trình sản xuất, chế biến nông nghiệp Phế thải nông nghiệp không chỉ làm ô nhiễm môi trường sinh thái, ô nhiễm nguồn nước, ô nhiễm đất, gây độc hại đến sức khỏe con người, vật nuôi và cây trồng mà còn làm mất

đi cảnh quan văn hóa đô thị và nông thôn

Ở các nước phát triển như EU - Mỹ - Úc - Nhật Bản - Singapo đều có hệ thống thu gom và phân loại rác thải gia đình, nơi công cộng ngay cả ở các vùng nông thôn Sau đó tái chế phần rác thải hữu cơ thành phân bón hữu cơ bón cho cây trồng Tại nhiều nước đang phát triển của Châu Á như: Thái Lan, Indonesia, Malaysia cũng đã có nhiều chương trình giáo dục và nghiên cứu khoa học về thu gom rác thải hữu cơ góp

Trang 21

phần làm sạch môi trường và tạo nguồn phân bón hữu cơ bằng công nghệ sinh học cho sản xuất nông nghiệp

Tại các nước phát triển - Châu Âu và các nước đang phát triển - Thái Lan, Malaysia, Ấn Độ đã xây dựng nhiều cơ sở ủ chế biến rác thải hữu cơ sinh hoạt và phế phẩm nông nghiệp bằng công nghệ sinh học để sản xuất phân bón hữu cơ bón cho rau, hoa cây cảnh đem lại lợi ích kinh tế cao

Ở Úc, Ấn Độ, Thái Lan…đã thu gom tàn dư thực vật trên đồng ruộng dùng chế phẩm vi sinh vật xử lí thành rác thải hữu cơ tại chỗ để trả lại cho đất làm sạch đồng ruộng và chống ô nhiễm môi trường

Ở Đài Loan với công nghệ sản xuất phân hữu cơ từ phế thải mùn rác, phế thải chăn nuôi công suất hàng trăm ngàn tấn/năm (leichu Enterprise Co.Ltd 2000)

Ở Ấn Độ dùng công nghệ vi sinh vật xử lí hèm rượu, bã bùn lọc trong quá trình sản xuất đường để thành phân hữu cơ bón cho cây trồng với công suất hàng chục ngàn tấn/năm

2.4.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước [14]

Việc nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật trong nước ta để xử lý chất thải rắn cũng đang là một hướng đi đầy triển vọng Bởi vì, nó không chỉ giải quyết được những vấn đề rác thải có thành phần hữu cơ cao mà còn tạo ra nhiều loại sản phẩm khác phục

vụ cho nông nghiệp Trong đó, vi sinh vật góp phần bảo vệ môi trường sinh thái và xây dựng một nền nông nghiệp xanh - phát triển bền vững

Canh tác tự nhiên là một phương pháp nhằm thực hiện mục tiêu trên Canh tác tự nhiên tận dụng các chất hữu cơ, phụ phẩm nông nghiệp tại chỗ: vỏ cà phê, lõi bắp, vỏ trấu, rơm rạ, bã mía, xơ dừa, mùn cưa,…qua quá trình tự lên men tạo ra phân bón hữu

cơ thay thế cho một phần phân hóa học Canh tác tự nhiên đã giúp giảm chi phí đầu vào, giúp cây trồng phát triển tốt, giảm 40 % lượng phân bón và thuốc trừ sâu so với canh tác thông thường

Để xử rác thải sinh học, mô hình sử dụng chế phẩm Bokashi đã được áp dụng rộng rãi trong các hộ gia đình ở tỉnh Bắc Giang (Việt Nam) Chế phẩm này được tạo ra

từ việc lên men chất hữu cơ (cám gạo) với dung dịch vi sinh vật EM (effective microorganisms) trong 7-8 ngày Sau đó, chế phẩm được rắc vào rác thải giúp quá trình phân hủy rác tốt hơn Chế phẩm EM là chế phẩm được sản xuất từ vi khuẩn

Trang 22

quang hợp, vi khuẩn lên men acid lactic, nấm men, xạ khuẩn Các loại vi sinh vật này giúp tăng quá trình phân hủy rác thải

Một số vấn đề chống ô nhiễm môi trường mới được nghiên cứu với các chương trình, các đề tài Nhà nước:

- Đề tài KHCN 02-04 giai đoạn 1996-2000 do GS Lê Văn Nhương chủ trì “Xử

lí phế thải hữu cơ rắn: lá mía, vỏ cà phê” bằng công nghệ sinh học chống ô nhiễm môi

Trường Đại học Nông nghiệp I - Hà Nội 2001-2002

Nhìn chung kết quả nghiên cứu của các đề tài, các dự án cho thấy nhiều triển vọng tốt, đã góp phần vào xử lí phế thải nông công nghiệp chống ô nhiễm môi trường 2.4.4 Một số mô hình ủ phân hữu cơ tại Việt Nam

Xuất phát từ thực tiễn nhu cầu phân hữu cơ, phân hữu cơ vi sinh trong sản xuất nông nghiệp nước ta ngày càng cao, nên nhiều nơi đã tiến hành nghiên cứu, thử nghiệm sản xuất phân hữu cơ, phân hữu cơ vi sinh từ nguồn nguyên liệu là rác thải, phụ phế phẩm nông nghiệp Những mô hình này bước đầu đã đạt được một số thành công đáng kể nhưng bên cạnh đó vẫn còn những nhược điểm cần nghiên cứu khắc phục khi phổ biến trên quy mô lớn hay nhân rộng mô hình

- Mô hình “Ủ phân hữu cơ từ thân cây ngô” (2011) của anh Nguyễn Công Huế

nông dân huyện Trảng Bom, Đồng Nai [7] Mô hình này được đánh giá đạt hiệu quả cao của Trung tâm khuyến nông huyện Trảng Bom Kết quả thu được từ mô hình này

là qua gần 4 tháng ủ với thân cây bắp được tận thu sau hoạch vụ đông xuân trên diện tích 2.500 m2, ủ cùng 10 lít chế phẩm sinh học 3 kg nấm Trichoderma và trộn cùng

2.000 kg phân chuồng đã tạo được 5.000 kg phân hữu cơ Phương pháp ủ được sử dụng là ủ đống Mô hình này được xem là thành công nhưng vẫn còn vướng phải một

số nhược điểm sau:

Trang 23

 Thời gian ủ còn dài;

 Chưa kiểm soát được nguồn chế phẩm sinh học và giống nấm mốc

Trichoderma;

 Chưa xác định được các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình ủ;

 Chưa kiểm soát được chất lượng phân thành phẩm

- Mô hình “Ủ phân hữu cơ từ vỏ quả cà phê” (2007) của Trung tâm Khuyến

nông tỉnh Đăk Lăk [19] Kết quả thu được từ mô hình này là từ 1.000 kg vỏ quả cà phê được lấy từ quá trình xay xát tạo ra 3.000 kg cà phê nhân, phân chuồng: 200 kg, phân lân nung chảy: 50 kg, phân urê: 10 kg, vôi bột: 15 kg, đường cát: 2 kg, men sinh học:

2 kg Sau 3,5 - 4 tháng ủ, thu được 1.400 kg phân hữu cơ Phương pháp ủ được sử dụng là ủ đống Mô hình ủ này thực hiện theo một quy trình công nghệ phù hợp và được kiểm soát tốt trong quá trình ủ Tuy nhiên trong mô hình này vẫn còn một số hạn chế như:

- Thời gian ủ còn dài;

- Dùng chung một loại chế phẩm sinh học cho hai giai đoạn ủ nên hiệu quả phân giải cellulose chưa cao;

- Mô hình “Sản xuất phân hữu cơ từ rác thải hữu cơ sinh hoạt và phế thải nông nghiệp dùng để làm phân bón cho rau sạch vùng ngoại vi thành phố” (2005), Đào

Châu Thu, ĐH Nông Nghiệp I, Hà Nội [14] Mô hình này sử dụng quy trình phức tạp, khó thực hiện và chuyển giao đến nông dân

2.4.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình ủ phân

2.4.5.1 Yếu tố dinh dưỡng

Đề tài này sử dụng vỏ ca cao làm cơ chất ủ phân hữu cơ Cellulose trong vỏ ca cao sẽ bị thủy phân bởi các enzyme của vi sinh vật thành các monosaccharide cung cấp năng lượng cho vi sinh vật trong phân hữu cơ hoạt động [21]

Tuy nhiên, vỏ ca cao không phải là nguồn nguyên liệu quá giàu dinh dưỡng, dễ dàng phân huỷ nhanh, chúng phải được phối trộn với các thành phần khác gọi là nguyên liệu bổ sung Các nguyên liệu này bổ sung trên cơ sở công thức được tính toán sao cho các chất dinh dưỡng có tỷ lệ hợp lý Các thông số xác lập công thức này là lượng carbon, nitơ tổng số và tỷ lệ C:N của nguyên liệu [23]

Quá trình chế biến phân hữu cơ là quá trình phân hủy nguyên liệu bằng hoạt động của vi sinh vật có trong nguyên liệu Vi sinh vật trong nguyên liệu bắt đầu hoạt

Trang 24

động khi được bổ sung thêm nước Để kích thích hoạt động và tăng sinh khối vi sinh vật trong phân hữu cơ, các chất dinh dưỡng giàu protein và cacbonhydrate hòa tan cần phải được bổ sung Các chất này được bổ sung một cách cân đối, chúng không chỉ cung cấp nitơ mà còn bổ sung các chất hữu cơ Một số nguyên liệu sau được bổ sung vào phân hữu cơ như:

- Các chất có hàm lượng nitơ cao như: (NH4)2SO4, NH4NO3 và urea;

- Cám gạo;

- Phân bò, phân gà, phân heo, phân dê

Ngoài ra có bổ sung thêm lân và các khoáng chất dinh dưỡng khác Những khoáng chất dinh dưỡng được phân thành 2 loại: đa lượng và vi lượng

- Các nguyên tố đa lượng: C, N, P, Ca và K

- Các nguyên tố vi lượng: Mg, Mn, Co, Fe, S

Tỷ lệ C:N trong phân hữu cơ là một tỷ lệ rất quan trọng cần được xác định Tỷ lệ C:N là hệ số dinh dưỡng chính Dựa trên nhu cầu carbon và nitơ tương đối cho sự phát triển của tế bào, tỷ lệ trên lý thuyết là 25:1 Trong thực tiễn sản xuất phân hữu cơ, tỷ lệ này vào khoảng 20:1 đến 25:1

Theo kinh nghiệm chung, nếu tỷ lệ C:N vượt quá giới hạn vừa nêu, tốc độ phân hủy sẽ bị chậm lại Ngược lại, nếu tỷ lệ thấp hơn 20:1 thì nitơ có khả năng bị thất thoát Lý do thất thoát nitơ bởi vì nitơ dư chuyển hóa thành nitơ trong NH3

Tỷ lệ C:N không thuận lợi, cao có thể được hạ thấp xuống bằng cách bổ sung thêm chất thải có nhiều nitơ vào nguyên liệu đầu vào Nếu khả năng kinh tế cho phép,

có thể hạ tỷ lệ C:N bằng cách thêm phân bón hóa học như: phân urea hay ammonium sulfate Trái lại, chất thải có nhiều C có thể được sử dụng để nâng tỷ lệ C:N thấp

Trang 25

2.4.5.2 Vi sinh vật

a Một số loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase tốt trong tự nhiên Mặc dù có nhiều loại vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase, nhưng chỉ có một số ít vi sinh vật là có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase với

số lượng lớn Sau đây là kết quả nguyên cứu các chủng vi sinh vật sản xuất enzyme cellulase

Bảng 2.3 Chủng vi sinh vật sinh enzyme cellulase ngoại bào [1, 17]

cellulose cao rất đa dạng và phong phú bao gồm: vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc…[18]

Các nhóm vi sinh vật này có khả năng phân hủy cellulose nhờ có hệ enzyme cellulase ngoại bào Trong đó nấm mốc là nhóm được nghiên cứu nhiều nhất trong lĩnh vực phân hủy cellulose [1, 18] Vì chúng có khả năng tiết ra môi trường một lượng lớn enzyme cellulase với nồng độ rất cao và có tác dụng phân hủy rất mạnh cellulose Các chi nấm

có khả năng sinh enzyme cellulase phổ biến là: Aspergillus, Penicillium, Trichoderma…với khả năng chống chịu pH và khả năng sử dụng nguồn carbon, nguồn

nitơ tốt [18]

Nhiều loài vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose, tuy nhiên cường độ không mạnh bằng nấm mốc Nguyên nhân là do số lượng enzyme tiết ra môi trường của vi khuẩn thường nhỏ hơn, thành phần các loại enzyme không đầy đủ Thường ở trong

Trang 26

đống ủ có ít loài vi khuẩn có khả năng tiết đầy đủ các loại enzyme trong hệ enzyme cellulase Nhóm này tiết ra một loại enzyme, nhóm khác tiết ra các loại khác, chúng phối hợp với nhau để phân giải cơ chất trong mối quan hệ hỗ sinh

Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật phân hủy cellulose cao [18], nó đóng vai trò quan trọng thứ hai sau nấm mốc Người ta rất chú ý việc dùng xạ khuẩn để xử lý phụ phế phẩm nông nghiệp, bởi vì so với nấm mốc, vi khuẩn thì nó ít phát tán lây lan cho các

đối tượng khác Người ta thường sử dụng xạ khuẩn đặc biệt là chi Streptomyces,

những xạ khuẩn này thường thuộc nhóm ưa nóng, sinh trưởng và phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 45-500C rất thích hợp với quá trình ủ phân hữu cơ

Đa số vi sinh vật phân giải cellulose trong điều kiện hiếu khí và một số vi sinh vật kị khí là loài ưa ẩm và ưa nóng Vì vậy nếu ta sản xuất được một lượng enzyme cellulase lớn với mức chi phí thấp thì ta có thể tận dụng được nguồn phế thải lớn từ phế phẩm nông nghiệp [18]

Trong quá trình thực hiện đề tài tôi sử dụng bổ sung chế phẩm sinh học GEM đã chứa vi khuẩn và xạ khuẩn, song ở giai đoạn thứ hai chúng tôi bổ sung thêm nấm mốc

để tăng hiệu quả quá trình ủ, rút ngắn thời gian ủ Vì vậy chúng tôi đã tiến hành phân

lập, tuyển chọn Trichoderma và Aspergillus ứng dụng vào quá trình ủ phân hữu cơ từ

vỏ trái ca cao

b Vi sinh vật phân hủy tinh bột trong đống ủ

Trong đống ủ có nhiều loại vi sinh vật có khả năng phân giải tinh bột [18] Một

số vi sinh vật có khả năng tiết ra môi trường đầy đủ các loại enzyme trong hệ enzyme

amylase Ví dụ như một số vi nấm bao gồm một số loài trong các chi Aspergillus, trong nhóm vi khuẩn có các loài thuộc chi Bacillus, Cytophaga…xạ khuẩn cũng có

một số chi có khả năng phân giải tinh bột

Đa số các vi sinh vật không có khả năng tiết đầy đủ hệ enzyme amylase để phân hủy tinh bột Chúng chỉ có thể tiết ra môi trường một hoặc một vài enzyme trong hệ

đó Ví dụ như các loài Aspergillus niger, Bacillus subtilis, Clostridium butiricum… chỉ tiết ra môi trường một loại enzyme -amylase Các loài Aspergillus oryzae, Clostridium acetobutilicum…chỉ tiết ra môi trường enzyme -amylase Một số loài

khác chỉ tiết ra môi trường enzyme glucoamylase Các nhóm này cộng tác với nhau trong quá trình phân hủy tinh bột thành đường

Trang 27

c Vi sinh vật phân hủy phosphate

Phospho là một thành phần khoáng rất quan trọng trong tế bào của vi sinh vật và

là một yếu tố dinh dưỡng không thể thiếu được trong sự phát triển của các loài nấm [18] Các hợp chất lân hữu cơ trong đống ủ rất nhiều và có nguồn gốc từ xác thực vật, phân gia súc, gia cầm…Sự chuyển hóa các hợp chất phospho hữu cơ thành muối của

H3PO4 được thực hiện bởi nhóm vi sinh vật phân hủy phospho hữu cơ [28]

Những vi sinh vật này có khả năng tiết ra enzymes phosphatase để xúc tác cho quá trình phân giải Vi sinh vật phân giải lân hữu cơ chủ yếu thuộc hai chi Bacillus và Pseudomonas Các loài có khả năng phân giải mạnh là Bacillus megatherium, Bacillus mycoides và Pseudomonas sp

Các hợp chất lân khó tan còn nằm trong các hợp chất khoáng bổ sung vào trong đống ủ Rất nhiều vi sinh vật tham gia phân giải lân vô cơ, trong đó vi khuẩn có rất

nhiều loài phân giải mạnh như: Bacillus megatherium, Bacillus butyricus…

Các vi khuẩn nitrat hóa sống trong đống ủ cũng có khả năng phân giải lân vô cơ,

do nó có khả năng chuyển NH3 thành NO2-, rồi NO3- Rồi NO-3 sẽ phản ứng với H+ tạo thành HNO3 HNO3 sẽ phản ứng với phosphate khó tan thành dạng dễ tan:

Ca3(PO4)2 + 4HNO3 Ca(H2PO4 )2 + 2Ca(NO3)2 Ngoài ra một số vi nấm và xạ khuẩn cũng có khả năng phân hủy lân vô cơ Trong

nhóm vi nấm thì A.niger có khả năng phân giải lân mạnh nhất

d Vi sinh vật phân giải protein

Quá trình phân giải protein còn gọi là quá trình amon hóa Vai trò của vi sinh vật

chính là thông qua các quá trình amon hóa - phân giải protein, urê, acid uric,… để biến

các chất thải này thành dạng có ích [18] Có nhiều vi sinh vật có khả năng phân giải protein: nấm mốc, xạ khuẩn và vi khuẩn

Muốn phân giải protein các vi sinh vật phải tiết vào môi trường enzyme protease ngoại bào Chúng xúc tác quá trình thủy phân liên kết peptide và một số liên kết khác

để phân cắt protein thành các phân tử nhỏ hơn Các chất này tiếp tục được phân hủy thành các aminoacid nhờ enzyme peptidase hoặc hấp thu trực tiếp và phân hủy thành aminoacid sau khi vào tế bào, một phần các aminoacid được sử dụng để xây dựng protein của chúng, một phần tiếp tục bị phân hủy, sản phẩm của quá trình này là NH3,

CO2 và nhiều sản phẩm trung gian khác

Trang 28

Quá trình phân giải protein có thể xảy ra trong điều kiện hiếu khí và kị khí Trong điều kiện hiếu khí, các hợp chất hữu cơ chứa nitơ được phân giải bởi các loài

thuộc chi Bacillus, Pseudomona…Một số loài trong chi Clostridium thực hiện quá

Rất nhiều vi sinh vật có khả năng amon hóa protein:

- Vi khuẩn: Bacillus mycoides, Clostridium…

- Xạ khuẩn: Streptomyces griceus, Streptomyces rimosus…

- Nấm mốc: A.flavus, A.niger, Penicillium, mucor…

e Vi sinh vật phân giải hemicellulose

Do cấu trúc của hemicellulose không chặt, rất nhiều vi sinh vật trong các nhóm nấm mốc, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn có khả năng tổng hợp và phân giải hemicellulose [18]

Ngoài ra vi sinh vật phân giải hemicellulose thường có trong dạ dày của động vật

nhai lại như trâu bò, chủ yếu là các giống sau: Bacillus, Bacteroides, Closridium Nhiều loại nấm sợi như: Aspergillus, Penicillium, Trichoderma

2.4.5.3 Kích cỡ hạt

Kích thước các hạt trong chất thải là yếu tố có liên quan đến dinh dưỡng, bởi vì chất thải là cơ chất trong quá trình sản xuất phân hữu cơ và cơ chất lại chính là nguồn dinh dưỡng Kích cỡ hạt quyết định tỷ lệ khối được phô bày thành bề mặt Do đó, quyết định khối hạt tiếp xúc trực tiếp với sự tấn công của vi sinh vật [23]

Độ xốp phụ thuộc phần lớn vào sức bền của cấu trúc của chất liệu hạt Nguyên vật liệu có cấu trúc chắc, khỏe, chịu được lực nén ép như gỗ, rơm, giấy, giữ được độ xốp cao với kích thước hạt rất nhỏ Những chất thải nêu trên có kích cỡ hạt thích hợp khoảng 1,5-7 cm Kích thước hạt phù hợp đối với gỗ dạng dăm bào có độ dày khoảng 1cm và có chiều rộng khoảng 2-5 cm Những chất thải có nguồn gốc từ sợi và do cắt tỉa cây cối có kích thước thích hợp từ 5-10 cm Kích thước hạt cho phép tối thiểu đối với những loại rác mềm có xu hướng lớn hơn bởi vì những hạt vật liệu mềm có kích cỡ

Trang 29

nhỏ quá mức cho phép có khuynh hướng kết lại thành một khối vô định hình đến mức rất ít lỗ xốp hoặc thậm chí không có lỗ xốp nào Như vậy, kích cỡ cho phép tối thiểu của rác thực vật tươi, rác thải rau quả có thể to khoảng 15 cm và thậm chí có thể lớn hơn với những loại rác khác mềm hơn

Sự giảm kích cỡ luôn luôn được tiến hành với một thiết bị cắt hoặc máy xay nghiền, đó thường là thiết bị lớn và đắt tiền Vì thế có thể chọn giải pháp khác cho việc cắt giảm kích thước, đó là đảo trộn vật liệu để làm cho chúng gãy vỡ, bị rách, bị dập một cách tương đối

2.4.5.4 Độ pH

Độ pH của khối ủ thay đổi theo thời gian [5] Vào giai đoạn đầu của quá trình sản xuất phân hữu cơ độ pH thường bị giảm xuống [12], tuy nhiên không bao lâu sau nó bắt đầu tăng lên Sở dĩ ban đầu pH giảm xuống là do những phản ứng tạo thành acid hữu cơ, những acid này sẽ đóng vai trò là cơ chất cho quần thể vi sinh vật kế tiếp, pH sau đó tăng lên tương ứng với việc vi sinh vật sử dụng những acid vừa sinh ra trong giai đoạn trước Bởi vì độ pH tối thiểu trong giai đoạn giảm xuống ban đầu không gây

ức chế đối với hầu hết các loài vi sinh vật

2.4.5.5 Nước

Nước là thành phần rất quan trọng trong chế biến phân hữu cơ [14, 22] Lượng nước trong phân hữu cơ liên quan đến mức độ hoạt động của vi sinh vật Sự hoạt động của vi sinh vật tạo ra lượng nhiệt trong đống ủ phân hữu cơ và hấp thụ các chất dinh dưỡng trong dung dịch Ngoài ra, vi sinh vật không chỉ cần nước để sinh trưởng mà còn cần oxy

Mối quan hệ nghịch giữa lượng nước và oxy trong đống ủ phân hữu cơ như sau: phân hữu cơ ẩm độ cao sẽ dẫn đến thiếu không khí, ẩm độ thấp thì nhiều không khí, nhiệt độ trong đống ủ thấp Phân hữu cơ quá ướt làm cho bề mặt phân hữu cơ có nhiều nước, oxy không thể khuếch tán gây ra hiện tượng yếm khí Tầm quan trọng của việc giữ độ ẩm của cơ chất trên 40-60 % thường bị coi nhẹ trong quá trình sản xuất phân hữu cơ Điều này thực chất rất quan trọng bởi vì độ ẩm thấp hơn sẽ kìm hãm hoạt động của vi khuẩn và tất cả vi khuẩn ngừng hoạt động tại độ ẩm 12 %

Nguyên liệu thô trước khi xử lý thường khô, các vi sinh vật không hoạt động và quá trình chuyển hoá phân hữu cơ không diễn ra Giai đoạn đầu tiên của quá trình chế

Trang 30

biến phân hữu cơ là xử lý nước Có nhiều phương pháp xử lý nước như: ngâm hoặc nhúng nguyên liệu vào nước, phun nước đều lên nguyên liệu

Để kích thích hoạt động của vi sinh vật, các nguyên liệu bổ sung được thêm vào khi xử lý nước như: phân gà, vỏ hạt bông, ammonium sulfate, urea…

Để cho quá trình phân tán nước đồng đều, cũng như phá vỡ phần nào cấu trúc cellulose của vỏ trái ca cao bằng biện pháp cơ học đó là băm nhỏ vỏ ca cao ra, khi đó một phần cấu trúc cellulose sẽ bị phá vỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình phân hủy vỏ ca cao

2.4.5.6 Nhiệt độ

Trong quá trình sản xuất phân hữu cơ quá trình bắt đầu từ nhiệt độ thường (20-400C), tăng nhiệt độ từ từ và đạt tới khoảng nhiệt độ cao (45-1220C), sau đó lại giảm xuống khoảng nhiệt độ nhiệt độ thường Quá trình sản xuất phân hữu cơ nào cũng tăng và giảm nhiệt độ như vậy [19]

Sự thay đổi nhiệt độ cơ bản là một thông số phụ thuộc vào thời gian, nhiệt độ của nguyên liệu đưa vào sản xuất phân hữu cơ, sau một thời gian rất ngắn, bắt đầu tăng lên sau khi tạo lập những điều kiện cần thiết cho quá trình sản xuất phân hữu cơ

Sự thay đổi nhiệt độ ban đầu song song với giai đoạn ủ của quần thể vi khuẩn Dưới những điều kiện thuận lợi, giai đoạn này sẽ được kế tiếp bởi giai đoạn gia tăng nhiệt độ gần như theo cấp số mũ tới nhiệt độ 600C đến khoảng 70-800C Sự gia tăng nhiệt độ rất cao là kết quả phân huỷ những thành phần dễ phân hủy trong chất thải như: đường, tinh bột, một số protein đơn giản Nhiệt độ này tiếp tục được duy trì qua một thời gian, độ dài của giai đoạn phụ thuộc vào loại hệ thống sản xuất phân hữu cơ

sử dụng và bản chất của chất thải Sau đó, nhiệt độ giảm dần xuống cho đến khi bằng môi trường xung quanh

Sau khi những thành phần dễ phân hủy đã được phân hủy và trong cơ chất chỉ còn những thành phần bền vững hơn, hoạt động của vi khuẩn cũng giảm đi và nhiệt độ bắt đầu giảm xuống

Nếu nhiệt độ của khối phân hữu cơ không tăng hoặc tăng chậm, mặc dù chất thải

đã được đánh luống thì có thể một số điều kiện trong quá trình sản xuất phân hữu cơ chưa hợp lý Trong trường hợp này, vấn đề có khả năng xảy ra cao nhất là độ ẩm cao quá 80 % hoặc thấp quá 12 % Mùi hôi ngày càng nhiều là dấu hiệu của độ ẩm quá mức Ngược lại, không có bất cứ mùi nào sẽ biểu thị cho độ ẩm quá thấp

Trang 31

Độ ẩm cao quá có thể điều chỉnh bằng cách thêm vật liệu có nhiều chất xơ Một giải pháp khác là tăng cường làm thoáng khí Làm thoáng không chỉ cung cấp oxi cần thiết, mà còn làm hơi ẩm bay hơi Thêm nước là biện pháp đương nhiên để điểu chỉnh

độ ẩm quá thấp

Theo đó, trong những quá trình sản xuất phân hữu cơ thông thường, có thể nói rằng tại thời điểm nhiệt độ giảm xuống bằng hay gần bằng nhiệt độ môi trường, các thành phần chưa ổn định về mặt sinh học bắt đầu quá trình ổn định Nhờ vậy, nguyên liệu được hoai mục thành phân hữu cơ đủ phẩm chất, cho phép lưu trữ hoặc sử dụng Những kinh nghiệm đã qua cho thấy rằng sản phẩm phân hữu cơ có thể sử dụng

an toàn hoặc có thể lưu trữ được sau khi nhiệt độ cuối cùng giảm đến mức 400C 2.4.5.7 Sự thay đổi những tính chất vật lý [23]

- Hình thức bề ngoài:

Khối phân hữu cơ dần dần sậm lại, chứng tỏ quá trình phân hữu cơ diễn ra đúng hướng Sản phẩm phân hữu cơ cuối cùng luôn luôn có màu đen, xám sẫm hoặc màu hơi nâu nâu

- Kích cỡ hạt:

Các hạt cơ chất có khuynh hướng ngày càng nhỏ vì sự phân rã và sự cọ sát giữa các hạt diễn ra trong quá trình đảo trộn Ngoài ra, sự phân hủy làm cho các thớ sợi trở nên giòn, dễ gãy và làm cho vật chất không có hình dạng nhất định trở thành có dạng hạt

2.5 Các chỉ tiêu xác định chất lượng phân thành phẩm

Theo thông tư số 36/2010/TT-BNNPTNT về việc ban hành quy định sản xuất kinh doanh và sử dụng phân bón, thông tư này quy định chi tiết và hướng dẫn thực

Trang 32

hiện một số nội dung về quản lí chất lượng phân bón Thông tư quy định các chỉ tiêu bắt buộc kiểm tra về hàm lượng dinh dưỡng được chấp nhận theo TCVN bao gồm một

GEM là chế phẩm sinh học bao gồm nhiều chủng vi sinh vật khác nhau trong đó

5 nhóm vi khuẩn lên men acid lactic, lên men rượu, vi khuẩn quang hợp, xạ khuẩn và nấm men Năm nhóm vi khuẩn này tạo ra acid amin tự do, acid hữu cơ, vitamin hòa tan trong nước, kháng sinh tự nhiên và tạo ra các hoocmon tự nhiên Vì thế các vi khuẩn này được sử dụng vào trong tự nhiên sẽ tạo ra mối liên kết nhằm khống chế các

vi khuẩn gây hại đối với các loại cây trồng và vật nuôi

Chế phẩm GEM được tạo ra không phải bằng kỹ thuật di truyền và cũng không chứa các loài vi sinh vật được tạo ra bởi kỹ thuật di truyền GEM rất an toàn, rẻ và ứng dụng có hiệu quả, cải thiện tốt môi trường Các vi sinh vật tạo ra một môi trường sinh thái đồng nhất, sản sinh ra nhiều sản phẩm khác nhau cùng sinh trưởng, phát triển Mỗi loại vi sinh vật trong chế phẩm GEM có chức năng năng hoạt động riêng của chúng Các vi sinh vật này đều là những vi sinh vật có lợi chung sống trong cùng một môi trường, chúng sống cộng sinh với nhau, cùng hỗ trợ nhau do vậy hiệu quả của họat động tổng hợp của chế phẩm tăng lên rất nhiều

Trong bảo vệ môi trường: GEM có tác dụng tiêu diệt các vi sinh vật gây mùi thối

do các loại khí H2S, SO2, NH3… gây ra, nên khi phun GEM vào rác thải, cống rãnh,

Trang 33

toilet, chuồng trại chăn nuôi Sẽ khử được mùi hôi một cách nhanh chóng Đồng thời

số lượng ruồi muỗi, ve các loại côn trùng bay khác giảm hẳn số lượng Chức năng phân hủy rác thải hữu cơ tiêu diệt các vi sinh vật gây thối, làm tốc độ hóa mùn diễn ra nhanh hơn Đây là sản phẩm thân thiện môi trường Chế phẩm GEM sử dụng: GEM- P, GEM-K

2.6.2 Chế phẩm Trichoderma

Chế phẩm Trichoderma chứa thành phần chính là nấm Trichoderma và các

enzyme thủy phân như cellulase, chitinase, xylanase…giúp cây trồng kháng bệnh

Khống chế và tiêu diệt các loại nấm bệnh như Rhizoctonia solani, Fusarium, Sclerotium gây bệnh thối rễ, chết yểu, héo rũ… tạo điều kiện cho vi sinh vật trong đất

phát triển, kích thích sự tăng trưởng của bộ rễ, phân giải các chất xơ, chitin, pectin, lignin trong phế thải hữu cơ thành đơn chất dinh dưỡng làm đất tơi xốp hơn, giúp cây

dễ dàng hấp thu, tăng hàm lượng chất mùn và mật độ côn trùng có ích, giữ độ phì của đất

Dùng ủ phân chuồng có tác dụng phân hủy nhanh, mau hoai mục có thể bón trực tiếp cho cây trồng như rau, hoa, cây ăn quả, cây công nghiệp, tăng khả năng kháng một

số nấm bệnh Các chế phẩm nấm Trichoderma được sản xuất và sử dụng như là chất

kiểm soát sinh học một cách có hiệu quả Hình thức sử dụng dưới dạng chế phẩm riêng biệt hoặc được phối trộn vào phân hữu cơ để bón cho cây trồng vừa cung cấp dinh dưỡng cho cây vừa tăng khả năng kháng bệnh của cây Những lợi ích mà những loài nấm này mang lại đã được biết đến bao gồm việc kích thích sự tăng trưởng và phát triển của thực vật do việc kích thích sự hình thành nhiều hơn và phát triển mạnh hơn của bộ rễ so với thông thường Những cơ chế giải thích cho các hiện tượng này chỉ mới được hiểu rõ ràng hơn trong thời gian gần đây Hiện nay, một giống nấm

Trichoderma đã được phát hiện là chúng có khả năng gia tăng số lượng rễ mọc sâu

(sâu hơn 1 m dưới mặt đất) Những rễ sâu này giúp các loài cây có khả năng chịu được hạn hán

Nấm Trichoderma có khả năng phân huỷ cellulose, phân giải lân chậm tan [30] Lợi dụng đặc tính này người ta đã trộn Trichoderma vào quá trình sản xuất phân hữu

cơ vi sinh để thúc đẩy quá trình phân huỷ hữu cơ được nhanh chóng Tuy nhiên, một

số chế phẩm Trichoderma trên thị trường hiện nay chay theo thị hiếu, người nông dân

do hạn chế về mặt kĩ thuật chuyên môn, sử dụng sản phẩm Trichoderma trên thị

Trang 34

trường tuy nhiên hiệu quả thật sự thì không như mong muốn, chính vì điều đó, chúng

tôi tiến hành tự phân lập và tuyển chọn ra được hai dòng nấm mốc là T.viride và A.niger thử nghiệm nhân giống thay thế đối chứng với chủng Trichoderma thương

mại

Chúng tôi cũng sử dụng một loại chế phẩm sinh học Trichoderma thương mại

xuất phát từ nơi sản xuất có uy tín (vì lí do pháp lí không thể nêu tên công ty sản xuất

và hình thực tế chế phẩm) để đối chứng với sản phẩm thuần gồm hai chủng nấm mốc

kết hợp với nhau: T.viride và A.niger

2.7 Hai chủng nấm mốc được tuyển chọn ứng dụng thực nghiệm

2.7.1 Trichoderma viride [3]

Vị trí phân loại của T.viride: T.viride phân bố rộng rãi trong đất, xác bã thực vật Theo Persoon et Gray (1801), thì T.viride thuộc ngành Ascomycota, lớp Euascomyces, bộ Hypocreae, giống Tricoderma Các loài được nhận biết thông qua sự

khác biệt về hình thái giữa các loài trong cùng giống Tuy nhiên mức độ giống nhau về hình thái không liên quan mật thiết với quan về mặt phát sinh chủng loài Trong

trường hợp Trichoderma, rất khó phân biệt giữa các loài với nhau và với các loài có

giai đoạn sinh sản hữu tính thuộc giống Hypocrea

Đặc điểm sinh học: khuẩn lạc ban đầu có màu trắng, sau đó có màu xanh lục do bào tử được hình thành Cuống sinh bào tử có dạng chum, phân nhánh liên tục Sinh ra các thể bình hình tam giác, mỗi nhánh kết thúc bởi một thể bình Đính bào tử hình elip hoặc bầu dục, có màu xanh lục

Đặc điểm sinh hóa: T.viride có khả năng tổng hợp các enzyme như cellulase,

xylanase, chitinase, protease, pectinase…

- Protease: T.viride có khả năng tạo ra hai loại protease Protease thứ nhất phân

giải protein thành polypeptide, pepton, còn protesea thứ hai tiếp tục chuyển hóa các sản phẩm trên thành acid amin Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của chúng khoảng 500C

- Celulase: là phức hợp gồm nhiều enzyme, chủ yếu là cellulase C1, cellulase

Cx và β-glucosidase hay cellobiase Cellulase có tác dụng thủy phân cellulose thành cellobiose rồi thành glucose theo trình tự sau:

Cellulse Cellobiase Cellulose Cellobiose Glucose

Trang 35

T.viride còn có khả năng tạo kháng sinh Vì vậy T.viride còn được sử dụng làm

nhân tố kiểm soát sinh học [28, 29]

2.7.2 Aspergillus niger [3]

Vị trí phân loại của A.niger: giống Aspergillus do Michelli mô tả lần đầu vào

năm 1729 Năm 1901 Wehmer đã cho ra đời một chuyên luận phân loại giống nấm

này Raper và Fennell chỉ dung một tên Aspergillus cho tất cả các loài bào tử trần Như vậy A.niger có vị trí phân loại như sau: lớp Deuteromyces, bộ Moniliales, họ Moniliaceace, giống Aspergillus

Khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn, bào tử đính không nằm trong bọc bào tử, cuống sinh thể bình phình ra rõ rệt ở đầu tạo thành bọng lớn hình cầu, màu nâu đen Thể bình gồm hai lớp, lớp thứ nhất hình tam giác ngược, lớp thứ hai hình chai, bào tử đính xòe ra, có hình cầu xù xì, có màu nâu đen đến màu than

Đặc điểm sinh học của A.niger: sinh trưởng không cần ánh sáng Nấm có thể phát

triển tốt ở môi trường acid nhưng pH tối ưu là 4 – 6,5, một số loài phát triển tốt ở pH <

3 và một số ít phát triển ở pH> 9

Đặc điểm sinh hóa: A.niger có khả năng tổng hợp các enzyme như cellulase,

α-amylse, protease, có khả năng lên men đường, đồng hóa tốt các loại đường đơn và đường đôi như glucose, fructose, maltose, saccharose

α-amylse: A.niger có khả năng tổng hợp α-amylse ngoại bào để thủy phân tinh

bột tạo dextrin và một ít maltose và glucose

α-amylse của A.niger hoạt động tối ưu ở pH từ 4,5-4,7 Trong khi để đường hóa

tinh bột, pH thích hợp nhất là 5-5,5 ở 500C Enzyme bị mất hoạt tính sau 30 phút ở

Trang 36

CHƯƠNG III

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1.1 Thời gian và địa điểm

- Thời điểm: 25/02/2013 đến ngày 12/07/2013

- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Vi sinh- Hóa sinh trường Đại học Bà Rịa - Vũng

Tàu Khuôn viên trường Đại học Bà Rịa- Vũng Tàu và Cty TNHH Ca cao Thành Đạt

3.1.2 Nguyên vật liệu

Vật liệu để phân lập chủng nấm mốc: vỏ ca cao tại xã Xà Bang, huyện Châu

Đức, Bà Rịa - Vũng Tàu; mẫu đất tại khuôn viên Đại học Bà Rịa-Vũng Tàu; mẫu đất

tại Xã Bông Trang, Huyện Xuyên Mộc và xã Xà Bang, huyện Châu Đức,

Bà Rịa - Vũng Tàu

Cám gạo, vỏ trấu, vỏ ca cao xay nhuyễn, bã mía phơi khô, vỏ lạc

Vật liệu để nghiên cứu xử lí phân hủy cellulose thành phân hữu cơ là vỏ ca cao

của Cty TNHH Thành Đạt tại Xã Xà Bang, Huyện Châu Đức, Bà Rịa - Vũng Tàu

3.1.4 Môi trường nghiên cứu phân lập

- Môi trường phân lập nấm mốc thạch - khoai tây PGA (phụ lục 1);

- Môi trường xác định hoạt tính enzyme cellulase bằng phương pháp đục lỗ trên

thạch 2 % agar, 1 % CMC (phụ lục 1);

- Môi trường phân lập Trichoderma sp trong đất M1 (phụ lục 1);

Trang 37

- Môi trường Czapeck xác định nhanh hoạt tính enzyme cellulase trực tiếp trên khuẩn lạc (phụ lục 1);

- Môi trường bổ sung mandel bổ sung 10 ml dung dịch khoáng vi lượng (phụ lục 1)

- Bình mircokjeldahl, buret, pipet, giấy lọc không tro, thước đo;

- Bể ổn nhiệt, máy đo quang phổ, vortex, cân phân tích;

- Bếp điện, ống nghiệm;

- Đĩa petri, que cấy, que trang, đèn cồn, bông hút ẩm, bông không hút ẩm;

- Đũa thủy tinh;

- Máy khuấy từ;

- Máy lắc ngang;

- Máy phân tích độ ẩm;

- Nồi khử autoclave;

- Tủ cấy, tủ hút, tủ lạnh, tủ sấy, kính hiển vi;

- Lamen, băng keo trong…

Trang 38

3.1.6 Thiết bị sử dụng

Thiết bị, dụng cụ phục vụ nghiên cứu thực nghiệm:

Bảng 3.1 Dụng cụ cần sử dụng

Trang 39

Hình 3.1 Sơ đồ khối bố trí thí nghiệm 1

Bình tam giác + 90 ml nước cất

Định danh tại trung tâm

KHCN Sắc Ký Hải Đăng

Giữ giống trên

PGA

Trang 40

Nội dung theo dõi:

- Phân lập;

- Tuyển chọn các chủng có khả năng sinh tổng hợp cellulase cao bằng phương pháp xác định đường kính vòng phân giải theo thời gian;

- Định danh sơ bộ tại phòng thí nghiệm;

- Định danh tại trung tâm KHCN Sắc Ký Hải Đăng

3.2.2 Thí nghiệm 2: Phương pháp xác định ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase

a Mục đích thí nghiệm

Xác định pH tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase

b Nội dung thí nghiệm

Định dạng
Số trang	88
Dung lượng	3,6 MB