phân lập và tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp enzyme laccase

LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, em đã nhận được những sự quan tâm giúp đỡ của rất nhiều cá nhân và tập thể. Lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình đến giảng viên ThS. Trịnh Thị Thu Thủy người đã dành nhiều thời gian, tâm huyết, tận tình giúp đỡ và trực tiếp hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp này. Em xin chân thành cảm ơn sự quan tâm, chỉ bảo của thầy giáo TS. Nguyễn Văn Giang, ThS. Nguyễn Thị Bích Lưu cùng các thầy cô và cán bộ trong khoa Công nghệ sinh học – Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình thực hiện đề tài. Cuối cùng em xin gửi tới gia đình, bạn bè và tập thể lớp CNSH-K52 lời cảm ơn cùng những tình cảm chân thành nhất vì những sự động viên giúp đỡ quý báu mà mọi người đã dành cho em trong suốt thời gian qua. Em xin chân thành cảm ơn! 1 MỤC LỤC PHẦN I: MỞ ĐẦU 8 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 10 2.1. Laccase 10 2.2. Các nguồn thu laccase 11 2.2.1. Laccase vi sinh vật 11 2.2.2. Laccase từ thực vật 12 2.3. Cấu tạo của laccase 12 2.3.1. Khối lượng phân tử 12 2.3.2. Cấu trúc không gian 13 2.4. Đặc tính của laccase 15 2.4.1. Các chất ức chế hoạt tính laccase 15 2.4.2. Tính đặc hiệu cơ chất 15 2.4.3. Nhiệt độ và pH tối ưu 16 2.4.4. Km và Vmax 17 2.4.5. Các isozyme 19 2.5. Cơ chế xúc tác của laccase 20 2.6. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp laccase 21 2.6.1. Nguồn cacbon 22 2.6.2. Nguồn nitơ 23 2.6.3. Nhiệt độ 23 2.6.4. pH 23 2.7. Ứng dụng của laccase 24 2.7.1. Ứng dụng trong công nghiệp 24 2.7.2. Ứng dụng trong xử lý ô nhiễm môi trường 24 PHẦN III. VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP 26 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 26 3.1. Địa điểm nghiên cứu 26 3.2. Thời gian nghiên cứu 26 3.3. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 26 3.3.1. Đối tượng 26 3.3.2. Thiết bị và hóa chất 26 3.3.3. Môi trường 27 3.3.4. Cơ chất 28 3.4. Phương pháp nghiên cứu 28 3.4.1. Phương pháp vi sinh vật 28 3.4.2. Phương pháp hóa sinh – Phương pháp xác định hoạt tính laccase 29 3.4.3. Xây dựng đường cong sinh trưởng của chủng nấm mốc phân lập được 31 2 3.4.4. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên khả năng sinh tổng hợp enzyme laccase của chủng nấm 32 3.4.5. Xác định một số đặc tính của laccase 33 3.4.5.1. Xác định nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt của laccase 33 PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 4.1. Phân lập các chủng nấm mốc sinh tổng hợp laccase 34 4.2. Đánh giá khả năng tổng hợp laccase của 5 chủng phân lập được 40 4.3. Xây dựng đường cong sinh trưởng của chủng BV1 42 4.4. Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến sinh tổng hợp laccase của chủng BV1 43 4.4.1. Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh tổng hợp laccase 43 4.4.2. Ảnh hưởng của pH đầu đến khả năng sinh tổng hợp laccase 44 4.4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh tổng hợp laccase 45 4.4.4. Ảnh hưởng của nguồn carbon đến khả năng sinh tổng hợp laccase 46 4.4.5. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp laccase 48 4.4.6. Ảnh hưởng của nồng độ CuSO4 lên khả năng sinh tổng hợp laccase 50 4.4.7. Ảnh hưởng của các chất cảm ứng đến sinh tổng hợp laccase 51 4.5. Xác định một số đặc tính của laccase 52 4.5.1. Xác định nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt của laccase 52 4.5.2. Xác định pH tối ưu và độ bền pH 54 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 5.1. Kết luận 57 5.2. Kiến nghị 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT kDa Kilodalton EDTA Ethylene diamine tetra-acetic acid DMP Dimethoxypheno His Histidine Cys Cystein ABTS 2,2'-azino-bis 3- ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid HAA 3-Hydroxyanthranillic acid HBT N-hydroxybenzo-trialzone HPI N-hydroxyphtaimide 3 VLA Violuric acid NAD(P) + Nicotine-Adenine Dinucleotide Phosphate + PAH Polycyclic aromatic hydrocarbon PCB Polychlorinated biphenyl TNT 2,4,6-trinitrotoluen DDT Dichloro Diphenyl Trichloroethane HCH Hexacyclohexan 2,4,5-T 2,4,5- Trichlorophenoxyacetic acid 2,4- D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid HSX Hãng sản xuất PDA Potato Dextrose Agar SNA Spezieller Nährstoffarmer Agar BN Bắc Ninh ĐA Đông Anh BV Ba Vì ĐC Đối chứng TN Thí nghiệm DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Khối lượng phân tử và số lượng isozym laccase từ một số chủng nấm mốc….5 Bảng 2: Một vài đặc tính của laccase từ một số chủng nấm …………………………10 Bảng 3: Thành phần phản ứng ……………………………………………………….22 Bảng 4: Một số đặc điểm hình thái của 5 chủng nấm mốc phân lập được ………… 29 Bảng 5: Hoạt độ enzyme laccase và trọng lượng khô của 5 chủng nấm mốc……… 33 4 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Cấu trúc bậc ba của laccase từ Melanocarpus albomyces…………………… 7 Hình 2: Trung tâm hoạt động của laccase …………………………………………… 7 Hình 3: Quá trình oxy hóa syringaldazine thành dạng quinone tương ứng bởi laccase 8 Hình 4: Cơ chế xúc tác của laccase………………………………………………… 13 Hình 5: Các kiểu xúc tác của laccase ……………………………………………… 14 Hình 6: Khả năng phân hủy axit tannic chủng BN2-2 ……………………………….27 Hình 7: Khả năng phân hủy syringaldazine của chủng BV1 ……………………… 27 Hình 8: Hình ảnh khuẩn lạc, sợi nấm và bào tử của 5 chủng nấm mốc …………… 32 5 Hình 9: Ảnh hưởng của nguồn carbon lên khả năng sinh trưởng của BV1 ………….40 Hình 10: Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh trưởng của BV1…………….42 Hình 11: Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh trưởng của BV1…………….43 Hình 12: Ảnh hưởng của pH đệm đến khả năng phản ứng của laccase …………… 47 DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ Đồ thị 1: Tỷ lệ giữa hoạt độ laccase và sinh khối của 5 chủng nấm mốc ……………33 Đồ thị 2: Đường cong sinh trưởng của chủng nấm mốc BV1……………………… 34 Đồ thị 3: Ảnh hưởng của thời gian tới khả năng tổng hợp laccase của BV1 ……… 35 Đồ thị 4: Ảnh hưởng của pH đầu tới khả năng tổng hợp laccase của BV1 ………… 37 Đồ thị 5: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng tổng hợp laccase của BV1 ……… 38 Đồ thị 6: Ảnh hưởng của nguồn carbon đến khả năng tổng hợp laccase …………….39 Đồ thị 7: Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng tổng hợp laccase ……………… 41 Đồ thị 8: Ảnh hưởng của nồng độ CuSO 4 lên khả năng sinh laccase ……………… 42 Đồ thị 9: Ảnh hưởng của các chất cảm ứng lên khả năng sinh laccase ………………44 6 Đồ thị 10: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng của laccase ………………………45 Đồ thị 11: Ảnh huởng của nhiệt độ đến độ bền của laccase từ chủng BV1 ………….46 Đồ thị 12: Ảnh hưởng của pH đệm đến phản ứng của laccase ……………………….47 Đồ thị 13: Độ bền pH của laccase từ chủng BV1 ……………………………………48 TÓM TẮT Laccase (E.C.1.10.3.2) thuộc nhóm enzyme oxidase, cụ thể là polyphenol oxidase có chứa 4 nguyên tử đồng ở trung tâm hoạt động và có khả năng oxy hóa cơ chất sử dụng phân tử oxy làm chất nhận điện tử. Laccase được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như tẩy trắng bột giấy, tẩy màu thuốc nhuộm vải, ứng dụng trong chế biến thực phẩm thông qua việc đưa vào các quy trình xử lý sinh học xử lý các nguồn nước thải bị ô nhiễm bằng việc loại bỏ các hợp chất phenol, ứng dụng trong việc xử lý phụ phẩm của sản phẩm nông nghiệp để tạo nguyên liệu cho các quá trình khác. Đề tài được tiến hành nhằm mục đích phân lập và tuyển chọn các chủng nấm mốc có nguồn gốc từ gỗ mục trong tự nhiên có hoạt tính laccase, nhằm tạo ra một lượng lớn enzyme laccase dùng để xử lý hợp chất lignin từ các phụ phẩm của ngành nông nghiệp. 7 Để tìm được chủng nấm mốc có các đặc tính phù hợp với yêu cầu của đề tài nghiên cứu, chúng tôi tiến hành thu thập nhiều mẫu gỗ mục ở các địa phương khác nhau, nuôi cấy và làm thuần đối với các chủng phân lập được. Sau đó chúng tôi thực hiện các phuơng pháp sàng lọc định tính và xác định hoạt độ enzyme tổng số để chọn ra chủng có hoạt độ laccase cao nhất phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo, bước đầu thu được một số kết quả sau: - Phân lập được 5 chủng nấm mốc có hoạt tính laccase kí hiệu là: BN1, BN2- 1, BN2-2, ĐA3-1 và BV1, tuyển chọn đuợc chủng BV1 là chủng có hoạt tính laccase cao nhất. - Đánh giá được đặc điểm hình thái khuẩn lạc, đặc điểm của sợi nấm và bào tử nấm của 5 chủng nêu trên. - Xây dựng được đường cong sinh trưởng của chủng BV1 - Tìm được các điều kiện thích hợp cho sinh trưởng và tổng hợp enzyme của chủng BV1 như: thời gian nuôi cấy là 6 ngày, nhiệt độ thích hợp là 30 0 C, pH 5, nguồn carbon và nitơ phù hợp nhất là glucose và asparagine, nồng độ CuSO 4 thuận lợi cho tổng hợp enzyme là 200µM, chất cảm ứng sinh tổng hợp enzyme thích hợp nhất là ABTS (2mM). - Xác định đuợc một số tính chất hoá sinh của laccase thô thu được từ chủng BV1 bao gồm: nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt động của enzyme là 40 0 C và pH 6.5. Laccase thô từ chủng BV1 bền nhiệt ở ngưỡng nhiệt độ dưới 60 0 C và độ bền pH đạt được ở mức pH 7. PHẦN I: MỞ ĐẦU Ngày nay việc sử dụng enzyme trong sản xuất và đời sống ngày càng được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu và thực tế cho thấy chế phẩm enzyme đang được sử dụng phổ biến ở nhiều nước đã mang lại lợi ích kinh tế khá lớn, đặc biệt là các enzyme có khả năng phân hủy các hợp chất thơm đa vòng. Điển hình trong số đó là enzyme laccase. Laccase thuộc nhóm polyphenol oxydase do đó có khả năng oxy hóa diphenol và các hợp chất có liên quan. Ưu điểm vượt trội của laccase là có tính oxy hóa mạnh và sử dụng oxy phân tử làm chất nhận điện tử vì vậy mà có thể tiến hành nghiên cứu để đưa vào ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp cũng như trong xử lý ô nhiễm môi 8 trường. Laccase còn được biết đến như một enzyme thân thiện với môi trường do trong phản ứng laccase chỉ cần lấy oxy từ không khí và sản phẩm phụ duy nhất tạo thành sau phản ứng là nước (Sergio Riva, 2006). Laccase có thể được thu từ các nguồn khác nhau như thực vật, vi khuẩn, côn trùng và phổ biến nhất là nấm mốc. Hiện nay nhiều chủng nấm sợi đã được phát hiện cho thấy khả năng tổng hợp laccase rất tốt như: Rhizoctonia solani (J. D. Crowe và S. Olsson, 2001), Trametes versicolor (R. Bourbonnais và cộng sự, 1995), Melanocarpus albomyces (Laura và L.Kiiskinen, 2005), Trametes modesta (G.S. Nyanhongo và cộng sự, 2002). Đồng thời do nấm mốc có khả năng sinh trưởng phát triển mạnh nên còn tạo thuận lợi rất nhiều cho việc sản xuất laccase ở quy mô lớn phục vụ trong công nghiệp và đời sống. Trong những năm gần đây, laccase được ứng dụng phổ biến trên nhiều lĩnh vực khác nhau như tẩy trắng bột giấy, tẩy màu thuốc nhuộm vải, ứng dụng trong chế biến thực phẩm thông qua việc đưa vào các quy trình xử lý sinh học (A.Kunamneni và cộng sự, 2007). Laccase còn được sử dụng trong tổng hợp chất hữu cơ, xử lý các nguồn nước thải bị ô nhiễm bằng việc loại bỏ các hợp chất phenol, ứng dụng trong việc xử lý phụ phẩm của sản phẩm nông nghiệp để tạo nguyên liệu cho các quá trình khác. Phổ ứng dụng của laccase được mở rộng bằng việc kết hợp laccase với các mediator -chất trung gian- làm chúng có khả năng oxy hóa những hợp chất không có bản chất phenol (non-phenol). Cùng với những ứng dụng quan trọng mà enzyme laccase mang lại đồng thời góp phần mở rộng việc sử dụng enzyme trong thực tế sản xuất của nước ta đặc biệt là đối với các quá trình xử lý nước thải công nghiệp, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp enzyme laccase”. Nội dung thực hiện: • Phân lập và làm thuần các chủng nấm mốc từ các mẫu gỗ, lá mục trong tự nhiên • Sàng lọc các chủng nấm mốc có hoạt tính laccase • Xác định đặc điểm hình thái của các chủng có hoạt tính cao • Khảo sát điều kiện nuôi (thời gian, nhiệt độ, pH) 9 • Khảo sát một số ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi đến khả năng sinh tổng hợp laccase • Khảo sát một số đặc tính của enzyme (nhiệt độ tối ưu, độ bền nhiệt, pH tối ưu, độ bền pH) PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Laccase Laccase (E.C.1.10.3.2) thuộc nhóm enzyme oxidase, cụ thể là polyphenol oxidase. Trong phân tử có chứa 4 nguyên tử đồng có khả năng oxy hóa cơ chất sử dụng phân tử oxy làm chất nhận điện tử. Phổ cơ chất của laccase rất đa dạng bao gồm: diphenol, polyphenol, các dẫn xuất phenol, diamine, amine thơm, benzenethiol, dioxin và cả các hợp chất vô cơ như iot. Các loại enzyme laccase tách chiết từ các nguồn khác nhau rất khác nhau về mức độ glycosyl hóa, khối lượng phân tử và tính chất động học (Laura và Leena Kiiskinen, 2005) 10 [...]... bộ sưu tập gồm 37 chủng bộ sưu tập này sẽ được dùng để thử khả năng sinh tổng tổng hợp laccase trong các thí nghiệm tiếp theo - Sàng lọc các chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp laccase Để sàng lọc các chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp laccase chúng tôi tiến hành thử định tính khả năng sinh laccase trên cơ chất là axit tannic và syringaldazine (phương pháp tiến hành được mô tả trong phần 3.4.2.1)... tâm, giữ lại phần sinh khối tế bào rồi sấy khô, xác định trọng lượng khô của chủng nấm mốc trong 7 ngày nuôi (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 2000) 3.4.4 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên khả năng sinh tổng hợp enzyme laccase của chủng nấm 3.4.4.1 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp enzyme Tiến hành nuôi lỏng lắc trong 7 ngày đối với chủng nấm mốc được chọn trong môi... nm để xác định hoạt độ enzyme Để tìm được pH thích hợp cho việc bảo quản enzyme, dịch enzyme được ủ ở nhiệt độ phòng với các pH khác nhau: 6, 6.5, 7, 7.5, 8 Hoạt độ enzyme còn lại được xác định sau các khoảng thời gian ủ: 1giờ, 2 giờ, 3 giờ PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Phân lập các chủng nấm mốc sinh tổng hợp laccase - Phân lập, làm thuần tạo bộ sưu tập các chủng nấm mốc Các mẫu gỗ mục được thu... độ enzyme laccase của từng chủng (E) theo công thức ở mục c phần 3.4.2.2 Phần sinh khối tế bào được làm khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 80 0C trong 15 giờ rồi cân trọng lượng khô (m) Đánh giá khả năng tổng hợp enzyme để chọn chủng có hoạt tính laccase cao dựa trên 2 chỉ số: o E càng cao thì khả năng sinh enzyme càng nhiều o Tỷ lệ E/m lớn cho thấy khả năng tổng hợp enzyme cao Kết quả đánh giá khả năng tổng. .. hóa sinh – Phương pháp xác định hoạt tính laccase 3.4.2.1 Phương pháp thử định tính a Thử định tính với cơ chất là axit tannic Sử dụng cơ chất là axit tannic để thử định tính về khả năng tổng hợp các loại enzyme phân giải lignin của các chủng nấm mốc đã phân lập được Cấy chuyển các chủng nấm mốc đã phân lập được thành từng điểm trên bề mặt môi trường PDA có bổ sung axit tannic với nồng độ 0.5% Các chủng. .. nhiệt độ và pH môi trường thích hợp được thu và tiến hành đo OD ở bước sóng 530 nm, xác định hoạt độ enzyme để chọn ra nguồn carbon và nitơ thích hợp nhất cho quá trình tổng hợp enzyme laccase của chủng nuôi 3.4.4.6 Ảnh hưởng của nồng độ CuSO4 lên khả năng sinh tổng hợp enzyme Bổ sung CuSO4 vào môi trường nuôi ở các nồng độ khác nhau bao gồm: 100µM, 200 µM, 300 µM, 400 µM và 500 µM, chủng nấm mốc được... độ và pH thích hợp Tại thời điểm nuôi thuận lợi nhất cho quá trình sinh enzyme, tiến hành thu dịch đem đo OD ở bước sóng 530 nm để xác định hoạt độ enzyme, khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ CuSO4 đến quá trình sinh enzyme của chủng nuôi 3.4.4.7 Ảnh hưởng của chất cảm ứng lên khả năng sinh tổng hợp enzyme Tiến hành nuôi lắc 200 vòng/phút đối với chủng nấm mốc đã chọn trong môi trường sinh tổng hợp laccase. .. (C.F.Thurston, 1994) Ở nấm, Laccase đã được phân lập từ Ascomyceteous, Deuteromyceteous và nấm Basidiomyceteous Trong đó Ascomycetes và Deuteromycetes chưa có các chứng minh rõ ràng về sự phân hủy lignin nhiều như các nấm mục trắng Basidiomyceteous (A.Kunamneni và cộng sự, 2008) Hoạt tính của laccase thể hiện ở khả năng phân hủy lignin và chúng được tìm thấy nhiều trong các chủng nấm Hiện nay, các nấm mục trắng... của laccase nội bào của nấm mục trắng Trong đó laccase nội bào có chức năng như một tiền thân cho laccase ngoại bào và không có sự khác biệt giữa hai loại laccase này Laccase nấm có khả năng khử oxy hóa cao hơn so với laccase vi khuẩn hoặc thực vật (lên đến 800 mV), và các quá trình diễn ra trong tự nhiên của chúng có khả năng ứng dụng quan trọng trong công nghệ sinh học Như vậy, laccase thu được từ nấm. .. lấy dịch để đo OD ở bước sóng 530nm nhằm xác định hoạt độ laccase theo từng ngày nuôi Dựa vào kết quả thu được để xác định thời gian thích hợp cho sự sinh tổng hợp laccase của chủng nuôi 3.4.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp enzyme Sử dụng môi trường sinh tổng hợp enzyme tiến hành nuôi lỏng lắc chủng nấm đã chọn ở các ngưỡng nhiệt độ 26 0C, 300C, 340C, 380C Đo OD ở bước . hành thực hiện đề tài: Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp enzyme laccase . Nội dung thực hiện: • Phân lập và làm thuần các chủng nấm mốc từ các mẫu gỗ, lá mục trong. 34 4.1. Phân lập các chủng nấm mốc sinh tổng hợp laccase 34 4.2. Đánh giá khả năng tổng hợp laccase của 5 chủng phân lập được 40 4.3. Xây dựng đường cong sinh trưởng của chủng BV1 42 4.4. Khảo sát các. ảnh hưởng đến sinh tổng hợp laccase của chủng BV1 43 4.4.1. Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh tổng hợp laccase 43 4.4.2. Ảnh hưởng của pH đầu đến khả năng sinh tổng hợp laccase 44 4.4.3.