Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng chuyển hóa dầu thầu dầu thành chất thơm

Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng chuyển hóa đầy thầu dầu thành chất thơm

Đặt vấn đề

Con ngời từ lâu đã khao khát tìm ra những nguồn hơng liệu để phục vụcho nhu cầu ngày càng tăng của các ngành công nghiệp dợc phẩm, thựcphẩm, mỹ phẩm Những năm qua, nhiều loại chất thơm đặc biệt đã đợc xác

định rõ về cấu tạo cũng nh tính chất hoá học, trong số đó các hợp chất lactone là những hợp chất tạo ra mùi thơm rất dễ chịu Các hợp chất này đợctìm thấy trong tự nhiên ở một số loại hoa quả, thảo mộc và một số sản phẩmlên men tự nhiên Với giá trị tạo hơng thơm các lactone này đã đợc sử dụng

-để tạo ra các loại nớc hoa, hay làm tăng mùi vị thơm ngon của các loại thựcphẩm Tuy nhiên tách chiết chúng từ nguồn tự nhiên là một công việc khókhăn và không mang lại hiệu quả kinh tế cao Thực tế các -lactone đợc tổnghợp từ nguồn nguyên liệu dầu thực vật nhờ vào quá trình chuyển hoá của visinh vật Dầu thầu dầu là loại nguyên liệu rất lý tởng để làm việc trên dothành phần chính của nó là acid ricinoleic, một acid có cấu trúc đặc biệtthuận lợi cho việc tổng hợp các lactone

Nguồn nguyên liệu dầu thầu dầu ở nớc ta rất sẵn có và rẻ tiền nhng việc

sử dụng nó cho sinh tổng hợp chất thơm nhờ vi sinh vật còn rất mới mẻ Vì

vậy chúng tôi đã tiến hành đề tài: “ Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng chuyển hoá dầu thầu dầu thành chất thơm ” với các

mục tiêu sau:

- Phân lập từ tự nhiên các chủng nấm men có khả năng chuyển hoá dầu

thầu dầu thành chất thơm -decalactone

- Tuyển chọn các chủng nấm men từ bộ su tập giống của Viện CNTP

- Tách chiết -decalactone từ môi trờng nuôi cấy nấm men và sơ bộ

định tính, định lợng bằng sắc ký khí

phần i: Tổng quan tài liệu

1.1 Đại Cơng về nấm men

Nấm men (yeast, Levure) là tên gọi thông thờng của một nhóm nấm có

vị trí phân loại không thống nhất nhng có những đặc điểm chung sau[3]: nóichung có tồn tại trạng thái đơn bào, đa số sinh sôi nảy nở theo lối nảy chồi,cũng có khi sinh sản theo lối phân cắt tế bào, nhiều loại có khả năng lên men

đờng, thành tế bào có chứa mannan, thích nghi với môi trờng có chứa đờngcao, có tính acid cao

Nấm men phân bố rộng rãi trong tự nhiên, nhất là trong môi trờng cóchứa đờng, có pH thấp, chẳng hạn nh trong hoa quả rau, da, mật mía, rỉ đ-ờng, trong đất vờn trồng cây ăn quả, trong đất có nhiễm dầu mỡ Là vi sinhvật điển hình cho nhóm nhân thật, nấm men có cấu tạo tế bào hoàn chỉnhgồm có: thành tế bào, màng tế bào, tế bào chất, nhân, ty thể, 1-2 khôngbào Kích thớc tế bào nấm men lớn gấp 10 lần so với vi khuẩn, và vào

khoảng 8-15 m do đó có thể thấy rõ dới kính hiển vi quang học Hình thái

tế bào nấm men rất đa dạng và phong phú: hình cầu, hình trứng, hình ô van,hình elip, hình cong, hình thoi, hình tam giác, hình thận, hình lỡi liềm, hình

mũ Nấm men có cả hai hình thức sinh sản hữu tính và vô tính Sinh sản vôtính bằng cách nảy chồi, phân cắt và bằng bào tử: bào tử đốt ở chi

Geotrichum, bào tử bắn ở chi Sporobolomyces, bào tử áo ở chi Candida Sinh

sản hữu tính bằng bào tử túi ở các chi Saccharomyces, Zygosaccharomyces,

và nhiều chi nấm men thuộc bộ Endomycetales.

Nấm men thuộc loại dinh dỡng hoá năng hữu cơ Chúng chỉ có khả năngthu nhận năng lợng nhờ quá trình oxy hoá hiếu khí hoặc lên men kỵ khí cáchợp chất hữu cơ ngoại bào [4] Trong quá trình sinh sống và phát triển nấmmen cần những nguồn dinh dỡng nh: nguồn cacbon, nguồn nitrơ, các nguyên

tố khoáng và các chất sinh trởng Đồng thời trong quá trình sinh sống nấmmen cũng tổng hợp nên các chất hữu cơ, tạo ra các sản phẩm trao đổi chất màcon ngời đã và đang sử dụng chúng để phục vụ cho đời sống của mình Rấtnhiều loại nấm men đợc ứng dụng trong sản xuất nh: công nghiệp sản xuất r-

ợu, bia, nớc giải khát, sinh khối phục vụ chăn nuôi, cao nấm men, lipit nấmmen, các enzym nh amilaza, invertaza, lactaza, uricaza, sản xuất ergosterol,acid ribonucleic, riboflavin, các acid amin nh lizin, cystein, methionin Cũng

có rất nhiều loài nấm men đã đợc biết là có khả năng chuyển hoá dầu thầu dầuthành -decalacton và đã đợc sử dụng trong công nghiệp để sản xuất -

decalactone nh: Candida guilliermondii, Yarrowia lipolytica, Geotrichum

klebahni [13], Sporobolomyces odorus, Rhodotorula glutinus [11]

1.2 Dầu thầu dầu

1.2.1 Cây thầu dầu [1]

Cây thầu dầu có tên khoa học là Ricinus communis L, thuộc họ thầu dầu

Euphorbiaceae, bộ ba mảnh vỏ Euphorbiales, còn có tên gọi khác là: đu đủ

tía, tỳ ma, cây dầu ve, cây hơng thét

mọc so le có cuống, lá kép hai bên họp thành một túi màng, sớm rụng, phiếnlá hình chân vịt từ 5-9 có khi tới 11 thuỳ cắt sâu, mép có răng ca không đều.Hoa mọc thành chùm sim, quả 3 mảnh vỏ trên mặt có nhiều gai mềm Hạthình trứng hơi dẹt Mặt hạt nhẵn bóng

Phân bố thu hái, chế biến: Mọc hoang ở nhiều vùng nhiệt đới: Việt

Nam, ấn Độ, Brazin Ngời ta thu hoạch hạt thầu dầu vào tháng 4-5, với mục

đích chủ yếu là dùng để ép dầu trong công nghiệp Ngày nay, cây thầu dầu

đợc trồng ở nhiều nơi trên thế giới

1.2.2 Dầu thầu dầu

Dầu thầu dầu có tên thơng phẩm là Castor oil đợc tách ra từ hạt thầu dầubằng phơng pháp ép lạnh, ép nóng hoặc trích ly

Dầu thầu dầu là một chất lỏng sền sệt, không màu hoặc hơi vàng, mùi vịnhạt Thành phần hoá học của dầu thầu dầu Việt Nam cha đợc xác định rõràng, theo tác giả Đỗ Tất Lợi dầu thầu dầu Việt Nam ngoài các glyceritchung nh stearin, palmitin còn có một một glycerit đặc biệt là ricinolein làthành phần chính của dầu thầu dầu (xà phòng hoá sẽ cho acid ricinoleic).Ricinoleic là một acid rợu béo có công thức nh sau:

Acid ricinoleic (12-hydroxy-9-octadecenoic )

Bảng 1: Thành phần hoá học của dầu thầu dầu[9,10]

Acid Dầu Brazin (%) Dầu ấn độ (%)

1.3 [R]- -decalactone tính chất hoá lý nguồn gốc và ứng dụng

Các lactone đợc tìm thấy nhiều trong tự nhiên trong số đó decalactone là lactone có giá trị nhất và cũng đựoc quan tâm nghiên cứunhiều nhất -Decalactone là một lactone đợc tìm thấy lần đầu tiên trong quả

-đào và một số loại hoa quả khác -Decalactone là một ester nội phân tử củaacid 4-hydroxy-decanoic, acid này trong điều kiện pH từ 1-5 và nhiệt độ 70-

O

O C

H3

T o

ACID

+ Tỷ trọng : 0,952

+ Mùi: Hoa quả và bơ sữa

-Decalactone không có độc tính và có thể sử dụng trực tiếp trong thựcphẩm Năm 1974, Uỷ ban hợp tác Châu Âu đã đa chất này vào danh sáchnhững hợp chất thơm tổng hợp đợc sử dụng trong thực phẩm ở mức độ caonhất từ 5 –20 ppm Tuy nhiên trong thực tế, nồng độ lactone này sử dụngtrong thực phẩm cũng không quá 3 ppm và trong nớc hoa từ 20-400ppm[23] Trên thế giới -decalactone đợc sử dụng trong nhiều ngành côngnghiệp khác nhau nh thực phẩm, dợc phẩm và mỹ phẩm chính vì sự an toàn

và mùi thơm hấp dẫn đối với ngời sử dụng Nó đợc dùng làm chất tạo hơngthơm cho thực phẩm, singum, kem đánh răng, đồ uống, nớc hoa, sản phẩmlàm mềm vải, các chế phẩm dùng cho tóc [13]

Trong tự nhiên, -decalactone có mặt trong một số loại hoa quả nh: mận

1230 mg/kg, mơ 490 mg/kg, xoài 450 mg/kg, đào 125 mg/kg, dứa 20mg/kg một số loại thảo mộc và một số sản phẩm lên men Trong phân tử

-decalactone có chứa một trung tâm hoạt động quang học vì vậy trong tựnhiên ngời ta tìm thấy cả hai loại đồng phân quang học của nó là [R]-

-decalactone và [S]--decalactone Tuy nhiên dạng đồng phân quang học R

đợc tìm thấy nhiều hơn Ngời ta đã nghiên cứu rất kỹ về sự vợt trội này trongnhiều loại quả từ các nớc khác nhau trên thế giới

1.4 Tổng hợp -decalactone nhờ vi sinh vật [18].

-Decalactone đợc tổng hợp qua hai con đờng: tổng hợp sinh học(biosynthetic) và biến đổi sinh học (biotransformation) Con đờng biến đổisinh học là con đờng chính trong công nghiệp để tổng hợp -decalactone vì con đờng này cho năng suất cao hơn con đờng tổng hợp sinhhọc

1.4.1 Con đờng tổng hợp sinh học(biosynthetic)

Là con đờng tổng hợp -decalactone nhờ vi sinh vật trong đó không sửdụng chất béo hay dầu mỡ Một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp

-decalactone từ những hợp chất đơn giản Berger là ngời đầu tiên đã pháthiện ra sự có mặt của -decalactone trong môi trờng nớc thịt lên men các

chủng Basidomycetes (nấm đảm) Có rất nhiều các báo cáo khoa học về việc

tổng hợp decalactone nhờ nấm mốc nhng nói chung sản lợng

-decalactone thu đợc rất thấp Jourdant và cộng sự đã dùng chủng

Sporobolomyces odorus để tổng hợp -decalactone nhng hiệu suất thu đợc

rất thấp (1mg/1 liter môi trờng) Tressel và Albrecht đã đa ra ý kiến vềviệc sản xuất -decalactone nhờ sự hoá đặc acyl-ACP cùng succinyl CoA.Tuy nhiên có rất ít tài liệu nói về khả năng có thể của việc kết hợp giữa hoásinh hoặc sinh lý học với tổng hợp -decalactone

1.4.2 Con đờng biến đổi sinh học (biotransformation)

-Decalactone và những lactone khác đợc sản xuất trong công nghiệpbằng cách chuyển hoá acid ricinoleic, acid béo cơ bản của dầu thầu dầu nhờ

vi sinh vật acid ricinoleic đầu tiên bị biến đổi thành acid decanoic sau đó đóng vòng lacton để tạo ra -decalactone

Phản ứng đóng vòng lactone xảy ra do sự tác động của enzym haykhông cần sự xúc tác của enzym là điều cha rõ ràng Tổng hợp -decalactone từ nguồn nguyên liệu dầu thầu dầu và acid ricinoleic theo quymô công nghiệp là mục đích của nhiều công trình nghiên cứu [9,11,12,13,14,

22, 24, 26] Những vi sinh vật đã đợc biết là có khả năng chuyển hoá acidricinoleic thành -decalactone rất đa dạng và phong phú bao gồm cả vikhuẩn, nấm men và nấm mốc

Bảng 2: Một số vi sinh vật đã đợc sử dụng cho sản xuất -decalacton và

một số lactone khác[9, 11, 13, 22, 25 ].

-hydroxy-Yarrowia lipolytica HR 145

Dầu thầu dầu

-decalactonedecalactone

Quá trình chuyển hoá acid ricinoleic xảy ra ở vi sinh vật thực chất làqúa trình -oxi hoá nhờ vào hoạt động của các Acyl Coenzym A oxidase(Aox) Acid ricinoleic bị cắt dần thành từng mẩu 2 cacbon tạo ra Acetyl-CoA, chất này sau đó sẽ biến đổi qua chu trình citric acid và chuỗi hô hấp tếbào tạo năng lợng ATP cung cấp cho hoạt động sống của VSV [2] Quá trình

này tạo ra sản phẩm trung gian acid 4-hydroxy decanoic, nh đã biết ở trênacid này có thể đóng vòng để tạo ra -decalactone Yves Wache [27,28] vàcộng sự đã chứng minh hoạt động của các Aox (Aox1 đến Aox5) đợc mã hoábởi các gen Pox1->Pox5 ở nấm men Yarrowia lipolytica có liên quan đến sựtích tụ và tiêu huỷ lactone Trong đó gen Pox3 mã hoá enzym Aox3 ( chuỗingắn-short chain ) có ảnh hởng lớn nhất đến sự tổng hợp -decalactone ở những chủng đột biến cắt đứt gen Pox3 lợng -decalactone tạo thành tăng lên đáng kể so với chủng hoang dã ( Từ 50mg/llên đến 220mg/l sau 24 h ) ở các chủng hoang dã sự tạo thành 3-hydroxy--decalactone chiếm phần lớn trong sản phẩm thu đợc đã gợi ra suy nghĩ rằng

ở chủng hoang dã quá trình -oxi hoá chịu sự tác động của Coenzym A Hydrogenase

nấm men Yarrowia lipolytica theo Yves Wache và cộng sự [28]:

+ Sản phẩm tạo thành:

1: Dec-3-en-4-Olide 2: -Decalactone 3: Dec-2-en-4-Olide 4: 3-hydroxy--Decalactone 5: 3-keto--Decalactone + Hệ enzymes:

Aox: Acyl Coezym A oxidase Ahy: Acyl Co A Hydratase Hdh: 3-hydroxy -Decalactone Thi : 3keto acyl Co A thiolase.

Phần 2: Thực nghiệm và kết quả

2.1 Nguyên vật liệu và phơng pháp thực nghiệm

2.1.1 Nguyên vật liệu hoá chất và thiết bị

 Dầu thầu dầu : Đợc mua tại trung tâm Dầu mỡ, Viện hoá học Công

nghiệp Dầu ở dạng thô, đợc khai thác từ thiết bị ép nóng tại ngay nơi trồng ởBắc Ninh

 Acid ricinoleic : Do viện Công nghiêp Thực Phẩm cung cấp

 Chủng giống: 64 chủng nấm men trong bộ su tập của viện CNTP đợc

tuyển chọn khả năng chuyển hoá dầu thầu dầu

 Lá cây, đất và hoa: Gồm có 16 mẫu lá cây, 6 mẫu đất, và 6 mẫu hoa

đợc lấy ở viện CNTP, vờn thực vật trờng Đại học Dợc, công viên Pasteur,Công viên Lê-nin, Hoài Đức Hà Tây

+ Box cấy vô trùng Bioblock scientific ( Pháp )

+ Nồi hấp áp lực Himayamatoko (Nhật )

+ Máy lắc ống nghiệm IKA* KS 130 basic ( Nhật )

+ Máy lắc bình tam giác Lab-line ( Mỹ )

+ Kính hiển vi quang học E clipse E 600 Nikon ( Nhật )

+ Máy sắc ký khí Aligent 6890 A/ USA

+ Đĩa petri, ống eppendoff, ống nghiệm có nắp vặn, ống fancol, pipet,bình tam giác

2.1.2 Một số môi trờng sử dụng cho nghiên cứu

+ Yeast nitrogen base w/o amino acid (Difco): 6,7g)

+ Nớc cất vừa đủ 100 ml

Yeast nitrogen base w/o amino acid: Là môi trờng khô của hãng Difcogồm có: các acid amin, các vitamin và các muối vô cơ cần thiết cho sự pháttriển của nấm men

Hấp ở 120 0C/ 1atm / 20 phút, sau khi để nguội tới 80 0C bổ xung 0,1 %acid lactic và đổ thạch đĩa

 Môi tr ờng 5: môi tr ờng làm sạch lần 2

Thành phần nh môi trờng làm sạch lần 1nhng không bổ xung acid lactic

Thành phần nh môi trờng làm sạch lần 2

2.1.3 Phơng pháp thực nghiệm

+ Nguyên tắc:

Để phân lập nấm men có khả năng chuyển hoá acid ricinoleic chúng tôi

sử dụng môi trờng chứa nguồn cacbon duy nhất là acid ricinoleic Nếu nấmmen mọc có nghĩa chúng phải oxy hoá đợc acid ricinoleic Những chủng cókhả năng chuyển hoá acid ricinoleic đợc kiểm tra khả năng tạo mùi thôngqua đánh giá cảm quan

+ Chuẩn bị môi tr ờng : Pha môi trờng 1 đong vào các ống nghiệm loại

10 ml có nắp vặn , mỗi ống 3ml Bổ xung 30 l acid ricinoleic / ống Hấpthanh trùng ở 120 0C / 20 phút

- Ly tâm ở 13000 vòng/phút trong thời gian 5 phút

- Hút bỏ 900 l phần dịch trong, trộn đều phần còn lại và nhỏ toàn bộvào ống chứa môi trờng chọn lọc

Nuôi cấy lắc trên giá ống nghiệm, chỉnh tốc độ lắc sao cho toàn bộ phầndịch bị khuấy trộn Sau 1-2 tuần, tuỳ theo mức độ phát triển có thể tiến hànhphân lập nấm men.

Môi trờng sử dụng cho phân lập là môi trờng 5

- Lắc đều dịch nuôi cấy

- Nhúng que cấy vào canh trờng và cấy lên mặt thạch vài lần

- Di que cấy theo hớng từ vị trí ban đầu ra các phía để tách từng khuẩnlạc riêng rẽ

Sau 3- 5 ngày ta chọn các khuẩn lạc nấm men riêng rẽ và cấy lên đĩathạch chứa môi trờng làm sạch lần 1 Khi VSV đã mọc ta chọn một khuẩnlạc riêng rẽ cấy lên môi trờng làm sạch lần 2 Qua 2 lần làm sạch ta có thểchọn đợc các giống thuần chủng, các chủng mới đợc giữ giống trong ốngeppendrof ở 5 0 C

Chuẩn bị môi trờng 1 và đong vào các ống nghiệm 10 ml có nắp khoảng

3 ml/ống Bổ xung 30l acid ricinoleic/ống Hấp thanh trùng ở 1 atm/20phút Các chủng đã phân lập đợc cấy vào các ống nghiệm có chứa môi trờngtrên Nuôi cấy trong điều kiện hiếu khí (mở 1/4 nắp ống nghiệm) nhiệt độ 25

0C, lắc 320 vòng /phút Theo dõi mùi tạo ra hàng ngày trong thời gian 2 tuần

để chọn chủng có khả năng tạo hơng thơm

dầu thầu dầu từ bộ su tập giống của Viện CNTP:

Các chủng giống đợc giữ trong ống eppendorf trong tủ lạnh đợc cấytruyền sang môi trờng 6 trên thạch nghiêng để hoạt hoá chủng

Pha môi trờng 2 đong vào các ống nghiệm 2ml/ống Bổ xung 20l acidricinoleic /ống nuôi cấy ở điều kiện: rung lắc 320 vòng/phút, 25 0C và theodõi mùi tạo ra trong 14 ngày

Các chủng nấm men đợc cấy truyền từ ống giữ giống lên môi trờngMalt-Glu 2 0 Bx 2 % Agar và quan sát trên kính hiển vi quang học để sơ bộxác định hình thái và sơ bộ định tên.

nuôi cấy các chủng tạo hơng

+ Chuẩn bị chủng giống: chủng giống đợc cấy tryuền từ ống eppendorf

sang thạch nghiêng, sau 2-3 ngày có thể sử dụng cho lên men

+ Chuẩn bị môi tr ờng : chuẩn bị bình tam giác chứa 100 ml môi trờng

2% pepton, 0.02 % Tween 80, 10 gam dầu thầu dầu Tween 80 đợc cho vào ở

đây nhằm làm tăng khả năng nhũ hoá của dầu thầu dầu giúp cho vi sinh vật

có thể sử dụng tốt hơn Môi trờng đợc hấp thanh trùng ở 120 0C /1 atm /20phút Cấy khoảng một vòng que cấy chủng vào môi trờng nuôi cấy, lắc đều

Đặt các bình nuôi cấy chủng trong điều kiện rung lắc ở 200 rpm, nhiệt độ 25

0C, pH môi trờng đợc giữ ở 6,5-7 trong thời gian 8 ngày Sau 8 ngày kết thúcquá trình lên men pH đợc chỉnh về 1,5 bằng dung dịch acid HCl 2 % Đunnóng ở 100 0C trong 10 phút để thực hiện phản ứng đóng vòng lacton Saukhi làm lạnh chiết bằng dung môi n- hecxan Ly tâm dịch chiết để loại bỏcặn Hút lấy dịch trong vào ống Fancol giữ trong tủ lạnh để sử dụng choviệc định tính và định lợng chất thơm tạo ra bằng sắc ký khí

Định tính chất thơm trong dịch chiết bằng cách so sánh đối chiếu vị trícủa pic tơng ứng trên sắc đồ trùng với pic của chất chuẩn đối chiếu

Định lợng chất thơm tạo thành bằng cách tính diện tích pic của chấtchuẩn đã biết chính xác hàm lợng từ đó suy ra lợng chất chuẩn có trong mẫuthử

khi nuôi cấy và tách chiết theo các cách khác nhau:

Nuôi cấy chủng KFP 346 theo các cách sau: