Con người từ lâu đã khao khát tìm ra những nguồn hương liệu để phục vụ cho nhu cầu ngày càng tăng của các ngành công nghiệp dược phẩm, thực phẩm, mỹ phẩm
Đặt vấn đề Con người từ lâu đã khao khát tìm ra những nguồn hương liệu để phục vụ cho nhu cầu ngày càng tăng của các ngành công nghiệp dược phẩm, thực phẩm, mỹ phẩm. Những năm qua, nhiều loại chất thơm đã được xác định rõ về cấu tạo cũng như tính chất hoá học, trong số đó các hợp chất γ-lactone là những hợp chất tạo ra mùi thơm rất dễ chịu. Các hợp chất này được tìm thấy trong tự nhiên ở một số loại hoa quả, thảo mộc và một số sản phẩm lên men tự nhiên. Với giá trị tạo hương thơm, các lactone này đã được sử dụng để tạo ra các loại nước hoa, hay làm tăng mùi vị thơm ngon của thực phẩm… Tuy nhiên việc tách chiết chúng từ nguồn tự nhiên là một công việc khó khăn và ít có hiệu quả kinh tế, vì vậy nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu điều chế các hợp chất lactone này từ nguồn nguyên liệu dầu thực vật nhờ vào quá trình chuyển hoá của vi sinh vật. Trong các loại dầu thực vật, dầu thầu dầu là loại nguyên liệu lý tưởng để làm việc trên do thành phần chính của nó là acid ricinoleic, một acid có cấu trúc đặc biệt thuận lợi cho việc tổng hợp các lactone. Nguồn nguyên liệu dầu thầu dầu ở nước ta có rất sẵn và rẻ nhưng sử dụng nó cho sinh tổng hợp chất thơm nhờ vi sinh vật còn chưa được nghiên cứu. Vì vậy chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng chuyển hoá dầu thầu dầu thành chất thơm” với các mục tiêu sau: - Phân lập từ tự nhiên và tuyển chọn trong bộ sưu tập giống các chủng nấm men có khả năng chuyển hoá dầu thầu dầu thành chất thơm γ- decalactone. - Tách chiết γ-decalactone từ môi trường nuôi cấy nấm men và sơ bộ định tính, định lượng bằng sắc ký khí. 1 PHN I: TNG QUAN TI LIU. 1.1. i Cng v nm men Nm men (yeast, Levure) l tờn gi thụng thng ca mt nhúm nm cú v trớ phõn loi khụng thng nht nhng cú nhng c im chung sau[3]: núi chung chỳng thng trng thỏi n bo, a s sinh sn theo cỏch ny chi, cng cú khi sinh sn theo li phõn ct t bo, nhiu loi cú kh nng lờn men ng, thnh t bo cú cha mannan, thớch nghi vi mụi trng cú nng ng cao v cú tớnh acid. Nm men phõn b rng rói trong t nhiờn, nht l trong mụi trng cú cha ng, cú pH thp, chng hn nh trong hoa qu, rau da, mt mớa, r ng, trong t vn trng cõy n qu, trong t cú nhim du m. L vi sinh vt thuc nhúm nhõn tht, nm men cú cu to t bo hon chnh gm cú: thnh t bo, mng t bo, t bo cht, nhõn Kớch thc t bo nm men ln gp 10 ln so vi vi khun, v vo khong 2-15 àm do ú cú th thy rừ di kớnh hin vi quang hc. Hỡnh thỏi t bo nm men rt a dng v phong phỳ: hỡnh cu, hỡnh trng, hỡnh ụ van, hỡnh elip, hỡnh cong, hỡnh thoi, hỡnh tam giỏc, hỡnh thn, hỡnh li lim, hỡnh mNm men cú c hai hỡnh thc sinh sn hu tớnh v vụ tớnh. Sinh sn vụ tớnh bng cỏch ny chi, phõn ct v bng bo t: bo t t chi Geotrichum, bo t bn chi Sporobolomyces, bo t ỏo chi Candida. Sinh sn hu tớnh bng bo t tỳi cỏc chi Saccharomyces, Zygosaccharomyces, v nhiu chi nm men thuc b Endomycetales. Nm men thuc loi dinh dng hoỏ nng hu c. Chỳng ch cú kh nng thu nhn nng lng nh quỏ trỡnh oxy hoỏ hiu khớ hoc lờn men k khớ cỏc hp cht hu c ngoi bo [4]. Trong quỏ trỡnh sinh trng v phỏt trin nm men cn nhng ngun dinh dng nh: ngun cacbon thng l cỏc loi ng, ngun nit, cỏc nguyờn t khoỏng v cỏc cht sinh trng. ng thi 2 trong quá trình sinh trưởng và phát triển nấm men cũng tổng hợp nên các chất hữu cơ, tạo ra các sản phẩm trao đổi chất mà con người đã và đang sử dụng chúng để phục vụ cho đời sống của mình. Rất nhiều loại nấm men được ứng dụng trong sản xuất như: công nghiệp sản xuất rượu, bia, nước giải khát, sinh khối phục vụ chăn nuôi, cao nấm men, lipid nấm men, các enzym như amilase, invertase, lactase, sản xuất ergosterol, acid ribonucleic, riboflavin, các acid amin như lyzin, cystein, methionin .Cũng có rất nhiều loài nấm men đã được biết là có khả năng chuyển hoá dầu thầu dầu thành γ-decalactone và đã được sử dụng để sản xuất γ-decalactone như: Candida guilliermondii, Yarrowia lipolytica, Geotrichum klebahni [13], Sporobolomyces odorus, Rhodotorula glutinus [10]… 1.2. Dầu thầu dầu 1.2.1. Cây thầu dầu [1] Cây thầu dầu có tên khoa học là Ricinus communis L, thuộc họ thầu dầu Euphorbiaceae, bộ ba mảnh vỏ Euphorbiales, còn có tên gọi khác là: đu đủ tía, tỳ ma, cây dầu ve, cây hương thét. Hình thái: Cây sống lâu năm, thân yếu, nhưng có thể cao tới 10-12m. Lá mọc so le có cuống, lá kép hai bên họp thành một túi màng, sớm rụng, phiến lá hình chân vịt từ 5-9 có khi tới 11 thuỳ cắt sâu, mép có răng cưa không đều. Hoa mọc thành chùm sim, quả 3 mảnh vỏ trên mặt có nhiều gai mềm. Hạt hình trứng hơi dẹt. Mặt hạt nhẵn bóng. Phân bố thu hái, chế biến: Mọc hoang ở nhiều vùng nhiệt đới: Việt Nam, Ấn Độ, Brazin…Người ta thu hoạch hạt thầu dầu vào tháng 4-5, với mục đích chủ yếu là dùng để ép dầu trong công nghiệp. Ngày nay, cây thầu dầu được trồng ở nhiều nơi trên thế giới. 1.2.2. Dầu thầu dầu 3 Dầu thầu dầu có tên thương phẩm là Castor oil được tách ra từ hạt thầu dầu bằng phương pháp ép lạnh, ép nóng hoặc trích ly. Dầu thầu dầu là một chất lỏng sền sệt, không màu hoặc hơi vàng, mùi vị nhạt. Thành phần hoá học của dầu thầu dầu Việt Nam chưa được xác định rõ ràng. Theo tác giả Đỗ Tất Lợi dầu thầu dầu Việt Nam ngoài các glycerid chung như stearin, palmitin còn có một một glycerid đặc biệt là ricinolein là thành phần chính của dầu thầu dầu (xà phòng hoá sẽ cho acid ricinoleic). Ricinoleic là một acid rượu béo có công thức như sau: C OH O OH Acid ricinoleic (12-hydroxy-9-octadecenoic ) Trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu thành phần hoá học của dầu thầu dầu và đã được công bố. Theo các tác giả C.Borch-Jensen và G.Lakshininarayana dầu thầu dầu có thành phần hoá học như bảng1. Bảng 1: Thành phần hoá học của dầu thầu dầu[9,14] Acid Dầu Brazin (%) Dầu ấn độ (%) Ricinoleic acid 83-90,00 87,4-90,4 Linoleic 3,19-5,98 2,9-4,0 Oleic 2,96-5,64 2,5-4,0 Stearic 0,68-1,84 0,9-1,3 Palmitic 0,87-2,35 0,8-1,3 Dihydrostearic - 0,5-0,8 Encozenic - 0,6-1,6 Linoleic 0,34-0,91 0,1-1,1 Theo bảng 1 thì thành phần hoá học của dầu thầu dầu có sự khác biệt theo nguồn gốc tuy nhiên thành phần chính vẫn là acid ricinoleic (chiếm 83- 90,4 %). 4 CH 3 OH OH O O O CH 3 T o ACID 4-HYDROXY-DECANOIC GAMMA-DECALACTON 1.3. [R]- γ-decalactone tính chất hoá lý nguồn gốc và ứng dụng Các γ-lactone được tìm thấy nhiều trong tự nhiên trong số đó γ-decalactone là lactone có giá trị nhất và cũng đựoc quan tâm nghiên cứu nhiều nhất. γ-Decalactone là một lactone được tìm thấy lần đầu tiên trong quả đào và một số loại hoa quả khác. γ-Decalactone là một ester nội phân tử của acid 4-hydroxy-decanoic, acid này trong điều kiện pH từ 1-5 và nhiệt độ 70-100 0 C sẽ đóng vòng để tạo γ-decalactone [7]. Ở điều kiện thường γ-decalactone là một chất lỏng trong suốt không màu, hoặc có màu vàng rơm rất nhạt, rất dễ bay hơi tạo mùi thơm dễ chịu. Nó hầu như không tan trong nước nhưng tan rất tốt trong rượu, dầu, ete, etyl acetat, hexane…Nó có các đặc tính hoá lý sau [6,20]: + Công thức phân tử: C 10 H 18 O 2 (M=170) + Công thức cấu tạo: + nhiệt độ sôi: 281 0 C + Tỷ trọng : 0,952 + Mùi: Hoa quả và bơ sữa. γ-Decalactone không có độc tính và có thể sử dụng trực tiếp trong thực phẩm. Năm 1974, Uỷ ban hợp tác Châu Âu đã đưa chất này vào danh sách những hợp chất thơm tổng hợp được sử dụng trong thực phẩm ở mức độ cao nhất từ 5 –20 ppm. Tuy nhiên trong thực tế, nồng độ lactone này sử dụng trong thực phẩm cũng không quá 3 ppm và trong nước hoa từ 20-400 ppm[17]. Trên thế giới γ-decalactone được sử dụng trong nhiều ngành công 5 nghiệp khác nhau như thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm chính vì sự an toàn và mùi thơm hấp dẫn đối với người sử dụng. Nó được dùng làm chất tạo hương thơm cho thực phẩm, singum, kem đánh răng, đồ uống, nước hoa, sản phẩm làm mềm vải, các chế phẩm dùng cho tóc [13] . Trong tự nhiên, γ-decalactone có mặt trong một số loại hoa quả như: mận 1230 mg/kg, mơ 490 mg/kg, xoài 450 mg/kg, đào 125 mg/kg, dứa 20 mg/kg .một số loại thảo mộc và một số sản phẩm lên men. Trong phân tử γ-decalactone có chứa một trung tâm hoạt động quang học vì vậy trong tự nhiên người ta tìm thấy cả hai loại đồng phân quang học của nó là [R]-γ-decalactone và [S]-γ-decalactone. Tuy nhiên dạng đồng phân quang học R được tìm thấy nhiều hơn. Người ta đã nghiên cứu rất kỹ về sự vượt trội này trong nhiều loại quả từ các nước khác nhau trên thế giới[5]. 1.4. Tổng hợp γ-decalactone nhờ vi sinh vật [15]. γ-Decalactone được tạo thành bằng hai con đường: tổng hợp sinh học (biosynthetic) và biến đổi sinh học (biotransformation). Con đường biến đổi sinh học là con đường chính trong công nghiệp để tổng hợp γ-decalactone vì con đường này cho năng suất cao hơn con đường tổng hợp sinh học. 1.4.1. Con đường tổng hợp sinh học(biosynthetic). Là con đường tổng hợp γ-decalactone nhờ vi sinh vật trong đó không sử dụng chất béo hay dầu mỡ. Một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp γ-decalactone từ những hợp chất đơn giản. Berger là người đầu tiên đã phát hiện ra sự có mặt của γ-decalactone trong môi trường nước thịt lên men bởi các chủng Basidomycetes (nấm đảm). Có rất nhiều báo cáo khoa học về việc tổng hợp γ-decalactone nhờ nấm mốc nhưng nói chung sản lượng γ-decalactone thu được rất thấp. Jourdant và cộng sự đã dùng chủng 6 Sporobolomyces odorus để tổng hợp γ-decalactone nhưng chỉ thu được 1mg/1 liter môi trường…Tressel và Albrecht đã đưa ra ý kiến về việc sản xuất γ-decalactone nhờ sự hoá đặc acyl-ACP cùng succinyl CoA. Tuy nhiên có rất ít tài liệu nói về khả năng có thể của việc kết hợp giữa hoá sinh hoặc sinh lý học với tổng hợp γ-decalactone. 1.4.2. Con đường biến đổi sinh học (biotransformation) γ-Decalactone và những lactone khác được sản xuất trong công nghiệp bằng cách chuyển hoá acid ricinoleic, acid béo cơ bản của dầu thầu dầu nhờ vi sinh vật. Đầu tiên acid ricinoleic bị biến đổi thành acid 4-hydroxy- decanoic sau đó đóng vòng để tạo ra γ-decalactone . Con đường biến đổi acid ricinoleic tạo γ -decalactone ở vi sinh vật. Phản ứng đóng vòng lactone xảy ra do sự tác động của enzym hay không cần sự xúc tác của enzym là điều chưa rõ ràng. Tổng hợp γ-decalactone từ nguồn nguyên liệu dầu thầu dầu và acid ricinoleic theo quy mô công nghiệp là mục đích của nhiều công trình nghiên cứu [7, 8, 10, 11, 12, 13, 16, 18, 19]. Những vi sinh vật đã được biết là có khả năng chuyển hoá acid ricinoleic thành γ-decalactone rất đa dạng và phong phú bao gồm cả vi khuẩn, nấm men và nấm mốc. Bảng 2: Một số vi sinh vật đã được sử dụng cho sản xuất γ-decalactone và một số lactone khác[8, 10, 12, 16, 19]. 7 CH 3 OH O OH CH 3 O OH OH CH 3 O O Vi sinh vËt Acid 4-hydroxy decanoic Acid ricinoleic Gamma-decalactone Năm Chủng vi sinh vật Nguyên liệu Sản phẩm 198 0 Pityrosporum canis Pit.achydermatis Pit.orbiculare Pit.ovale Acid oleic γ-decalactone γ-hexa γ-hepta 1982 Aspergillus oryzae Geotrichum klebahnii Yarrowia lipolytica Candida guilliermondii Candida albicans Candida krusei Candida parakrusei Candida pseudotropicals Candida stellatoidea Candida tropicalis Candida rugosa Hansenula saturnus Dầu thầu dầu Dầu thầu dầu thuỷ phân Acid ricinoleic γ -decalactone 1989 Aspergillus niger Cladosporium suaveolens Phanerochaetechrysosporiu m Pichia etchellsii Dầu thầu dầu Dầu hướng dương Dầu dừa γ-decalactone γ-octanolied γ-decanolied 1990 Sporobolomyces odorus Rhodotorula glutinus Dầu thầu dầu γ-decalactone γ-hydroxy- decanoic acid 2001 Yarrowia lipolytica HR 145 (DSM 12397) Dầu thầu dầu γ-decalactone 1.4.3. Cơ chế chuyển hoá acid ricinoleic thành γ-decalactone ở vi sinh vật. Quá trình chuyển hoá acid ricinoleic xảy ra ở vi sinh vật thực chất là qúa trình β-oxy hoá nhờ vào hoạt động của các Acyl Coenzym A oxidase 8 (Aox). Acid ricinoleic bị cắt dần thành từng mẩu 2 cacbon tạo ra Acetyl- CoA, chất này sau đó sẽ biến đổi qua chu trình citric acid và chuỗi hô hấp tế bào tạo năng lượng ATP cung cấp cho hoạt động sống của vi sinh vật [2]. Quá trình này tạo ra sản phẩm trung gian acid 4-hydroxy decanoic, như đã biết ở trên acid này có thể đóng vòng để tạo ra γ-decalactone. Yves Wache [21, 22] và cộng sự đã chứng minh hoạt động của các Aox (Aox1 đến Aox5) được mã hoá bởi các gen Pox1->Pox5 ở nấm men Yarrowia lipolytica có liên quan đến sự tích tụ và tiêu huỷ lactone. Trong đó gen Pox3 mã hoá enzym Aox3 (chuỗi ngắn-short chain) có ảnh hưởng lớn nhất đến sự tổng hợp γ-decalactone. Ở những chủng đột biến cắt đứt gen Pox3 lượng γ-decalactone tạo thành tăng lên đáng kể so với chủng hoang dã (Từ 50mg/l lên đến 220mg/l sau 24 h). Ở các chủng hoang dã sự tạo thành 3-hydroxy-γ- decalactone chiếm phần lớn trong sản phẩm thu được đã gợi ra suy nghĩ rằng ở chủng hoang dã quá trình β-oxy hoá chịu sự tác động của 3-hydroxy-Acyl- Coenzym A Hydrogenase. 9 Con đường β -oxy hoá biến đổi methyl ricinoleate ở nấm men Yarrowia lipolytica theo Yves Wache và cộng sự [22]: Sản phẩm β-oxy hoá khác PHẦN II: Thực nghiệm và kết quả + Sản phẩm tạo thành: 1: Dec-3-en-4-Olide 2: γ-Decalactone 3: Dec-2-en-4-Olide 4: 3-hydroxy-γ-Decalactone 5: 3-keto-γ-Decalactone +Hệ enzym: Aox: Acyl CoezymA oxidase Ahy: Acyl Co A Hydratase Hdh: 3-hydroxy-γ-Decalactone Thi : 3keto acyl Co A thiolase. 10 [...]... trong h thng phõn loi nm men Hu ht nhng nm men thuc lp Ascomycetes nu khụng to bo t v khụng cú c im gỡ ni tri u c xp vo chi ny Mt s c im ca nm men Candida phõn lp c cú th thy c thụng qua hỡnh 2 21 Rhodotorula: Mt c im d nhn bit nht ca chi l chỳng to khun lc cú sc t hng Nm men ny c xp vo lp Basidiomycetes Chỳng khụng cú kh nng lờn men cỏc loi ng Sc t giỳp cho nm men ny chng chi c vi tỏc dng ca tia t ngoi... ging c cy truyn sang mụi trng 6 trờn thch nghiờng, sau ú c cy vo bỡnh lờn men Sau khi kt thỳc quỏ trỡnh lờn men cht thm to thnh c chit bng dung mụi n-hecxan theo s sau: Chủng giống Cấy truyền Thạch nghiêng 25 0 C, 3 ngy Lên men 7 ngày Dd HCl Dịch lên men Đun 100 0 C/10 phút Làm lạnh Dịch acid hoá Chiết 25 ml nhecxan Dịch chiết nhecxan 1 Ly tâm loại cặn 2.2.7 nh tớnh v nh lng cht thm to thnh trong cỏc... ca mt s chng nm men phõn lp v tuyn chn Cỏc chng nm men c cy truyn t ng gi ging sang thch nghiờng, nuụi cy 25 0C trong 3-5 ngy v quan sỏt hinh thỏi Cỏc hỡnh nh qua kớnh hin vi quang hc Eclipse 600 c truyn bng camera JVC v lu gi trờn mỏy vi tớnh Hỡnh nh ó s hoỏ c s lý bng phn mm ho Adobe Photoshop 5.0 Kt qu thu c s c tham chiu vi nhng khoỏ phõn loi nm men s b nh tờn cỏc chng ging Lờn men v tỏch chit... ca nm men trong cỏc chi ny cú th c lit kờ nh sau : - Candida : Phn ln nm men phõn lp c thuc chi ny (18/36 i din) c bit c 5 chng phõn lp (HRA 1, HRA 2, HRA 51, HRA 55, HRA 61) cú kh nng to hng u thuc vo chi ny Nm men Candida cú c trng l to khun lc mu kem, t bo cú th hỡnh oval cho ti hỡnh ng a s cỏc chng cú kh nng to khun ti gi Chi Candida l mt trong nhng chi phc hp nht trong h thng phõn loi nm men Hu... trng 6: mụi trng phõn lp v gi ging 13 Thnh phn nh mụi trng lm sch ln 2 2.1.3 Phng phỏp thc nghim Phng phỏp phõn lp nm men s dng Ricinoleic acid : + Nguyờn tc: phõn lp nm men cú kh nng chuyn hoỏ acid ricinoleic chỳng tụi s dng mụi trng cha ngun cacbon duy nht l acid ricinoleic Nu nm men mc cú ngha chỳng phi oxy hoỏ c acid ricinoleic Nhng chng cú kh nng chuyn hoỏ acid ricinoleic c kim tra kh nng to mựi... quỏ trỡnh lờn men pH c chnh v 1,5 bng dung dch acid HCl un núng 100 0C trong 10 phỳt Sau khi lm lnh chit bng 25 ml dung mụi n-hecxan Ly tõm loi cn Cỏc dch chit trờn c ký hiu theo th t KFP 346.1; KFP 346.2; KFP 346.3 c chy sc ký khớ nh lng -decalactone 2.2 Kt qu thc nghim 2.2.1 Phõn lp cỏc chng nm men chuyn hoỏ du thu du thnh cht thm T 28 mu lỏ cõy, hoa v t chỳng tụi phõn lp c 70 chng nm men (HRA1-HRA70),... 2.26 Lờn men v tỏch chit cht thm to thnh t mụi trng nuụi cy cỏc chng to hng - Chng ging c s dng lờn men v tỏch chit cht thm gm: + KFP 346, KFP 145, KFP 248, HRA 51 + JMC 2320 : Chng ging trong b su tp ca b mụn vi sinh vin ó nh tờn l Yarrowia lipolytica + PDT 7: chng phõn lp t t nhiờn ca b mụn cú kh nng to hng 23 - Cỏc chng ging c cy truyn sang mụi trng 6 trờn thch nghiờng, sau ú c cy vo bỡnh lờn men Sau... cacbon v nng lng duy nht, cú 25 mu cú biu hin phỏt trin ca nm men T nhng mu ny 70 chng nm men c phõn lp Cỏc chng ny c phõn nhúm theo c im hỡnh thỏi khun lc v hỡnh thỏi t bo Nhng chng i din c nh tờn s b ti chi thụng qua hỡnh thỏi t bo Tt c cỏc chng phõn lp c u c th nghim kh nng to hng khi mc c lp trờn mụi trng cha acid ricinoleic Cỏc chng nm men ó qua phõn loi s b c lit kờ bng 5 Trong s 36 chng ó phõn... lờn men s cú c hai cht, khi acid hoỏ mụi trng phn ng úng vũng s xy ra, ng thi khi mụi trng acid cỏc phõn t hu c s tn ti dng phõn t khụng phõn ly v vic tỏch chit s tt hn Theo cỏch 1 mụi trng sau lờn men khụng c acid hoỏ m tỏch chit luụn bng dung mụi etyl acetat do ú hiu qu tỏch chit s thp Lng decalactone thu c theo cỏch 2 v 3 cao hn rt nhiu iu ú cú th do vic acid hoỏ v un núng mụi trng sau lờn men. .. tờn cỏc chng ging Lờn men v tỏch chit cht thm to thnh t mụi trng nuụi cy cỏc chng to hng + Chun b chng ging: chng ging c cy truyn t ng eppendorf sang thch nghiờng, sau 2-3 ngy cú th s dng cho lờn men +Lờn men v tỏch chit: chun b bỡnh tam giỏc cha 100 ml mụi trng 2% pepton, 0.02 % Tween 80, 10 gam du thu du Tween 80 c cho vo õy nhm lm tng kh nng nh hoỏ ca du thu du giỳp cho vi sinh vt cú th s dng tt . 2.2.1 Phân lập các chủng nấm men chuyển hoá dầu thầu dầu thành chất thơm Từ 28 mẫu lá cây, hoa và đất chúng tôi phân lập được 70 chủng nấm men (HRA1-HRA70),. chuyển hoá dầu thầu dầu thành chất thơm với các mục tiêu sau: - Phân lập từ tự nhiên và tuyển chọn trong bộ sưu tập giống các chủng nấm men có khả