phân lập và tuyển chọn các chủng nấm men có khẳ năng chuyển hóa xylose thành xylitol

BỘYTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI NGUYỄN QUỐC LÂM PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ KHẲ NĂNG CHUYỂN HÓA XYLOSE THÀNH XYLITOL ( KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHOÁ 1999-2004) Giáo viên hướng dẫn : TS. Vũ Nguyên Thành GVC. Nguyễn Lệ Phi Noi thực : Viện Công Nghiệp-Thực Phẩm Bộ môn Vi Sinh trường ĐH Dược Hà Nội. Thời gian thực : Tháng 2/04-5/04. HÀ NỘI, THÁNG 6-2004 /0 .6 ^ LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: TS. Vũ Nguyên Thành GVC. Nguyễn Lệ Phi Là thấy cô tận tình bảo trực tiếp hướng dẫn làm khoá luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn cán kỹ thuật viên Bộ môn Vi sinhViện Công nghiệp Thực phẩn, Bộ môn Vi sinh - trường Đại Học Dược Hà Nội phòng ban khác trường nhiệt tình giúp đỡ trình thực đề tài. Cuối cùng, muốn gửi lời cảm ơn tới tất người thân bạn bè động viên, khuyến khích đóng góp nhiều ý kiến quý báu cho thực khoá luận này. Hà Nội, ngày 31 tháng 05 năm 2004 Sinh viên Nguyễn Quốc Lâm MỤC LỤC Trang Đặt vấn đề Phần 1. Tổng Quan .2 1.1. Khái quát vê xylỉtol .2 1.1.1. Công thức - đặc điểm - tính chất 1.1.2. Nguồn gốc .3 1.2. ứng dụng xylỉtol 1.2.1. ứng dụng chung .4 1.2.2. ứng dụng Y-Dược . 1.3. Tình hình sản xuất xylitol 1.3.1. Phương pháp hoá tổng hợp 1.3.2. Phương pháp sinh tổng hợp .12 Phần 2. Kết quả-Bàn luận 17 2.1. Nguyên vật liệu, thiết b ị . 17 2.2. Phương pháp nghiên cứu . 20 2.2.1. Tim điều kiện thủy phân hemicellulose 20 2.2.2. Phân lập nấm men từ đất hoa có khả mọc môi trường chứa dịch thủy phân .21 2.2.3. Tuyển chọn khiết .21 2.2.4. Nhân giống chủng phân lập 21 2.2.5. Thử khả sinh xylitol 22 2.2.6. Phương pháp định lượng xylitol 22 2.2.7. Sơ định tên chủng chotest xylitol dương tính 23 2.3. Kết - bàn luận . 23 2.3.1. Xác dịnh điều kiện thủy phân hemicellulose tối ưu .23 2.3.2. Phân lập khiết 24 2.3.3. Xác định khả sinh xylitol 28 2.3.4. Sơ xác định đến tên chi chủng phân lập cho test xylitol dương tính .34 Phần 3. Kết luận Đề xuất . 40 Tài liệu tham khảo 41 ĐẶT VÂN ĐỂ Từ lâu xylitol biết đến loại đường chức có nhiều ứng dụng quan trọng Thực phẩm Y-Dược. Một phần xylitol tạo thể thông qua trình chuyển hóa chất. Sự chuyển hóa xylitol không phụ thuộc vào insulin, không gây tăng đường huyết dùng cho bệnh nhân tiểu đường, người bị tiểu đường sử dụng chế phẩm xyliyol mà không ảnh hưởng đến tình trạng bệnh sử dụng đường khác. Hoạt chất có khả chữa sâu răng, viêm tai giữa, nhờ khả tăng pH miệng, trung hòa acid mảng bám, không bị vi khuẩn gây sâu lên men ngăn chặn khả phát triển liên cầu khuẩn. Không có vậy, xylitol ứng dụng rộng rãi ngành công nghiệp dược phẩm, công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm hàng tiêu dùng . Xylitol thị trường chủ yếu tổng hợp phương pháp hoá học áp dụng số nước Mỹ, Trung Quốc, Đức . Sản xuất xylitol theo phương pháp có giá thành cao qui trình sản xuất qua nhiều công đoạn tốn kém. Hiện nay, sản xuất xylitol thông qua chuyển hoá sinh học sản phẩm thuỷ phân hemicellulose xu nhiều nhà sản xuất quan tâm. Để góp phần vào hướng nghiên cứu tiến hành đề tài “ Phận lập tuyển chọn chủng nấm men có khả chuyển hoá xylose thành xylitol “ với mục tiêu: > Xác định điều kiện tối ưu để thuỷ phân rơm, trấu cho nồng độ đường khử cao. > Phân lâp chủng nấm men chuyển hóa xylose thành xylitol. > Sơ định tên số chủng phân lập . Đê tài thực khuôn khổ đề tài nhánh cấp nhà nước “Nghiên cứu xây dựng công nghệ sản xuất đường xylitol từ phụ phẩm ph ế thải nông nghiệp (rơm, ra, bã mía .) để ứng dụng thực phẩm Dược phẩm “ thuộc chương trình KC.04 PHẦN 1. TỔNG QUAN 1.1. Khái quát xylitol. 1.1.1. Công thức - đặc điểm - tính chất [18],[22]. * Công thức. C H 2OH H— HO— II— ỷ -OH c ---- H ỷ -OH C H 2OH - Tên khoa học: 1,2,3,4,5 pentahydroxyl pentan - Tên khác : xylitol, xylit. - Công thức phân tử: C5H120 - Khối lượng phân tử: 152,15 *Đặc điểm - tính chất. Xylitol polyol cacbon kết tinh dạng bột màu trắng, vị mát. Ở nhiệt độ thường độ xylitol tương đương với saccharose nhiệt độ thấp (khoảng 5°C) độ xylitol cao 1,2 lần. Khi hòa tan vào nước xylitollàm giảm nhiệt độ dung dịch nhiều sorbitol. Ởnhiệt độ tương đương nhiệt độcơ thể xylitol tan tốt so với saccharose. Một số tính chất xylitol trình bày bảng 1. Bảng 1. Một số tính chất xylỉtol. Tính chất Xylitol Công thức phân tử c 5h 12o Khối lượng phân tử 152,15 Mùi Không mùi Độ tan 20°c 169 g/lOOg H20 pH (lg/lOml H20 ) 5-7 Nhiệt độ chảy 93-94,5 Nhiệt độ sôi 216°c 4,06 calo/g (16,88 J/g) Năng lượng Tỷ trọng dung 10% 1,03 dịch (20°C) 60% 1,23 36,61 calo/g (153,76 J/g) Độ hấp thụ n liệt 10% 1,23 40% 4,81 dịch (20°C)/Ì 50% 8,04 * 60% 20,63 Độ nhớt dung CJ 1.1.2. Nguồn gốc [22]. Trong tự nhiên xylitol có nhiều loại hoa dâu tây, mận, yến mạch, ngũ cốc . Nhưng với hàm lượng nhỏ nên để tách chiết xylitol từ nguồn không hiệu kinh t ế . Trong thể xylitol tổng hợp vài gam ngày thông qua trình chuyển hóa thức ăn thể không sử dụng sản phẩm chứa xylitol. Hàm lượng xylitol số loại thực vật trình bày bảng 2. Bảng 2. Hàm lượng xylỉtol số loài thực vật. Loại thực vật Hàm lượng xylitol. (mg/lOOg khối lượng khô) Chuối 21 Mâm xôi 268 Dâu tây 362 Mận 935 Cà rốt 86,5 Rau diếp quăn 258 Hành 89 Xà lách 131 Cải hoa 300 Bí ngô 96,5 Xu hào 94 Cà 180 Tỏi tây 53 Thì 92 Nấm 128 Hạt dẻ 14 1.2. ứng dụng xylitol. 1.2.1. ứng dụng chung [15],[17],[18]. Xylitol polyol cacbon có vị số polyol lượng calo tương đương với glucose thấp nhiều so với saccharose. Xylitol dùng nguồn dinh dưỡng bổ trợ phù hợp. Đã có nghiên cứu đưa xylitol vào sử dụng đồ ăn không đường, kẹo cao su, sôcola, kẹo có độ đậm. Đặc biệt xylitol sử dụng thay carbohydrate alchohol đồ ăn mà đảm ---------------- r*~ bảo dinh dưỡng chế độ ăn kiêng người sử dụng (ngay mắc bệnh béo phì). Trong công nghiệp thực phẩm đồ uống loại kẹo sử dụng xylitol, hoạt chất đă đưa vào sản phẩm khác loại đồ uống mát, đồ uống bổ dưỡng, đồ tráng miệng, sữa, cà phê . Xylitol sử dụng để tăng khả giữ ẩm cho mỹ phẩm mà không gây ảnh hưởng đến da xylitol đưa vào số sản phẩm kem làm đẹp da, kem chống nắng , sữa rửa m ặt . 1.2.2. ứng dụng Y-Dược. Một ứng dụng xylitol cần nhắc đến ứng dụng hoạt chất ngành Y-Dược phục vụ cho công tác điều trị chăm sóc sức khỏe, ứng dụng nghiên cứu thử nghiêm lâm sàng chứng minh qua kết thực tế điều trị số bệnh nhiều năm qua, đặc biệt số bệnh như: tiểu đường, bệnh viêm tai trẻ em, sâu số bệnh miệng . * Đối với bệnh sâu số bệnh khác miệng [16],[17]. Qua nhiều kết nghiên cứu cho thấy rằng, bình thường sử dụng đồ ăn (đặc biệt đồ ăn có hàm lượng đường cao) phần thức ăn bị vi khuẩn miệng lên men tạo nên acid có hại cho răng. Các acid làm giảm pH miệng, tạo phức chelat với canxi hòa tan canxi. Lâu ngày tạo nên lỗ thủng răng, tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn lên men đường thức ăn. Vì bệnh sâu ngày tiến triển. Khác với đường khác xylitol không bị vi khuẩn miệng lên men nên acid có hại cho không tạo ra. Các trắc nghiệm cho thấy xylitol góp phần làm tăng pH miệng, trung hòa acid mảng bám, ngăn chặn khả phát triển vi khuẩn gây sâu răng. Xylitol sử dụng nguồn canxi phosphat từ hỗ trợ thêm nguồn khoáng chất cho răng. Xylitol đẩ ứng dụng sản xuất số sản phẩm cho miệng : nước xúc miệng, kem đánh răng, kẹo cao su xylitol . Theo khuyến cáo cách sử dụng sản phẩm này, ta nên giữ cho xylitol tiếp xúc lâu với miệng. Đặc biệt với sản phẩm kẹo cao su 100% xylitol theo đường tổng số, ta sử dụng 4-5 lần/ngày, lần 1-2 sau bữa ăn chính, bữa ăn nhẹ trước lúc ngủ kèm theo sử dụng nước súc miệng trải thường xuyên có khả điều trị sâu hiệu quả. Theo trắc nghiệm số học sinh mắc bệnh sâu trường học cho thấy, nhóm sử dụng kẹo cao su xylitol 65% ngày ữ lần, lần phút, nhóm sử dụng kẹo 15% nhóm không sử dụng kẹo hay chế phẩm khác xylitol. Kết hai nhóm sử dụng xylitol giảm 55% tình trạng bệnh so với nhóm không sử dụng. Nhóm giảm bệnh nhóm 33%. Người ta tiếp tục trắc nghiêm nhóm học sinh sử dụng kẹo cao su xylitol nhóm khác sử dụng kẹo cao su có saccharose. Kết chứng minh xylitol giảm 83% tình trạng bệnh, saccharose tác dụng bệnh sâu răng. Một số xét nghiệm lâm sàng gần cho thấy liên cầu khuẩn gây sâu truyền từ mẹ sang qua số tiếp xúc hàng ngày hôn, nhai mớm thức ăn . Khi tiến hành thử nghiệm nhóm bà mẹ sau sinh sử dụng kẹo cao su xylitol từ 3-24 tháng nhóm khác sử dụng chế phẩm flour chlohexidin 6, 12 18 tháng. Kết cho thấy đứa trẻ có mẹ sử dụng xylitol giảm tỷ lệ mắc bệnh sâu từ 71-74% so với nhóm sử dụng flour chlohexidin. Từ họ khuyến cáo để giảm tỷ lệ mắc sâu trẻ em, bà mẹ nên sử dụng kẹo cao su xylitol 45 lần/ngày kết hợp với việc vệ sinh miệng cho mẹ con. * Đối với bệnh đái tháo đường [8]. Qua nghiên cứu trình chuyển hóa cho thấy xylitol chất trung gian bình thường trình chuyển hóa glucid, chuyển hóa qua đường pentose phosphat acid uronic. Lượng xylitol bên đưa vào thể chuyển hóa không phụ thuộc insulin không làm tăng lượng đường máu. Xylitol có hiệu lực cung cấp lượng kể trường hợp có rối loạn chuyển hóa glucid. Trong số glucid, chất có hiệu lực chống ceton huyết mạnh nhất. Xylitol định dùng để cải thiện rối loạn chuyển hóa glucid bệnh nhân đái tháo đường, bổ sung cung cấp lượng cho thể với số dạng bào chế cách dùng sau: + Dung dịch 10 20% tiêm tĩnh mạch với liều tương ứng 2-30g xylitol, dùng đơn phối hợp với thuốc khác chia 1-3 lần/ ngày + Dung dịch 5% tiêm truyền tĩnh mạch đơn hay phối hợp với dụng dịch natri clorid (NaCl) kèm điện giải. Lượng dùng 24h không lOOg xylitol/kg/giờ. * Xylitol với bệnh viêm tai trẻ em [9],[16]. Xylitol sử dụng điều trị bệnh viêm tai trẻ em. Bệnh xác định xuất dịch tai nhiễm trùng. Có tới nửa số trẻ sơ sinh năm thứ mắc phải bệnh 30% trẻ ba tuổi mắc bệnh lần. Trẻ mắc bệnh thường có triệu chứng cáu kỉnh, biếng ăn, sốt, hôn mê . Một số triệu chứng gặp tượng trớ, nôn ngoài. Hậu nguy hiểm trẻ bị giảm thính lực. Streptococcus pneumonie vi sinh vật chủ yếu gây nên bệnh sau Haemophilus influenza, Escherichia coli, Kỉebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa Proteus sp. Thông thường mắc bệnh viêm tai người ta thường sử dụng kháng sinh để điều trị Ampicilin, Amoxicilin, Erythromycin, Trimethoprim Sulfamethoxazole (Bactrim). Việc sử dụng kháng sinh Qua bảng bảng nhận thấy mẫu đất hoa có tế bào nấm men. Trong mẫu đất cống đất vườn màu mỡ cho nhiều chủng mẫu đất khác. Mẫu đất đồi lấy xã Hoàng Tân-Yên Hưng- Quảng Ninh phân lập chủng Xyl-89. Với mẫu đất lấy xã Kim Nỗ-Đông Anh, phân lập nhiều chủng nấm men (16 chủng). Với mẫu hoa quả, mẫu phân lập từ đến chủng nấm men. Bình thường phân lập môi trường Malt-Glucose, mẫu phân lập từ 10 đến 20 chủng. Với môi trường dịch thuỷ phân rơm phân lập trung bình từ đến chủng/mẫu. Điều chứng tỏ khả chọn lọc môi trường cao, chủng có khả đồng hoá xylose có khả đề kháng với chất độc mọc môi trường này. 2.3.3. Xác định khả sinh xylitol. Dựa kết phân lập chủng nấm men từ đất hoa quả, tiến hành thử khả sinh xylitol theo bước : - Nhân giống chủng phân lập môi trường phân lập số 2, làm phần 2.2.4. - Thử khả mọc môi trường dùng D-xylose nguồn cacbon nhất, làm phần 2.2.5. Khi nuôi cấy môi trường thử test số thấy hầu hêt chủng mọc tốt chúng sử dụng D-xylose làm nguồn cacbon cho trình phát triển tế bào. Một số chủng Xyl-1, Xyl-3, Xyl-33, Xyl-34, Xyl-38, Xyl-41, Xyl-43 Xyl-46 mọc yếu môi trường khả đồng hoá D-xylose chủng (chiếm 8,5%). Như việc dùng môi trường dịch thuỷ phân hiệu chọn lọc chủng nấm men có khả đồng hoá xylose. - Tiến hành xác định khả sinh xylitol phương pháp đo quang. 28 Kết định lượng xylitol trình bày bảng (hiệu suất chuyển hoá tính theo lượng xylose sử dụng). Bảng 9. Khả sinh xylitol chủng phân lập được. Khả sinh Hiệu suất xylitol (gA) chuyển hoá(%) (3) (4) TT Kí hiệu chủng (1) (2) Xyl-1 Xyl-2 Xyl-3 Xyl-4 31,5 42,0 Xyl-5 32,6 43,4 Xyl-6 20,4 27,2 Xyl-7 41,2 54,9 Xyl-8 12,9 17,2 Xyl-9 18,2 24,2 10 Xyl-10 - 11 Xyl-11 - 12 Xyl-12 24,8 13 Xyl-13 - 14 Xyl-14 41,0 15 Xyl-15 - 16 Xyl-16 - 17 Xyl-17 - 18 Xyl-18 - 19 Xyl-19 19,8 26,4 20 Xyl-20 25,6 34,1 - 43,7 58,2 - 29 33,6 56,6 (1) (2) 21 Xyl-21 - 22 Xyl-22 - 23 Xyl-23 24 Xyl-24 - 25 Xyl-25 21,8 29,6 26 Xyl-26 15,3 20,4 27 Xyl-27 17,8 23,7 28 Xyl-28 19,7 26,3 29 Xyl-29 30 Xyl-30 31 Xyl-31 32 Xyl-32 33 Xyl-33 - 34 Xyl-34 - 35 Xyl-35 - 36 Xyl-36 44,3 59,1 37 Xyl-37 36,2 48,3 38 Xyl-38 - 39 Xyl-39 - 40 Xyl-40 41 Xyl-41 42 Xyl-42 43 Xyl-43 44 Xyl-44 45 Xyl-45 - 46 Xyl-46 - (3) 31,7 (4) 42,3 - 31,5 42,0 - 18,6 25,0 24,8 33,3 - 22,9 30,5 - 15,9 30 21,2 (1) (2) (3) (4) 47 Xyl-47 36,8 49,1 48 Xyl-48 - 49 Xyl-49 - 50 Xyl-50 - 51 Xyl-51 - 52 Xyl-52 41,8 53 Xyl-53 16,1 54 Xyl-54 - 55 Xyl-55 - 56 Xyl-56 - 57 Xyl-57 - 58 Xyl-58 59 Xyl-59 60 Xyl-60 61 Xyl-61 - 62 Xyl-62 - 63 Xyl-63 64 Xyl-64 - 65 Xyl-65 - 66 Xyl-66 - 67 Xyl-67 10,5 14,0 68 Xyl-68 37,8 50,4 69 Xyl-69 24,4 32,5 70 Xyl-70 - 71 Xyl-71 - 72 Xyl-72 - 27,8 55,7 37,1 - 19,4 52,6 31 25,9 70,1 (3) (4) (1) (2) 73 Xyl-73 74 Xyl-74 75 Xyl-75 76 Xyl-76 77 Xyl-77 - 78 Xyl-78 - 79 Xyl-79 - 80 Xyl-80 20,9 27,9 81 Xyl-81 16,1 21,3 82 Xyl-82 21,8 29,1 83 Xyl-83 19,7 26,3 84 Xyl-84 85 Xyl-85 11,7 15,6 86 Xyl-86 20,9 27,9 87 Xyl-87 88 Xyl-88 30,9 41,2 89 Xyl-89 27,5 36,7 90 Xyl-90 16.3 21,5 91 Xyl-91 44,9 59,9 92 Xyl-92 22,0 29,3 93 Xyl-93 22,6 30,1 94 Xyl-94 45,3 60,4 - 24,4 32,5 - 24,4 32,5 - - Qua bảng kết xác định 94 chủng phân lập có 47 chủng cho test xylitol dương tính (+) chiếm 50%, 47 chủng cho test xylitol âm tính (-) chiếm 50%. Các chủng Xyl-1, Xyl-3, Xyl-33, Xyl-34, Xyl-38, Xyl-41, Xyl-43 Xyl-46 chủng mọc yếu môi trường thử test số 32 thuộc nhóm cho test xylitol âm tính. Trong chủng sinh xylitol dương tính chọn dược 11 chủng có khả sinh xylitol cao : Xyl-2, Xyl-7, Xyl-14, Xyl-36, Xyl-37, Xyl-47, Xyl-52, Xyl-63, Xyl-68, Xyl91, Xyl-94 (các chủng in đậm bảng kết quả). Đặc biệt chủng Xyl-63 hiệu suất sinh tổng hợp xylitol đạt 70,1%. Trong 47 chủng cho test xylitol dương tính có 15 chủng sinh tổng hợp xylitol từ 10-20 g/1 chiếm 31,9%, 16 chủng đạt mức từ 20-30 g/1 chiếm 34,1%, chủng đạt mức từ 30-40 g/1 chiếm 17% chủng đạt mức lớn 40 g/1 chiếm 17%. Tỉ lệ chủng sinh tổng hợp xylitol mức thể hình 3. Tỉ lệ 0/° Nhóm Hình 3. Biểu đồ tỉ lệ sinh tổng hợp xylỉtol mức 1: 10-20 g/1 2: 20-30 g/1 3: 30-40 g/1 33 4: >40 g/1 2.3.4. Sơ xác định đến tên chi chủng phân lập cho test xylitol dương tính. Sau thử test, chọn chủng cho cho kết xylitol dương tính, cấy chủng môi trường số (môi trường Malt-Glucose 2°Bx) ống nghiệm có nắp điều kiện vô trùng. Nuôi tủ 28°c, 21 ngày. Làm tiêu giọt ướt, soi kính hiển vi điện tử chụp ảnh hình thái tế bào chủng từ vật kính x40 vật kính xioo. Căn vào hình dạng, màu sắc khuẩn lạc nuôi cấy, hình dạng, kích thước, khả sinh bào tử, tạo khuẩn ty, cách nảy chồi đặc điểm phân cắt tế bào. Căn vào số khoá phân loại nấm men dược nghiên cứu, sơ phân loại chủng nấm men phân lập cho test xylitol dương tính vào số chi trình bày bảng 10 [4]. Bảng 10. Kết phân loại sơ bộ. TT Tên chi/loài Chủng phân loại Xyl-2, Xyl-4, Xyl-5, Xyl-6, Xyl-8, Xyl-7, Xyl-9, Xyl-12, Xyl-14, Xyl-19, Xyl-20, Xyl-23, Xyl-26, Xyl-27, Xyl-28, Xyl-36, Candida Xyl-37, Xyl-40, Xyl-44, Xyl-47, Xyl-52, Xyl-53, Xyl-58, Xyl-63, Xyl-74, Xyl-81, Xyl-83, Xyl-86, Xyl-88, Xyl-89, Xyl-90, Xyl-91, Xyl-92, Xyl-94. Pichia Trichosporon Xyl-67, Xyl-68, Xyl-69, Xyl-80, Xyl-76, Xyl-82, Xyl-85. Xyl-25, Xyl-32. Debarỵomỵces/T orulaspora Xyl-30, Xyl-60. Debaryomyces hansenii Xyl-42. Chưa xác định đươc tên chi Xyl-93. 34 Trong 47 chủng mà phân loại sơ có 34 chủng thuộc chi Candida, chủng thuộc chi Pichia, chủng thuộc chi Trichospron, chủng Xyl-30 Xyl-60 thuộc hai chi Debaryomyces chi Torulaspora, chủng Xyl-42 nhờ đặc điểm đặc trưng xác định loài Debaryomyc.es hansenii. Riêng chủng Xyl-93 chưa tìm đặc điểm đặc trưng nên tạm thời chưa xếp vào chi nào. Hình thái tế bào số chi nấm men thể hình 4, 5. 35 ề È Ịkj * ^ 1 ( ó m m » . Q , > ■ ■ ị > © _____ b ề ẽ © < T $' ; c ) o o ® * ? Ê Ê Ê Ê S t Ê Ê Ê Ê ÊI Ê Ê Ê Ê Ê Êí Ê Ê ÊI tí S Ế Ê Ê Ê Ê ÊI Ê ÊI Ê Ê Ê Ê ểSk ' ậ m % . Q o * ° « © © « . © ? ’ • Hình 4. Hình thái nấm men có khả chuyển D-xyỉose thành Xylỉtol. Hình 4a, 4b - Candida sp. Xyl-12; 4c, 4d - Candida sp. Xyl- 28; 4e, f-X y l30 (DebarỵomỵcesỉTorulaspora). Thanh chèn hình 4a, 4c, 4e tương ứng vói 10 L im . Thanh chèn hình 4b, 4d, 4f tương ứng với LIIĨ1. 36 M Xác định tiếp tên loài 11 chủng có khả sinh xylitol cao. > Tìm điều kiện tối ưu cho khả sinh tổng hợp xylitol chủng phân lập trên. > Sử dụng kỹ thuật gây đột biến để tạo chủng cho suất sinh tổng hợp xylitol cao hơn. > Nghiên cứu sản xuất quy mô phòng thí nghiệm. > Nghiên cứu bào chế dạng chế phẩm chứa xylitol. 40 Ọ TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Báo cáo khoa học (1999) Nhà xuất Khoa Học Kỹ Thuật, trang 8587, 123-125. 2. Bộ môn Vi sinh trường ĐH Dược Hà Nội (2001) Thực tập Vi sinh - Ký sinh, trang 7-12, 15-18. 3. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm văn Ty (1997) Vi sinh vật học, nhà xuất Giáo Dục Hà Nội trang 84-87. 4. Nguyễn Lân Dũng cộng (1976) Một số phương pháp nghiên cứu Vi sinh vật học, nhà xuất Khoa Học Kỹ Thuật, tập trang 65, 298, tập trang 297-299, 302-303 5. Kiều Khắc Đôn, Nguyễn Lệ Phi (1998) Vi sinh học -Bộ môn Vi sinh trường ĐH Dược Hà Nội, trang 5-10, 29-34,127. 6. Nguyễn Thị Ngọc Hoa (2003) Phân lập tuyển chọn chủng nấm men có khả chuyển hóa dầu thầu dầu thành chất thơm - Khoá luận tốt nghiệp trường ĐH Dược Hà Nội, trang 14-22. 7. Lê Xuân Hoành (2003) Phân lập tuyển chọn chủng nấm men sinh tổng hợp Ị3-Carotene-Khoá luận tốt nghiệp trường ĐH Dược Hà Nội, trang 17, 34 8. Thuốc Biệt Dược Cách Sử Dụng (2000) Nhà xuất Y Học, trang 978. 9. Andrew Glasnapp (2000) “Xylitol in the prevention of Otitis media “ International journal compounding, May, 2000. 10. Chen, L.F., Gong, c.s. 1985. Fermentation of Sugarcane Bagasse Hemicellulose Hydrolysate to Xylitol by a Hydrolysate-Acclimatized Yeast. J. Food Sci. 50: 227. 11. Felipe, M., Vitolo, M., Mancilha, I.M., Silva, s.s. 1997. Environmental Parameters Affecting Xylitol Production From Sugarcane Bagasse 41 Hemicellulosic Hydrolyzate by Candida guilliermondii. J. Indust. Microbiol. Biotechnol. 18: 251-254. 12. Hiroshi Onishi and Toshiyuki Suzuki (1969) Microbial Production of Xylitol from Glucose, page 1033. 13. Heikkila, H., Puuppo, o., Tylli, M., Nikander, H., Nygren, J., Lindroos, M., Eroma, o . 1999. Method for Producing Xylitol. U.S. patent 5,998,607. 14. http://www.apott.org/database/to 1378. Xylose and xylitol product from Bagasse or Comcob. 15. http://www.chinaxylitol.com/pl_4-e.htm. KAIHUA HUAKANG Pharmaceutical Co., Ltd. 16. http:/www.drgreene.com/21_837.html. Ear infection and xylitol. Feature article january 20, 1997. 17. http://www.findarticles.com/cf_dls/mOISW/2002_May/85131524/ . Townsend Letter for Doctors and patiens, May, 2002, by Ward Deen. 18. http://www.yuxin-xylitol/E-product-2.htm. Xylitol character. 19. Izumori, K., Tuzaki, K. 1988. Production of Xylitol from D-Xylulose by Mycobacterium smegmatis. J. Ferment. Technol. 66(1):33-36. 20. Jorg Buhner and F.A. Agblevor. Dilute acid hydrolysis and fermentation of corn fiber to xylitol-Department of Mechanical Engineering Technical ưniversity of Dresden, Dresden, Germany 21. Leleu, J., Duílot, p., Caboche, J. 1992. Process for Manuíacturing Xylitol and Xylitol-Rich Products. U.S. patent 5,096,820. 22. Richard Peter Affleck (2000) Recover of xylitol from íermentation of model hemicellulose hydrolysates using membrane technology. December 12, 2000. Blacksburg Virginia. Page 1-20. 42 23. Roberto, I.C., Sato, s., Mancilha, I.M., Taqueda, M.E.S.1995. InAuence of Media Composition on Xylitol Fermentation by Candida guiliiermondii Using Response Suríace Methodology. Biotechnol Lett. 17 (11): 1223-1228 24.Yahashi, Y., Horitsu, H., Kawai, K., Suzuki, T., Takamizawa, K. 1996. Production of Xylitol From D-Xylose by Candida tropicalis: The Effect of D-Glucose Feeding. J.Ferment. Bioeng. 81 (2): 148-152. 43 [...]... Malt-Glucose để phân lập Với môi trường này ta có thể phân lập tuyển chọn được rất nhiều chủng nấm men Song với mục đích là phân lập các chủng nấm men có khả năng chuyển hoá xylose thành xylitol, chúng tôi không sử dụng môi trường này để tránh phân lập các chủng nấm men không cần thiết và có thể tiết kiệm được thời gian cũng như kinh tế Nếu sử dụng môi trường chứa xylose kết quả phân lập sẽ có tính chọn lọc hơn... đã phân lập được từ 2 đến 3 chủng nấm men Bình thường khi phân lập trên môi trường Malt-Glucose, mỗi mẫu có thể phân lập được từ 10 đến 20 chủng Với môi trường dịch thuỷ phân rơm chúng tôi chỉ phân lập được trung bình từ 2 đến 5 chủng/ mẫu Điều đó chứng tỏ khả năng chọn lọc của môi trường này rất cao, chỉ những chủng nào có khả năng đồng hoá được xylose và có khả năng đề kháng với các chất độc mới có. .. xylitol trên chủng Mycobacterium smagematis bằng dung dịch D -xylose 2% theo phương pháp lẽn men động và lên men tĩnh Kết quả nồng độ xylitol thu được sau quá trình lên men động là 0,8% và quá trình lên men tĩnh là 1,4% Năng suất của phương pháp đạt 74% [19] Năm 1997, Saha đã tìm ra một số chủng nấm men và nấm sợi sinh enzym xylose reductase và có khả năng sinh tổng hợp xylitol Một số loài nấm men thuộc... Khi sử dụng môi trường dịch thuỷ phân rơm, từ 39 mẫu (33 mẫu đất và 6 mẫu hoa quả) chúng tôi đã phân lập được 94 chủng nấm được kí hiệu từ Xyl-1 đến Xyl-94 Trong đó từ đất phân lập được 77 chủng, từ hoa quả phân lập được 17 chủng Kết quả phân lập được trình bày trong bảng 7 và 8 Bảng 7 Kết quả phân lập men phân lập từ hoa quả TT Chủng phân lập Loại hoa quả 1 Chuối Xyl-67, Xyl-68, Xyl-84 2 Quất hồng bì... loãng V: số ml dịch thủy phân đã dùng để chuẩn độ 20 2.2.2 Phân lập nấm men từ đất và hoa quả có khả năng mọc trên môi trường chứa dịch thủy phân Sử dụng môi trường số 1 phân lập các chủng nấm men từ đất và hoa quả bằng cách: *Với các mẫu đất: Pha loãng các mẫu đất trong các ống Falcon có nước cất đã hấp thanh trùng (121°C/30 phút) Dùng Pipetman hút 200 JU nhỏ lên Ì đĩa petri có môi trường số 1 Dùng... Xyl-89 27 Qua bảng 7 và bảng 8 chúng tôi nhận thấy các mẫu đất và hoa quả đều có tế bào nấm men Trong đó các mẫu đất cống và đất vườn màu mỡ cho nhiều chủng hơn các mẫu đất khác Mẫu đất đồi lấy tại xã Hoàng Tân-Yên Hưng- Quảng Ninh chúng tôi chỉ phân lập được một chủng là Xyl-89 Với các mẫu đất lấy tại xã Kim Nỗ-Đông Anh, chúng tôi phân lập được nhiều chủng nấm men nhất (16 chủng) Với các mẫu hoa quả,... trong vấn đề giá thành Chúng tôi đã sử dụng môi trường dịch thuỷ rơm để phân lập vì trong dịch thuỷ phân rơm có nồng độ xylose cao nên đảm bảo được tính chọn lọc trong phân lập, tuyển chọn Hơn thế nữa, nguồn nguyên liệu lại rất sẵn, rẻ và phương pháp làm đơn giản Một số chủng nấm men có thể mọc trên môi trường dich thuỷ phân rơm mặc dù không có khả năng đồng hoá xylose Chúng đã đồng hoá các đường khác... khả năng sinh xylitol Dựa trên kết quả phân lập các chủng nấm men từ đất và hoa quả, chúng tôi đã tiến hành thử khả năng sinh xylitol theo các bước : - Nhân giống các chủng phân lập được trên môi trường phân lập số 2, làm như phần 2.2.4 - Thử khả năng mọc trên môi trường dùng D -xylose là nguồn cacbon duy nhất, làm như phần 2.2.5 Khi nuôi cấy trên môi trường thử test số 3 chúng tôi thấy rằng hầu hêt các. .. được trong 94 chủng phân lập có 47 chủng cho test xylitol dương tính (+) chiếm 50%, 47 chủng cho test xylitol âm tính (-) chiếm 50% Các chủng Xyl-1, Xyl-3, Xyl-33, Xyl-34, Xyl-38, Xyl-41, Xyl-43 và Xyl-46 là những chủng mọc yếu trên môi trường thử test số 32 3 đều thuộc nhóm cho test xylitol âm tính Trong các chủng sinh xylitol dương tính chúng tôi chọn dược 11 chủng có khả năng sinh xylitol cao là... ngày nấm men mọc thành các khuẩn lạc, sơ bộ chọn các chủng nấm men dựa vào màu sắc, đặc điểm của khuẩn lạc và hình dạng tế bào Các khuẩn lạc được thuần khiết trên môi trường số 1 theo phương pháp cấy zic-zăc, để thu được chủng thuần Giữ các chủng thu được trong môi trương số 1 ở 5°c Theo những phương pháp thông thường khi phân lập nấm men trong thiên nhiên, người ta sử dụng môi trương Malt-Glucose để phân . NỘI NGUYỄN QUỐC LÂM PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ KHẲ NĂNG CHUYỂN HÓA XYLOSE THÀNH XYLITOL ( KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHOÁ 1999-2004) Giáo viên hướng dẫn : TS. Vũ Nguyên Thành GVC thủy phân hemicellulose 20 2.2.2. Phân lập nấm men từ đất và hoa quả có khả năng mọc trên môi trường chứa dịch thủy phân 21 2.2.3. Tuyển chọn và thuần khiết 21 2.2.4. Nhân giống các chủng phân lập. quan tâm. Để góp phần vào hướng nghiên cứu này chúng tôi tiến hành đề tài “ Phận lập và tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng chuyển hoá xylose thành xylitol “ với các mục tiêu: > Xác