phân lập và tuyển chọn các chủng nấm men có khẳ năng chuyển hóa xylose thành xylitol

có vậy, xylitol còn được ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp như dược phẩm, công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm và hàng tiêu dùng...Xylitol trên thị trường chủ yếu được tổng hợp bằn

B Ộ Y T Ế TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

NGUYỄN QUỐC LÂM

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ KHẲ NĂNG CHUYỂN HÓA XYLOSE THÀNH XYLITOL

( KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHOÁ 1999-2004)

Giáo viên hướng dẫn : TS Vũ Nguyên Thành

GVC Nguyễn Lệ Phi

Noi thực hiện : Viện Công Nghiệp-Thực Phẩm

Bộ môn Vi Sinh trường ĐH Dược

Hà Nội.

Thời gian thực hiện : Tháng 2/04-5/04.

HÀ NỘI, THÁNG 6-2004

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:

TS Vũ Nguyên Thành GVC Nguyễn Lệ Phi

Là những thấy cô đã tận tình chỉ bảo và trực tiếp hướng dẫn tôi làm khoá luận này Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ kỹ thuật viên Bộ môn Vi sinh- Viện Công nghiệp Thực phẩn, Bộ môn Vi sinh - trường Đại Học Dược Hà Nội

và các phòng ban khác trong và ngoài trường đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cảm ơn tới tất cả những người thân và bạn bè đã động viên, khuyến khích và đóng góp nhiều ý kiến quý báu cho tôi khi thực hiện khoá luận này

Hà Nội, ngày 31 tháng 05 năm 2004

Sinh viên

Nguyễn Quốc Lâm

MỤC LỤC

Trang

Đặt vấn đề 1

Phần 1 Tổng Quan .2

1.1 Khái quát vê xylỉtol 2

1.1.1 Công thức - đặc điểm - tính chất .2

1.1.2 Nguồn gốc 3

1.2 ứng dụng của xylỉtol .4

1.2.1 ứng dụng chung 4

1.2.2 ứng dụng trong Y-Dược 5

1.3 Tình hình sản xuất xylitol 8

1.3.1 Phương pháp hoá tổng hợp 8

1.3.2 Phương pháp sinh tổng hợp 12

Phần 2 Kết quả-Bàn luận 17

2.1 Nguyên vật liệu, thiết b ị 17

2.2 Phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Tim điều kiện thủy phân hemicellulose 20

2.2.2 Phân lập nấm men từ đất và hoa quả có khả năng mọc trên môi trường chứa dịch thủy phân .21

2.2.3 Tuyển chọn và thuần khiết .21

2.2.4 Nhân giống các chủng phân lập .21

2.2.5 Thử khả năng sinh xylitol .22

2.2.6 Phương pháp định lượng xylitol .22

2.2.7 Sơ bộ định tên các chủng cho test xylitol dương tính 23

2.3 Kết quả - bàn luận 23

2.3.1 Xác dịnh điều kiện thủy phân hemicellulose tối ưu .23

2.3.2 Phân lập và thuần khiết 24

2.3.3 Xác định khả năng sinh xylitol .28

2.3.4 Sơ bộ xác định đến tên chi các chủng phân lập cho test xylitol dương tính .34

Phần 3 Kết luận và Đề xuất 40

Tài liệu tham khảo .41

có vậy, xylitol còn được ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp như dược phẩm, công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm và hàng tiêu dùng

Xylitol trên thị trường chủ yếu được tổng hợp bằng phương pháp hoá

học đã được áp dụng ở một số nước như Mỹ, Trung Quốc, Đức Sản xuất

xylitol theo phương pháp này có giá thành cao vì qui trình sản xuất qua nhiều công đoạn và tốn kém Hiện nay, sản xuất xylitol thông qua chuyển hoá sinh học các sản phẩm thuỷ phân hemicellulose là một xu thế được nhiều nhà sản xuất quan tâm Để góp phần vào hướng nghiên cứu này chúng tôi tiến hành đề

tài “ Phận lập và tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng chuyển

hoá xylose thành xylitol “ với các mục tiêu:

> Xác định điều kiện tối ưu để thuỷ phân rơm, trấu cho nồng độ đường khử cao

> Phân lâp các chủng nấm men chuyển hóa xylose thành xylitol

> Sơ bộ định tên một số chủng phân lập được

Đê tài này của chúng tôi được thực hiện trong khuôn khổ đề tài nhánh cấp nhà nước “Nghiên cứu xây dựng công nghệ sản xuất đường xylitol từ phụ

- Tên khoa học: 1,2,3,4,5 pentahydroxyl pentan

- Tên khác : xylitol, xylit

- Công thức phân tử: C5H120 5

- Khối lượng phân tử: 152,15

*Đặc điểm - tính chất.

Xylitol là một polyol 5 cacbon kết tinh dạng bột màu trắng, vị ngọt mát

Ở nhiệt độ thường độ ngọt của xylitol tương đương với saccharose nhưng ở nhiệt độ thấp (khoảng 5°C) thì độ ngọt của xylitol cao hơn 1,2 lần Khi hòa tan vào nước xylitol làm giảm nhiệt độ của dung dịch nhiều hơn sorbitol Ở nhiệt

độ tương đương nhiệt độ cơ thể xylitol tan tốt hơn so với saccharose Một sốtính chất của xylitol được trình bày trong bảng 1

Bảng 1 Một số tính chất của xylỉtol.

Bảng 2 Hàm lượng xylỉtol trong một số loài thực vật.

(mg/lOOg khối lượng khô)

Đã có những nghiên cứu đưa xylitol vào sử dụng trong các đồ ăn không đường, kẹo cao su, sôcola, hoặc những kẹo có độ ngọt đậm Đặc biệt xylitol được sử dụng thay thế carbohydrate và alchohol trong các đồ ăn mà vẫn đảm

r*~

-bảo dinh dưỡng và chế độ ăn kiêng của người sử dụng (ngay cả khi mắc bệnh béo phì) Trong công nghiệp thực phẩm và đồ uống ngoài các loại kẹo sử dụng xylitol, hoạt chất này đă được đưa vào các sản phẩm khác như các loại đồ uống mát, đồ uống bổ dưỡng, đồ tráng miệng, sữa, cà phê Xylitol được sử dụng để tăng khả năng giữ ẩm cho các mỹ phẩm mà không gây ảnh hưởng đến

da vì vậy xylitol đã được đưa vào một số sản phẩm như kem làm đẹp da, kem chống nắng , sữa rửa m ặt

1.2.2 ứng dụng trong Y-Dược.

Một trong những ứng dụng của xylitol cần được nhắc đến đó là ứng dụng của hoạt chất này trong ngành Y-Dược phục vụ cho công tác điều trị và chăm sóc sức khỏe, ứng dụng này đã nghiên cứu thử nghiêm trên lâm sàng và được chứng minh qua các kết quả thực tế điều trị một số bệnh trong nhiều năm qua, đặc biệt trong một số bệnh như: tiểu đường, bệnh viêm tai giữa ở trẻ em, sâu răng và một số bệnh về răng miệng

* Đối với bệnh sâu răng và một số bệnh khác về răng miệng [16],[17].

Qua nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy rằng, bình thường khi sử dụng các đồ ăn (đặc biệt là đồ ăn có hàm lượng đường cao) thì một phần thức ăn bị các vi khuẩn ở răng miệng lên men và tạo nên các acid có hại cho răng Các

acid này sẽ làm giảm pH ở miệng, tạo phức chelat với canxi và hòa tan canxi

Lâu ngày sẽ tạo nên các lỗ thủng ở răng, tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn lên men đường trong thức ăn Vì vậy bệnh sâu răng ngày càng một tiến triển

Khác với các đường khác xylitol không bị các vi khuẩn răng miệng lên men nên các acid có hại cho răng không được tạo ra Các trắc nghiệm cho thấy xylitol góp phần làm tăng pH miệng, trung hòa acid mảng bám, ngăn

nguồn canxi và phosphat từ đó hỗ trợ thêm nguồn khoáng chất cho răng Xylitol đẩ được ứng dụng sản xuất một số sản phẩm cho răng miệng như : nước xúc miệng, kem đánh răng, kẹo cao su xylitol Theo khuyến cáo về cách sử dụng các sản phẩm này, ta nên giữ cho xylitol được tiếp xúc lâu với răng miệng Đặc biệt với sản phẩm kẹo cao su 100% xylitol theo đường tổng

số, ta có thể sử dụng 4-5 lần/ngày, mỗi lần 1-2 cái sau bữa ăn chính, bữa ăn nhẹ hoặc trước lúc đi ngủ kèm theo sử dụng nước súc miệng và trải răng thường xuyên có khả năng điều trị sâu răng rất hiệu quả

Theo các trắc nghiệm trên một số học sinh mắc bệnh sâu răng tại một trường học cho thấy, nhóm 1 sử dụng kẹo cao su xylitol 65% mỗi ngày 4 ữ 5 lần, mỗi lần 5 phút, nhóm 2 sử dụng kẹo 15% và nhóm 3 không sử dụng kẹo hay chế phẩm nào khác của xylitol Kết quả hai nhóm sử dụng xylitol đã giảm 55% tình trạng bệnh so với nhóm không sử dụng Nhóm 1 giảm bệnh hơn nhóm 2 là 33% Người ta tiếp tục trắc nghiêm một nhóm học sinh sử dụng kẹo cao su xylitol và một nhóm khác sử dụng kẹo cao su có saccharose Kết quả

đã chứng minh xylitol giảm 83% tình trạng bệnh, saccharose không có tác dụng đối với bệnh sâu răng

Một số xét nghiệm lâm sàng gần đây cho thấy liên cầu khuẩn gây sâu răng có thể được truyền từ mẹ sang con qua một số tiếp xúc hàng ngày như hôn, nhai mớm thức ăn Khi tiến hành thử nghiệm trên một nhóm bà mẹ sau khi sinh sử dụng kẹo cao su xylitol từ 3-24 tháng và một nhóm khác sử dụng chế phẩm của flour và chlohexidin trong 6, 12 và 18 tháng Kết quả cho thấy những đứa trẻ có mẹ sử dụng xylitol giảm tỷ lệ mắc bệnh sâu răng từ 71-74%

so với nhóm sử dụng flour và chlohexidin Từ đó họ đã khuyến cáo rằng để giảm tỷ lệ mắc sâu răng ở trẻ em, các bà mẹ nên sử dụng kẹo cao su xylitol 4-

5 lần/ngày kết hợp với việc vệ sinh răng miệng cho cả mẹ và con

* Đối với bệnh đái tháo đường [8].

Qua nghiên cứu về quá trình chuyển hóa đã cho thấy xylitol là một chất trung gian bình thường trong quá trình chuyển hóa glucid, được chuyển hóa qua đường pentose phosphat và acid uronic Lượng xylitol bên ngoài đưa vào

cơ thể chuyển hóa không phụ thuộc insulin và không làm tăng lượng đường trong máu Xylitol có hiệu lực cung cấp năng lượng kể cả trong trường hợp có rối loạn chuyển hóa glucid Trong số các glucid, đó là chất có hiệu lực chống ceton huyết mạnh nhất

Xylitol đã được chỉ định dùng để cải thiện rối loạn chuyển hóa glucid ở bệnh nhân đái tháo đường, bổ sung cung cấp năng lượng cho cơ thể với một số dạng bào chế và cách dùng như sau:

+ Dung dịch 10 và 20% tiêm tĩnh mạch với liều tương ứng 2-30g xylitol, dùng đơn thuần hoặc phối hợp với các thuốc khác chia 1-3 lần/ ngày

+ Dung dịch 5% tiêm truyền tĩnh mạch đơn thuần hay phối hợp với

dụng dịch natri clorid (NaCl) kèm điện giải Lượng dùng 24h không quá lOOg xylitol/kg/giờ

* Xylitol với bệnh viêm tai giữa ở trẻ em [9],[16].

Xylitol đã được sử dụng điều trị bệnh viêm tai giữa ở trẻ em Bệnh được xác định khi xuất hiện dịch trong tai do nhiễm trùng Có tới một nửa số trẻ sơ sinh năm thứ nhất mắc phải bệnh này và 30% trẻ trên ba tuổi mắc bệnh ít nhất một lần Trẻ mắc bệnh này thường có triệu chứng cáu kỉnh, biếng ăn, sốt, hôn mê Một số triệu chứng ít gặp hơn đó là hiện tượng trớ, nôn và đi ngoài Hậu

quả nguy hiểm là trẻ có thể bị giảm và mất thính lực Streptococcus

pneumonie là vi sinh vật chủ yếu gây nên bệnh này sau đó là Haemophilus influenza, Escherichia coli, Kỉebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa

và Proteus sp Thông thường khi mắc bệnh viêm tai giữa người ta thường sử

dụng kháng sinh để điều trị như Ampicilin, Amoxicilin, Erythromycin,

thường gây tác dụng phụ đối với trẻ em và đặc biệt là nguy cơ gặp phải vấn đế

kháng kháng sinh do vi khuẩn có khả năng sinh enzym p -lactamase.

Các nghiên cứu gần đây ở trẻ nhỏ cho thấy xylitol có vai trò trong việc điều trị bệnh viêm tai giữa ở trẻ em Xylitol có tác dụng ngăn ngừa sự phát

triển của các vi sinh vật gây bệnh, điển hình là Streptococcus pneumonie Việc

sử dụng xylitol không chỉ tránh được vấn đề kháng kháng sinh mà còn tránh

được các phản ứng phụ như: phát ban, tiêu chảy, tưa lưỡi do Candida thường

gặp phải khi sử dụng kháng sinh Ngoài những ứng dụng điển hình trên, một

sổ tài liệu còn cho rằng xylitol có vai trò trong việc ngăn chặn sự phát triển

của Helicobacter pylori một trong các tác nhân gây bệnh viêm loét dạ dày,

ngăn ngừa bệnh loãng xương ở người già và phụ nữ thông qua quá trình tăng cường hấp thu canxi ở thành ruột [16]

Năm 1891 nhà bác học Fischer đã phát hiện ra xylitol, đến nay hoạt chất này được ứng dụng rất rộng rãi trong công tác điều trị bệnh Tuy vậy việc

năng suất cao vẫn là vấn đề được nhiều nhà khoa học quan tâm

1.3 Tình hình sản xuất xylitol.

Ngay từ khi biết đến xylitol và những ứng dụng của hoạt chất này người

ta đã tiến hành nghiên cứu, tổng hợp và đưa vào sản xuất trên quy mô lớn Hai phương pháp được áp dụng rộng rãi để sản xuất xylitol là phương pháp hóa tổng hợp và phương pháp sinh tổng hợp

1.3.1 Phương pháp hóa tổng hợp [22].

Phương pháp hóa học tổng hợp xylitol được tiến hành trên nguyên tắc khử hóa D-xylose hay dịch thủy phân hemicellulose giàu xylose Quá trình

Raney-nikel (hỗn hợp gồm 50% nhôm, 50% nikel được sử lý bằng natrihydroxyd đặc nóng) thời gian thủy phân là 2,5 giờ

Xylytol được kết tinh và tách khỏi dịch khử hóa, phần xylitol không kết tinh được tách bằng phương pháp sắc ký lỏng Cột sắc ký sử dụng cao 1 m, đường kính 0,94 m, nhựa trao đổi cation là sulíonat polystyren divinylbenzen được gắn trên chất mang là canxi hoặc stronti Kết quả chạy sắc ký ngoài xylitol còn có một số đường khác như: manitol, arabitol, galactitol, sorbitol

c h 2 o h

H -c -OH + H2

-► HO

H-H -OH

CH2 OH

Hình 1 Quá trình thủy phân và khử hóa tổng hợp xylỉtol.

Sau khi xylitol được kết tinh từ dung dịch mẹ khoảng 30- 60% khối lượng sẽ còn có một số đường khác như: adonitol, arabitol, sorbitol, manitol Thành phần của dung dịch mẹ được trình bày trong bảng 3

Bảng 3 Thành phần của dung dịch mẹ khi kết tinh xylitol.

độ xylitol khoảng 85% Dung dịch tiếp đó được làm lạnh từ từ xuống khoảng

2-5°C để kết tinh xylitol Sản phẩm xylitol thu được sẽ lẫn khoảng 5% xylose

Dung dịchh sau khi tách xylitol kết tinh được tái chế để thu nốt phần xylitol chưa kết tinh Sản phẩm sẽ được tinh chế lại cho đến khi xylose chỉ còn dưới

0,1%.

Năm 1999 Heikkila đưa ra phương pháp tổng hợp xylitol từ acid

rutheni trong 3 giờ Dịch khử hóa được lọc và cô đặc đến nồng độ xylitol

t khoảng 92% thì bắt đầu cho kết tinh Xylitol kết tinh được tách bằng máy ly tâm với tốc độ 4500 vòng/phút trong 5 phút Năng suất của phương pháp này đạt 0,297 g/g và độ tinh khiết của sản phẩm là 68% Thành phần dich trước và sau khử hoá dược trình bày trong bảng 4 [13]

Bảng 4 Nồng độ các chất sau khử hóa trong phương pháp sử dụng

ở 120°c, trong 3 giờ, với xúc tác Raney-nikel Dịch khử hóa được cô đặc và hạ

đạt 0,7 g/g, độ tinh khiết sản phẩm đạt 97% [21]

Ngoài ra xylitol còn được tổng hợp từ acid gluconic Acid gluconic được decarboxyl hoá bằng natri hypochlorid (NaC103) trong 45 phút ở nhiệt độ

55°c để chuyển thành arabinose Arabinose được khử hóa thành arabitol, sau

tách xylitol được tiến hành bằng sắc ký Năng suất của phương pháp đạt 77% Những phương pháp hóa học nghiên cứu để tổng hợp xylitol từ D-xylose và dịch thủy phân hemicellulose đã được ứng dụng trên quy mô công nghiệp Phương pháp tách chiết và tinh chế chủ yếu là ly tâm và sắc ký, song giá thành của phương pháp hóa tổng hợp rất đát vì đầu tư trang thiết bị, qui trình sản xuất qua nhiều công đoạn tốn kém và phức tạp

1.3.2 Phương pháp sinh tổng hợp [22].

Phương pháp sinh tổng hợp được nghiên cứu và lựa chọn sản xuất xylitol dựa trên quá trình chuyển hoá của vi sinh vật biển đổi trực tiếp D-xylose dưới tác dụng của enzym D-xylose reductase và NADPH

Một số chủng vi khuẩn, nấm mốc và nấm men đã được nghiên cứu là có khả năng sinh tổng hợp xylitol từ quá trình chuyển hoá D-xylose Năm 1998,

Izumori đã nghiên cứu sinh tổng hợp xylitol trên chủng Mycobacterium

smagematis bằng dung dịch D-xylose 2% theo phương pháp lẽn men động và 1

lên men tĩnh Kết quả nồng độ xylitol thu được sau quá trình lên men động là 0,8% và quá trình lên men tĩnh là 1,4% Năng suất của phương pháp đạt 74% [19] Năm 1997, Saha đã tìm ra một số chủng nấm men và nấm sợi sinh enzym xylose reductase và có khả năng sinh tổng hợp xylitol Một số loài nấm

men thuộc chi Candida được ứng dụng rộng rãi để sản xuất xylitol gồm:

Candida pelliculosa , Candida boidinii , Candida guilliermondii , Candida tropicalis Một số chi nấm men khác cũng được sử dụng sinh tổng hợp xylitol

là: Saccharomyces , Debaryomyces , Pichia , Hansenula , Trichosporon ,

Cryptococcus , Rhodotorula , Kluyveromyces , Pachysolen , Ambrosiozyma , Kloeckera Các chủng vi khuẩn ít được ứng dụng sinh tổng hợp xylitol hơn

so với các chủng nấm men, tuy nhiên một số chủng vi khuẩn như :

MDP+ x y litđ

D-xyỊiẩose

Hình 2 Sơ đồ chuyển hoá D-xylose thành xylitol.

chú thích XR: enzym D-xylose reductase

Enterobacter liquỷaciens, Corinebacterium sp, Mycrobacterium smagenmatis

đã được Horitsu nghiên cứu là có khả năng sinh tổng hợp xylitol vào năm

1992 [24]

Sử dụng vi sinh vật sing tổng hợp xylitol từ nguồn nguyên liệu xylose trong công nghiệp rất quan trọng và ngày càng được nghiên cứu ứng dụng sâu rộng, mở ra nhiều hướng nghiên cứu mới

* Ảnh hưởng của nồng độ D-xylose và một sô' điều kiện khác đến quá trình

sinh tổng hợp xylitol.

Nồng độ xylose ban đầu có thể ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp xylitol của vi sinh vật Năm 1992, Horitsu đã nghiên cứu ảnh hưởng của các nồng độ D-xylose khác nhau, từ 100 g/1 đến 300 g/1, đối với quá trình sản xuất xylitol Theo tác giả, nồng độ D-xylose tối ưu để sinh tổng hợp xylitol đối với

chủng Candida tropicalis là 172,0 g/1 Horitsu đã tiến hành lên men ở nồng

độ trên với tốc độ thông khí thay đổi từ 100Ữ300 vòng/phút, bổ sung cao nấm

2,76 g/l-h khi lượng cao nấm men thêm vào là 21,0 g/1 [22]

* Ảnh hưởng của nồng độ glucose đến quá trình sinh tổng hợp xylitol

[22],[24]

Qua nghiên cứu trên một số chủng nấm men cho thấy, tuỳ vào chủng sử dụng mà lượng glucose thêm vào có thể tăng hoặc giảm năng suất sinh tổng hợp xylitol Năm 1996, Yahashi đã bổ sung thêm D-xylose và D-glucose trong

khi nuôi cấy tế bào nấm men C.tropicalis Kết quả năng suất sinh tổng hợp

xylitol đã tăng lên từ 1,2 đến 1,3 lần Silva cũng nghiên cứu sinh tổng hợp

xylitol trên chủng c.guilliermondii FTI 20037 với năng xuất đạt 0,66 g/g

Nhưng khi thêm glucose vào môi trường nuôi cấy, năng xuất đẫ giảm xuống còn 0,45 g/g

* Ảnh hưởng của tuổi, số lượng tế bào nấm men đưa vào môi trường và nồng độ D-xylose đến quá trình sinh tổng hợp xylitol [11].

Các đặc tính về tuổi ống giống, số lượng tế bào và nồng độ dịch lên men

có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng sinh xylitol của vi sinh vật Năm 1997,

thay đổi từ 37,6-74,2 g/1, tuổi ống giống từ 16 dến 48 giờ, số lượng tế bào từ

0,1 đến 6,0 g/1 Kết quả tại nồng độ D-xylose là 54,5 g/1, tuổi ống giống là 24

giờ và số lượng tế bào là 3,0 g/1 thì lượng xylitol sinh tổng hợp đạt cao nhất

với năng suất là 0,74 g/g

Phương pháp sinh tổng hợp xylitol đã được nghiên cứu không chỉ trên

nguồn nguyên liệu D-xylose mà còn sử dụng nguồn nguyên liệu là dịch thuỷ

phân hemicellulose Những vi sinh vật có khả năng sinh enzym xylose

reductase sẽ lên men được dịch thuỷ phân hemicellulose lấy từ các nguồn thực

vật Chủng Candida sp B-22 đã được Chen và Gong ứng dụng sinh tổng hợp

xylitol từ dịch thuỷ phân hemicellulose bã mía với năng suất hơn 85% so với

lý th u y ết Nồng độ xylitol thu được từ dịch thuỷ phân sau lên quá trình men

là 94,74 g/1 với nồng độ D-xylose trong dịch thuỷ phân trước khi lên men là

105,35 g/1 Nghiên cứu được tiến hành nhằm tăng hiệu suất sinh tổng hợp

xylitol của chủng này bằng sự thay đổi nồng độ D-xylose trong dịch thuỷ

phân bắt đầu từ nông độ thấp đến nồng độ cao cho đến khi tế bào nấm men

vẫn phát triển tốt và sinh tổng hợp xylitol cho hiệu suất cao Năm 1995,

Roberto sử dụng dịch thỷ phân rơm có thêm amonisulíat ((NH4)2S04) và cám

thì chủng Candida guilliermondii đã đạt năng suất là 0,68 g/g với tốc độ sinh

xylitol là 0,54 g/l.h Với chủng Candida sp 11-2, nguồn nguyên liệu sử dụng

là lõi ngô thì năng suất đạt 0,57 g/g và tốc độ sinh xylitol là 1,94 g/l.h [23]

Qua nghiên cứu, Hyroshi Onishi và Toshiyuki Suzuki đã xác định được năng

suất tổng hợp xylitol từ D-xylulose của một số chủng nấm men Kết quả được

trình bày trong bảng 5 [12]

Bảng 5 Năng suất tổng hợp xylitol của một số chủng nấm men.

Với viêc sử dụng các chủng vi sinh vật có khả năng lên men D-xylose hoặc dịch thỷ phân hemicellulose phương pháp sinh tổng hợp xylitol không chỉ cho năng suất cao mà còn tận dụng đươc nguồn chất thải nông nghiệp vừa tránh lãng phi vừa tránh gây ô nhiễm môi trường và giải quyết được vấn đề giá thành trong các qui trình sản xuất trên qui mô lớn.

PHẦN 2 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

2.1 Nguyên vật liệu , thiết bị

2.1.1.Nguyên liệu, hoá chất

- Acid photphoric (Việt nam)

- Kalifericyanua (Việt nam)

- Kalihydroxid (Trung quốc)

- Xanh methylen (Việt nam)

- Kính hiển vi quang học Eclipse E600-Nikon

- Tủ sấy

- Cân điện tử

- Lò vi sóng

SanyoPrecisaLG

(Nhật) (Nhật) (Thụy Điển) (Hàn Quốc)

-Đĩa petri, ống nghiệm có nắp, ống Eppendorí, ống Falcon, Pipetman, đầu côn các loai, que cấy các loại

2.1.3 Môi trường.

* Các thành phần quan trọng dùng trong môi trường:

M ineral: (Dung dịch muối khoáng cơ bản)

Dich thuỷ phân rơm

Rơm được phơi khô, cắt thành đoạn 4-5 cm Cho 300g vào bình sứ và bổ sung

2000 ml dung dịch H2S04 0,75 % Đem hấp trong nồi hấp áp lực ở nhiệt độ

121°c /60 p h ú t Bỏ bã lấy dịch trong trung hoà bằng vôi bột đến pH = 7 Ly tâm 4500 vòng/phút trong 10 phút, loại tủa lấy dịch Dùng dung dịch acid phosphoric đưa pH đến 4,5 Ly tâm 4500 vòng/phút trong 10 phứíđể loại tủa canxi phosphat

Môi trường 1 : Môi trường phân lập.

* Môi trường được hấp thanh trùng ở nhiệt độ 105°c trong 25phút

Môi trường 2: Môi trường nhân giống(nguồn cacbon là dịch thủy phân rơm )

* Môi trường được hấp thanh trùng ở 105°c trong 25phút

Mỏi trường 3 : Môi trường thử test xylitol

Mỏi trường 4 : Môi trường Malt-Glucose 2°Bx.

* Môi trường được hấp thanh trùng ở nhiệt độ 121°c trong 20 phút để nguội

(không còn hơi nước bám trên thành ống nghiệm)

2.2 Phưtpig pháp nghiên cứu.

2.2.1 Tìm điều kiện thuỷ phân hemicellulose.

Chúng tôi sử dùng dung dịch acid sulíuric để thủy phân hemicellulose trong nguyên liệu là một số chất thải nông nghiệp như rơm, trấu Dịch thuỷ phân được sử dụng làm nguồn cacbon cho môi trường phân lập sơ bộ Quá trình xác định điều kiện thuỷ phân được tiến hành theo phương pháp :

-Thay đổi nồng độ acid sulíuric, tỉ lệ rơm - acid, thời gian thủy phân, nhiệt độ thủy phân

- Định lượng đường khử ở các điều kiện bằng phương pháp