tính.
Sau khi thử test, chúng tôi đã chọn ra các chủng cho cho kết quả xylitol dương tính, cấy các chủng này trên môi trường số 4 (môi trường Malt-Glucose 2°Bx) trong các ống nghiệm có nắp ở điều kiện vô trùng. Nuôi trong tủ 28°c,
trong 21 ngày. Làm tiêu bản giọt ướt, soi trên kính hiển vi điện tử và chụp ảnh hình thái tế bào các chủng từ vật kính x40 cũng như vật kính xioo.
Căn cứ vào hình dạng, màu sắc khuẩn lạc khi nuôi cấy, hình dạng, kích thước, khả năng sinh bào tử, tạo khuẩn ty, cách nảy chồi và đặc điểm phân cắt của tế bào. Căn cứ vào một số khoá phân loại nấm men đã dược nghiên cứu, chúng tôi sơ bộ phân loại các chủng nấm men đã phân lập cho test xylitol dương tính vào một số chi được trình bày trong bảng 10 [4].
Bảng 10. Kết quả phân loại sơ bộ.
TT Tên chi/loài Chủng phân loại
1 Candida
Xyl-2, Xyl-4, Xyl-5, Xyl-6, Xyl-8, Xyl-7, Xyl-9, Xyl-12, Xyl-14, Xyl-19, Xyl-20, Xyl-23, Xyl-26, Xyl-27, Xyl-28, Xyl-36, Xyl-37, Xyl-40, Xyl-44, Xyl-47, Xyl-52, Xyl-53, Xyl-58, Xyl-63, Xyl-74, Xyl-81, Xyl-83, Xyl-86, Xyl-88, Xyl-89, Xyl-90, Xyl-91, Xyl-92, Xyl-94.
2 Pichia Xyl-67, Xyl-68, Xyl-69, Xyl-80, Xyl-76,
Xyl-82, Xyl-85. 3 Trichosporon Xyl-25, Xyl-32. 4 Debarỵomỵces/T orulaspora Xyl-30, Xyl-60. 5 Debaryomyces hansenii Xyl-42.
Trong 47 chủng mà chúng tôi đã phân loại sơ bộ có 34 chủng thuộc chi
Candida, 7 chủng thuộc chi Pichia, 2 chủng thuộc chi Trichospron, 2 chủng Xyl-30 và Xyl-60 có thể thuộc một trong hai chi Debaryomyces hoặc chi
Torulaspora, chủng Xyl-42 nhờ các đặc điểm đặc trưng chúng tôi xác định được là loài Debaryomyc.es hansenii. Riêng chủng Xyl-93 do chưa tìm được đặc điểm đặc trưng nên tạm thời chưa xếp vào chi nào. Hình thái tế bào của một số chi nấm men được thể hiện trên hình 4, 5.
ề È jỊk * ^
1 4
ó . » 0 0 Q * >
© _____
m m Ê Ê Ê Ê S t Ê Ê Ê Ê IÊ Ê Ê Ê Ê Ê íÊ Ê Ê IÊ ít S Ế Ê Ê Ê Ê IÊ Ê IÊ Ê Ê Ê Ê
1 1 ( ? , > ■ ■ ị 0 ể S k b ề m ẽ '$ % © < T ; c ) . . . Q o 0 o * o ậ ° « 3 ? ' © © ’ ® « . © •
Hình 4. Hình thái nấm men có khả năng chuyển D-xyỉose thành X ylỉtol.
Hình 4a, 4b - Candida sp. Xyl-12; 4c, 4d - Candida sp. Xyl- 28; 4e, 4 f -X y l-
30 (DebarỵomỵcesỉTorulaspora). Thanh chèn trong hình 4a, 4c, 4e tương ứng vói 10 L im . Thanh chèn trong hình 4b, 4d, 4f tương ứng với 4 LIIĨ1.
M <É» * y « ~ t . <ề 0 r s 0 w Ợ ộ 0 õ ( ... —
Hình 5. Hình thái nấm men có khả năng chuyển D-xylose thành Xylỉtol.
Hình 5a, 5b-Pichia sp. Xyl-76; 5c, 5d-Pichia sp. Xyl-85; 5e, 5f -
Trichosporon sp. Xyl-32. Thanh chèn trong hình 5a, 5c, 5e tương ứng vỗl 10
Đặc tính nấm men trong các chi này có thể được liệt kê như sau :
- Candida: Phần lớn các nấm men phân lập được thuộc chi này. Đặc biệt 11 chủng có khả năng sinh xylitol cao thì có tới 10 chủng thuộc chi này. Đặc điểm nấm men thuộc chi này rất phong phú và đa dạng. Khuẩn lạc thường có màu kem, khô hoặc ướt (Xyl-14, Xyl-83, Xyl-91...) đôi khi có chủng khuẩn lạc lại có màu nâu (Xyl-23). Trong 34 chủng thuộc chi Candida mà chúng tôi phân lập được thì hầu như hình thái tế bào rất khác nhau. Tế bào từ hình oval cho tới hình ống. Một số chủng có khả năng tạo khuẩn ty (Xyl-37, Xyl-93), một số chủng lại không tạo khuẩn ty khi nuôi cấy trên môi trường 4 (Xyl-02, Xyl-47). Chi Candida là một chi phức hợp nhất trong hệ thống phân loại nấm men. Một số đặc điểm của nấm men Candida phân lập được có thể tham khảo trên hình 4a-4b, 4c-4d [3],[4], [6].
- Pichia: Nấm men thuộc chi này thường có khuẩn lạc màu trắng đục, bề mặt khô chắc, mọc lấm tấm khi cấy zic-zăc trên môi trường Malt-Glucose và tạo khuẩn ty bám vào bề mặt thạch (Xyl-68, Xyl-76, Xyl-85). Chúng có khả năng hình thành nang túi, nang có thể hình cẩu (Xyl-67) hay hình trứng (Xyl-85). Nang có thể nhẵn hoặc sần sùi mép gờ không rõ rệt khi quan sát trên kính hiển vi quang học. Sớm tạo váng trên môi trường nước chiết mạch nha.Tế bào sinh dưỡng không tiếp hợp ngay trước khi hình thành nang. Bào tử có khi hình hình mũ, đa giác, bán nguyệt hoặc hình tròn. Bào tử đôi khi nhiều nhưng rất khó quan sát trên kính hiển vi quang học (Xyl-67, Xyl-82), đôi khi lại rất đễ quan sát (Xyl-68, Xyl-69, Xyl-76) Nấm men thuộc chi này khả năng lên men glucose chậm và yếu ( hình 5a-5b, 5c-5d ) [4].
- Trichospron: Khi nuôi cấy trên môi trường Malt-Glucose, khuẩn lạc nấm men có màu vàng nhạt, bề mặt khô sần sùi đôi khi tạo thành các múi và rãnh (Xyl-25, Xyl-32). Bám chắc trên bề mặt môi trường do tạo thành nhiều khuẩn ty thể thật quanh đường cấy. Tế bào sinh dưỡng nảy chồi ở nhiều phía, khi phân cắt tế bào có dạng đốt (Xyl-32). Nấm men thuộc chi này có khả năng tạo
bào tử đốt nhưng không tạo đông bào tử. Một số chủng thuộc chi này có thể tạo khuẩn ty giả và không có nang bào tử ( hình 5e-5f) [3],[4].
- Debaryomyces: khuẩn lạc màu trắng đục có thể có lớp trên màu sữa, có khi màu nâu nhạt. Tế bào sinh dưỡng tiếp hợp ngay trước khi hình thành nang. Bào tử hình cầu, màng có nhiều mấu lồi, không màu. Bào tử hình thành sau sự tiếp hợp của hai tế bào sinh dưỡng thường là giữa tế bào mẹ và tế bào con. Với chủng Debaryomyces hansenii bào tử thường hình cầu và mỗi nang chỉ có 1-2 bào tử. (hình 4 e-4f) [3],[4].
-Torulaspora: khuẩn lạc thường có màu sữa, hơi ướt, bề mặt nhẵn. Đặc điểm nổi bật của chi này là khi sinh bào tử tế bào sẽ biến thành nang, tạo thành ống tiếp hợp nhưng không có hiện tượng tiếp hợp giữa hai tế bào. Người ta gọi ống tiếp hợp này là ống tiếp hợp giả. Bề mặt bào tử thường xù xì, không có nếp lồi. Tế bào sinh dưỡng nảy chồi về nhiều phía [3],[4].
Với kết quả phân loại sơ bộ, các chủng phân lập được xếp vào 5 chi nói trên. Kết quả này sẽ thúc đẩy việc nghiên cứu để xác định đến tên loài đặc biệt là các chủng có khả năng tổng hợp xylitol cao.
PHẦN 3. KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT
3.1. Kết luận.
- Đã xác định được phương pháp phân lập và tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng chuyển hoá xylose thành xylitol.
- Từ 39 mẫu đã phân lập được tổng số 94 chủng nấm men.
- Đã kiểm tra khả năng sinh xylitol của 94 chủng phân lập được và tìm ra 8 chủng sinh xylitol với mức lớn hơn 40g/l (hiệu suất chuyển hoá >53,3%).
Ọ
- Đã phân loại tới chi 47 cho test xylitol dương tính và cho thấy
Candida là chi có tiềm năng nhất trong chuyển hoá xylose thành xyitol.
3.2. Đê xuất.
Đề tài của chúng tôi mới chỉ là những nghiên cứu bước đầu về các chủng nấm men có khả năng chuyển hoá xylose thành xylitol. Trong thời gian tới đề tài cần tiếp tục được nghiên cứu thêm để có thể tìm ra những chủng nấm men cho hiệu suất sinh tổng hợp xylitol cao, ứng dụng vào sản xuất trên quy mô lớn nhằm sớm đưa ra những chế phẩm xylitol phục vụ cho việc chăm sóc và bảo vệ sức khoẻ nhân dân, cụ thể cần :
> Xác định tiếp tên loài 11 chủng có khả năng sinh xylitol cao. > Tìm điều kiện tối ưu cho khả năng sinh tổng hợp xylitol của các
chủng phân lập ở trên.
> Sử dụng kỹ thuật gây đột biến để tạo ra các chủng mới cho năng suất sinh tổng hợp xylitol cao hơn.
> Nghiên cứu sản xuất trên quy mô phòng thí nghiệm. > Nghiên cứu bào chế dạng chế phẩm chứa xylitol.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Báo cáo khoa học (1999) Nhà xuất bản Khoa Học Kỹ Thuật, trang 85- 87, 123-125.
2. Bộ môn Vi sinh trường ĐH Dược Hà Nội (2001) Thực tập Vi sinh - Ký sinh, trang 7-12, 15-18.
3. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm văn Ty (1997) Vi sinh vật học, nhà xuất bản Giáo Dục Hà Nội trang 84-87.
4. Nguyễn Lân Dũng và các cộng sự (1976) Một số phương pháp nghiên cứu Vi sinh vật học, nhà xuất bản Khoa Học Kỹ Thuật, tập 1 trang 65, 298, tập 2 trang 297-299, 302-303
5. Kiều Khắc Đôn, Nguyễn Lệ Phi (1998) Vi sinh học -Bộ môn Vi sinh trường ĐH Dược Hà Nội, trang 5-10, 29-34,127.
6. Nguyễn Thị Ngọc Hoa (2003) Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng chuyển hóa dầu thầu dầu thành chất thơm - Khoá luận tốt nghiệp trường ĐH Dược Hà Nội, trang 14-22.
7. Lê Xuân Hoành (2003) Phân lập tuyển chọn các chủng nấm men sinh tổng hợp Ị3-Carotene-Khoá luận tốt nghiệp trường ĐH Dược Hà Nội, trang 17, 34
8. Thuốc Biệt Dược và Cách Sử Dụng (2000) Nhà xuất bản Y Học, trang 978.
9. Andrew Glasnapp (2000) “Xylitol in the prevention of Otitis media “ International journal compounding, May, 2000.
10. Chen, L.F., Gong, c.s. 1985. Fermentation of Sugarcane Bagasse Hemicellulose Hydrolysate to Xylitol by a Hydrolysate-Acclimatized Yeast. J. Food Sci. 50: 227.
Hemicellulosic Hydrolyzate by Candida guilliermondii. J. Indust. Microbiol. Biotechnol. 18: 251-254.
12. Hiroshi Onishi and Toshiyuki Suzuki (1969) Microbial Production of Xylitol from Glucose, page 1033.
13. Heikkila, H., Puuppo, o ., Tylli, M., Nikander, H., Nygren, J., Lindroos, M., Eroma, o . 1999. Method for Producing Xylitol. U.S. patent 5,998,607.
14. http://www.apott.org/database/to 1378. Xylose and xylitol product from Bagasse or Comcob.
15. http://www.chinaxylitol.com/pl_4-e.htm. KAIHUA HUAKANG Pharmaceutical Co., Ltd.
16. http:/www.drgreene.com/21_837.html. Ear infection and xylitol. Feature article january 20, 1997.
17. http://www.findarticles.com/cf_dls/mOISW/2002_May/85131524/... Townsend Letter for Doctors and patiens, May, 2002, by Ward Deen. 18. http://www.yuxin-xylitol/E-product-2.htm. Xylitol character.
19. Izumori, K., Tuzaki, K. 1988. Production of Xylitol from D-Xylulose by
Mycobacterium smegmatis. J. Ferment. Technol. 66(1):33-36.
20. Jorg Buhner and F.A. Agblevor. Dilute acid hydrolysis and fermentation of corn fiber to xylitol-Department of Mechanical Engineering Technical ưniversity of Dresden, Dresden, Germany
21. Leleu, J., Duílot, p., Caboche, J. 1992. Process for Manuíacturing Xylitol and Xylitol-Rich Products. U.S. patent 5,096,820.
22. Richard Peter Affleck (2000) Recover of xylitol from íermentation of model hemicellulose hydrolysates using membrane technology. December 12, 2000. Blacksburg Virginia. Page 1-20.
23. Roberto, I.C., Sato, s., Mancilha, I.M., Taqueda, M.E.S.1995. InAuence of Media Composition on Xylitol Fermentation by
Candida guiliiermondii Using Response Suríace Methodology. Biotechnol Lett. 17 (11): 1223-1228
24.Yahashi, Y., Horitsu, H., Kawai, K., Suzuki, T., Takamizawa, K. 1996. Production of Xylitol From D-Xylose by Candida tropicalis: The Effect of D-Glucose Feeding. J.Ferment. Bioeng. 81 (2): 148-152.