3.4.2.1. Phương pháp thử định tính
a. Thử định tính với cơ chất là axit tannic
Sử dụng cơ chất là axit tannic để thử định tính về khả năng tổng hợp các loại enzyme phân giải lignin của các chủng nấm mốc đã phân lập được. Cấy chuyển các chủng nấm mốc đã phân lập được thành từng điểm trên bề mặt môi trường PDA có bổ sung axit tannic với nồng độ 0.5%. Các chủng sau khi cấy được nuôi ở 300C trong thời gian từ 6 – 8 ngày. Quan sát theo dõi sự phát triển của nấm và sự thay đổi màu sắc của khu vực môi trường nuôi xung quanh khuẩn lạc. Nếu môi truờng quanh khuẩn lạc chuyển sang màu nâu hoặc nâu đen chứng tỏ có sự phân huỷ axit tannic của enzyme (J.M.Harkin và John R.OBST, 1973).
b. Thử định tính với cơ chất là Syringaldazine
Các chủng sau khi đã thử và có kết quả dương tính trên cơ chất là axit tannic sẽ được chọn để tiếp tục thử với syringaldazine. Nhỏ trực tiếp dung dịch syringaldazine 1mM lên khuẩn lạc của các chủng nuôi đã chọn, ủ trong bóng tối từ 3 – 5 phút rồi tiến hành quan sát. Nếu dung dịch syringaldazine sau khi ủ chuyển từ màu vàng sang màu hồng chứng tỏ chủng nấm mốc đó có hoạt tính laccase (D. Faure và cộng sự, 1994).
3.4.2.2. Phương pháp xác định hoạt độ laccase (Ride, 1980)
a. Nguyên tắc xác định
Dựa trên sự oxi hóa syringaldazine bởi laccase thành hợp chất hấp thụ ánh sáng mạnh tại bước sóng 530 nm theo phản ứng sau:
Syringaldazine + O2 Oxidized Syringaldazine + 2H2O
Định nghĩa: Một đơn vị hoạt độ laccase là lượng enzyme cần thiết để tạo thành
1 μM sản phẩm từ syringaldazine trong thời gian 1 phút, ở điều kiện nhiệt độ là 300C, pH 6.5. b. Thành phần phản ứng Bảng 3: Thành phần phản ứng Thành phần ĐC TN 1. Đệm phosphate (100 mM), pH 6.5 2.2 ml 2.2 ml 2. Dịch laccase thô 0.5 ml 0 ml 3. Nước cất 0 ml 0.5 ml 4. Syringaldazine 0.3 ml 0.3 ml 5. Tổng thể tích 3 ml 3ml Laccase
Phản ứng xảy ra sau khi cho syringaldazine vào hỗn hợp và giữ ổn định ở nhiệt độ 300 C trong 10 phút, tiến hành đo OD.
c. Công thức tính
Trong đó:
U: Hoạt độ enzyme (U/ml)
0.001: Hệ số thay đổi ở buớc sóng A530nm/phút trên 1 đơn vị của laccase ở điều kiện pH 6.5, 300C trong 3 ml hỗn hợp phản ứng.
VE : Thể tích enzyme df: Độ pha loãng
d. Cách tiến hành
Các chủng cho kết quả dương tính với cơ chất là syringaldazine tiếp tục được chọn để xác định hoạt độ enzyme laccase. Tiến hành nuôi lắc 200 vòng/phút ở điều kiện 300C trong môi truờng sinh tổng hợp laccase, pH 5 đối với các chủng đã chọn. Sau 5 ngày nuôi tiến hành thu toàn bộ dịch nuôi đưa đi ly tâm 4000 vòng/phút rồi tách riêng phần dịch và phần sinh khối tế bào. Phần dịch sau ly tâm được thu để tiến hành đo OD ở bước sóng 530nm theo thành phần phản ứng được mô tả trong Bảng 3, từ đó tính hoạt độ enzyme laccase của từng chủng (E) theo công thức ở mục c phần 3.4.2.2. Phần sinh khối tế bào được làm khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 800C trong 15 giờ rồi cân trọng lượng khô (m).
Đánh giá khả năng tổng hợp enzyme để chọn chủng có hoạt tính laccase cao dựa trên 2 chỉ số:
o E càng cao thì khả năng sinh enzyme càng nhiều. o Tỷ lệ E/m lớn cho thấy khả năng tổng hợp enzyme cao.
Kết quả đánh giá khả năng tổng hợp enzyme laccase của các chủng nấm mốc sẽ được dùng để chọn ra chủng có hoạt tính laccase cao nhất sử dụng cho quá trình tiến hành các nghiên cứu tiếp theo sau đây.