Phương pháp nghiên cứu

3.4.1. Phương pháp vi sinh vật

3.4.1.1. Phương pháp phân lập

Sử dụng phương pháp pha loãng ( Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 2000) với môi trường phân lập là PDA có bổ sung chloramphenicol ( 0.2% ).

Nghiền nhỏ 1g mẫu gỗ mục, dùng nước muối sinh lý pha loãng thành các dung dịch có nồng độ 10-1, 10-2, 10-3, 10-4. Sử dụng các nồng độ 10-2, 10-3, 10-4 cấy trang trên bề mặt môi trường phân lập trong một đĩa petri rồi nuôi ở 300C từ 4 – 6 ngày cho tới khi các tản nấm phát triển. Sau đó làm thuần bằng cách tiếp tục cấy truyền các tản nấm trên bề mặt môi trường PDA có bổ sung chloramphenicol từ 2 đến 3 lần.

3.4.1.2. Phương pháp giữ giống

Các chủng nấm mốc sau khi đã làm thuần được cấy trên môi trường giữ giống theo phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng (Nguyễn Lân Dũng, dịch 1983).

Dùng que cấy vô trùng lần lượt cấy mỗi chủng nấm vào một ống thạch nghiêng theo đường zich zac. Các ống nghiệm được đặt trong tủ ổn nhiệt ở nhiệt độ 300C trong từ 5 - 7 ngày, khi thấy đã xuất hiện khuẩn lạc thì chuyển ống nghiệm vào tủ lạnh giữ giống ở 40C.

3.4.1.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm mốc

Tiến hành quan sát trực tiếp chủng nấm mốc trên môi trường PDA bằng mắt thường và quan sát dưới kính hiển vi quang học.

 Quan sát một số chỉ tiêu của các chủng nấm mốc trên môi trường PDA:

• Khả năng phát triển của khuẩn lạc

• Màu sắc khuẩn lạc

• Hình dạng khuẩn lạc

• Bề mặt khuẩn lạc

• Đo kích thước khuẩn lạc

 Quan sát một số chỉ tiêu của các chủng nấm mốc dưới kính hiển vi quang học:

• Phương pháp này được tiến hành để quan sát đặc điểm sợi nấm, sự hình thành bào tử và đặc điểm của bào tử nấm. Sử dụng thuốc nhuộm Fuchsin kiềm để nhuộm sợi nấm rồi quan sát với độ phóng đại 400 lần và 1000 lần. (Nguyễn Thị Minh Đức, 2001).

3.4.2. Phương pháp hóa sinh – Phương pháp xác định hoạt tính laccase

3.4.2.1. Phương pháp thử định tính

a. Thử định tính với cơ chất là axit tannic

Sử dụng cơ chất là axit tannic để thử định tính về khả năng tổng hợp các loại enzyme phân giải lignin của các chủng nấm mốc đã phân lập được. Cấy chuyển các chủng nấm mốc đã phân lập được thành từng điểm trên bề mặt môi trường PDA có bổ sung axit tannic với nồng độ 0.5%. Các chủng sau khi cấy được nuôi ở 300C trong thời gian từ 6 – 8 ngày. Quan sát theo dõi sự phát triển của nấm và sự thay đổi màu sắc của khu vực môi trường nuôi xung quanh khuẩn lạc. Nếu môi truờng quanh khuẩn lạc chuyển sang màu nâu hoặc nâu đen chứng tỏ có sự phân huỷ axit tannic của enzyme (J.M.Harkin và John R.OBST, 1973).

b. Thử định tính với cơ chất là Syringaldazine

Các chủng sau khi đã thử và có kết quả dương tính trên cơ chất là axit tannic sẽ được chọn để tiếp tục thử với syringaldazine. Nhỏ trực tiếp dung dịch syringaldazine 1mM lên khuẩn lạc của các chủng nuôi đã chọn, ủ trong bóng tối từ 3 – 5 phút rồi tiến hành quan sát. Nếu dung dịch syringaldazine sau khi ủ chuyển từ màu vàng sang màu hồng chứng tỏ chủng nấm mốc đó có hoạt tính laccase (D. Faure và cộng sự, 1994).

3.4.2.2. Phương pháp xác định hoạt độ laccase (Ride, 1980)

a. Nguyên tắc xác định

Dựa trên sự oxi hóa syringaldazine bởi laccase thành hợp chất hấp thụ ánh sáng mạnh tại bước sóng 530 nm theo phản ứng sau:

Syringaldazine + O2 Oxidized Syringaldazine + 2H2O

 Định nghĩa: Một đơn vị hoạt độ laccase là lượng enzyme cần thiết để tạo thành

1 μM sản phẩm từ syringaldazine trong thời gian 1 phút, ở điều kiện nhiệt độ là 300C, pH 6.5. b. Thành phần phản ứng Bảng 3: Thành phần phản ứng Thành phần ĐC TN 1. Đệm phosphate (100 mM), pH 6.5 2.2 ml 2.2 ml 2. Dịch laccase thô 0.5 ml 0 ml 3. Nước cất 0 ml 0.5 ml 4. Syringaldazine 0.3 ml 0.3 ml 5. Tổng thể tích 3 ml 3ml Laccase

Phản ứng xảy ra sau khi cho syringaldazine vào hỗn hợp và giữ ổn định ở nhiệt độ 300 C trong 10 phút, tiến hành đo OD.

c. Công thức tính

Trong đó:

U: Hoạt độ enzyme (U/ml)

0.001: Hệ số thay đổi ở buớc sóng A530nm/phút trên 1 đơn vị của laccase ở điều kiện pH 6.5, 300C trong 3 ml hỗn hợp phản ứng.

VE : Thể tích enzyme df: Độ pha loãng

d. Cách tiến hành

Các chủng cho kết quả dương tính với cơ chất là syringaldazine tiếp tục được chọn để xác định hoạt độ enzyme laccase. Tiến hành nuôi lắc 200 vòng/phút ở điều kiện 300C trong môi truờng sinh tổng hợp laccase, pH 5 đối với các chủng đã chọn. Sau 5 ngày nuôi tiến hành thu toàn bộ dịch nuôi đưa đi ly tâm 4000 vòng/phút rồi tách riêng phần dịch và phần sinh khối tế bào. Phần dịch sau ly tâm được thu để tiến hành đo OD ở bước sóng 530nm theo thành phần phản ứng được mô tả trong Bảng 3, từ đó tính hoạt độ enzyme laccase của từng chủng (E) theo công thức ở mục c phần 3.4.2.2. Phần sinh khối tế bào được làm khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 800C trong 15 giờ rồi cân trọng lượng khô (m).

Đánh giá khả năng tổng hợp enzyme để chọn chủng có hoạt tính laccase cao dựa trên 2 chỉ số:

o E càng cao thì khả năng sinh enzyme càng nhiều. o Tỷ lệ E/m lớn cho thấy khả năng tổng hợp enzyme cao.

Kết quả đánh giá khả năng tổng hợp enzyme laccase của các chủng nấm mốc sẽ được dùng để chọn ra chủng có hoạt tính laccase cao nhất sử dụng cho quá trình tiến hành các nghiên cứu tiếp theo sau đây.

3.4.3. Xây dựng đường cong sinh trưởng của chủng nấm mốc phân lập được

U =

(Δ A530nm/phútTN – Δ A530nm/phút ĐC) x (df) 0.001 x VE

Chủng giống nấm mốc được nuôi lắc trong môi truờng Basal, pH = 5, điều kiện nhiệt độ 300C. Mỗi ngày tiến hành thu toàn bộ dịch nuôi của 1 bình đem quay ly tâm, giữ lại phần sinh khối tế bào rồi sấy khô, xác định trọng lượng khô của chủng nấm mốc trong 7 ngày nuôi (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 2000).

3.4.4. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên khả năng sinh tổng hợp enzyme laccase của chủng nấm

3.4.4.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp enzyme.

Tiến hành nuôi lỏng lắc trong 7 ngày đối với chủng nấm mốc được chọn trong môi trường Basal. Thường xuyên mỗi ngày hút dịch nuôi đem quay ly tâm, lấy dịch để đo OD ở bước sóng 530nm nhằm xác định hoạt độ laccase theo từng ngày nuôi. Dựa vào kết quả thu được để xác định thời gian thích hợp cho sự sinh tổng hợp laccase của chủng nuôi.

3.4.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp enzyme

Sử dụng môi trường sinh tổng hợp enzyme tiến hành nuôi lỏng lắc chủng nấm đã chọn ở các ngưỡng nhiệt độ 260C, 300C, 340C, 380C. Đo OD ở bước sóng 530nm tại thời điểm nuôi thuận lợi nhằm xác định hoạt độ enzyme để chọn nhiệt độ nuôi phù hợp cho quá trình tổng hợp laccase của chủng nuôi.

3.4.4.3. Ảnh hưởng của pH môi trường lên khả năng sinh tổng hợp enzyme

Chủng nấm mốc được nuôi ở nhiệt độ nuôi thích hợp trong môi trường Basal với các mức pH môi trường thay đổi: 4, 4.5, 5, 6, 7.

Tại thời điểm nuôi thuận lợi, tiến hành đo OD ở bước sóng 530nm, xác định hoạt độ enzyme để chọn pH môi trường phù hợp nhất cho quá trình sinh laccase của chủng nuôi.

3.4.4.4. Ảnh hưởng của nguồn carbon và nitơ lên khả năng sinh tổng hợp enzyme

Để nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn carbon và nitơ khác nhau, chủng nghiên cứu được nuôi trong môi trường Basal với thành phần carbon trong môi trường (glucose) được thay thế bằng malt extract, saccarose và maltose. Nguồn nitơ là asparagine được thay bằng pepton, cao nấm men, (NH4)2SO4, NH4NO3.

Dịch nuôi lắc ở điều kiện nhiệt độ và pH môi trường thích hợp được thu và tiến hành đo OD ở bước sóng 530 nm, xác định hoạt độ enzyme để chọn ra nguồn carbon và nitơ thích hợp nhất cho quá trình tổng hợp enzyme laccase của chủng nuôi.

3.4.4.6. Ảnh hưởng của nồng độ CuSO4 lên khả năng sinh tổng hợp enzyme

Bổ sung CuSO4 vào môi trường nuôi ở các nồng độ khác nhau bao gồm: 100µM, 200 µM, 300 µM, 400 µM và 500 µM, chủng nấm mốc được nuôi lắc 200 vòng/ phút ở điều kiện nhiệt độ và pH thích hợp.

Tại thời điểm nuôi thuận lợi nhất cho quá trình sinh enzyme, tiến hành thu dịch đem đo OD ở bước sóng 530 nm để xác định hoạt độ enzyme, khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ CuSO4 đến quá trình sinh enzyme của chủng nuôi.

3.4.4.7. Ảnh hưởng của chất cảm ứng lên khả năng sinh tổng hợp enzyme

Tiến hành nuôi lắc 200 vòng/phút đối với chủng nấm mốc đã chọn trong môi trường sinh tổng hợp laccase có bổ sung các loại cơ chất cảm ứng khác nhau: axit tannic (0.1%), syringaldazine (0.2µM), ABTS (2mM) ở điều kiện nhiệt độ và pH môi trường thích hợp cho sự tổng hợp laccase.

Dựa trên thời gian nuôi thích hợp để đo OD ở bước sóng 530 nm, xác định hoạt độ enzyme từ đó chọn cơ chất phù hợp cho sự sinh tổng hợp laccase của chủng nuôi.

3.4.5. Xác định một số đặc tính của laccase

3.4.5.1. Xác định nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt của laccase

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng của enzyme được xác định bằng cách ủ hỗn hợp dịch lên men, đệm và cơ chất ở các mức nhiệt độ: 200C, 300C, 400C, 500C, 600C, 700C. Sau đó đo OD ở bước sóng 530 nm, xác định hoạt độ ở các mức nhiệt độ khác nhau để tìm ra ngưỡng nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme.

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền enzyme được xác định bằng cách ủ dịch lên men tại các nhiệt độ 400C, 500C, 600C, 700C, 800C, 900C. Hoạt độ còn lại được xác định bằng phuơng pháp đo OD (λ = 530 nm) sau các khoảng thời gian ủ nhất định.

pH thích hợp nhất cho hoạt động của laccase từ chủng tuyển chọn được xác định bằng cách ủ hỗn hợp dịch lên men và cơ chất với các dung dịch đệm có pH thay đổi: 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5. Tiến hành đo OD ở bước sóng 530 nm để xác định hoạt độ enzyme.

Để tìm được pH thích hợp cho việc bảo quản enzyme, dịch enzyme được ủ ở nhiệt độ phòng với các pH khác nhau: 6, 6.5, 7, 7.5, 8. Hoạt độ enzyme còn lại được xác định sau các khoảng thời gian ủ: 1giờ, 2 giờ, 3 giờ.

PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Phân lập các chủng nấm mốc sinh tổng hợp laccase

- Phân lập, làm thuần tạo bộ sưu tập các chủng nấm mốc

Các mẫu gỗ mục được thu thập từ nhiều địa điểm khác nhau được tiến hành phân lập trên môi trường PDA có bổ sung kháng sinh. Sau 3 đến 5 ngày nuôi trong tủ ổn nhiệt ở 300C các khuẩn lạc khác nhau sẽ được cấy chuyển sang các đĩa petri chứa môi trường PDA riêng biệt và tiếp tục cấy chuyển 2 đến 3 lần để làm thuần. Dựa trên việc quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hệ sợi, các chủng nấm mốc được tập hợp thành bộ sưu tập gồm 37 chủng bộ sưu tập này sẽ được dùng để thử khả năng sinh tổng tổng hợp laccase trong các thí nghiệm tiếp theo.

- Sàng lọc các chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp laccase

Để sàng lọc các chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp laccase chúng tôi tiến hành thử định tính khả năng sinh laccase trên cơ chất là axit tannic và syringaldazine (phương pháp tiến hành được mô tả trong phần 3.4.2.1).

Kết quả thu được cho thấy:

• Với cơ chất axit tannic 0,5% thu được 12 chủng có vùng xung quanh khuẩn lạc chuyển từ màu trắng đục sang màu nâu đen. Các chủng này được cho là có khả năng sinh tổng hợp hệ enzyme lignolytic vì khi đó các enzyme trong hệ lignolytic được tổng hợp sẽ oxy hóa axit tannic làm xuất hiện các vùng thẫm màu xung quanh khuẩn lạc (J.M.Harkin và John R.OBST, 1973). Do đó 12 chủng này được lựa chọn để tiếp tục sàng lọc hoạt tính laccase với cơ chất đặc hiệu là syringaldazine.

Hình 6: Khả năng phân hủy axit tannic của chủng BN2-2

• Tiếp tục dùng syringaldazine để thử với 12 chủng dương tính với cơ chất acid tanic ở trên, chúng tôi chọn ra được 5 chủng cho kết quả dương với syringaldazine, biểu hiện cụ thể là khi nhỏ trực tiếp dung dịch syringaldazine lên khuẩn lạc rồi ủ 5-10 phút trong bóng tối quan sát thấy cơ chất từ màu vàng chuyển sang màu hồng hoặc đỏ (D.Faure và cộng sự, 1994).

Sau khi thực hiện các thí nghiệm về xác định hoạt độ laccase, chúng tôi đưa ra kết luận sơ bộ như sau:

Mức độ làm đổi màu vùng môi truờng xung quanh khuẩn lạc nấm mốc khi thử trên cơ chất là axit tannic chưa phản ánh đầy đủ về khả năng sinh tổng hợp laccase của chủng nấm đó. Nhưng khi thử với cơ chất là syringaldazine thì sự đổi màu của cơ chất phản ánh khá chính xác về khả năng sinh laccase của một chủng, cụ thể là những chủng sau khi phân giải có thể khiến cơ chất chuyển từ màu vàng sang màu đỏ như chủng BV1 thì hoạt độ laccase đo đuợc cũng rất cao (kết quả thể hiện ở những nghiên cứu xác định hoạt độ tiếp theo). Điều này cũng phù hợp khi xét đến khía cạnh tính đặc hiệu của cơ chất.

• Các chủng nấm mốc có hoạt tính laccase thu được bao gồm: BN1, BN2-1, BN2-2, ĐA3-1, BV1, đặc điểm của 5 chủng được mô tả cụ thể ở Bảng 4

Bảng 4: Một số đặc điểm hình thái của 5 chủng nấm mốc phân lập được Chủng Đặc điểm BN1 BN2-1 BN2-2 ĐA3-1 BV1 Khuẩn lạc Khuẩn lạc trắng, bông xốp, sợi nấm mọc thưa, khuẩn ty khí sinh và khuẩn ty cơ chất đều có màu trắng Khuẩn lạc trắng hồng nhạt, mọc thành các hình tròn đồng tâm, kết cấu chặt, khuẩn ty khí sinh ngắn, khuẩn ty cơ chất vàng Khuẩn lạc trắng, kết cấu thưa, khuẩn ty khí sinh ngắn, khuẩn ty cơ chất vàng nâu nhạt Khuẩn lạc trắng, sợi nấm dài, phát triển nhanh, lan rộng, khuẩn ty cơ chất ban đầu trắng sau chuyển sang đen

Khuẩn lạc trắng bông, khuẩn ty khí sinh phát triển cao, tạo khuẩn lạc hình bán cầu, khuẩn ty cơ chất vàng nhạt

Đường kính khuẩn

lạc sau 4 ngày nuôi ^{4.8 cm 2.7 cm 3 cm 8.2 cm 2 cm}

Quan sát duới kính hiển vi quang học Bọc bào tử tròn, đính ở nhiều vị trí trên cành bào tử. Bào tử nhỏ, tròn bóng. Sợi nấm không có vách Bào tử hình bầu dục dài, hai đầu nhỏ, có vách ngăn, màng ngoài nhăn. Sợi nấm phân đốt

Bọc bào tử hình tròn. Bào tử hình bầu dục, hai đầu tròn, bề mặt căng, nhẵn. Sợi nấm có vách ngăn Bào tử bé hình bầu dục, hai đầu tròn, bào tử lớn hình lưỡi liềm, có vách ngăn. Sợi nấm phân đốt. Bọc bào tử hình quả chanh yên, có thể đính ở đầu cành hoặc bám ở nhiều vị trí khác nhau trên cành bào

ngăn. tử. Bào tử nhỏ, tròn, màng ngoài nhăn. Sợi nấm không có vách ngăn.

Sinh trưởng trên môi trường lỏng

Tạo dung dịch dạng huyền phù màu trắng đục.

Sợi nấm cuộn lại tạo thành các khối tròn, xù xì, màu vàng có kích trước lớn, dịch nuôi trong. Tạo dung dịch dạng huyền phù màu trắng hồng, dịch nuôi đục. Tạo dung dịch dạng huyền phù màu vàng nhạt, dịch nuôi đục.

Sợi nấm cuộn lại tạo thành các khối tròn, xù xì có màu trắng, kích thước lớn, dịch nuôi trong.

Hình 8 mô tả đặc điểm hình thái, kích thước của 5 chủng nấm mốc có hoạt tính laccase phân lập được

Hình 8 : Hình ảnh khuẩn lạc, sợi nấm, bào tử của 5 chủng nấm mốc BN1, BN2-1, BN2-2, ĐA3-1, BV1

Năm chủng nấm mốc có hoạt tính laccase được nuôi trong môi trường Basal lỏng, lắc 200 vòng/phút. Sau 5 ngày, tiến hành thu toàn bộ dịch nuôi đem quay ly tâm 4000 vòng/phút. Phần dịch enzyme ngoại bào được sử dụng để đo OD, xác định hoạt