Phân lập, tuyển chọn chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp endo polygalacturonase nhằm ứng dụng trong sản xuất pectic oligosaccharide (POS

Luận văn thạc sỹ LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, cố gắng nỗ lực thân, nhận ủng hộ, giúp đỡ hướng dẫn tận tình thầy cô giáo, gia đình bạn bè Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS.Nguyễn Thị Xuân Sâm – Bộ môn Vi sinh - Hóa sinh - Sinh học phân tử - Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội định hướng hướng dẫn cho nghiên cứu suốt thời gian thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn NCS Vũ Kim Dung, thuộc Bộ môn Vi sinh - Hóa sinh - Sinh học phân tử - Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội - người giúp đỡ hướng dẫn suốt trình hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, anh chị, bạn học viên, sinh viên phòng thí nghiệm Vi sinh- Hóa sinh -Sinh học phân tử nhiệt tình giúp đỡ cho trình học tập thực luận văn Cuối xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè người thân động viên, khuyến khích giúp vượt qua khó khăn suốt trình nghiên cứu Hà Nôi, ngày 24 tháng năm 2014 Lê Thị Huyền i Luận văn thạc sỹ LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu khoa học Các kết nghiên cứu luận văn hoàn toàn trung thực, số liệu, tính toán hoàn toàn xác chưa công bố công trình nghiên cứu Mọi liệu, hình ảnh, biểu đồ trích dẫn tham khảo luận văn thu thập sử dụng nguồn liệu mở trích dẫn rõ nguồn gốc Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm với cam đoan Hà Nội, ngày 24 tháng 03 năm 2014 Lê Thị Huyền ii Luận văn thạc sỹ MỤC LỤC MỞ ĐẦU Đột biến số lượng nhiễm sắc thể 21 Đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể 21 Tìm cực trị phương trình hồi quy y= b0 + b1X1 + b11 X12+ b2 X2 + b22 X22 + b3X3+ b33X32 + b12 X1X2 + b13X1X3 + b23X2X3 phần mềm Design-Expert 7.15 cho kết đạt giá trị cưc trị X1, X2, X3 tương ứng với giá trị độ ẩm, hàm lượng pectin nhiệt độ 36 Vậy hiệu xuất thu hồi PG đạt giá trị lớn tại X1, X2, X3 tương ứng với giá trị độ ẩm, hàm lượng pectin nhiệt độ 36 36 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .37 3.2.1 Ảnh hưởng hàm lượng pectin 43 3.2.4 Xác định động thái trình tổng hợp enzym 45 3.5.2 Ảnh hưởng nhiệt độ 58 PHỤ LỤC .71 iii Luận văn thạc sỹ DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Vị trí phân cắt pectinesterase Hình 1.2 Sản phẩm phân cắt polymetyl galacturonase Hình 1.3 Cơ chế hoạt động Endo Polygalacturonase Hình 1.4 Sản phẩm phân cắt Exo Polygalacturonase Hình 1.5 Sản phẩm phân cắt Polymetylgalacturonate lyase Hình 1.6 Sản phẩm phân cắt Polygalacturonate lyase .6 Hình 1.7: Cơ chế hoạt động Endo polygalacturonase Bảng 1.1: Đặc tính endo polygalacturonase [4] .7 Hình 1.8 Cấu tạo A niger [1] Bảng 1.2: Đặc điểm hình thái A niger [7] .9 Hình 1.9 Cấu tạo củapectic polysaccharide 14 Hình 1.10 Công thức Homogalacturonan 15 Bảng 1.3: Hàm lượng pectin loại trái [6] 16 Hình 1.11: Cấu tạo củaD - galacturonic acid pectic oligosaccharide .17 Bảng 1.4: Sản xuất POS theo phương pháp khác từ nguồn pectin .18 Bảng 2.1 Hóa chất chính, enzym 26 Bảng 2.2 Máy, thiết bị 26 Hình 2.1: Đồ thị đường chuẩn galacturonic acid 30 Bảng 2.3: Các biến số khoảng chạy chúng 34 Bảng 3.1 Nguồn gốc đặc điểm chủng nấm mốc phân lập 37 Hình 3.1.Khuẩn lạc, hệ sợi bào tử chủng CF1 môi trường Czapeck (sau ngày nuôi, 300C) .38 Hình 3.2.Vòng thủy phân chất pectin dịch chiết enzym số chủng nấm mốc thử nghiệm (0,1ml/lỗ, giờ, 50oC) .40 Bảng 3.3: Hoạt độ polygalacturonase chủng thử nghiệm .40 iv Luận văn thạc sỹ Hình 3.3 Sự giảm độ nhớt dịch thủy phân pectin dịch 41 chiết enzym chủng mốc thử nghiệm 41 E1: dịch thủy phân pectin enzym chủng nấm mốc 5037 42 E2 : dịch thủy phân pectin enzym chủng nấm mốc 5004 42 E3 : dịch thủy phân pectin enzym chủng nấm mốc 5007 42 E4 : dịch thủy phân pectin enzym chủng nấm mốc CF .42 E5: dịch thủy phân pectin enzym chủng nấm mốc C2 42 E6: dịch thủy phân pectin enzym chủng nấm mốc 5002 42 E7: dịch thủy phân pectin enzym chủng nấm mốc 5020 42 Hình 3.5 Ảnh hưởng độ ẩm đến khả sinh tổng hợp polygalacturonase chủng A niger CNTP 5037 44 Hình 3.7 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp Polygalacturonase chủng A niger CNTP 5037 46 Bảng 3.4 Ảnh hưởng thời gian chiếu xạ tới tỉ lệ sống A niger 47 Bào tử chủng A niger CNTP5037 chiếu UV với thời gian 75 phút sau trang môi trường Czapeck-pectin chứa Triton X100, tiếp tách khuẩn lạc cấy chấm điểm khuẩn lạc đĩa pettri chứa môi trường Czapeck-pectin để xác định đường kính vòng thủy phân Bảng 3.5 giá trị D/d số chủng đột biến tìm thấy cao so với chủng tự nhiên 48 Bảng 3.5: Giá trị D/d thu từ chủng đột biến 48 Bảng 3.6: Kết kiểm tra khả tổng hợp enzym chủng đột biến 49 Bảng 3.7 Khả sinh tổng hợp PG chủng cải tạo qua hệ 50 Bảng 3.8: Ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố hoạt độ PGthu điều kiện nuôi cấy khác 51 Bảng 3.9: Kết phân tích phương sai mô hình ưu phần mềm DX7.1.5 52 Hình Hàm kỳ vọng điều kiện tối ưu để nuôi cấy thu EPG 53 v Luận văn thạc sỹ Bảng 3.10 Ảnh hưởng nồng độ ammonium sulfat bão hòa đến hiệu suất thu nhận PG 55 Bảng 3.11 Ảnh hưởng nồng độ ethanol tới hiệu suất thu nhận PG .55 Bảng 3.12: Hiệu suất cô đặc thu hồi PG phương pháp lọc (màng lọc 10 kDa)56 Hình 3.9 Ảnh hưởng pH đến hoạt độcủa enzym 57 Hình 3.10 Ảnh hưởng pH đến đô bền enzym 58 59 Hình 3.11 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzym 59 Hình 3.12 Ảnh hưởng nhiệt độ đến độ bền enzym 60 Hình 3.13 Khảo sát trình thủy phân pectin tạo POS dịch chiết enzym từA.niger ĐB 5037.06 61 vi Luận văn thạc sỹ DANH MỤC CHŨ VIẾT TẮT DE EPG ENPO- PMG-K1 EXO-PMG-K3 PG-K4 PE PG PME PMG POS UV Degree of esterication Endo Polygalacturonase Endo polymetyl galacturonase Exo– polymetyl galacturonase Exo–Polygalacturonase Pectin esterase Polygalacturonase Pectin methyl esterase Polymethyl galacturonase Pectic oligosaccharide Ultraviolet( tia cực tím) vii Luận văn thạc sỹ MỞ ĐẦU Tài nguyên sinh học Việt Nam đa dạng phong phú Do đó, việc khai thác nguồn tài nguyên thực thường xuyên dạng nghiên cứu đa dạng sinh học loài sinh vật để tìm tòi gen phục vụ cho nghiên cứu ứng dụng đời sống Các nghiên cứu enzym thường bắt đầu việc phân lập tuyển chọn từ tự nhiên - nơi có nhiều chất đặc hiệu cho enzym xúc tác, từ đó, hóa chủng phân lập biến đổi hệ gen chủng để đạt mục tiêu mong muốn Endo polygalacturonase enzym có nhiều ứng dụng quan trọng thuộc họ pectinase Endo polygalacturonase (EPG) xúc tác thủy phân liên kết α-(1, 4) – D – galacturonic phân tử pectin để tạo thành pecic oligosaccharide acid galacturonic EPG nghiên cứu nhiều đối tượng khác thực vật, nấm mốc, nấm men, vi khuẩn Tuy nhiên, đối tượng nghiên cứu nhiều có khả tổng hợp EPG cao Aspergillus niger Với ưu điểm dễ nuôi cấy, sinh trưởng phát triển nhanh, sản xuất enzym thời gian ngắn A niger sử dụng để nuôi cấy thu enzym EPG EPG ứng dụng công nghiệp thực phẩm sản xuất nước quả, rượu vang, lên men trà, cà phê sản xuất tinh dầu EPG ứng dụng ngành công nghiệp khác như: công nghiệp dệt, xử lý nước thải, sản xuất thức ăn chăn nuôi Hiện nay, hướng nhà khoa học tập trung nghiên cứu sử dụng EPG thủy phân giới hạn chất pectin tạo Pectic oligosaccharide (POS) Đây prebiotic hệ có nhiều hoạt tính sinh học có lợi cho người Cơ chất pectin để tạo POS sản xuất từ phụ phẩm nông nghiệp vỏ cam, bưởi, chanh dây, cà rốt,…Việt Nam nước nhiệt đới, khí hậu thích hợp cho phát triển loại qủa này, đó, nguồn phụ phẩm nông nghiệp giàu pectin dồi Lê Thị Huyền Luận văn thạc sỹ Việc tìm kiếm chủng A niger có khả tổng hợp EPG cao để chủ động tạo nguồn enzym ứng dụng thực phẩm đặc biệt để thủy phân chất pectin Việt Nam tạo POS công việc có ý nghĩa Xuất phát từ vấn đề trên, thực nghiên cứu đề tài: "Phân lập, tuyển chọn chủng nấm mốc có khả sinh tổng hợp Endo -polygalacturonase nhằm ứng dụng sản xuất pectic oligosaccharide (POS)" Nội dung nghiên cứu: + Phân lập tuyển chọn chủng A niger có khả sinh tổng hợp Endo polygalacturonase cao + Xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp sinh tổng hợp Endo polygalacturonase cao cho chủng lựa chọn + Cải tạo chủng lựa chọn phương pháp chiếu xạ UV để thu chủng đột biến có khả tổng hợp enzym cao chủng tự nhiên + Thu nhận enzym kỹ thuật + Xác định đặc tính thăm dò khả ứng dụng enzym nghiên cứu vào thuỷ phân pectin tạo pectic oligosaccharide (POS) Lê Thị Huyền Luận văn thạc sỹ Chương 1: TỔNG QUAN 1 Đại cương nguồn enzym 1.1.1 Pectinase [27,31,47] Pectinase nhóm enzym thủy phân pectin, sản phẩm trình axit galacturonic, galactose, arabinose, methanol,…Đây nhóm enzym ứng dụng rộng rãi công nghiệp đứng sau amylase protease Một ngành công nghiệp ngành công nghệ thực phẩm dược phẩm Đặc biệt công nghệ sản xuất nước rượu vang Người ta sử dụng pectinase để tránh tượng bị đục lắng cặn trình sản xuất bảo quản Ngoài ra, chúng có vai trò quan trọng hàng đầu việc phá vỡ làm mềm mô thực vật, hỗ trợ trình cân sinh thái việc phân hủy tái chế chất thải từ nguyên liệu thực vật Những nghiên cứu gần cho thấy ứng dụng quan trọng pectinase việc thuỷ phân pectin tạo sản phẩm có khối lượng phân tử thấp pectic olygosacchride (POS) có thuộc tính prebiotic mang lại sức khỏe cho người, hỗ trợ giúp phòng chống bệnh tật Pectinase không tìm thấy thực vật bậc cao mà có vi sinh vật vi khuẩn, nấm men nấm sợi Pectinase họ bao gồm nhiều loại enzym, xúc tác cho kiểu phản ứng khác có tính đặc hiệu cao vi sinh vật Hiện nay, việc phân loại pectinase dựa vào tính đặc hiệu, chế tác dụng, kiểu phản ứng pH tối ưu enzym Năm 1966, Koller Neukom chia pectinase thành số enzym sau: - Pectinesterase (PE) Pectinesterase hay gọi với số tên khác pectinmethylesterase (PME), pectase, pectin methoxylase, pectin demethoxylase pectolipase, thuộc nhóm enzym thủy phân Enzym PE xúc tác trình thủy phân liên kết este để tách nhóm metoxyl (OCH3) phân tử pectin, giải phóng methanol acid pectic acid pectinic Pectinesterase ứng dụng làm nước sản xuất rượu vang, sâm panh Lê Thị Huyền Luận văn thạc sỹ solid state systems, Journal of Industrial Micro biology & Biotechnology, pp 34- 38 34 Mads H Clausen (2002)Synthesis and Application of Pectic oligosaccharides, Ph.D Thesis, Technical University of Denmark 35 Maciel, M.H.C.; Herculano, P.N.; Porto, T.S.; Teixeira, M.F.S.; Moreira, K.A.; Souza-Motta, C.M (2011)Production and partial characterization of pectinases from forage palm by Aspergillus niger URM4645 Afr 36 Manderson K., Pinart M., Tuohy K M., Grace W E., Hotchkiss A T., Widmer W., Yadhav M P., Gibson G R., Rastall R A (2005)In Vitro Determination of Prebiotic Properties of Oligosaccharides Derived from an Orange Juice Manufacturing By-Product Stream, Applied and environmental microbiology, Vol 71 (12), pp 8383–8389 37 Martina Martínez Sabajanes, Remedios Yáñez, José L Alonso, Juan C Parajó (2012)Pectic oligosaccharides production from orange peel waste by enzymatic hydrolysis, International Journal of Food Science & Technology, Vol 47 (4), pp 747–754 38 María A Martos; Francisco Martinez Vazquez; Fernando O Benassi; Roque A Hours (2009)Production of pectinases by A niger: influence of fermentation conditions,Brazilian Archives of Biology and Technology, pp 567- 572 39 M.L Buga, Sani Ibrahim and J Andrew, (2010)Physico-chemical characteristics of immobilized Polygalacturonase from Aspergillus niger 40 M.M B (1976) Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 77: 248-254 67 Lê Thị Huyền Luận văn thạc sỹ 41 N Akhter , M Alam Morshed., Azim Uddin, Feroza Begum, Tipu Sultan, Abul Kalam Azad (2011), Production of Pectinase by Aspergillus niger Cultured in Solid, State Media, International Journal of Biosciences, pp 33- 42 42 N.Hadj-Taieb, M.Ayadi, S.Trigui, F.Bouabdallah, A.Gar-gouri(2002) Hyperproduction of pectinase activities by a fully constitutive (CT1) of Penicillium occitains,Enzym Microb Technol, 30,pp.662-666O 43 N Martin., Simone Regina de Souza, Roberto da Silva and Eleni Gomes(2004)Pectinase Production by Fungal Strains in Solid-State Fermentation Using Agro-Industrial Bioproduct, brazilian archives of biology and technology, Vol.47, n : pp 813-819 44 O.A Uzoma, O.V.Ihuaka, O Joy, A.A Adedotun, E.O Albert, OM Bleeding(2009) pectinase production by UV -2DG resistant mutant of Apergillus niger with a catabolite repression resistance activity FASEB Joural 45 O.Loera, G Viniegra-Gonzaslez (1998) Identification of growth phenotypes in Aspergillus niger pctinase over producing mutants using image analysis image analysis procedures Biotechnol Tech.12,pp.801-804 46 Olano-Martin E., Mountzouris K.C., Gibson G.R., Rastall R.A (2001),Continuous Production of Pectic Oligosaccharides in an Enzym Membrane Reactor, Food Engineering and Physical Properties, Vol 66 (7), pp 966 – 971 47 Olano-Martin E., G R Gibson, and R A Rastall (2002)Comparison of the in vitro bifidogenic properties of pectins and pectic-oligosaccharides, J Appl Microbiol Vol 93, pp 505-511 48 Palframan, R., G R Gibson, and R A Rastall (2003), )Development of a quantitative tool for the comparison of the prebiotic effect of dietary oligosaccharides Lett Appl Microbiol Vol 37, pp 281-284 49 P Antier, A Minjares, S.Roussos, M.Raimbault, G Vini-egra-Gonzaslez (1993) Pectinase hyper producing mutants of Aspergillus niger C28B25 for solidstate fermentation on coffee pulp.Enzym Microb,Technol, pp.254-260 68 Lê Thị Huyền Luận văn thạc sỹ 50 P Antier, A Minjares, S.Roussos, G Viniegra-G onzaslez(1993) new approarch for selecting pectinase producing mutants of Aspergillus niger well adapted to solid - state fermentation.Biotech Adv.11 pp 429-440 51 P Palanivelu (2006), Polygalacturonase: Active site analyses and mechanism of action, Indian Journal ò Biotechnology, Vol 5, pp 142- 162 52 R.C Fontana, S Salvador., M Moura da Silveira (2005)Influence of pectin and glucose on growth and Polygalacturonase production by Aspergillus niger in solid-state cultivation, J Ind Microbiol Biotechnol 32: 371–377 53 R Kavitha, S Umesh- kumar( 2000) Gennetic improvement of Aspergillus carbonarius for pectinase overproduction during solid- state growth.Biotechnol.Bioeng, 67., pp.121-125 54 S.M Mohsen, W.A Bazaraa and K Doukani , (2009) Purification and characterization of aspergillus niger U-86 Polygalacturonase and its use in clarification of pomegranate and grape juices, Conference on Recent Technologies in Agriculture 55 Ranveer Singh Jayani, Shivalika Saxena, Reena Gupta (2005)Microbial pectinolytic enzyms: A review, Process Biochemistry 40, pp 2931–2944 56 R R S Kiran., R Konduri., G.H Rao, G.M Madhu (2010)Statistical optimization of endo-Polygalacturonase production by overproducing mutants of Aspergillus niger in solid-state fermentation, J Biochem Tech, pp 154-157 57 S Fanaro,J Jelinek, B Stahl, G Boehm, R Kock., V.Vigi (2005) Acidicoligosaccharides from pectin hydrolysate as new component for infant formulae: effect on intestinal flora, stool characteristics, and pH, J Pediatr Gastroenterol Nutr., 41(2), pp.186-190 58 S Akbar, D.R.G Prasuna, R Khanam (2013) Multistep mutagenic strain improvenment in Aspergillus carbonarius to enhance pectinase production potential, International journal of applied biology and pharmaceutical technology, 4(2), pp 92-98 69 Lê Thị Huyền Luận văn thạc sỹ 59 Voragen A.G.J., Voragen F., Schols H., R., V (2003) Advances in pectin and pectinase research Kluwer Academic Publishers: 38 60 A Chaudhri,V Suneetha (2012) Microbially derived Pectinase: A review IOSR Journal of Pharmacy and Biological Sciences, 2(2), pp.1-5 61 E Favela-Torres, T Volke-Sepúlveda, G Viniegra-González (2006) Production of Hydrolytic Depolymerising Pectinases Food Technol Biotechnol , 44(2), 221– 22 70 Lê Thị Huyền Luận văn thạc sỹ PHỤ LỤC 71 Lê Thị Huyền Luận văn thạc sỹ Hình 1: Khuẩn lạc chủng A niger nuôi môi trường chứa 1% pectin, sau ngày 30oC Bảng Giá trị OD575 hoạt độ enzym thay đổi nhiệt độ Nhiệt độ 25 Hoạt độ enzym (U/g 15,31 30 35 40 17,75 16,51 14.42 môi trường) Bảng Giá trị OD575 hoạt độ enzym thay đổi hàm lượng pectin Hàm lượng pectin(%) Hoạt độ enzym (U/g môi trường) 15.72 10 17,01 12 19,10 14 16.80 50 13,18 60 20,21 70 14,83 80 6,02 Bảng Hoạt độ enzym thay đổi hàm ẩm Hàm ẩm (%) Hoạt độ enzym (U/g môi trường) 72 Lê Thị Huyền Luận văn thạc sỹ Bảng Giá trị OD575 hoạt độ enzym thời gian nuôi thay đổi Thời gian nuôi(h) 24 Hoạt độ enzym 4,28 36 48 60 72 10.15 15.43 18.34 22.05 84 96 108 120 21.21 17.62 13.76 8.67 (U/g) Bảng Hoạt độ enzym pH khác pH Hoạt độ (U/ml) 14.85 45.53 55.08 35.84 Bảng Hoạt độ enzym lại pH khác pH Hoạt độ tương đối thời gian khác nhau(%) 100 76.24 66.66 60.58 53.82 49.39702 100 99.24 93.69 93.69 87.14 77.77252 100 98.42 92.50 92.50 84.61 72.33389 100 84.23 76.38 57.93 53.39 41.38094 Bảng Hoạt độ enzym giá trị nhiệt độ khác Nhiệt độ 30 40 50 60 70 (⁰C) Hoạt độ 23.92 38.30 43.15 54.07 19.60 (U/ml) Bảng Hoạt độ enzym lại giá trị nhiệt độ khác Nhiệt độ (0C) Hoạt độ tương đối (%)) Lê Thị Huyền 73 144 2.81 Luận văn thạc sỹ 20 100 100 94.35 37.03 24.19 17.47 99.05 88.63 18.68 13.95 9.29 96.12 86.08 16.96 10.03 3.45 85.36 100 70 100 89.79 99.74 91.30 100 40 100 98.95 30 50 60 78.81 75.60 11.82 7.39 1.16 Bảng 9: Giá trị d/D 458 chủng đọt biến đột biến STT d(mm) D (mm) D/d STT d(mm) D (mm) D/d 1.8 35 1.7 2.3 36 11 2.2 3 12 4.0 37 11 1.8 10 2.0 38 11 2.8 11 3.7 39 11 2.8 10 2.0 40 2.3 10 3.3 41 12 2.4 10 2.5 42 2.5 10 2.5 43 3.0 10 2.0 44 2.7 11 12 3.0 45 2.3 12 10 2.5 46 2.0 13 2.3 47 2.0 14 12 3.0 48 2.3 15 2.3 49 12 2.4 74 Lê Thị Huyền Luận văn thạc sỹ 16 2.3 50 12 2.4 17 10 2.5 51 2.0 18 2.3 52 1.7 19 1.7 53 11 2.2 20 11 2.2 54 11 1.8 21 11 1.8 55 11 2.8 22 11 2.8 56 11 2.8 23 11 2.8 57 2.3 24 2.3 58 12 2.4 25 1.8 59 2.5 26 2.3 60 3.0 27 12 4.0 61 2.7 28 10 2.0 62 2.3 29 11 3.7 63 2.0 30 10 2.0 64 2.0 31 10 3.3 65 2.3 32 10 2.5 66 12 2.4 33 10 2.5 67 12 2.4 34 2.0 68 2.0 69 10 2.5 107 11 2.2 70 2.3 108 11 1.8 71 12 3.0 109 11 2.8 72 2.3 110 11 2.8 73 2.3 111 2.3 74 10 2.5 112 12 2.4 75 Lê Thị Huyền Luận văn thạc sỹ 75 2.3 113 2.5 76 114 10 77 2.3 115 11 2.2 78 12 2.4 116 2.7 79 12 3.0 117 10 2.0 80 11 2.2 118 10 2.0 81 12 3.0 119 6.0 82 10 2.0 120 10 2.0 83 10 2.0 121 11 1.8 84 11 2.2 122 2.3 85 12 4.0 123 10 2.0 86 10 2.0 124 10 2.0 87 10 2.0 125 10 2.0 88 11 2.2 126 1.8 89 11 2.2 127 10 2.0 90 10 2.5 128 2.3 91 3.0 129 2.3 92 1.8 130 10 2.5 93 2.3 131 1.8 94 10 2.0 132 11 2.2 95 10 2.0 133 4.0 96 11 1.8 134 2.7 97 1.5 135 2.3 98 2.3 136 11 2.2 99 10 2.0 137 2.0 76 Lê Thị Huyền Luận văn thạc sỹ 100 2.3 138 2.7 101 10 2.0 139 2.7 102 10 2.0 140 2.3 103 1.8 141 11 2.2 104 10 2.0 142 2.7 105 2.3 143 2.3 106 2.3 144 11 2.2 145 2.7 183 2.3 146 2.3 184 3.0 147 10 2.5 185 3.0 148 1.8 186 2.7 149 11 2.2 187 2.3 150 4.0 188 11 2.8 151 2.3 189 10 2.5 152 11 0.5 190 2.7 153 2.7 191 11 2.8 154 11 2.2 192 10 3.3 155 4.0 193 10 2.5 156 2.7 194 3.0 157 2.3 195 2.3 158 11 2.2 196 11 2.2 159 2.5 197 10 160 2.7 198 2.7 161 10 2.0 199 10 2.5 162 10 2.0 200 11 2.2 77 Lê Thị Huyền Luận văn thạc sỹ 163 3.0 201 11 2.2 164 10 2.0 202 12 2.4 165 11 1.8 203 1.5 11 7.3 166 2.3 204 12 6.0 167 10 2.0 205 168 10 2.0 206 2.5 10 4.0 169 10 2.0 207 10 3.3 170 1.8 208 11 5.5 171 10 2.0 209 3.0 172 2.3 210 10 5.0 173 2.3 211 12 4.0 174 10 2.5 212 9.0 175 1.8 213 2.5 10 4.0 176 11 2.2 214 3.0 177 4.0 215 2.5 10 4.0 178 2.7 216 11 3.7 179 2.3 217 11 3.7 180 11 2.2 218 1.5 6.0 181 4.0 219 15 2.5 182 2.7 220 0.1 307 10 2.0 346 16 3.2 308 2.5 3.2 347 10 2.0 309 10 2.0 348 11 2.8 310 5.5 10 1.8 349 11 2.2 311 11 5.5 350 10 2.5 78 Lê Thị Huyền Luận văn thạc sỹ 312 4.5 10 2.2 351 11 2.2 313 2.3 352 11 2.2 314 2.3 353 2.7 315 2.0 354 2.3 316 355 15 2.1 317 0 0.0 356 0 318 3.5 357 2.5 319 1.5 358 13 2.6 320 3.5 359 0 0.0 321 7.5 2.5 360 0 0.0 322 2.3 361 0 0.0 323 14 3.5 362 0 0.0 324 10 2.5 363 3.0 325 2.3 364 2.5 326 10 2.0 365 0 0.0 327 10 2.0 366 1.8 328 1.8 367 2.5 3.2 329 2.0 368 11 3.7 330 7.5 1.9 369 4.0 331 2.0 379 11 2.8 332 3.5 10 2.9 371 12 2.4 333 12 2.4 372 3.5 2.6 334 10 2.5 373 12 2.4 335 0 0.0 374 18 3.0 336 0 0.0 375 12 6.0 79 Lê Thị Huyền Luận văn thạc sỹ 337 0 0.0 376 2.3 338 3.0 377 10 2.5 339 15 1.9 378 10 2.0 340 10 2.5 379 10 2.5 341 11 2.5 380 0 342 0 381 12 4.0 343 2.5 382 344 10 2.5 383 2.5 11 4.4 384 3.5 16 4.5 422 14 2.8 385 3.5 14 423 10 2.5 386 424 4.5 387 3.0 425 3.0 388 2.5 426 2.5 389 10 3.3 427 10 3.3 390 10 2.5 428 5.5 10 1.8 391 11 2.2 429 11 1.8 392 10 2.5 430 10 2.5 393 11 2.2 431 4.5 11 2.4 394 11 2.2 432 11 2.2 395 2.7 433 2.0 396 2.3 434 2.3 397 15 2.1 435 13 1.9 398 0 0.0 436 0 399 11 2.2 437 11 2.2 400 10 2.5 438 4.5 12 2.7 80 Lê Thị Huyền Luận văn thạc sỹ 401 11 2.2 439 11 2.2 402 11 3.6 440 11 2.2 403 2.7 441 3.5 2.3 404 2.3 442 2.3 405 15 2.1 443 15 2.5 406 0 0.0 444 0 407 11 2.2 445 11 2.2 408 10 2.5 446 10 2.5 409 11 2.2 447 11 1.8 410 11 2.2 448 11 2.2 411 2.7 449 2.0 412 2.3 450 2.3 413 15 2.1 451 15 2.1 414 0 0.0 452 0 415 11 2.2 453 11 2.2 416 10 2.5 454 10 2.5 417 11 2.2 455 11 2.2 418 11 2.2 456 11 2.2 419 2.7 457 2.7 420 2.3 458 2.3 421 15 2.1 12 3.0 81 Lê Thị Huyền KC