Phân lập tuyển chọn chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp laccase, nghiên cứu điều kiện nuôi cấy và một số đặc tính của laccase

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM MỐC CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP LACCASE, NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA LACCASE NGÀNH: CƠNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: LÊ HỒNG NGA NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : GS TS ĐẶNG THỊ THU HÀ NỘI 2007 MỤC LỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Laccase 1.2 Các nguồn thu laccase (EC 1.10.3.2) 1.2.1 Laccase vi sinh vật 1.2.2 Laccase từ thực vật 10 1.3 Cấu tạo laccase 11 1.3.1 Khối lượng phân tử 11 1.3.2 Cấu trúc không gian 12 1.4 Đặc tính laccase 14 1.4.1 Các chất ức chế hoạt tính laccase 14 1.4.2 Tính đặc hiệu chất 15 1.4.3 Nhiệt độ pH tối ưu 15 1.4.4 Điểm đẳng điện (pI) 16 1.4.5 Km Vmax 16 1.4.6 Các isozym 19 1.5 Cơ chế xúc tác laccase 20 1.6 Ảnh hưởng môi trường nuôi đến khả sinh tổng hợp laccase 23 1.6.1 Nguồn cacbon 23 1.6.2 Nguồn nitơ 24 1.6.3 Nguồn khoáng 24 1.6.4 Chất cảm ứng 26 1.6.5 Chất kìm hãm 27 1.6.6 Nhiệt độ 27 1.6.7 pH 28 1.7 Ứng dụng laccase 28 1.7.1 Ứng dụng laccase chất tẩy trắng sinh học 28 1.7.2 Ứng dụng laccase việc làm giảm thiểu ô nhiễm môi trường phương pháp sinh học 30 1.7.3 Ứng dụng tạo nguồn nguyên liệu 32 1.7.4 Những ứng dụng số lĩnh vực khác 33 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 34 2.1 Đối tượng vật liệu nghiên cứu 34 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 34 2.1.2 Hóa chất 34 2.1.3 Thiết bị sử dụng 34 2.1.4 Môi trường 35 2.2 Phương pháp 36 2.2.1 Phương pháp vi sinh vật 36 2.2.2 Phương pháp hóa sinh – phương pháp xác định hoạt tính laccase38 2.2.3 Phương pháp định tên nấm mốc 38 2.2.4 Tối ưu hố điều kiện ni cấy phương pháp quy hoạch thực nghiệm 41 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 3.1 Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật có hoạt tính laccase 45 3.1.1 Phân lập chủng nấm mốc phương pháp tách khuẩn lạc 45 3.1.2 Tuyển chọn chủng nấm có hoạt tính laccase phương pháp sàng lọc đĩa thạch 45 3.1.3 Tuyển chọn chủng nấm mốc có hoạt tính laccase phương pháp ni cấy chìm 50 3.2 Định tên chủng BB19_3 52 3.3 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến q trình ni cấy sinh tổng hợp laccase 55 3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống 55 3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng nguồn cacbon 56 3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ glucose 57 3.3.4 Khảo sát ảnh hưởng nguồn nitơ 58 3.3.5 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ nitơ 59 3.3.6 Khảo sát ảnh hưởng chất cảm ứng 59 3.3.7 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng 60 3.3.8 Khảo sát ảnh hưởng CuSO4 61 3.3.9 Khảo sát ảnh hưởng pH đầu 62 3.3.10 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ nuôi 63 3.4 Tối ưu hố mơi trường ni cấy sinh tổng hợp laccase từ BB19_3 64 3.5 Khảo sát động thái trình lên men sinh tổng hợp laccase từ chủng BB19_3 môi trường nuôi cấy với điều kiện tối ưu 68 3.6 Khảo sát nồng độ (NH4)2SO4, ethanol kết tủa laccase 70 3.7 Xác định số đặc tính laccase từ BB19_3 72 3.7.1 Ảnh hưởng nhiệt độ tới hoạt tính laccase 72 3.7.2 Ảnh hưởng pH tới hoạt tính laccase 73 3.7.3 Ảnh hưởng nhiệt độ tới tính bền laccase 74 3.7.4 Ảnh hưởng pH tới tính bền laccase 75 KẾT LUẬN 76 KIẾN NGHỊ 77 TÀI LIỆU THAM KHẢO 78 PHỤ LỤC 83 CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABTS 2,2’-azino-bis (3-etylthiazolin-6 sunfonat) BB Ba Bể BV Ba Vì CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylene diamine tetra-acetic acid EPR Electroparamagnetic resonance ITS Internal transcribed spacer kDa Kilodalton MEA Malt Extract Agar MT Môi trường PCR Polymease chain reaction PDA Potato Dextrose Agar PSC Pusamcap RBBR Remazol Brilliant Blue R RCP Rừng Cúc Phương TE Tris-EDTA VA Veratryl alcohol DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Khối lượng phân tử số lượng isozym laccase từ số chủng nấm mốc Bảng 1.2 Một vài đặc tính laccase từ số chủng vi sinh vật Bảng 2.1 Ma trận thực nghiệm Bảng 2.2 Ma trận giả định thực tối ưu Bảng 3.1 Số lượng mẫu chủng nấm mốc thu từ trình phân lập Bảng 3.2 Kết sàng lọc chủng nấm mốc phân lập môi trường khác Bảng 3.3 Số lượng chủng có hoạt tính laccase qua bước sàng lọc Bảng 3.4 Hoạt độ laccase chủng nấm mốc phân lập Bảng 3.5 Khảo sát khả sinh tổng hợp laccase ngoại bào chủng nấm mốc Bảng 3.6 Ảnh hưởng tỷ lệ giống đến khả sinh tổng hợp laccase Bảng 3.7 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến sinh tổng hợp laccase Bảng 3.8 Ảnh hưởng nồng độ nguồn nitơ đến khả tổng hợp laccase Bảng 3.9 Ảnh hưởng chất cảm ứng khác đến sinh tổng hợp laccase Bảng 3.10 Ảnh hưởng pH đầu đến khả sinh tổng hợp laccase Bảng 3.11 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi đến khả sinh tổng hợp laccase Bảng 3.12 Các mức thí nghiệm Bảng 3.13 Ma trận thực nghiệm kết Bảng 3.14 Kiểm tra tương ứng mơ hình theo tiêu chuẩn Fisher Bảng 3.15 Ma trận điều kiện tối ưu Bảng 3.16 Khảo sát nồng độ muối (NH4)2SO4 thích hợp thu chế phẩm laccase Bảng 3.17 Khảo sát nồng độ ethanol thích hợp thu chế phẩm laccase DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1 Chu trình xúc tác laccase Hình 1.2 Cấu trúc bậc ba laccase từ Melanocarpus albomyces Hình 1.3 Cơ chế oxy hóa tiểu phần phenol lignin laccase Hình 1.4 Cơ chế oxy hóa tiểu phần khơng có chất phenol (nonphenolic) lignin laccase ABTS Hình 1.5 Mơ hình oxy hóa trung gian chất laccase Hình 3.1 Kết sàng lọc mơi trường MEA có sử dụng axit tanic làm chất thị Hình 3.2 Kết sàng lọc môi trường RBBR chủng BB13_2 Hình 3.3 Kết sàng lọc lần với chất đặc hiệu Syringaldazine ABTS Hình 3.4 Kết chạy điện di kiểm tra sản phẩm DNA sau tinh Hình 3.5 Đặc điểm hình thái hệ sợi BB19_3 kính hiển vi điện tử (độ phóng đại 400 lần) Hình 3.6 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến khả tổng hợp laccase Hình 3.7 Ảnh hưởng nồng độ glucose đến khả tổng hợp laccase Hình 3.8 Ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng veratryl alcohol tới sinh tổng hợp laccase Hình 3.9 Ảnh hưởng nồng độ CuSO4 đến khả sinh tổng hợp laccase Hình 3.10 Động thái trình lên men sinh tổng hợp laccase chủng BB19_3 Hình 3.11 So sánh tác nhân kết tủa laccase Hình 3.12 Ảnh hưởng nhiệt độ tới hoạt tính laccase Hình 3.13 Ảnh hưởng pH tới hoạt tính laccase Hình 3.14 Ảnh hưởng nhiệt độ tới tính bền laccase Hình 3.15 Ảnh hưởng pH tới tính bền laccase MỞ ĐẦU Laccase (EC 1.10.3.2) polyphenol oxidase chứa nguyên tử đồng trung tâm xúc tác thường gọi polyphenol oxydase đa đồng Laccase có khả xúc tác phản ứng chuyển hóa hợp chất phenol thành gốc quinin sau oxy hóa chúng thành quinon Phản ứng oxy hóa gắn liền với khử phân tử oxy tạo thành nước Khả oxy hóa hợp chất phenol laccase đánh dấu bước phát triển ngành công nghệ enzym [38, 40] Trong tự nhiên, laccase thu từ nhiều nguồn khác từ vi khuẩn, nấm mốc, thực vật loại côn trùng, laccase phân bố chủ yếu thực vật bậc cao nấm mốc Trametes versicolor, Coprinus cinereus, Pleurotus ostreatus, Pycnoporus cinnabarinus [31] Laccase ứng dụng rộng rãi công nghiệp bao gồm tẩy trắng giấy, tẩy màu thuốc nhuộm vải loại bỏ hợp chất phenol rượu [36] Phổ ứng dụng laccase mở rộng việc kết hợp laccase với chất trung gian (mediator) làm chúng có khả oxy hóa hợp chất khơng có chất phenol (non-phenol) Ngồi ra, laccase cịn có số ứng dụng khác việc phát loại bỏ hợp chất phenol gây ô nhiễm môi trường, ứng dụng việc xử lý phụ phẩm sản phẩm nông nghiệp để tạo nguyên liệu cho trình khác Laccase có nhiều ứng dụng nên vấn đề đặt cần phải tìm chủng vi sinh vật có khả sinh tổng hợp laccase cao, góp phần làm giảm giá thành trình sản xuất liên quan đến laccase Vì vậy, tiến hành nghiên cứu đề tài “Phân lập, tuyển chọn chủng nấm mốc có khả sinh tổng hợp laccase, Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy số đặc tính laccase” Nội dung đề tài : - Phân lập, tuyển chọn chủng nấm mốc có hoạt tính laccase cao - Tìm điều kiện thích hợp cho nấm mốc sinh tổng hợp laccase - Tối ưu hóa điều kiện ni cấy - Khảo sát động thái trình lên men sinh tổng hợp laccase - Khảo sát khả kết tủa nghiên cứu số đặc tính laccase CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Laccase Laccase (EC 1.10.3.2) enzym chứa nhiều nguyên tử đồng có khả xúc tác phản ứng oxy hóa hợp chất phenol thành quinin sau oxy hóa tiếp thành quinon (Gimbert) Laccase xúc tác phản ứng oxy hóa với oxy hóa khử lên tới 0,8V Số lượng đồng laccase biến động từ hai đến bốn nguyên tử tùy thuộc vào loại laccase Tất laccase từ thực vật, vi sinh vật glycoprotein (với mức độ glycosyl hóa từ 22%- 45%) có bốn nguyên tử đồng phân tử [25] Laccase từ nguồn khác khác mức độ glycosyl hóa, khối lượng phân tử đặc tính động học [41] 1.2 Các nguồn thu laccase (EC 1.10.3.2) Laccase số enzym biết đến từ kỷ XIX Năm 1883, Yoshida (Nhật) lần phát laccase ơng chiết từ dịch chiết gỗ lacquer Rhus vernicifera năm 1896 laccase Bertrand Laborde tìm thấy từ nấm mốc [27, 38] Phần lớn nguồn thu laccase có chủng nấm mốc có khả phân hủy lignin, biết đến nhiều loài nấm đảm Ngoài ra, thực vật Rhus vernicifera có khả sinh laccase Ở số lồi vi khuẩn có hoạt tính laccase [19] 1.2.1 Laccase vi sinh vật * Laccase từ nấm mốc: Laccase phân lập từ Ascomyceteous, Deuteromycetous, nấm Basidiomeeteous nghiên cứu chủ yếu tập trung vào Basidiomeeteous [7] 74 Kết cho thấy pH 6,0 hoạt độ laccase xác định cao nhất, pH tối ưu laccase từ BB19_3 6,0 3.7.3 Ảnh hưởng nhiệt độ tới tính bền laccase Tiến hành thí nghiệm nhiệt độ khác nhau: 25, 30, 35, 40, 50, 60oC với thời gian xác định 10 giờ, sau xác định hoạt độ lần Kết xác định tính bền nhiệt laccase thể hình 3.14 Hình 3.14 Ảnh hưởng nhiệt độ tới tính bền laccase Kết hình 3.14 cho thấy, laccase có vùng bền nhiệt 25-35°C Nhiệt độ thấp enzyme bền Ở khoảng nhiệt độ 25-35°C sau 10 hoạt độ laccase 55,75 – 78,21% Ở 60°C hoạt độ giảm mạnh sau 10 10,02% 75 3.7.4 Ảnh hưởng pH tới tính bền laccase Để xác định ảnh hưởng pH tới tính bền laccase, tiến hành thí nghiệm ủ enzym đệm giá trị pH khác từ 4,0 - 7,5 thời gian 10 Cứ sau xác định hoạt độ laccase Kết thể hình 3.15 Hình 3.15 Ảnh hưởng pH tới tính bền laccase Kết cho thấy laccase bền vùng pH 5,5 – 6,5 sau 10 hoạt độ 50,14 – 79,56 % Ở pH 7,5 sau 10 hoạt độ 9,63% 76 KẾT LUẬN Từ 40 mẫu thu thập rừng nhiệt đới Việt Nam phân lập 115 chủng nấm mốc Qua bước sàng lọc, tuyển chọn 18 chủng có khả sinh tổng hợp laccase Chọn chủng BB19_3 cho hoạt tính laccase cao Bằng phương pháp sinh học phân tử (ITS) phương pháp đặc điểm hình thái định tên chủng BB19_3 thuộc lồi Pestalotiopsis sp Đã tìm điều kiện thích hợp sinh tổng hợp laccase Mơi trường Basal với glucose 10g/l; pepton 1,5g, (NH4)2SO4 1,5g; bổ sung 0,3mM chất cảm ứng veratryl alcohol; 300µM CuSO4.5H2O; pH đầu 5,5; nhiệt độ ni 30°C, tốc độ lắc 200 vịng/phút, thời gian 4ngày Tối ưu hóa điều kiện ni cấy chủng Pestalotiopsis sp sinh tổng hợp laccase phương pháp quy hoạch thực nghiệm xác định thành phần tối ưu là: 14 g/l glucose; 0,4mM veratryl alcohol; pH đầu 6,0 cho hoạt độ cao đạt 189,3U/ml, gấp 1.92 lần so với truớc tối ưu (98,59U/ml) Đã xác định động thái laccase từ chủng BB19_3 bao gồm: nấm mốc sinh trưởng cực đại từ 72-96 giờ, tổng hợp laccase cao (166,9 U/ml) sau 96 nuôi pH môi trường thay đổi, 96 nuôi pH đạt 5,8 giai đoạn laccase tổng hợp nhiều Khảo sát điều kiện kết tủa laccase muối (NH4)2SO4 ethanol, chọn tác nhân kết tủa thích hợp muối (NH4)2SO4 65% bão hòa thu laccase với hoạt độ tổng cao (7454U) hiệu suất 66,7% Xác định số đặc tính laccase - Nhiệt độ tối ưu cho hoạt tính laccase 35°C, bền vùng nhiệt độ 25-35°C, sau 10 hoạt độ 55,75 – 78,21% - pH tối ưu: 6,0; bền vùng pH 5,5-6,5; sau 10 hoạt độ 50,14 – 79,56 % 77 KIẾN NGHỊ Từ kết nghiên cứu chúng tơi có đề xuất: - Tiếp tục khảo sát đặc tính laccase từ Pestalotiopsis sp: tính đặc hiệu chất, pI, ảnh hưởng ion kim loại đến trung tâm hoạt động laccase… - Tinh chế enzym để thu chế phẩm laccase tinh khiết - Tạo chủng đột biến có khả sinh tổng hợp laccase với hoạt lực cao, khảo sát khả ứng dụng laccase quy mô công nghiệp: tẩy trắng giấy, phát xử lý hợp chất phenol 78 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Hồng Đình Hịa (1999), Tối ưu hóa công nghiệp thực phẩm, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Khuất Hữu Thanh (2006), Kỹ thuật gen, nguyên lý ứng dụng, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Xuân Sâm (2004), Công nghệ enzym, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội TIẾNG ANH Abadulla, E., Tzanov, T., Costa, S., Robra, K.-H., Cavaco-Paulo, A and Gübitz, G.M (2000), “Decolorization and detoxification of textile dyes with a laccase from Trametes hirsuta”, Appl Environ Microbiol, 66: 3357-3362 Archibald, Bourbonnais, Jurasek, Paice, M.g & Reid (1997), “Kraft pulp bleaching and delignification by Trametes versicolor”, J Biotechnol, 53: 215-236 Arora, D.S & Gill, P.K (2000), “Laccase production by some white rot fungi under different nutritional conditions”, Bioresource Technol, 73: 283-285 Assavanig, A., Amornkitticharoen, B, Ekpaisal, N., Meevootisom, V & Flegel, T.W (1992) “Isolation, characterization and function of laccase from Trichoderma”, Appl Microbiol Biotechnol, 38: 198-202 Aust, S D P R Swaner J D Stahl (2003), Detoxification and metabolism of chemicals by white-rot fungi Pesticide decontamination and detoxification, Washington, D.C.: Oxford University Press, 3-14 79 Bermek, H., K Li, and K –E L Eriksson (2002) “Studies on mediators of manganese peroxidase for bleaching of wood pulps”, Bioresour Technol, 85: 249-252 10 Bertrand, T C., C Jolivalt, P Briozzo, E Caminade, N Joly, C Madzak, and C Mougin (2002), “Crystal Structure of Four-Copper Laccase Complexed with an Arylamin: insights into Substrate Recognition and Correlation with Kinetics”, Biochemistry-US, 41: 73257333 11 Bollag, J.M & Leonowicz, A (1984), “Comparative studies of extracellular fungal laccases”, Appl Environ Microbiol, 48(4): 849-854 12 Bourbonnais, R & Paice, M.G (1992), “Demethylation and delignification of kraft pulp by Trametes versicolor laccase in the presence of 2,2'-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)”, Appl Microbiol Biotechnol, 36: 823-827 13 Chen, C., A Potthast, T Rosenau, J S Gratzl, A G Kirkman, D Nagai, and T Miyakoshi (2000), “Laccase-catalyzed oxidation of 1(3,4-dimethoxyphenol)-1-propene using ABTS as mediator”, J Mol Cat B: Enzymol, 8: 213-219 14 Eggert, C., U Temp, and K –E L Eriksson (1996), “Laccase is essential for lignin degradation by the white-rot fungus Pycnoporus cinnabarinus”, FEBS Lett, 407: 89-92 15 Fabbrini, M., C Galli and P Gentili (2002), “Comparing the catalytic efficiency of some mediators of laccase”, J Mol Cat B, 16: 231-240 16 Farnet, A.M., Criquet, S., Tagger, S., Gil, G and Le Petit, J (2000), “Purification, partial characterisation, and reactivity with aromatic 80 compounds of two laccases from Marasmius quercophilus strain 17” Canadian Journal of Microbiology, 46: 189-194 17 Felby, C (1998), “Measurement of laccase activity by a syringaldazine based assay”, Novo Nordisk, Application Development, 1-3 18 Gayazov, R & Rodakiewicz-Nowak, J (1996), “Semi-continuous production of laccase by Phlebia radiata in different culture media”, Folia Microbiol, 41(6): 480-484 19 Gianfreda, L., Xu, F & Bollag, J-M (1999), “Laccases: a useful group of oxidoreductive enzymes”, Bioremediation J, 3(1): 1-26 20 Hao J, Song F, Huang F, Yang C, Zhang Z, Zheng Y, Tian X (2007), “Production of laccase by a newly isolated deuteromycete fungus Pestalotiopsis sp and its decolorization of azo dye” J Ind Microbiol Biotechnol, 34(3): 233-240 21 Harkin, J.M and Obst, J.R (1973), “Syringaldazine, an effective reagent for detecting laccase and peroxidase in fungi” Experientia, 29: 381-508 22 Johannes jacobus van der merwe (2002), Production of laccase by the white-rot fungus Pycnoporus sanguineus, University of the Free State, Bloemfontein, South Africa 23 Justin Jordaan (2005), Isolation and Characterization of a Novel Thermostable and Catalytically Efficient Laccase from Peniophora sp Strain UD4, Doctor of Philosophy of Rhodes University 24 Kiiskinen, L.-L., Rättö, M and Kruus, K (2004), “Screening for novel laccase-producing microbes” Journal of Applied Microbiology, 97: 640646 81 25 Kumar, S.V., Phale, P.S., Durani, S and Wangikar, P.P (2003), “Combined sequence and structure analysis of the fungal laccase family” Biotechnol Bioeng, 83: 386-394 26 Kumarasamy Murugesan, In-Hyun Nam, Young-Mo Kim, YoonSeok Chang (2006), “Decolorization of reactive dyes by a thermostable laccase produced by Ganoderma lucidum in solid state culture” Enzyme and Microbial Technology, 1-11 27 Levine, W.G (1965), Laccase, a review.In: The biochemistry of copper, AcademicPress Inc., New York: 371-385 28 Laura-Leena Kiiskinen (2005), Characterization and heterologous production of a novel laccase from Melanocarpus albomyces, Dissertation for the degree of Doctor of Science in Technology at Helsinki University of Technology (Espoo), Finland 29 Lee, Jung, & Park, (1999), “Enhanced production of laccase in Trametes versicolor by the addition of ethanol”, Biotechnol Lett, 21: 965-968 30 M Enriqueta Arias, María Arenas, Juana Rodríguez, Juan Soliveri, Andrew S Ball, and Manuel Hernández (2003), “Kraft Pulp Biobleaching and Mediated Oxidation of a Nonphenolic Substrate by Laccase from Streptomyces cyaneus CECT 3335” Appl Environ Microbiol, 69(4): 1953–1958 31 Marièlle Bar (2001), Kinetics and physico-chemical properties of white- rot fungal laccases, University of the Free State, Bloemfontein 32 Palmieri, Giardina, Bianco, Fontanella, & Sannia (2000), “Copper induction of laccase isoenzyms in the ligninolytic fungus Pleurotus ostreatus” Appl Environ Microbiol, 66: 920-924 82 33 Petr Baldrian (2005), Fungal laccases - occurrenceand properties, Laboratory of Biochemistry of Wood-Rotting Fungi, Institute of Microbiology ASCR, Prague, Czech Republic 34 Rogers SO and Bendich AJ (1988), “Extraction of DNA from plant tissues”, Plant Molecular Biology Manual, 6: 1–10 35 Solaya Suksa-Ard (2004), Genetic Improvement of Lignolytic Fungi: Screening for Lignolytic Activities, Kasetsart University, Japan 36 Susana Rodríguez Couto, José Luis Toca Herrera, (2006), “Industrial and biotechnological applications of laccases: A review”, Biotechnology Advances, 24: 500–513 37 Thakker, G.D., Evans, C.S and Rao, K.K (1992), “Purification and characterisation of laccase from Monocillium indicum Saxena”, Applied Microbiol Biotechnology, 37: 321-323 38 Thurston CF (1994), “The structure and function of fungal laccases” Microbiology, 140: 19–26 39 Xavier, A.M.R.B., Evtuguin, D.V., Ferreira, R.M.P.& Amado, F.L (2001), Laccase production for lignin oxidative activity, Proceedings of th the International Conference on Biotechnology in the Pulp and Paper Industry, Helsinki, Finland 40 Xu, F (1996), “Oxidation of phenols, anilines, and benzenethiols by fungal laccases: Correlation between activity and redox potentials as well as halide inhibition”, Biochem, 35: 7608-7614 41 Yaropolov, A I., O V Skorobogat’ko, S S Vartanov, and S D Varfolomeyev 1994, “Laccase: Properties, Catalytic Mechanism, and Applicability”, Appl Biochem Biotechnol, 49: 257-280 83 PHỤ LỤC Bảng Ảnh hưởng nguồn cacbon đến khả tổng hợp laccase Hoạt độ Laccase (U/ml) Thời gian (ngày) Nguồn C (g/l) Glucose 86,73 101,36 89,99 Malt extract 84,56 91,14 78,40 Saccarose 82,46 88,33 76,93 Galactose 72,86 86,89 75,94 Lactose 52,19 75,69 68,56 Rỉ đường 48,60 71,72 63,97 Bảng Ảnh hưởng nồng độ glucose đến khả sinh tổng hợp laccase chủng BB19_3 Thời gian N/độ (ngày) glucose(g/l) Hoạt độ Laccase (U/ml) 5 51,20 53,42 51,69 81,53 89,11 76,68 10 89,39 104,46 80,37 12 80,13 86,12 74,34 15 69,26 79,54 65,36 Bảng Ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng veratryl alcohol tới việc sinh tổng hợp laccase Hoạt độ Laccase (U/ml) Thời gian nồng độ (ngày) chất c.ứ(mM) 0,1 85,73 78,36 89,89 0,2 87,56 112,14 92,49 0,3 96,23 131,6 99,45 0,4 82,86 96,89 95,94 84 Bảng Ảnh hưởng nồng độ CuSO4 tới việc sinh tổng hợp laccase Hoạt độ Laccase (U/ml) Thời gian CuSO4 (ngày) (µM) 100 89,73 105,36 85,54 200 94,56 135,89 88,40 300 110,46 165,80 106,93 400 99,86 146,12 100,94 Đối chứng 82,19 102,69 84,56 Bảng Động thái trình lên men sinh tổng hợp laccase BB19_3 Thời gian Sinh khối pH Hoạt độ (giờ) (g/l) 0,6 6,0 12 5,58 2,5 24 5,11 25,4 36 10 4,36 45,7 48 15,6 4,15 59,8 60 32,4 4,69 89,7 72 37 5,1 121,5 84 36,5 5,5 152,2 96 36,8 5,8 166,9 108 35,8 5,6 158,2 120 35,1 5,0 128,5 132 34,2 4,8 90,4 144 33,7 4,52 72,8 (U/ml) 85 Bảng Nhiệt độ tối ưu cho laccase Nhiệt độ (°C) 25 30 35 40 45 50 Hoạt độ laccase (U/ml) 151,3 166,9 182,0 161,5 142,9 120,3 Bảng pH tối ưu cho laccase BB19_3 pH Hoạt độ (U/ml) 101,5 4.5 121,5 5.5 170,2 179,4 189,5 6.5 136.9 110,2 7.5 99.6 86 Hình 1: Kết Blast NCBI 87 88 ... mốc có khả sinh tổng hợp laccase, Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy số đặc tính laccase? ?? 8 Nội dung đề tài : - Phân lập, tuyển chọn chủng nấm mốc có hoạt tính laccase cao - Tìm điều kiện thích hợp. .. hợp cho nấm mốc sinh tổng hợp laccase - Tối ưu hóa điều kiện ni cấy - Khảo sát động thái trình lên men sinh tổng hợp laccase - Khảo sát khả kết tủa nghiên cứu số đặc tính laccase CHƯƠNG TỔNG QUAN... KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật có hoạt tính laccase 3.1.1 Phân lập chủng nấm mốc phương pháp tách khuẩn lạc Các chủng vi sinh vật có khả sinh tổng hợp laccase