Luận văn: "Phân lập, tuyển chọn chủng Bacillus subtilis có khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α- glucosidase và tối ưu điều kiện nuôi cấy để thu chất ức chế α-glucosidase cao" doc

Nhuộm Gram & bào tửT2 Trực khuẩn, kích thước nhỏ, không có bào tử.. Khảo sát định tính khả năng sinh tổng hợp Đường kính vòng thủy phân mẫu đối chứng d=18 mm Đường kính vòng thủy phân ch

Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa công nghệ sinh học

GVHD: PGS.TS Trần Liên Hà SVTH: Nguyễn Quỳnh Trang

Lớp: KS.CNSH 07-01

NỘI DUNG

I.TỔNG QUAN

1.1 Bệnh tiểu đường 2030 có thể tăng Dự kiến đến

lên đến 472 triệu người

Dự kiến đến

2030 có thể tăng lên đến 472 triệu người

1.2 Tác hại của bệnh tiểu đường

1 2

1.4 Cơ chế tác dụng của AGIs trong điều trị

II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2 1 Vật liệu

2.2 Phương pháp nghiên cứu

III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Phân lập Bacillus từ tương Nam Đàn

Chủng Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Kích thước (mm)

T1 Màu trắng ngà, bề mặt trơn, có gợn nhăn thành vòng tròn, mép

T2 Màu trắng ngà, bề mặt trơn, mép bờ không tròn đều. 4

T3 Màu trắng đục, viền ngoài màu trắng ngà, bề mặt trơn, mép bờ

T4 Màu trắng ngà, bề mặt trơn, có gợn nhăn thành vòng tròn, mép

T5 Màu trắng ngà, bề mặt trơn, có gợn thành vòng tròn giống như

nhân, mép bờ răng cưa 2

T6 Màu trắng ngà, bề mặt váng, nhân hơi lồi, mép bờ không tròn

đều, hơi răng cưa 3 – 4

T7 Màu trắng đục, bề mặt váng, mép bờ không tròn đều,hơi răng

T11 Màu trắng đục hơi ngả vàng, viền ngoài màu trắng ngà, bề mặt

hơi lồi, mép bờ hơi nhăn 3

T12 Màu trắng đục, bề mặt nhăn, mép bờ không tròn đều. 5 – 6

T13 Màu trắng ngà, bề mặt có váng, mép bờ răng cưa. 3 – 4

3.2 Nhuộm Gram & bào tử

T2 Trực khuẩn, kích thước nhỏ, không có bào tử. –

T3 Trực khuẩn, kích thước không đồng nhất, tạo ít bào

T8 Trực khuẩn, kích thước nhỏ hơn so với các mẫu

T11 Trực khuẩn , tạo thành chuỗi, có nhiều bào tử. G(+)

T13 Trực khuẩn, hai đầu thon, có nhiều bào tử. G(+)

Bào tử của chủng T13

3.3 Khảo sát định tính khả năng sinh tổng hợp

Đường kính vòng thủy phân mẫu đối chứng d=18 mm

Đường kính vòng thủy phân chủng T13 Hình thái khuẩn lạc chủng T13

3.4 Khảo sát định lượng khả năng sinh tổng

hợp chất ức chế α-glucosidase

3.5 Tối ưu điều kiện nhiệt độ

30oC

3.5 Tối ưu điều kiện nhiệt độ

3.5 Tối ưu điều kiện nhiệt độ

3.5 Tối ưu điều kiện nhiệt độ

3.6 Tối ưu điều kiện pH

3.7.Tối ưu nồng độ cơ chất

 Lựa chọn cơ chất

 Khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase

sử dụng cơ chất đậu tương

IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1 Kết luận

- Phân lập được 13 chủng từ tương Nam Đàn.

- Chủng T13 có đường kính vòng thủy phân nhỏ nhất 12mm

- Chủng Natto có khả năng sinh tổng hợp chất ức

chế α-glucosidase cao nhất 70,61%.

- Chủng Natto có khả năng sinh tổng hợp chất ức

chế α-glucosidase cao nhất ở 40oC (82,23%), pH 5 (83, 73%), sử dụng cơ chất đậu tương với hàm lượng Nitơ 5% (85,75%).

4.2 Kiến nghị

- Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ lắc đến sự sinh trưởng phát triển và khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase từ canh trường nuôi cấy của chủng

Natto.

- Thu, tách và tinh sạch chất kìm hãm để ứng dụng trong điều trị bệnh tiểu đường.

Khảo sát định tính khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase

Dựa trên phương pháp đo đường kính vòng thủy phân tạo thành sau khi cho α-glucosidase thủy phân tinh bột tan đồng thời bổ sung canh trường nuôi cấy vi khuẩn có chứa chất ức chế enzyme α-glucosidase

Đĩa thạch nuôi ủ ở 300C trong 24h Lấy ra nhuộm bằng

Lugol.

Môi trường thạch đã bổ sung tinh

bột tan

Khảo sát định lượng khả năng sinh tổng hợp chất

Hoạt tính ức chế α-glucosidase được xác định theo công thức:

% ức chế = [Α – (B – C)]/Α.100 (%) (1) Trong đó:

A: là hàm lượng glucose tạo thành khi

α-glucosidase bị thủy phân.

B: là hàm lượng glucose tạo thành sau khi cho thêm canh trường nuôi cấy vi khuẩn

C: là hàm lượng đường glucose có sẵn

trong canh trường nuôi vi khuẩn.

* Phương pháp xác định hoạt tính ức chế

α-glucosidase: glucosidase:

Phương pháp nhuộm bào tử

* Nguyên tắc:

Sự bắt màu thuốc nhuộm của tế bào vi sinh vật là một quá trình hấp phụ Phần lớn vi sinh vật bắt màu bền vững Thuốc nhuộm thường dùng là các chất aminlin (chủ yếu là loại kiềm hoặc trung tính) Vì thành phần tế bào của mỗi vi sinh vật khác nhau nên khả năng bắt màu cũng rất khác nhau.

* Cách tiến hành:

Trước khi nhuộm bào tử, tiến hành sốc nhiệt (70oC trong 10 phút) hoặc để lạnh trong tủ lạnh 2oC trong 2 ngày, nhằm kích thích vi khuẩn tạo bào tử Sau

đó tiến hành làm tiêu bản để nhuộm bào tử.

Làm vết bôi và cố định vết bôi bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn.

Nhuộm xanh metylen theo loffler: Nhỏ 1 giọt xanh metylen, hơ nóng đến sôi nhẹ và giữ như vậy trong 15 − 20 giây.

Rửa bằng nước cất, nhuộm lại bằng fucshin giữ khoảng 30 giây Sau đó rửa bằng nước cất, hơ khô Nhỏ 1 giọt dầu soi rồi quan sát dưới vật kính dầu 100X.

Kết quả: tế bào bắt màu hồng, bào tử bắt màu xanh.

Phương pháp nhuộm Gram

* Cách tiến hành:

Làm vết bôi và cố định vết bôi bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn Nhỏ 1 giọt tím gential lên trên vết bôi, giữ trong khoảng 1 − 2 phút, rửa bằng nước cất, thấm khô.

Nhỏ dung dịch lugol lên trên vết bôi, giữ trong 1 phút rồi rửa cồn, thấm khô (hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn).

Nhỏ 1 giọt fucshin lên vết bôi, giữ trong 12 phút Sau đó rửa nước, thấm khô

Nhỏ 1 giọt dầu soi rồi quan sát dưới vật kính dầu 100X.

Kết quả: vi khuẩn Gram (+) bắt tím, vi khuẩn Gram (−) bắt màu hồng.

IC50: The half maximal inhibitory concentration DNJ : 1-deoxynojrimycin

α-glucosidase (enzyme EC 3.2.1.20)

Trung tâm hoạt động của α-glucosidase: glucosidase họ GH13