Phân lập, tuyển chọn chủng bacillus subtilis có khả năng ức chế nấm mốc aspergillus glavus

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG BACILLUS SUBTILIS CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ NẤM MỐC ASPERGILLUS FLAVUS Giáo viên hướng dẫn : PGS.TS Phạm Thị Tâm Sinh viên thực : Trần Thị Hồng Nhung Lớp: 12-02 Hà Nội – 2016 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, cán thuộc Khoa Công nghệ sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho em thực tập hoàn thành đề tài Em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tớiPGS.TS Phạm Thị Tâm giảng viên Khoa Công nghệ Sinh học, Viện Đại Học Mở Hà Nội, người trực tiếp tận tình hướng dẫn dìu dắt em suốt trình em thực tập hoàn thành đề tài Em quên gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, anh chị khóa trước, bạn bè bên em, tận tình giúp đỡ, cổ vũ động viên suốt thời gian em thực tập hoàn thiện đề tài Trong trình thực tập không tránh khỏi sai sót, kính mong thầy cô giáo, anh chị bạn đóng góp ý kiến để em tiếp thu hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Sinh viên Trần Thị Hồng Nhung Sinh viên: Trần Thị Hồng Nhung - Lớp 1202 MụC LụC LỜI CẢM ƠN MụC LụC i DANH MụC BảNG iii MỞ ĐẦU PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương chung nấm Apergillus flavus 1.2 Độc tố nấm mốc 1.2.1 Độc tố aflatoxin 1.2.2 Cơ chế gây bệnh Aflatoxin 1.2.3 Giới hạn Aflatoxin cho phép sử dụng 1.2.4 Độc tính Aflatoxin 10 1.2.4.1 Ảnh hưởng độc tố tế bào 10 1.2.4.2 Ảnh hưởng độc tố động vật 10 1.2.4.3 Ảnh hưởng độc tố sức khỏe người 13 1.2.5 Tình hình nghiên cứu nhiễm độc tố nấm mốc Apergillus flavus lương thực, thực phẩm 14 1.3 Biện pháp ngăn ngừa hạn chế nấm mốc cho lương thực trình bảo quản 16 1.4 Phương pháp phân hủy Aflatoxin 17 1.4.1 Phương pháp vật lý học 17 1.4.2 Phương pháp hóa học 19 1.4.3 Phương pháp sinh học 19 1.5 Tính chất đối kháng Bacillus subtilis với nấm 20 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Đối tượng 22 2.2 Vật liệu 22 2.2.1 Thiết bị dụng cụ phòng thí nghiệm 22 2.2.1.1 Thiết bị 22 Sinh viên: Trần Thị Hồng Nhung - Lớp 1202 i 2.2.1.2 Dụng cụ 22 2.2.2 Môi trường hóa chất 23 2.2.2.1 Môi trường 23 2.2.2.2 Hóa chất 25 2.3 Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis (theo Nguyễn Lân Dũng) 25 2.4 Các phương pháp thử sinh hóa 27 2.5 Phương pháp xác định hiệu ức chế nấm A.flavus đĩa thạch 29 2.6 Phương pháp xác định yếu tố gây ức chế nấm mốc Aspergillus flavus chủng vi khuẩn Bacillus subtilis 29 2.7 Phương pháp xác định điều kiện thích hợp sản sinh yếu tố gây ức chế chủng vi khuẩn Bacillus subtilis 30 2.8 Đánh giá khả ức chế nấm mốc vi khuẩn tuyển chọn chất cám ngô 31 PHẦN III: KẾT QUẢ 33 3.1 Phân lập chủng Bacillus subtilis từ đất 33 3.2 Khả ức chế nấm mốc Aspergillus flavus chủng vi khuẩn Bacillus subtilis môi trường thạch 37 3.3 Yếu tố gây ức chế nấm mốc Aspergillus flavus chủng vi khuẩn Bacillus subtilis 39 3.4 Điều kiện nuôi cấy thích hợp để chủng Bacillus subtilis tuyển chọn sản sinh yếu tố gây ức chế nấm mốc 40 3.4.1 Thời gian 41 3.5 Kết đánh giá khả ức chế nấm mốc vi khuẩn tuyển chọn chất cám ngô 44 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 Kết luận 46 Đề nghị 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 Sinh viên: Trần Thị Hồng Nhung - Lớp 1202 ii DANH MụC BảNG Bảng 1.2 Quy định độc tố aflatoxin B1 aflatoxin tổng số Việt Nam Bảng 1.3 Giới hạn aflatoxin số nước theo tiêu chuẩn FDA Bảng 1.4 Độc tính gây ung thư aflatoxin loài động vật khác 12 Bảng 2.1 Thiết bị dùng nghiên cứu 22 Bảng 3.1 Phản ứng sinh hóa chủng Bacillus subtilis phân lập từ đất 33 Bảng 3.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả ức chế nấm mốc Aspergillus flavus 38 Bàng 3.3 Kết xác định yếu tố ức chế nấm mốc chủng vi khuẩn Bacillus subtilis M1 Đ8.3 39 Bảng 3.4 Kết đánh giá khả ức chế nấm mốc cám ngô 44 DANH MụC HÌNH Hình 3.1: Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis quan sát kính hiển vi 35 Hình 3.2 Kết thử catalase 35 Hình 3.3 Kết thử thủy phân casein, tinh bột, gelatin 36 Hình 3.4: Kết phản ứng KIA 36 Hình 3.5: Kết thử Indole 37 Hình 3.6 Hình ảnh ức chế nấm mốc chủng M1 Đ8.3 38 Hình 3.7 Hình ảnh thí nghiệm xác định yếu tố ức ức chế nấm mốc vi khuẩn tuyển chọn 40 Hình 3.8 Ảnh hưởng thời gian tăng sinh tới khả ức chế nấm mốc chủng vi khuẩn M1 Đ8.3 42 Hình 3.9 Ảnh hưởng pH môi trường tăng sinh tới khả ức chế nấm mốc chủng vi khuẩn M1 Đ8.3 44 Hình 3.10 Đánh giá khả ức chế nấm mốc cám ngô chủng Đ8.3 45 \ Sinh viên: Trần Thị Hồng Nhung - Lớp 1202 iii DANH MụC BIểU Biểu đồ Ảnh hưởng thời gian tăng sinh tới khả ức chế nấm mốc chủngvi khuẩn B.subtilis 41 Biểu đồ Ảnh hưởng pH môi trường tăng sinh vi khuẩn đến khả ức chế nấm mốc chủng vi khuẩn B.subtilis 43 Sinh viên: Trần Thị Hồng Nhung - Lớp 1202 iv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Lubria – Bertani LB Acid Deoxyribonucleic AND Acid Ribonucleic ARN Part per billion Ppb Part per million Ppm Hydrate sodium calcium alumino- HSCAS silicate Kligler Iron Agar KIA Potato Dextrose Agar PDA Trypticase Soya Aga TSA Giờ h Đường kính vòng vô khuẩn D Đường kính khuẩn lạc d Đường kính lỗ giếng d’ Sinh viên: Trần Thị Hồng Nhung - Lớp 1202 v MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Nước ta nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, điều kiện thuận lợi cho nấm mốc phát triển Các nông sản dạng hạt ngô, lạc, vừng…là nguồn chất lí tưởng cho phát triển nấm mốc Nấm mốc phát triển, việc gây tổn thất mặt số lượng chất lượng, sản sinh độc tố đặc biệt nguy hiểm với sức khỏe người động vật kinh tế Độc tố aflatoxin độc tố nguy hiểm nghiên cứu sớm nhất, chúng thường nhiễm nông sản, gây độc cho người gia súc, gây tác dụng cấp tính, gây tổn thương gan (ung thư gan), gây quái thai, gây đột biến, chí với liều lượng cao dẫn tới tử vong Đặc biệt ăn thức ăn gia súc nhiễm aflatoxin, vật nuôi không chịu tác dụng độc trực tiếp mà mang aflatoxin vào sữa, thịt tạo nhiễm aflatoxin vào cho người Ngày nay, người ta công nhận có loại nấm sản xuất độc tố aflatoxin Đó là, A flavus, A Parasiticus, A nomius A pseudotamarii (Ito cộng sự, 2001; Kurtzman cộng sự, 1987; Payne, 1998) Tuy nhiên, có A flavus A Parasiticus gây thiệt hại kinh tế Trên giới nay, việc nghiên cứu để tìm biện pháp làm giảm lượng aflatoxin lương thực, thực phẩm nhà khoa học quan tâm Ở nước ta từ năm 1970, Nguyễn Phùng Tiến cộng nghiên cứu mức nhiễm nấm mốc thóc kho bảo quản lương thực miền bắc Việt Nam số loại lương thực khác đậu, đỗ, lạc, vừng… Đậu Ngọc Hào nghiên cứu ảnh hưởng thức ăn nhiễm nấm mốc độc tố vật nuôi gà công nghiệp đầu năm 1990… Nghiên cứu 648 mẫu nguyên liệu làm thức ăn gia súc Đậu Ngọc Hào cho thấy, tỷ lệ nhiễm loại nấm mốc hạt ngô 76.9 %, bột ngô 83.3%; sắn lát 62%; khô lạc 54.3%; cám gạo 75% [ 2] Nguyễn Thùy Châu cộng nghiên cứu thấy mức độ nhiễm aflatoxin ngô miền Nam miền Bắc Việt Sinh viên: Trần Thị Hồng Nhung - Lớp 1202 Nam từ 73.3% - 95.8% hàm lượng aflatoxin cao 63.8ppb hàm lượng aflatoxin trung bình thấp 16.25% ppb tỉnh khác nhau[10] Các nghiên cứu cho thấy mức độ nhiễm nấm mốc Aspergillus flavus lương thực, thực phẩm thức ăn chăn nuôi nước ta tương đối cao Điều ảnh hưởng lớn đến chất lượng thức ăn, thực phẩm mà gây hại cho sức khỏe người động vật sử dụng Một số công trình Đậu Ngọc Hào nhiễm nấm mốc aflatoxin thức ăn gia súc biện pháp khử độc tố aflatoxin NH4OH nghiên cứu công bố [4] Nguyễn Thùy Châu cộng [11] nghiên cứu khử ngô NH3 Ca(OH)2, kết cho thấy tác dụng khử aflatoxin hai hóa chất rõ rệt hiệu cao Tuy nhiên, việc khử nhiễm aflatoxin hóa chất NH3 có giá thành cao để lại mùi khó chịu cho nông sản bị xử lý Để khắc phục nhược điểm này, năm qua, nhiều công trình nghiên cứu khử nhiễm aflatoxin biện pháp sinh học nhiều nhà khoa học tập trung nghiên cứu thu số kết hứa hẹn Để góp phần vào việc nghiên cứu khử nhiễm aflatoxin biện pháp sinh học, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập, tuyển chọn chủng Bacillus subtilis có khả ức chế nấm mốc Aspergillus flavus” Mục tiêu đề tài Phân lập, tìm chủng vi khuẩn có khả ức chế nấm mốc ứng dụng bảo quản nguyên liệu, thức ăn gia súc, thành phẩm Nội dung nghiên cứu - Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất - Khảo sát khả ức chế nấm mốcApergillus flavus chủng vi khuẩn phân lập - Đánh giá khả tổng hợp yếu tố ức chế nấm mốc chủng tuyển chọn Sinh viên: Trần Thị Hồng Nhung - Lớp 1202 PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương chung nấm Apergillus flavus Aspergillus flavus có mặt khắp mặt khắp nơi trái đất: đất, chất hữu loại hạt có dầu Chúng xếp vào hệ nấm mốc đồng, đặc điểm hệ loài nấm xâm nhiễm hạt lương thực trước thu hoạch, thực vật phát triển đồng hay hạt thu hoạch trước đập hạt Điều kiện độ ẩm cao điều kiện tối cần thiết cho hệ nấm mốc đồng phát triển, hệ nấm mốc sinh sống thời gian dài hạt khô chết tương đối nhanh hạt có độ ẩm trạng thái cân với độ ẩm không khí Do bảo quản nông sản cần điều chỉnh nhiệt độ, hàm ẩm, thời gian bảo quản hợp lý hạn chế hoàn toàn nấm đồng nhiễm hạt lương thực hạt giống Từ lâu người ta phát có mặt đất, dù rừng, vùng than bùn, vùng đất hoang, sa mạc Sahara đất cày cấy: đất bùn, vùng hệ rễ cà chua hệ rẽ lúa mì… người ta phát thấy nhanh chóng xâm nhập lại đất khử trùng nước Đất đai vùng nhiệt đới chứa nhiều loài so với đất đai vùng ôn đới Nó thường có lúa mì chế phẩm bột, bột sống bánh mì,ngô gạo sản phẩm từ ngô, gạo Nó có nhiều sợi hạt khô hạt bông, xâm nhập vào hạt qua điểm tiếp hợp qua vết bị côn trùng cắn Ngoài ra, người ta thấy hạt khô đậu tương, cùi dừa , sắn , nhân hạt cacao, cà phê… có thức ăn gia súc tổng hợp, thành phần khô lạc Trong phomat bị loài mốc khác ức chế, phomat bị lây nhiễm phương pháp nhân tạo [2] Nếu có điều kiện thuận lợi, sinh Sinh viên: Trần Thị Hồng Nhung - Lớp 1202 Hình 3.1: Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilisquan sát kính hiển vi Theo quan sát hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis kính hiển vi, ta thấy đặc điểm hình thái chúng trực khuẩn gram (+), đứng riêng lẻ thành chuỗi dài Hình 3.2 Kết thử catalase Tiến hành thử khả sinh enzyme catalase, ta thu kết sau: chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập từ đất có tượng sủi bọt khí vi khuẩn có enzyme catalase thủy phân hydrogen peroxide (H2O2) thành H2O O2 Sinh viên: Trần Thị Hồng Nhung - Lớp 1202 35 Hình 3.3 Kết thử thủy phân casein, tinh bột, gelatin Tiến hành thử khả thủy phân casein, tinh bột, gelatin ta thu kết sau: chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập từ đất tạo vòng xung quanh khuẩn lạc Hình 3.4: Kết phản ứng KIA Tiến hành thử khả sử dụng loại đường môi trường KIA, ta thu kết là: có tượng phần sâu thạch màu vàng phần mặt thạch nghiêng có màu đỏ, màu đen đáy ống Điều đó, chứng tỏ chúng sử dụng đường glucose không sử dụng đường lactose, không sinh H2S Sinh viên: Trần Thị Hồng Nhung - Lớp 1202 36 Hình 3.5: Kết thử Indole Tiến hành thử khả sinh Indol, ta thu kết sau: chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập từ đất tượng xuất lớp màu hồng bề mặt môi trường Do vi khuẩn enzyme Tryptophanase oxi hóa tryptophan tạo thành sản phẩm chứa gốc Indol 3.2 Khả ức chế nấm mốc Aspergillus flavus chủng vi khuẩn Bacillus subtilis môi trường thạch Nhiều công trình nghiên cứu tác Claude Morro(1970), Cotty Pitter(1992), Norio Kimura(1990) cho thấy loài vi khuẩn Bacillus subtilis có khả ức chế độc tố nấm mốc Dựa sở đó, tiến hành xác định hoạt tính vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập Việt Nam Bằng phương pháp nuôi cấy môi trường đặc hiệu quan sát khả tạo vòng ức chế nấm mốc môi trường dinh dưỡng, thu kết tổng hợp bảng sau: Sinh viên: Trần Thị Hồng Nhung - Lớp 1202 37 Bảng 3.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus subtiliscó khả ức chế nấm mốc Aspergillus flavus STT Tên chủng Nguồn gốc phân lập Kích thước vòng ức chế* M1 Đất 1.20 M2 Đất 1.15 Đ8.3 Đất 1.40 Đ1.3 Đất 1.00 Đ10.3 Đất 0.00 Đ11.3 Đất Giá trị trung bình (D-d), đơn vị tính centimet 0.00 Từ chủng vi khuẩn phân lập thu chủng Bacillus subtilis có khả ức chế nấm mốc Aspergillus flavus (M1, M2, Đ8.3, Đ1.3) chủng khả (Đ10.3, Đ11.3), chủng vi khuẩn Đ8.3 có khả ức chế nấm mốc mạnh (kích thước vòng ức chế 1,40cm), chủng vi khuẩn Đ1.3 có khả ức chế với nấm Aspergillus flavus yếu (kích thước vòng ức chế 1,00cm) (hình 3.6) Hình 3.6 Hình ảnh ức chế nấm mốc chủng M1 Đ8.3 Với kết này, lựa chọn 02 chủng vi khuẩn M1, Đ8.3 để tiến hành thí nghiệm Sinh viên: Trần Thị Hồng Nhung - Lớp 1202 38 3.3 Yếu tố gây ức chế nấm mốc Aspergillus flavus chủng vi khuẩn Bacillus subtilis Kết phân lập tuyển chọn vi khuẩn cho thấy khả ức chế nấm mốc chủng tốt ổn định Tuy nhiên, quan tâm tới thành phần vi khuẩn có hoạt tính Bằng thí nghiệm với mẫu: canh khuẩn, dịch chiết canh khuẩn thu kết bảng 3.3 Bàng 3.3 Kết xác định yếu tố ức chế nấm mốc 2chủng vi khuẩn Bacillus subtilis M1 Đ8.3 STT Chủng vi khuẩn M1 Đ8.3 Yếu tố ức chế Dịch phá vỡ tế bào Kích thước vòng ức Dịch chiết canh khuẩn Không chế 2cm Kích thước vòng ức Không chế 4cm Kết bảng 3.3 cho thấy mẫu dịch chiết canh khuẩn sau xử lý với kháng sinh ly tâm để loại bỏ tế bào vi khuẩn khả gây ức chế phát triển nấm mốc Aspergillus flavus Điều chứng tỏ yếu tố gây ức chế phát triển nấm mốc Aspergillus flavuskhông phải enzyme ngoại bào yếu tố ngoại bào khác Mẫu canh khuẩn sau ly tâm thu cặn phá vỡ tế bào phương pháp sonicate quan sát thấy có dấu hiệu ức chế nấm mốc Aspergillus flavus kích thước vòng ức chế chủng M1: 2cm, Đ8.3: 4cm Theo nghiên cứu Lý Kim Hữu (2005) yếu tố ức chế phần lớn iturin Đầu tiên vi khuẩn Bacillus subtilis tạo thành khối xung quanh tác nhân gây bệnh ngăn chặn không cho chúng bám vào vật chủ để gây bệnh Sau đó, Bacillus subtilis tiết hỗn hợp gồm nhiều lipopeptid (được gọi serenade) Sinh viên: Trần Thị Hồng Nhung - Lớp 1202 39 để làm thủng vách tế bào màng tế bào chất tác nhân gây bệnh ngăn chặn phát triển chúng Với sở với kết thu bảng 3.3 cho hai chủng vi khuẩn M1, Đ8.3 có chứa yếu tố gây ức chế nấm mốc Aspergillus flavus enzyme nội bào A B C Hình 3.7 Hình ảnh thí nghiệm xác định yếu tố ức ức chế nấm mốc vi khuẩn tuyển chọn A: Đối chứng nấm B: Dịch phá vỡ tế bào C: Dịch chiết canh khuẩn Vấn đề đặt chủng vi khuẩn Bacillus subtilis tuyển chọn sản sinh enzym nội bào có hoạt tính ức chế nấm mốc điều kiện sản sinh yếu tố nào? mối tương quan trình sinh trưởng vi khuẩn với hàm lượng enzym sao? tiếp tục tiến hành thí nghiệm để xác định điều kiện thích hợp cho vi khuẩn sản sinh yếu tố ức chế 3.4 Điều kiện nuôi cấy thích hợp để chủng Bacillus subtilis tuyển chọn sản sinh yếu tố gây ức chế nấm mốc Theo kết nghiên cứu Ohno, A Ano T.Shoda, Bacillus subtilis phân lập mẫu đất phát triển tốt 30oC Đây sở giúp thiết lập điều kiện nuôi cấy thích hợp chủng M1 Đ8.3 để thu hiệu ức Sinh viên: Trần Thị Hồng Nhung - Lớp 1202 40 chế nấm mốc cao Trong nghiên cứu này, khảo sát yếu tố pH thời gian 3.4.1 Thời gian Điều kiện thời gian thích hợp hiểu thời gian tăng sinh vi khuẩn để thu nhiều yếu tố ức chế Chúng tiến hành khảo sát thông số mốc thời gian: 24h, 48h, 72h Kết thí nghiệm thể biểu đồ 24h 48h kích thước vòng ức chế (cm) 18 16 14 12 10 mật độ vi khuẩn (107/ml) kích thước vòng ức chế (cm) 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 3.5 2.5 1.5 0.5 72h Thời gian tăng sinh vi khuẩn(h) 18 16 14 12 10 24h 48h mật độ vi khuẩn(107/ml) Vi khuẩn Đ8.3 Vi khuẩn M1 72h Thời gian tăng sinh vi khuẩn(h) Biểu đồ Ảnh hưởng thời gian tăng sinh tới khả ức chế nấm mốc chủngvi khuẩn B.subtilis (Chú thích: biểu đồ, cột biểu diễn kích thước vòng ức chế, đường biểu diễn mật độ vi khuẩn sau tăng sinh) Từ biểu đồ ta thấy: Yếu tố ức chế nấm mốc mạnh tách từ mẫu tăng sinh vi khuẩn sau 48 giờ, đó, yếu tố tách từ chủng Đ8.3 ( vòng ức chế 3cm) có khả ức chế nấm mốc trội so với chủng M1( vòng ức chế 0,8cm) Từ kết đánh giá ngưỡng 48h thời gian thích hợp để thu tối đa protein nội bào gây ức chế nấm mốc Aspergillus flavus chủng vi khuẩn Sau 72 nuôi cấy, chủng vi khuẩn, khả ức chế nấm mốc protein giảm Sinh viên: Trần Thị Hồng Nhung - Lớp 1202 41 Mật độ vi khuẩn khả ức chế nấm mốc có tương quan thuận với nhau, cụ thể: đến 48 sau nuôi cấy, mật độ vi khuẩn đạt ngưỡng tối đa, đồng thời vòng ức chế nấm mốc protein tách chiết có kích thước lớn Tuy nhiên, đến thời điểm 72 sau nuôi cấy, mối tương quan thay đổi: mật độ vi khuẩn tăng kích thước vòng ức chế nấm mốc lại giảm.Nguyên nhân tượng sau 72h nuôi cấy trình tổng hợp yếu tố gây ức chế trình sản sinh protease, enzyme phân cắt liên kết peptit, làm giảm hàm lượng protein Vì vậy, hiệu ức chế nấm mốc A.flavus chủng vi khuẩn B.subtilis giảm theo Hình 3.8 Ảnh hưởng thời gian tăng sinh tới khả ức chế nấm mốc chủng vi khuẩn M1 Đ8.3 3.4.2 pH Điều kiện pH thích hợp hiểu giá trị pH môi trường tăng sinh để vi khuẩn Bacilllus subtilis sản sinh nhiều yếu tố ức chế nhất, tức để khả ức chế phát triển nấm mốc Aspergillus flavus vi khuẩn cao Chúng tiến hành khảo sát ngưỡng pH: 6,7 Kết thí nghiệm thể biểu đồ Sinh viên: Trần Thị Hồng Nhung - Lớp 1202 42 1.6 14 1.4 12 10 1.5 0.5 0 Kích thước vòng ức chế (cm) 16 Mật độ vi khuẩn (107/ml) Kích thước vòng ức chế (cm) 2.5 Vi khuẩn M1 18 16 14 12 10 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 pH môi trường Mật độ vi khuẩn (107/ml) Vi khuẩn Đ8.3 pH môi trường Biểu đồ Ảnh hưởng pH môi trường tăng sinh vi khuẩn đến khả ức chế nấm mốc chủng vi khuẩn B.subtilis (Chú thích: biểu đồ, cột biểu diễn kích thước vòng ức chế, đường biểu diễn mật độ vi khuẩn sau tăng sinh) Khi môi trường ban đầu trung tính (pH=7), kích thước vòng ức chế lớn hai chủng vi khuẩn M1 Đ8.3 1,4 cm mm theo thứ tự Khi môi trường ban đầu có tính axit (pH=6), kích thước vòng ức chế thấp hai chủng M1, Đ8.3 1,1 cm 1,4 cm theo thứ tự Khi môi trường ban đầu có tính kiềm (pH = 9), kích thước vòng ức chế thu hai chủng M1, Đ8.3 1,2 cm 1,6 cm theo thứ tự Mức nhỏ so với ngưỡng pH trung tính Như đánh giá mức pH thích hợp để tăng sinh vi khuẩn ngưỡng pH trung tính (pH=7) Kết phù hợp với kết nghiên cứu Ohno, A Ano T.Shoda công bố pH thích hợp cho B.Subtilis tạo sản lượng inturinA cao lớn 6,5 nhỏ 7,5 (dải pH trung tính) Sinh viên: Trần Thị Hồng Nhung - Lớp 1202 43 Hình 3.9 Ảnh hưởng pH môi trường tăng sinh tới khả ức chế nấm mốc chủng vi khuẩn M1 Đ8.3 3.5 Kết đánh giá khả ức chế nấm mốc vi khuẩn tuyển chọn chất cám ngô Mục đích việc phân lập tuyển chọn chủng Bacillus subtilis có khả ức chế nấm mốc để phục vụ bảo quản nông sản, thức ăn chăn nuôi Trong điều kiện thời gian cho phép chúng tôitiến hành thử khả đối kháng chủng vi khuẩn tuyển chọn cám ngô thu kết bảng sau: Bảng 3.4 Kết đánh giá khả ức chế nấm mốc cám ngô STT Lô thí nghiệm Kết Đối chứng nấm Nấm phát triển bình thường, xuất bào tử sau ngày Canh khuẩn( mật độ 7x105) + nấm Nấm phát triển sau ngày Canh khuẩn( mật độ 7x106) + nấm Nấm phát triển sau 10 ngày Canh khuẩn( mật độ 7x107) + nấm Nấm không phát triển hệ sợi bào tử sau 15 ngày Canh khuẩn( mật độ 7x108) + nấm Nấm không phát triển hệ sợi bào tử sau 17 ngày Canh khuẩn( mật độ 7x109) + nấm Nấm không phát triển hệ sợi bào tử sau 20 ngày Đối chứng âm Không có nấm mốc phát triển Sinh viên: Trần Thị Hồng Nhung - Lớp 1202 44 Hình 3.10 Đánh giá khả ức chế nấm mốc cám ngô chủng Đ8.3 Kết cho thấy, lô thí nghiệm: mẫu canh khuẩn + nấm (lô 4,5.6) cho kết tương tự lô đối chứng âm (lô 7) Điều có nghĩa là, mật độ vi khuẩn Bacillus subtilis cao khả ức chế nấm mốc mạnh Tuy nhiên cho mật độ 1,4/102 phù hợp thời điểm đạt mật độ mẫu canh khuẩn không bị tạp nhiễm nhiều sản phẩm trình trao đổi chất Một yếu tố thiếu trình bảo quản nông sản độ ẩm không khí nhiệt độ Để hạn chế nấm mốc xâm nhập phải bảo quản nông sản điều kiện khô độ ẩm < 13% Như bước đầu kết luận hiệu ức chế nấm mốc dịch nuôi cấy vi khuẩn chất thực tế (cám ngô) tốt phù hợp với đánh giá môi trường nuôi cấy (môi trường PDA) Điều mở triển vọng ứng dụng tốt nghiên cứu thực tế Sinh viên: Trần Thị Hồng Nhung - Lớp 1202 45 PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận - Tuyển chọn 4/12 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả ức chế nấm mốc Aspergillus flavus Trong đó, 02 chủng vi khuẩn có khả ức chế nấm mốc mạnh có kí hiệu Bacillus subtilis M1 Đ8.3, có kích thước vòng ức chế tương ứng là: 1,20cm; 1,40cm - Xác định yếu tố ức chế nấm mốc Aspergillus flavus vi khuẩn Bacillus subtilislà yếu tố nội bào - Xác định điều kiện tăng sinh thích hợp để vi khuẩn Bacillus subtilis sản sinh yếu tố ức chế nấm mốc Aspergillus flavus pH thời gian 48 - Xác định mẫu dịch nuôi cấy chủng Bacillus subtilis M1 Đ8.3có khả ức chế phát triển nấm mốc Aspergillus flavus chất cám ngô Đề nghị - Đánh giá tính an toàn chủng Bacillus subtilis để sử dụng bảo quản loại nông sản thức ăn chăn nuôi - Nghiên cứu giải pháp nhằm tăng cường yếu tố ức chế nấm mốc Aspergillus flavus Sinh viên: Trần Thị Hồng Nhung - Lớp 1202 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Bùi Xuân Đồng, 2004,Nguyên lý phòng chống nấm mốc mycotoxin, NXB khoa học kỹ thuật Đậu Ngọc Hào (1997),Thức ăn bị nhiễm nấm mốc độc tố nấm mốc, ảnh hưởng chăn nuôi biện pháp phòng chống Đậu Ngọc Hào(1992) ,Thức ăn nhiễm nấm mốc độc tố aflatoxin chúng gà công nghiệp, Tạp chí nông nghiệp công nghệ thực phẩm số 9/ Đậu Ngọc Hào(1993),Sử dụng hợp chất amin NaHSO3 làm giảm hoạt tính aflatoxin B1 ngô hạt dầu lạc bị nhiễm nấm mốc, Kết nghiên cứu khoa học chăn nuôi thú y Đậu Ngọc Hào, Lê Thị Ngọc Diệp( 2003),Nấm mốc độc tố aflatoxin thức ăn chăn nuôi, NXB nông nghiệp Độc tố nấm mốc aflatoxin B1 số loại thức ăn gia súc thực phẩm cho người, Báo Người Lao Động 9/1/2002 Dương Thanh Liêm, Bùi Huy Như Phúc, Dương Duy Đồng( 2002),Thức ăn dinh dưỡng động vật, NXB nông nghiệp Lê Anh Phụng( 2001),Nấm mốc sinh độc tố ảnh hưởng độc tố nấm mốc động vật Hướng khắc phục độc tố nấm mốc, Chuyên đề cấp tiến sĩ Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh Lý Kim Hữu( 2005),Khảo sát đặc điểm vi khuẩn Bacillus subtilis tìm hiểu điều kiện nuôi cấy thích hợp sản xuất thử nghiệm chế phẩm propiotic, Luận văn tốt nghiệp Khoa Chăn Nuôi-Thú Y Trường Đại học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh 10 Nguyễn Thùy Châu cộng (1995),Mức độ nhiễm aflatoxin ngô số tỉnh Việt Nam Sử dụng kỹ thuật công nghệ sinh học để bảo quản chế biến nông sản thu hoạch, NXB Nông nghiệp Sinh viên: Trần Thị Hồng Nhung - Lớp 1202 47 11 Nguyễn Thùy Châu cộng (1997),Nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc aflatoxin ngô- Biện pháp khử độc tố, Kết nghiên cứu khoa học nông nghiệp 1994 – 1995, NXB Nông nghiệp phát triển nông thôn 12 Tiêu chuẩn Việt Nam 5617 – 1991, Phương pháp xác định aflatoxin ngũ cốc Tài liệu tiếng anh 13 Bergey’s manual of Systematic Bacteriology, 2nd ed., vol.1(the Archaea and the deeply branching and phototrophic Bacteria) (D.R Boone and R.W Castenholz,eds.), Springer- Verlag, New York (2001),Pp.465 – 466 14 Claude Morean- nấm mốc độc thực phẩm, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, Hà nội, 1980 15 Coker_R – the destruction of aflatoxin using ammonia and other chemicals International IFF – Symposium unerwonschte stoffein Futtermitteln Braunchweing – thune.1990,pp 65- 66 16 Dawson, R.J ( 1991), A Global view of the mycotoxin Problem Fungi and mycotoxin, in stored products ACIAR Proceedings N 36 1991.[28uk] 17 Goto, T,Kawasugi S,Tsuzuta, Okazaki H, Siriach P, Buangsawon D, and Manabe M (1986), Aflatoxin contamination of maize in Thailand Aflatoxin contamination of maize harvested in the raining seasons of 1984 and 1985,z Proc Jpn Assoc Mycotoxincol, 24, pp.53 18 Nelson, P.E, Fennell, D.I, Kwoler, V.E (1996),A.flavus and aflatoxin in corn before harvest Science.193,pp.495- 496 19 Wogan.G.N (1973),Aflatoxin carcinogenisis New York, Academic pres,pp.309-304(1997) Sinh viên: Trần Thị Hồng Nhung - Lớp 1202 48 20 World Health Organigation (1997,Mycotoxin, Published under the joint sponrship of United Nations Environment Programme and World health organigation Tài liệu mạng 21 https://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus_subtilis 22 http://doc.edu.vn/tai-lieu/khoa-luan-nghien-cuu-cong-nghe-khunghiem-aflatoxin-tren-ngo-lac-o-muc-do-cao-bang-mot-so-chung-vikhuan-va-vi-nam-76035/ Sinh viên: Trần Thị Hồng Nhung - Lớp 1202 49