Nghiên cứu và phát triển chế phẩm vi khuẩn lactic có khả năng ức chế vi sinh vật độc hại và ứng dụng trong lên men rau quả

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI ********* CAO THỊ BÍCH NGỌC NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CHẾ PHẨM VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ VI SINH VẬT ĐỘC HẠI VÀ ỨNG DỤNG TRONG LÊN MEN RAU QUẢ LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC HÀ NỘI - 2009 MỤC LỤC MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 VI KHUẨN LACTIC 1.1.1 Đặc điểm hình thái 1.1.2 Đặc điểm sinh lý sinh hóa .7 1.1.3 Phân loại vi khuẩn lactic 10 1.2 LÊN MEN LACTIC 12 1.2.1 Lên men đồng hình (Homofermentation) 12 1.2.2 Lên men dị hình (Heterofermentation) 13 1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men lactic 15 1.2.4 Quá trình tạo sinh khối yếu tố ảnh hưởng đến trình tạo sinh khối 18 1.3 KHẢ NĂNG ỨC CHẾ VI SINH VẬT ĐỘC HẠI CỦA VI KHUẨN LACTIC 21 1.3.1 Cơ chế ức chế vi sinh vật độc hại vi khuẩn lactic 21 1.3.2 Các sản phẩm phụ lên men lactic có khả ức chế vi sinh vật độc hại 21 1.4 CHẾ PHẨM VI KHUẨN LACTIC 24 1.4.1 Chất mang cho chế phẩm 25 1.4.2 Các phương pháp sấy 27 1.5 ỨNG DỤNG CỦA VI KHUẨN LACTIC 30 1.5.1 Ứng dụng vi khuẩn lactic dùng làm chủng giống khởi động bảo quản chế biến thực phẩm 30 1.5.2 Ứng dụng vi khuẩn lactic bảo quản chế biến thức ăn chăn nuôi 30 1.5.3 Ứng dụng vi khuẩn lactic sản xuất loại đồ uống lên men 31 1.5.4 Ứng dụng vi khuẩn lactic sản xuất chế phẩm probiotic để tăng cường sức khỏe vật nuôi cải thiện môi trường 32 1.5.5 Ứng dụng vi khuẩn lactic muối chua rau, củ, 33 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .37 2.1 VẬT LIỆU VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 37 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 37 2.1.2 Hóa chất thiết bị dùng cho nghiên cứu .37 2.1.3 Môi trường nuôi cấy (xem phụ lục) .38 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .38 2.2.1 Phân lập giữ giống vi khuẩn lactic .38 2.2.2 Một số đặc điểm hình thái 39 2.2.3 Một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa .40 2.2.4 Xác định vi sinh vật độc hại 43 2.2.5 Phân loại vi khuẩn lactic 45 2.2.6 Tạo chế phẩm vi khuẩn lactic 47 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .50 3.1 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN LACTIC THUẦN KHIẾT ĐỂ KHỞI ĐỘNG QUÁ TRÌNH LÊN MEN LACTIC TRÊN RAU QUẢ 50 3.1.1 Phân lập chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin có khả ức chế phát triển Lactobacillus sp 50 3.1.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả kháng khuẩn, chịu nhiệt, chịu axit, chịu NaCl .51 3.1.3 Khả ức chế vi sinh vật gây bệnh chủng CM3 CM22 52 3.1.4 Định tên chủng vi khuẩn lactic CM3 55 3.2 XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY THÍCH HỢP CHO QUÁ TRÌNH TẠO SINH KHỐI CỦA CHỦNG L.PLANTARUM CM3 61 3.2.1 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy tới khả phát triển chủng Lactobacillus plantarum CM3 .61 3.2.2 Ảnh hưởng pH ban đầu tới phát triển chủng L.plantarum CM3 62 3.2.3 Động thái trình lên men lactic chủng L.plantarum CM3 .64 3.2.4 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến khả phát triển chủng L.plantarum CM3 66 3.3 NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM VI KHUẨN L.PLANTARUM CM3 68 3.3.1 Ảnh hưởng chất mang tỷ lệ chất mang 68 3.3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ sấy 71 3.3.3 Ảnh hưởng thời gian sấy .72 3.4 ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM TRONG MUỐI CHUA CÀ PHÁO 73 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 76 TÀI LIỆU THAM KHẢO 78 MỞ ĐẦU Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, thiên nhiên ưu đãi nên rau trồng quanh năm, chủng loại rau đa dạng Hàng năm rau sản xuất với số lượng lớn nên có ý nghĩa quan trọng tăng trưởng kinh tế phát triển công nghiệp chế biến, bảo quản thực phẩm Tuy nhiên, việc tiêu thụ rau Việt Nam gặp nhiều khó khăn, giá bấp bênh gây thiệt hại cho nhà nông Do đó, tìm hướng tiêu thụ sản phẩm rau mùa vụ điều cần thiết, phương pháp bảo quản rau cách muối chua phương pháp chế biến cổ truyền nước ta số nước phổ biến giới Việc muối chua rau vừa xem phương pháp chế biến vừa phương pháp bảo quản tác dụng axit lactic tạo trình lên men muối bổ sung vào trình muối Ngoài ra, axit lactic sản phẩm khác tạo trình muối tạo cho sản phẩm có hương vị đặc trưng trạng thái dòn hấp dẫn Các sản phẩm rau muối sử dụng sử dụng làm bán thành phẩm cho trình chế biến khác đóng hộp Nhưng cho dù sử dụng với mục đích sản phẩm rau muối chua cần phải đạt yêu cầu chất lượng định Nhưng với đặc tính rau loại nguyên liệu dễ bị tổn thương hư hỏng tác động bên nhiệt độ, ánh sáng yếu tố tác động trình muối chua đặc biệt nhiễm tạp vi sinh vật gây hư hỏng từ nguyên liệu, môi trường công đoạn chế biến Trong đó, sản phẩm rau muối chua nước ta chủ yếu sản xuất mức độ thủ công, lên men tự nhiên bắt đầu sản xuất công nghiệp qui mô nhỏ Do khả nhiễm tạp cao, chất lượng không đảm bảo, ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng Hơn nước ta chế phẩm vi khuẩn lactic chủng ứng dụng công nghiệp thực phẩm chủ yếu nhập ngoại để sản xuất sữa chua chủ yếu Chế phẩm lactic chủng cho sản xuất thực phẩm lên men truyền thống nói chung lên men rau nói riêng chưa có Vì việc nghiên cứu đưa chủng giống khởi động cho trình lên men lactic hoàn thiện chế phẩm lactic ứng dụng sản xuất rau lên men có khả hạn chế vi sinh vật gây ngộ độc, tạo khả công nghiệp hóa cho việc sản xuất rau lên men có ý nghĩa quan trọng Xuất phát từ lý nói trên, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phát triển chế phẩm vi khuẩn lactic có khả ức chế vi sinh vật độc hại ứng dụng lên men rau quả" Mục tiêu luận văn: - Tuyển chọn giống vi khuẩn lactic khiết có khả ức chế vi sinh vật có hại dùng làm chủng khởi động trình lên men lactic rau - Xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu trình tạo sinh khối chủng vi khuẩn lactic - Nghiên cứu lựa chọn chế độ sấy, chất bổ trợ thích hợp để tạo chế phẩm có hoạt tính cao kinh tế - Ứng dụng chế phẩm cho lên men rau CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 VI KHUẨN LACTIC Axit lactic người sử dụng từ lâu để bảo quản chế biến thực phẩm (như muối dưa cà, tôm chua, nem chua…) Axit lần đầu phát tách từ sữa bò lên men chua nhà hóa học người Thụy Điển Sheele năm 1780 Năm 1857 Louis Pasteur chứng minh việc làm chua sữa kết hoạt động số nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi vi khuấn lactic Năm 1878 Lister phân lập thành công vi khuẩn lactic đặt tên Bacterium lactic (hiện gọi Streptococcus lactic) [4] Từ đến nhiều loài vi khuẩn lactic khác phân lập nghiên cứu Vi khuẩn lactic xếp chung vào họ Lactobacillaeace Nhóm vi khuẩn không đồng mặt hình thái (gồm vi khuẩn hình que hình cầu), song mặt sinh lý chúng tương đối đồng Tất có đặc điểm chung vi khuẩn Gram (+), không tạo bào tử, không di động, chúng thu nhận lượng nhờ phân giải hydratcacbon sinh axit lactic, chúng vi khuẩn sống từ kỵ khí đến vi hiếu khí [4] 1.1.1 Đặc điểm hình thái Tùy theo hình dạng tế bào mà người ta chia vi khuẩn lactic thành dạng hình cầu hình que Dạng hình que thường ngắn kích thước 0,5 – 0,7µm, có sợi dài tới 8µm Chúng đứng riêng rẽ, kết đôi kết chuỗi Dạng hình cầu hay oval đường kính 0,5 – 1µm đứng riêng rẽ, kết đôi kết chuỗi có chiều dài khác Sự thay đổi hình dạng kích thước tế bào thường xảy trình sinh trưởng thay đổi tùy loài khác Tuy nhiên hình thái tế bào phụ thuộc vào môi trường điều kiện nuôi cấy 1.1.2 Đặc điểm sinh lý sinh hóa Nhu cầu dinh dưỡng vi khuẩn lactic khác khác nhau, đặc biệt nhu cầu vitamin nitơ Chẳng hạn, Lactobacillus coi nhóm vi khuẩn có nhu cầu dinh dưỡng cao nhất, chúng đòi hỏi không chất phức tạp chứa cacbon, nitơ, photphat lưu huỳnh mà có nhu cầu lớn yếu tố cần cho phát triển vitamin muối vô 1.1.2.1 Nhu cầu dinh dưỡng nitơ Hầu hết vi khuẩn lactic không tự tổng hợp hợp chất nitơ hữu phức tạp Tuy nhiên nitơ lại nguồn dinh dưỡng quan trọng, đảm bảo cho phát triển bình thường vi khuẩn lactic với vai trò: - Là thành phần protein, enzim, axit nucleic - Là chất cho nhận điện tử trình chuyển hóa Vì để đảm bảo cho phát triển tế bào chúng phải sử dụng nguồn nitơ có sẵn môi trường Chỉ có số loài vi khuẩn lactic có khả sinh tổng hợp chất nitơ hữu từ nguồn nitơ vô cơ, số trường hợp phát triển vài loài vi khuẩn lactic Lactobacillus helveticus bị kích thích có mặt muối amoni môi trường 1.1.2.2 Nhu cầu dinh dưỡng cacbon Nguồn lượng quan trọng cho vi khuẩn lactic monosaccarit disaccarit Các nguồn cacbon dùng để cung cấp lượng xây dựng cấu trúc tế bào sinh axit hữu axit malic, piruvic, fumaric, axetic…[14] Vi khuẩn lactic sử dụng nhiều loại hydratcacbon, từ đường đơn (glucoza, fructoza, manoza, galactoza ), đường đôi (saccaroza, lactoza, maltoza…) polysaccarit (tinh bột, dextrin) Tuy nhiên khả sử dụng nguồn thức ăn cacbon khác tùy thuộc vào loài Ví dụ: Lactobacillus debbrueckii sử dụng đường maltoza, glucoza, galactoza, saccaroza, dextrin mà không sử dụng lactoza; L.bulgaricus sử dụng glucoza, lactoza, không sử dụng maltoza saccaroza, số vi khuẩn lactic sử dụng dextrin tinh bột [14] Nguồn cacbon khác trình nuôi cấy có ảnh hưởng lớn đến khả chống chịu vi khuẩn lactic với trình xử lý sau Ví dụ tỉ lệ tế bào L.bulgaricus sống sót sau sấy đông khô phụ thuộc vào loại đường bổ sung trình nuôi cấy thu hồi chế phẩm, lên men từ đường manitol tỷ lệ tế bào chết nhiều hẳn so với lên men từ đường fructoza lactoza [24] 1.1.2.3 Nhu cầu vitamin Các vi khuẩn lactic, đặc biệt loài Lactobacillus, cần vitamin cho phát triển Thường phải bổ sung vào môi trường chất có chứa vitamin nước giá đỗ, nước khoai tây, nước chiết ngô… Các vitamin đóng vai trò coenzym trình trao đổi chất tế bào, vi khuẩn lactic có khả sinh tổng hợp vitamin [26] Nhu cầu vitamin B6 dạng tự dạng liên kết (pyridoxin, pyridoxan, pyridoxamin…) đặc biệt lớn loài Streptococcus Lactobacillus Các vitamin nhóm B kích thích phát triển vi khuẩn lactic [31] Rogosa cộng [41] axit nicotinic axit pantotenic cần thiết cho phát triển tất loài vi khuẩn lactic Trong vi khuẩn lactic lên men dị hình cần thiamin, axit folic axit paminobenzoic không ảnh hưởng đến phát triển loài Lactobacillus Người ta cho tế bào loài Lactobacillus leichmannii Lactobacillus delbruekii có chứa vitamin B12 hấp thụ từ môi trường với tỷ lệ khoảng 0,5µg/g chất khô Khi toàn lượng vitamin phát thấy thành tế bào liên kết chặt chẽ với chuỗi polypeptit Nhu cầu vitamin bị ảnh hưởng nhiều yếu tố nhiệt độ nuôi cấy, pH, lượng CO2 ban đầu oxy hóa khử môi trường, chẳng hạn thay đổi nhiệt độ khoảng – 4oC nhu cầu trao đổi riboflavin với môi trường bên Lactobacillus heboeticus thay đổi khoảng 25% Nhu cầu vitamin ảnh hưởng thành phần môi trường 1.1.2.4 Nhu cầu muối vô Để đảm bảo cho sinh trưởng phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic cần nhiều hợp chất vô sắt, đồng, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, mangan, magie… đặc biệt mangan Chính mangan ngăn cản trình tự phân tế bào cần thiết cho trình sống bình thường vi khuẩn Đối với Lactobacillus Mn2+, Mg2+, Fe2+ có tác động tích cực lên phát triển sản sinh axit lactic [30] Chẳng hạn Mg2+ chất hoạt động trình lên men lactic chúng giúp vi khuẩn lactic sử dụng tốt loại đường Phức hợp chất khoáng có tác dụng làm giảm độ axit môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic 1.1.2.5 Nhu cầu số chất hữu khác Ngoài axit amin vitamin vi khuẩn lactic có nhu cầu lớn hợp chất hữu khác cho phát triển chúng Dưới số chất hữu ảnh hưởng đến phát triển kích thích phát triển vi khuẩn lactic [14] - Các bazơ nitơ: Adenin, Guamin, Thimin… - Axit hữu cơ: axit axetic nhiều axit hữu không bay khác - Axit amin: L-asparagin, L-glutamin… Axit xitric, xitrat, axetat, axit axetic có tác động quan trọng đến sinh trưởng tế bào Axetat dùng làm chất đệm cho môi trường nuôi cấy nhiều loài vi khuẩn lactic Xitrat ảnh hưởng tốt đến tốc độ sinh trưởng vi khuẩn lactic nên ngày người ta thường sử dụng xitrat làm thành phần môi trường để nuôi cấy, phân lập bảo quản chủng vi khuẩn lactic Một số axit hữu quan trọng có ảnh hưởng đến sinh trưởng hầu hết loài vi khuẩn lactic axit oleic (có thể thay axit linoleic axit linolenic) Đó 72 việc bảo quản chế phẩm Do định chọn inulin làm chất mang nhiệt độ sấy 40oC cho nghiên cứu 3.3.3 Ảnh hưởng thời gian sấy Ta biết thời gian sấy cao độ ẩm chế phẩm thu thấp, ngược lại tỉ lệ tế bào sống sót thấp Do tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng thời gian sấy đến khả sống sót tế bào vi khuẩn L plantarum Tỉ lệ (%) CM3 Kết trình bày đồ thị 3.8 50 45 40 35 30 25 20 15 10 Độ ẩm chế phẩm (%) Tỷ lệ sống sót (%) 1h 2h 3h 4h Thời gian sấy (giờ) Đồ thị 3.8: Ảnh hưởng thời gian sấy đến khả sống sót tế bào sau sấy Kết cho thấy sấy 3-4 tỉ lệ tế bào chết cao (70-80%) Tỉ lệ tế bào sống sót đạt cao (48.14%) sau sấy chế phẩm có nồng độ 6,13.109 CFU/g, nhiên với thời gian sấy tỉ lệ tế bào sống sót không thấp nhiều so với sấy (đạt 44.53% với nồng độ tế bào 5,6.109CFU/g)) mà độ ẩm chế phẩm lại giảm cách đáng kể (đạt 8.63%) Do định chọn thời gian sấy để tạo chế phẩm 73 3.4 ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM TRONG MUỐI CHUA CÀ PHÁO Kết nghiên cứu phần 3.1.3 cho thấy chủng vi khuẩn L.plantarum CM3 có khả ức chế vi sinh vật gây hại nên thử nghiệm lên men cà pháo với chế phẩm có (mẫu TN) so sánh với mẫu đối chứng (mẫu ĐC) lên men tự nhiên Chúng tiến hành muối chua cà pháo theo quy trình Viện Rau (theo sơ đồ 2) với tỉ lệ bổ sung chế phẩm 3% so với khối lượng nguyên liệu (tương đương 2.108 CFU/g nguyên liệu) Sau ngày lên men đem đánh giá mức độ nhiễm vi sinh vật tiêu cảm quan sản phẩm cà muối chua Kết trình bày bảng 3.14 3.15 Bảng 3.14: Mức độ nhiễm vi sinh vật sản phẩm cà pháo muối chua Mức độ nhiễm (CFU/g) VSV t.số Coliform E.coli C.perfringen B.cereus Men mốc Mẫu ĐC 1,6.106 3,0.103 0 5,6.104 Mẫu TN 4,7.104 5,1.10 0 5,0.102 Quy định (*) 1,0.104 10 10 1,0.102 1,0.102 Chú thích: (*) Quy định Bộ Y tế “Quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học hóa học thực phẩm” Số: 46/2007/QĐ-BYT mục Quy định giới hạn cho phép vi sinh vật sản phẩm rau muối rau khô Bảng 3.15: Các tiêu cảm quan sản phẩm cà pháo muối chua Các tiêu cảm quan Màu sắc Mùi, vị Trạng thái Nước muối chua Mẫu ĐC Vàng sáng Chua, thơm Dòn Có váng Mẫu TN Vàng đồng Chua, thơm Dòn Sánh, không váng 74 Kết bảng 3.14 3.15 cho thấy mẫu thí nghiệm có tiêu cảm quan tốt mẫu đối chứng màu vàng hơn, nước muối sánh váng, mức độ nhiễm vi sinh vật giảm xuống cách rõ rệt, phù hợp với bảng tiêu vi sinh vật sản phẩm rau muối (theo quy định Bộ Y tế “Quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học hóa học thực phẩm” Số: 46/2007/QĐ-BYT mục Quy định giới hạn cho phép vi sinh vật sản phẩm rau muối rau khô) Kết cho thấy hoàn toàn ứng dụng chế phẩm lên men rau Hình 3.10: Sản phẩm cà muối chua, mẫu ĐC (phải), mẫu TN (trái) 75 Cà pháo Phân loại, lựa chọn Tách cuống Giềng tỏi Rửa để Rửa Thái lát Lên men lactic Nước muối 10% Chế phẩm VK lactic (3% so xay nhỏ với nguyên liệu ≈ 2.108 Sản phẩm CFU/g nguyên liệu Sơ đồ 3.2: Quy trình muối chua cà pháo 76 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ I KẾT LUẬN Qua kết nghiên cứu thu rút số kết luận sau: Đã phân lập 52 chủng vi khuẩn lactic từ 25 mẫu cà pháo muối chua, thu chủng sinh bacteriocin có khả ưc chế phát triển Lactobacillus sp Trong chủng CM3 có khả ức chế vi sinh vật gây hại (E.coli, Salmonella, S.aureus, B.cereus) mạnh Đã xác đinh đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa chủng CM3 theo khóa phân loại Bergey kết hợp với xác trình tự mã hóa 16S rARN xác định chủng vi khuẩn lactic mang kí hiệu CM3 thuộc loài Lactobacillus plantarum (kí hiệu L.plantarum CM3) Điều kiện nuôi cấy thích hợp cho trình tạo sinh khối chủng L.plantarum CM3 là: nhiệt độ 30oC; pH ban đầu 6,0; thời gian lên men sau 24 đạt 2,04.109CFU/ml môi trường MRS Khi áp dụng quy mô sản xuất sử dụng môi trường nước chiết cà chua nước chiết giá đỗ thay cho môi trường MRS giá thành rẻ mà khả phát triển chủng tốt Nghiên cứu chế độ sấy chân không cho thấy với chất mang inulin tỉ lệ sinh khối: chất mang 1:3, nhiệt độ sấy 40oC, thời gian sấy cho chế phẩm có tỉ lệ tế bào sống sót cao (44,53%) với mật độ tế bào 5,6.109CFU/g Ứng dụng chủng L.plantarum CM3 vào muối chua cà pháo cho kết cảm quan tốt mà mức độ nhiễm vi sinh vật giảm xuống cách rõ rệt, phù hợp với quy định Bộ Y tế giới hạn cho phép vi sinh vật sản phẩm rau muối rau khô 77 II ĐỀ NGHỊ Cần nghiên cứu sấy chế phẩm với nguồn chất mang phương pháp sấy khác (sấy phun, sấy đông khô…) Cần nghiên cứu chế độ bảo quản chế phẩm (thời gian bảo quản, vật liệu bao gói, nhiệt độ bảo quản…) Cần ứng dụng chế phẩm nhiều loại rau khác 78 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Nguyễn La Anh, Đặng Thu Hương, Nguyễn Việt Anh, Lê Văn Bắc (2008), "Nghiên cứu đặc điểm bacterioxin sản xuất vi khuẩn lactic Lactobacillus plantarum NCDN4 ứng dụng làm giống khởi động nhằm nâng cao chất lượng sản phẩm lên men truyền thống”, Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ IVHóa sinh sinh học phân tử phục vụ nông, sinh, y học công nghệ thực phẩm, 260-263 Kiều Hữu Ảnh (1999), Giáo trình vi sinh vật học công nghiệp, Nhà xuất khoa học kĩ thuật Bộ NN& PTNT- Viện Công nghệ sau thu hoạch (2002), Kết nghiên cứu khoa học công nghệ sau thu hoạch năm 2001 Trung tâm Thông tin nông nghiệp PTNT, Hà nội Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2000), Vi sinh vật học, Nhà xuất Giáo dục, Hà nội Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật, tập 1, Nhà xuất KHKT, Hà nội Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Miên, Nguyễn Vĩnh Thước, Nguyễn Đình Quyến, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Văn Ty (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật, tập 2, Nhà xuất KHKT, Hà nội Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Lê Đình Lương, Đoàn Xuân Mượu, Phạm Văn Ty (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật, tập 3, Nhà xuất KHKT, Hà nội Nguyễn Lân Dũng (dịch từ tiếng Nga) (1983), Thực tập vi sinh vật học, Nhà xuất Đại học Trung học chuyên nghiệp Hà nội 79 Nguyễn Thị Hiền (chủ biên) (2004), Công nghệ sản xuất mì sản phẩm lên men cổ truyền, Nhà xuất khoa học kĩ thuật, Hà nội 10 Nguyễn Thị Minh Huế (2003) Nghiên cứu điều kiện tối ưu trình tạo sinh khối vi khuẩn lactic Đồ án tốt nghiệp Đại học Bách khoa Hà nội 11 Phạm Ngọc Lan, Trần Thị Thúy, Lê Thanh Bình (1999), “Đặc tính hóa phân loại chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin có phổ tác dụng rộng” Báo cáo khoa học hội nghị CNSH toàn quốc, Hà nội, trang 314-318 12 Lê Thanh Mai cộng (2007), Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà nội 13 Lương Đức Phẩm (2000), Vi sinh vật học an toàn vệ sinh thực phẩm, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà nội 14 Lương Đức Phẩm (2007), Các chế phẩm dùng chăn nuôi nuôi trồng thủy sản, Nhà xuất Nông nghiệp 15 Hoàng Minh Quân (2005), Nghiên cứu tìm điều kiện thích hợp cho trình sấy vi khuẩn L.acidophilus để tạo chế phẩm bổ sung vào môi trường nuôi cá Luận văn thạc sĩ Đại học Bách khoa Hà nội 16 Phan Thanh Tâm (2008 ), Nghiên cứu số giải pháp sinh học công nghệ sản xuất nem chua Luận án tiến sĩ Đại học Bách khoa Hà nội 17 TCVN 4326:2001 (ISO 6496:1999) Xác định độ ẩm hàm lượng chất bay khác 18 TCVN 4884:2005 (ISO 4833:2003) Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng vi sinh vật đĩa thạch - Kỹ thuật đếm khuẩn lạc 30oC 19 TCVN 4991:2005 (ISO 7937:2004) Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng Clostridium perfringers đĩa thạch - Kỹ thuật đếm khuẩn lạc 80 20 TCVN 4992:2005 Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng Bacillus cereus giả định đĩa thạch - Kỹ thuật đếm khuẩn lạc 30oC Tài liệu Tiếng Anh 21 Ana S Carvalho, Joana Silva, Peter Ho, Paula Teixeia, Xavier Malcata and Paul Gibbs, 2004, "Relevant factor for the preparation of freeze-died lactic acid bacteria", International Dairy Journal, 14 (10), 835-847 22 Axelsson L.T (1993), Lactic acid bacteria: Classification and physiology In: Salminen, S and Von Wright, A (Eds.), Lactic acid bacteria, Marcel Dekkers Inc., New York, pp.1-65 23 Brian C.S To and Mark R.Rtzel (1997), "Spray drying, freeze drying or freezing of three different lactic acid bacteria species", Journal of food science, volume 62, No 3, 24 Carr, Frank.J.; Chill, Don; Maida, Nino (2002), "The lactic acid bacteria: a literature survey", Critical review in microbiology, 28(4), pp.281-370 25 C Santivarangkna, U Kulozik and P Foerst, "Effect of carbonhydrates on the survival of Lactobacillus helveticus during vacuum drying", Letters in Applied Microbiology, Vol 42 (2006), Issue 3, pp.271-276 26 Ebenezer R Vedamuthu et al (1992) “Bacterriocin from Lactococcus lastic subspecies Lactis” patent 5, pp.173-279 27 Ennahar S., Sashihara T., Sonomoto K., Ishizaki A (2000), "Class IIa bacteriocins: biosynthesis, structure and acitivity", FEMS Microbiol Revs 24, 85, pp.86-102 28 Fédéric Leroy and Luc De Vuyst, 2004, "Lactic acid bacteria as functional starter cultures for the food fermentation industry", Trends in Food Science & Technology, (15), pp.67-78 81 29 Holzafel W.H and Schillinger U (1992), "The genus Leuconostoc" In: Balows A., Truper H.G., Dworkin M., Harder W., Schleifer K H (Eds.), The Prokakyotes, Vol.2, Springer Verlag, New York, pp.1508-1534 30 Hubalek Z (1996), Cryopreservation of microorganisms, Pargue, Czech Republic: Academia 31 Ik-Keun Yoo, Ho Nam Chang, Eun Gyo Lee, Yong Keun Chang, Seung Hyeon Moon (1996), "Effect of B vitamin supplementation on lactic acid production by Lactobacillus casei", J Ferment Bioeng, Vol.81 (3), pp.279-280 32 James G., Cappuccino, Natalie Sheraman (1986), Microbiology a laboratory manual, pp.311-313 33 Kalaenhammer T.R (1993), "Genetics of bacteriocins producted by lactic acid bacteria", FEMS Microbiol Rev, 12, pp.39-86 34 Laguerre, G., Rigottier, G and Lemanceau, P (1994) "Pluorescent Pseudomonas species categorized by using polymerase chain reaction (PCR)/ restriction frament analysis of 16S rDNA", Mol Ecol 3(5), pp.479-487 35 Ledesma O.V., Holgado A.P., Oliver G., Giori G.S., Raibaud P and Galdin J.V (1977), “A synthetic medium for coparative nutritional studies of Lactobacilli”, J.Appl.Bacteriol, 42,pp.123-133 36 Leonie J.M.Linders, Wim F.Wolkers, Folkert A Hoektra and Klaas van't Riet, "Effect of added carbohydrate on membrane phase behavior and survival of dried Lactobacillus plantarum", Crybiology 35, 31-40, 1997 37 Lyhs U (2002), Lactic acid bacteria associated with the spoilage of fish products Academic Dissertation Department of Food and Environmental Hygiene, Faculty of Veterinary Medicine, University of Helsinki, Helsinki, Finland 38 Mariae.C.Bruno and Thomas.J.Montville (1993), Common mechanistic action of bacteriocins from lactic acid bacteria Applied and environmental microbiology Vol 20, pp.129-138 82 39 Norman F Havard, S.A.Od., Cherl Holece, Dr.R.Quintero Ramirez (1990), “Fermented cereals”, Aglobal perpective, Food and Agriculture Organization of the United nation, Rome, pp.508-512 40 Peter A Vandenbergh (1993), Lactic acid bacteria, their metabolic products and interference with microbial growth, Fermentation microbiology review 12, pp.256-296 41 Rogosa M., Franklin J.G and Perry K D (1961), "Correletion of vitamins requirements with cultural and biochemical characters of Lactobacillus ssp", J.Gen.Microbiol., 25, pp.473-482 42 Sharpe M.E (1997), “Indentification of the lactic acid bacteria, In: Skinner, F.A and Lovelock, D.W (Eds.), Indentification methods for microbiologists”, Soc Appl Bacteriol Technical., 14, Academic Press, London, pp.246-255 43 Thomas L., T.Brock, Michacel, E Madigan (1984), “Biology of microorganism”, Prentice Hall International Inc, pp 358-390 83 PHỤ LỤC 1.Môi trường MRS (g/l) Pepton 10g; cao thịt 10g; cao men 5g; glucoza 20g; Tween 801ml; K2HPO4 2g; CH3COONa 5g; MnSO4.4H2O 0,06g; MgSO4 7H2O 0,1g; agar 20g; H2O cho đủ 1000ml Thanh trùng 121°C 20 phút, pH = 6,5-6,8 Môi trường MPA (g/l) Cao thịt 5g; pepton 10g; NaCl 5g; agar 5g; nước cất cho đủ 1000ml Thanh trùng 121°C 20 phút, pH = 7,0-7,2 Môi trường TGA (g/l) Trypton pepton 5g; glucoza 1g; cao men 2,5g; agar 15g; H2O cho đủ 1000ml Môi trường hấp khử trùng 121°C 30 phút Môi trường YGC (g/l) Glucoza 20g; cao men 5g; agar 15g; chloramphenicol (hoặc tetracyclin hay oxytetracyclin) 0,1g; H2O cho đủ 1000ml Môi trường hấp khử trùng 121°C 20 phút Môi trường Endo(g/l) Pepton 10g, lactoza 10g, K2HPO4 2,5g, Na2SO3 3,3g; fucshin kiềm 0,3g; thạch 15g; H2O cho đủ 1000 ml; pH = 7,5 Hấp khử trùng 121°C 20 phút - Dung dịch trypton: trypton 10g; NaCl 5g; H2O cho đủ 1000ml; pH = 7,3 nhiệt độ 20oC Thanh trùng nhiệt độ 121oC 20 phút - Thuốc thử Indol: 4-dimethylaminobenzaldehyt 5g; 2- metyl butan-1-ol 75ml; HCl đậm đặc 25ml (Hòa tan 5g 4-dimetylaminobenzaldehyt 75ml 2- metyl butan1-ol nhiệt độ nhẹ 50-55oC, cách thủy Sau làm nguội, cho HCl đặc vào Bảo quản tối nhiệt độ thấp, thuốc thử có mầu vàng sáng) Môi trường TSC (g/l) 84 Trypton 15g; cao men 5g; pepton 5g; sắt amoni xitrat 1g; natri metabisunfat 1g; agar 20g; H2O cho đủ 1000ml Hấp khử trùng nhiệt độ 121°C 15 phút, pHcuối = 7,6 nhiệt độ 25oC - Dung dịch D-cycloserin: Hòa tan 1g D-cycloserin với 200ml nước cất Bảo quản 4oC Trước làm thí nghiệm cho 20ml dung dịch D-cycloserin vào 250ml môi trường TSC thạch đun nóng đổ đĩa petri - Môi trường lỏng thioglycollat + resazarin natri (g/l): trypton 15g; cao nấm men 5g; L-cystin 0,5g; dextroza 5g, NaCl 2,5g; natri thioglycollat 0,5g; dung dịch resazurin natri pha (1:1000) ml; agar 0,75g; H2O cho đủ 1000 ml Hấp khử trùng nhiệt độ 121°C 20 phút, pHcuối = 7,1 nhiệt độ 25°C - Môi trường Lactoza-gelatin (g/l): Trypton 15g; cao nấm men 10g; lactoza 10g, đỏ phenol 0,05g; gelatin 12g; H2O cho đủ 1000 ml; pH = 7,5 Hấp khử trùng nhiệt độ 121°C 15 phút Nếu không sử dụng ngày bảo quản tủ lạnh 5°C ± 3°C Môi trường MYP (g/l) - Môi trường Mossel (g/l): pepton 10g; cao thịt 1g; manitol 10g; NaCl 10g; đỏ phenol 25mg; agar 15g; H2O cho đủ 1000ml; pH= 7,2 Hấp khử trùng nhiệt độ 121°C 20 phút - Dung dịch polymixin 0,1%: cho 2ml nước cất vô trùng vào lọ polymixin (50,000 IU) Bảo quản tủ lạnh 4°C - Dung dịch nhũ tương lòng đỏ trứng: Sử dụng trứng gà nguyên vẹn Dùng bàn chải rửa trứng dung dịch tẩy rửa Tráng dòng nước chảy, ngâm etanol 95% (theo thể tích) 30 giây để khô Bằng kỹ thuật vô trùng, đập vỡ trứng tách riêng lòng đỏ cách chuyển lòng đỏ từ nửa vỏ sang nửa vỏ lại Cho lòng đỏ sang ống vô trùng trộn thật với nước muối 0,85 % với khối lượng Dung dịch nhũ tương bảo quản đến 72h nhiệt độ 5°C ± 3°C 85 - Môi trường MYP hoàn chỉnh: làm tan chảy môi trường Mossel làm nguội đến nhiệt độ 44°C đến 47°C Cho 0,2ml dung dịch polymyxin ml nhũ hoá lòng đỏ trứng vào 50ml môi trường Mossel nóng chảy, trộn đều, rót môi trường vào hộp petri có mẫu Môi trường dịch chiết cà chua [5] Lấy 0,5kg cà chua rửa sạch, thái nhỏ đun với 0,5l nước cất 60 phút Lọc lấy nước bổ sung nước cất cho đủ 0,5l Nước cà chua 400ml Glucoza 10g Cao nấm men 10g Dung dịch A 5ml Dung dịch B ml Dung dịch B Dung dịch A K2HPO4 2,5g MgSO4.7H2O 10g KH2PO4 2,5g NaCl 5g Nước cất 250ml FeSO4.7H2O 5g MnSO4.4H2O 5g Nước cất 250ml Khử trùng 105oC 15 phút Môi trường dịch chiết rau cải [8] Lấy 0,5 kg rau cải rửa sạch, thái nhỏ đun với 1000ml nước 30 phút Lọc lấy nước bổ sung nước cất cho đủ 1000ml Nước chiết rau cải 1000ml Glucoza saccaroza 20g Khử trùng 105oC 15 phút 10 Môi trường nước chiết giá đỗ [5] 86 Lấy 300g giá đỗ rửa sạch, đun sôi 30 phút với 1000ml nước cất Lọc lấy nước bổ sung nước cất cho đủ 1000ml Pepton 20g MnSO4.4H2O 0,58g Saccaroza 20g MgSO4 7H2O 0,28g K2HPO4 0,2g Nước chiết giá đỗ 500ml Axit xitric 2g Nước cất đủ 1000ml Khử trùng 105oC 15 phút ... bảo trình lên men hiệu quả, rút ngắn thời gian lên men 1.3 KHẢ NĂNG ỨC CHẾ VI SINH VẬT ĐỘC HẠI CỦA VI KHUẨN LACTIC 1.3.1 Cơ chế ức chế vi sinh vật độc hại vi khuẩn lactic Cơ chế kháng khuẩn hay... triển chế phẩm vi khuẩn lactic có khả ức chế vi sinh vật độc hại ứng dụng lên men rau quả" Mục tiêu luận văn: - Tuyển chọn giống vi khuẩn lactic khiết có khả ức chế vi sinh vật có hại dùng làm chủng... tạo sinh khối 18 1.3 KHẢ NĂNG ỨC CHẾ VI SINH VẬT ĐỘC HẠI CỦA VI KHUẨN LACTIC 21 1.3.1 Cơ chế ức chế vi sinh vật độc hại vi khuẩn lactic 21 1.3.2 Các sản phẩm phụ lên men lactic