Quy trình công nghệ lên men ethanol từ rỉ đường bằng phương pháp cố định tế bào trong hệ thống lên men liên tục Kết luận Kiến nghị Danh mục các công trình đã công bố Tài liệu tham khảo..
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
Trang 2BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1 GS TS Hoàng Đình Hòa
2 TS Đặng Hồng Ánh
Hà Nội – 2014
Trang 4LỜI CẢM ƠN
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các Thầy, Cô giáo hướng dẫn khoa học là GS Hoàng Đình Hòa và TS Đặng Hồng Ánh đã tận tình chỉ dẫn, giúp đỡ và động viên em trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận án để có kết quả học tập như ngày hôm nay
Em cũng xin chân thành cảm ơn tới Quý Thầy, Cô giáo trong Bộ môn Công nghệ sinh học của Viện Công nghệ sinh học và Thực phẩm – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã hết sức giúp
đỡ và hướng dẫn, chỉ bảo và tạo điều kiện cho em trong quá trình học tập và nghiên cứu
Em cũng xin cảm ơn Bộ môn Công nghệ đồ uống, Bộ môn Vi sinh – của Viện Công nghiệp thực phẩm – 301 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội nơi đã cho em niềm vinh dự là một trong các thành viên tham gia đề tài mã số ĐT 03.10/NLSH thuộc Đề án phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015, tầm nhìn đến 2025 của Bộ công thương và có cơ hội quý báu được nâng cao kiến thức chuyên môn và thực hiện luận án để có kết quả như ngày hôm nay
Em cũng xin cảm ơn Ban lãnh đạo và các Anh Chị, Em trong Phòng Đào tạo Đại học của Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã luôn ủng hộ tinh thần, tạo điều kiện và giúp đỡ trong công việc tại Phòng để em có thể hoàn thành luận án đúng hạn
Em cũng xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình, những người bạn đã động viên và khích lệ cho em có được sự chuyên tâm và động lực phấn đấu thực hiện lụân án này Việc hoàn thành luận án và được trở thành một tiến sĩ, đó không chỉ là mơ ước của cá nhân
em mà nó còn là sự mong chờ, là niềm tự hào to lớn của dòng họ em
Nghiên cứu sinh
Nguyễn Thị Hương
Trang 5MỤC LỤC
Lời cam đoan
1.1.2.Sơ đồ quy trình sản xuất ethanol từ rỉ đường
1.1.3.Yêu cầu chất lượng và các vấn đề về nấm men trong sản xuất ethanol
1.1.4 Rỉ đường dùng để sản xuất ethanol
1.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ ethanol trên thế giới và Việt Nam
1.3 Vấn đề cố định nấm men trên giá thể và các phương pháp cố định
1.4.1 Phương pháp lên men gián đoạn
1.4.2 Phương pháp lên men bán liên tục
1.4.3 Phương pháp lên men liên tục
1.5 Tình hình nghiên cứu về công nghệ sản xuất ethanol trên thế giới và ở
Việt nam
1.5.1.Tình hình nghiên cứu về công nghệ sản xuất ethanol trên thế giới
1.5.2 Tình hình nghiên cứu về công nghệ sản xuất ethanol ở Việt nam
CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Trang 62.1.4 Môi trường nuôi cấy
2.2.Thiết bị và phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Thiết bị
2.2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.3 Phân tích
2.2.3.1 Quan sát trạng thái nấm men
2.2.3.2 Xác định tế bào nấm men nhờ buồng đếm Thomas
2.2.3.8 Xác định mật độ tế bào nấm men bằng máy so màu
2.2.3.9 Xác định lượng vi khuẩn hiếu khí có trong dịch lên men
2.2.3.10 Phân tích đường khử theo phương pháp Graxianop
2.2.3.11 Xác định đường khử theo Nelson-Somogi
2.2.3.12 Phương pháp xác định tổng lượng chất keo trong rỉ đường
2.2.3.13 Phương pháp xác định lực đệm của rỉ đường
2.2.3.14 Phương pháp xử lý rỉ đường
2.2.3.15 Tính hiệu suất lên men
2.2.3.16 Tính tốc độ pha loãng và năng suất ethanol
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men bằng
phương pháp cố định tế bào trên môi trường rỉ đường để đạt hiệu suất lên
men cao
3.1.1 Nghiên cứu lựa chọn nguồn nguyên liệu rỉ đường
3.1.2 Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men trên môi
trường rỉ đường
3.1.3 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy tối ưu để thu sinh khối nấm men cho việc
cố định tế bào
3 2 Nghiên cứu quy trình công nghệ cố định tế bào
3.2.1 Nghiên cứu lựa chọn loại chất mang
3.2.2 Nghiên cứu thông số công nghệ cố định tế bào
Trang 73.3 Nghiên cứu công nghệ lên men ethanol nhờ tế bào cố định trên môi
trường rỉ đường
3.3.1 Lựa chọn nồng độ cơ chất ban đầu
3.3.2 Lựa chọn tỷ lệ giữa hạt tế bào cố định và dịch lên men thích hợp cho quá
trình lên men
3.3.3 Xác định các điều kiện lên men nhờ tế bào cố định
3.3.4 Đánh giá hoạt lực lên men của tế bào cố định theo thời gian lên men
3.4 Xây dựng quy trình lên men ethanol từ rỉ đường theo phương pháp lên
men liên tục nhờ tế bào cố định
3.4.1 Lựa chọn phương pháp lên men liên tục
3.4.2 Xác định tốc độ pha loãng của quá trình lên men liên tục
3.4.3 Nghiên cứu ổn định các thông số động học của quá quá trình lên men liên
tục
3.5 Nghiên cứu xử lý hạt tế bào nấm men để giữ hoạt lực lên men cho quá
trình lên men liên tục
3.5 1 Xác định thời điểm cần hoạt hóa
3.5.2 Nghiên cứu dung dịch rửa hạt tế bào nấm men
3.5.3 Nghiên cứu bổ sung một số cơ chất dinh dưỡng vào dịch hoạt hóa nấm
men
3.5.4 Nghiên cứu phương pháp hoạt hóa hạt tế bào
3.6 Xây dựng mô hình và sản xuất thử nghiệm ethanol ở qui mô pilot
3.6.1 Nghiên cứu thiết kế mô hình hệ thống thiết bị lên men liên tục nhờ tế bào
cố định thích hợp cho quy mô sản xuất 500lit ethanol/ngày
3.6.2 Xây dựng mô hình và sản xuất thực nghiệm ethanol bằng phương pháp
lên men liên tục nhờ cố định tế bào trên mô hình thiết bị
3.6.3 Đánh giá hiệu quả kinh tế
3.6.4 Quy trình công nghệ lên men ethanol từ rỉ đường bằng phương pháp cố
định tế bào trong hệ thống lên men liên tục
Kết luận
Kiến nghị
Danh mục các công trình đã công bố
Tài liệu tham khảo
Trang 8DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
1 0Bx: Độ Brix
2 EDTA: Ethylen diamin tetraacetic acid
3 SEM: Scanning electron microscope: Kính hiển vi điện tử quét
4 M/G: Tỷ lệ D-manuronic acid/L-guluronic acid của chế phẩm alginate
Trang 9DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.2 Tiêu thụ ethanol cho nhiên liệu của thế giới 12
Bảng 3.3 Năng lực lên men của các chủng nấm men trong điều kiện cố định tế
bào
49
Bảng 3.4 Sự sinh trưởng của chủng CNTP 7028 trên các nguồn ni tơ khác nhau 51 Bảng 3.5 ảnh hưởng của các loại chất mang đến quá trình lên men 57 Bảng 3.6 ảnh hưởng của chất mang đến khả năng lên men 58 Bảng 3.7 ảnh hưởng của nồng độ Na- Alginate đến quá trình lên men 59 Bảng 3.8 ảnh hưởng của nồng độ Na- Alginate đến các chỉ tiêu của dịch sau lên
Bảng 3.14 ảnh hưởng của tốc độ dòng chảy tạo hạt tế bào cố định đến chỉ tiêu
của dịch sau lên men
64
Bảng 3.15 ảnh hưởng của kích thứoc hạt đến quá trình lên men 64 Bảng 3.16 ảnh hưởng của kích thước hạt đến thành phần dịch sau lên men 65 Bảng 3.17 ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến quá trình lên men 66 Bảng 3.18 ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến chỉ tiêu của dịch sau lên men 67 Bảng 3.19 ảnh hưởng của tỷ lệ hạt tế bào cố định so với dịch khi lên men 68
Trang 10
Bảng 3.20 ảnh hưởng của tỷ lệ hạt tế bào cố định đến chỉ tiêu của dịch sau lên
men
68
Bảng 3.22 ảnh hưởng của ph đến chỉ tiêu của dịch sau lên men 69 Bảng 3.23 ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men 70 Bảng 3.24 ảnh hưởng của nhiệt độ đến chỉ tiêu của dịch sau lên men 71 Bảng 3.25 Lượng CO2 tạo thành theo các lần tái sử dụng tế bào nấm men cố
Bảng 3.27 Khả năng lên men của tế bào cố định trong quá trình lên men liên tục
(tỷ lệ giữa hạt tế bào cố định: thể tích dịch lên men là 30% w/v)
74
Bảng 3.28 Khả năng lên men của tế bào cố định trong quá trình lên men liên tục
(tỷ lệ giữa hạt tế bào cố định: thể tích dịch lên men là 40% w/v)
74
Bảng 3.29 Khả năng lên men của tế bào cố định trong quá trình lên men liên tục
(tỷ lệ giữa hạt tế bào cố định: thể tích dịch lên men là 50% w/v)
Bảng 3.33 ảnh hưởng của dung dịch rửa hạt đến quá trình lên men trong hệ thống
lên men liên tục
83
Bảng 3.34 ảnh hưởng của nguồn ni tơ trong dịch hoạt hoá đến khả năng lên men
của hạt tế bào nấm men cố định
84
Bảng 3.35 ảnh hưởng của nguồn ni tơ bổ sung vào dịch hoạt hoá đển tốc độ sinh
CO2 trong bình engol của hạt tế bào nấm men cố định
Bảng 3.39 ảnh hưởng của nguồn photpho bổ sung vào dịch hoạt hoá đến tốc độ
sinh CO2 trong bình engol của hạt tế bào nấm men
90
Trang 11Bảng 3.40 ảnh hưởng của nồng độ KH2PO4 đến khả năng lên men của hạt tế bào
nấm men cố định
89
Bảng 3.41 ảnh hưởng của nồng độ KH2PO4 đến tốc độ sinh CO2 trong bình engol
của hạt tế bào nấm men cố định
90
Bảng 3.42 ảnh hưởng của phương pháp hoạt hoá tới tốc độ sinh CO2 trong bình
engol của hạt tế bào nấm men cố định
Bảng 3.48 Kết quả phân tích một số thành phần của ethanol được sản xuất từ rỉ
đường theo quy trình công nghệ lên men liên tục nhờ cố định tế bào
Bảng 3.49 Đánh giá hiệu quả kinh tế của hai phương pháp lên men
100
101
Trang 12DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1.Quy trình sản xuất ethanol từ rỉ đường
Hình 1.2 Hình ảnh nấm men Saccharomyces cerevisiae
Hình 1.3 Hình ảnh rỉ đường mía
Hình 1.4 Các kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật
Hình 1.5 Cơ chế tạo gel của alginate
Hình 1.6: Cấu trúc của alginate
Hình 1.7 Mô hình tạo gel dạng vi trứng của alginate canxi
Hình 1.8 Sự liên kết của ion Ca2+ với các gốc guluronic
Hình 1.9 Quy trình tạo hạt gel ca-alginate
Hình 1.10: Cấu trúc của xanthan gum
Hình 1.11: Cấu trúc của carrageenan
Hình 2.1 Sơ đồ tạo hạt tế bào cố định
Hình 2.2 Sơ đồ bố trí hệ thống lên men liên tục
Hình 3.7 Động học của quá trình sinh trưởng của chủng CNTP 7028
Hình 3.8 ảnh hưởng của tốc độ ly tâm đến khối lượng sinh khối thu được
Hình 3.9 ảnh hưởng của số lần rửa tới mức độ sạch của sinh khối
Hình 3.10 ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến khả năng tạo ethanol và hiệu
suất lên men của tế bào cố định trong hệ thống lên men liên tục
Hình 3.11 ảnh hưởng của tốc độ pha loãng đến sản lượng ethanol thu được
4 5,6
Trang 13trong hệ thống lên men liên tục
Hình 3.12 Nồng độ ethanol thu đựoc trong hệ thống lên men liên tục theo
thời gian lên men
Hình 3.13 Hình ảnh hạt gel canxi alginate trong một chu kỳ lên men
Hình 3.14 Sự phát triển của tế bào nấm men Sacchromyces cerevisiae CNTP
7028 trong hạt gel đựơc chụp trên kính hiển vi điện tử quét
Hình 3.15 Thời gian sinh CO2 đẩy hết 5ml dịch trong bình engol sau khi
dùng dung dịch rửa hạt tế bào nấm men cố định
Hình 3.16 Động học của quá trình lên men liên tục trên hệ thống lên men
liên tục 1200 lít
Hình 3.17 Qúa trình lên men ethanol từ rỉ đường bằng phương pháp lên men
liên tục nhờ cố định tế bào trong gel ca-alginate
Trang 14MỞ ĐẦU Ethanol là sản phẩm lên men được loài người sử dụng lâu đời nhất và hiện nay cũng là thứ đồ uống được phổ biến rộng rãi ở mọi nước trên toàn thế giới Nó chiếm một vị trí khá quan trọng trong công nghiệp thực phẩm nói riêng và các ngành kinh tế nói chung Ngoài công dụng làm đồ uống, ethanol còn được dùng làm nguyên liệu cho một số ngành công nghiệp khác như: làm dung môi hữu cơ, nhiên liệu, dùng trong y tế, trong mỹ phẩm pha nước hoa, trong dược phẩm để trích ly các hoạt chất sinh học, sản xuất axit axetic và dấm ăn, sản xuất các loại este có mùi thơm, trong cao su tổng hợp và nhiều hợp chất khác v.v… Đặc biệt trong bối cảnh nguồn nhiên liệu hóa thạch đang ngày càng cạn kiệt thì ethanol được coi như nguồn nhiên liệu sinh học thay thế đầy hứa hẹn
Việt Nam nằm ở vùng khí hậu nhiệt đới, thích hợp cho việc trồng mía tạo thuận lợi cho công nghiệp mía đường phát triển Cùng với sản phẩm chính là đường kính, hàng năm các nhà máy đường thải ra khoảng 600.000 - 700.000 tấn rỉ đường [17] Đây là nguồn nguyên liệu dồi dào để cung cấp cho ngành công nghiệp lên men, đặc biệt là công nghiệp sản xuất rượu cồn Theo báo cáo công tác tháng 9 năm 2013 của Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn ngày 04/10/2013 số 3580/BC-BNN-VP thì tổng diện tích cây công nghiệp ngắn ngày tính đến trung tuần tháng 9 đạt 565,5 ngàn ha, bằng 97,3% so với cùng kỳ năm trước và trong đó mía đạt gần 174,3 ngàn ha, tăng 2,8% [1]
Tại Việt Nam việc sản xuất ethanol chủ yếu tập trung ở một số nhà máy lớn như Công
ty cổ phần cồn rượu Hà Nội, công ty cổ phần rượu Bình Tây, công ty cổ phần rượu Đồng Xuân mà đi từ nguồn nguyên liệu là tinh bột Công nghệ áp dụng vẫn chủ yếu là công nghệ lên men gián đoạn hoặc bán liên tục, sản phẩm tạo ra chủ yếu mới chỉ đáp ứng được nhu cầu của thị trường đồ uống Ngoài ra còn có một số nhà máy sản xuất cồn của các công ty Mía Đường như công ty Mía Đường Lam Sơn đã tận dụng nguyên liệu mật rỉ để sản xuất cồn
Một trong các chiến lược cải tiến quá trình lên men ethanol là áp dụng kỹ thuật cố định tế bào để thu được quá trình lên men có năng suất và hiệu suất cao Trong số các chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào ứng dụng trong lên men ethanol thì ca-alginate được sử dụng rộng rãi nhất do gel có độ xốp cao cho phép cơ chất và sản phẩm lên men đi vào, đi ra được dễ dàng tạo thuận lợi cho việc trao đổi chất Sự khuếch tán của glucoza và ethanol vào
và ra khỏi mạng lưới gel rất cao và do tính tương thích sinh học rất tốt cho phép các tế bào sống duy trì hoạt động sống của mình khi cố định trên mạng lưới gel, không độc, không gây
ức chế hoạt động sống của tế bào Theo Nedovic và cộng sự (2005) cho rằng có hơn 80% các nghiên cứu trên thế giới về cố định tế bào đã sử dụng chất mang alginate [97]
Trang 15Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu đề cập đến việc sử dụng các tế bào cố định để lên men sản xuất các loại đồ uống nói chung và ethanol nói riêng [9], [10], [21] Tuy nhiên ở Việt Nam hiện nay việc áp dụng công nghệ cố định tế bào mới chủ yếu ở mức độ phòng thí nghiệm mang tính khảo sát ban đầu và thực hiện trên các sản phẩm lên men khác như bia, rượu vang Việc kết hợp giữa cố định tế bào và quá trình lên men liên tục trong sản xuất ethanol từ rỉ đường phù hợp với điều kiện Việt Nam và có nhiều triển vọng ứng dụng vào thực tiễn Với những ý nghĩa đó chúng tôi
đã thực hiện đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu cố định tế bào và ứng dụng trong lên men etanol từ rỉ đường bằng phương pháp liên tục”
Mục tiêu cần đạt của đề tài là:
1 Xác định được công nghệ thích hợp tạo giá thể để cố định tế bào nấm men và các điều kiện thích hợp lên men dịch rỉ đường bằng nấm men cố định
2 Xác định được các thông số công nghệ cơ bản của quá trình lên men liên tục, sử dụng nấm men cố định
3 Xây dựng mô hình và sản xuất thử nghiệm ethanol bằng phương pháp lên men liên tục nhờ tế bào cố định trên mô hình thiết bị
Để đạt được các mục tiêu trên, đề tài cần nghiên cứu các nội dung:
1 Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men bằng phương pháp cố định tế bào trên môi trường rỉ đường để đạt hiệu suất lên men cao
- Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men tốt trên môi trường rỉ đường từ các chủng nấm men có trong sưu tập giống công nghiệp của Viện CNTP
- Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men tốt trong điều kiện cố định trong lớp chất mang từ các chủng đã được chọn ở trên
- Lựa chọn nguồn nguyên liệu rỉ đường
2 Nghiên cứu quy trình công nghệ cố định tế bào
- Khảo sát ảnh hưởng của một số loại chất mang đến quá trình cố định tế bào
- Nghiên cứu phối hợp sử dụng các chất mang khác nhau để đạt hiệu quả cố định và lên men tốt
- Lựa chọn nồng độ chất mang
- Nồng độ dung dịch tạo gel cho độ bền cơ học của hạt tế bào cố định cao
- Lựa chọn tỷ lệ giống thích hợp trong chất mang cho khả năng giữ tế bào và độ bền
cơ học cao nhất
- Lựa chọn tốc độ dòng chảy tạo hạt tế bào cố định
3 Nghiên cứu công nghệ lên men ethanol nhờ tế bào cố định trên môi trường rỉ đường
- Xác định nồng độ cơ chất ban đầu và nồng độ các chất vi lượng bổ sung
Trang 16- Nghiên cứu lựa chọn tỷ lệ hạt tế bào cố định và dịch lên men thích hợp cho quá trình lên men
- Xác định các điều kiện lên men nhờ tế bào cố định cho nồng độ ethanol cao ( nhiệt
độ, pH, )
- Đánh giá hoạt lực lên men của tế bào cố định theo thời gian lên men
- Xác định thời điểm cần hoạt hoá để kéo dài hoạt lực của tế bào cố định
- Nghiên cứu bổ sung một số cơ chất để nâng cao khả năng sống và duy trì hoạt tính lên men của tế bào cố định
- Nghiên cứu bổ sung oxy hoà tan để nâng cao khả năng sống và duy trì hoạt tính lên men của các tế bào cố định
4 Xây dựng quy trình lên men ethanol từ rỉ đường theo phương pháp lên men liên tục nhờ
tế bào cố định
- Lựa chọn phương pháp lên men thích hợp
- Xác định tốc độ pha loãng của quá trình lên men liên tục
- Nghiên cứu độ ổn định các thông số động học của quá trình lên men liên tục theo thời gian lên men
5 Nghiên cứu xử lý hạt tế bào nấm men để giữ hoạt lực lên men cho quá trình lên men liên tục
- Xác định thời điểm cần hoạt hoá
- Nghiên cứu dung dịch rửa hạt tế bào nấm men
- Nghiên cứu bổ sung một số cơ chất dinh dưỡng vào dịch hoạt hoá nấm men
6 Xây dựng mô hình và sản xuất thử nghiệm ethanol ở qui mô pilot
- Nghiên cứu mô hình hệ thống thiết bị lên men liên tục nhờ tế bào cố định thích hợp cho quy mô sản xuất 500 lít ethanol/ngày
- Thử nghiệm lên men liên tục ở qui mô pilot
- Đánh giá hiệu quả kinh tế
Trang 17CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Một số nét cơ bản về ethanol
1.1.1 Định nghĩa ethanol
Ethanol là chất lỏng trong suốt, có công thức phân tử là C2H5OH, phân tử gam 46,07g/mol, khối lượng riêng (0,789g/cm3), điểm sôi (78.40C), điểm bắt lửa ( 130C), nhiệt độ tự cháy (4250C) [17] Ethanol tan vô hạn trong nước, tan trong ete và clorofom, hút ẩm, dễ cháy, khi cháy không có khói và ngọn lửa màu xanh da trời 1.1.2 Sơ đồ quy trình sản xuất cồn etylic từ rỉ đường
Hình 1.1 Quy trình sản xuất ethanol từ rỉ đường
Bổ sung các chất dinh dưỡng
Tinh luyện cồn thô Tách aldehyd, tách dầu khét
(rượu bậc cao +ester)
Trang 181.1.3 Yêu cầu chất lượng và các vấn đề về nấm men trong sản xuất cồn etylic
- Chủng nấm men thường dùng trong sản xuất rượu ethanol là Saccharomyces
cerevisiae thuộc họ Endomycetacea hay Ascomyces
- Nấm men có nhiều hình dáng khác nhau: oval, tròn, hình quả chanh, hình chuỳ, hình cầu, hình trứng… Hình dáng tế bào có thể thay đổi tuỳ loài, điều kiện nuôi cấy và tuổi của nấm men
Hình 1.2 a
Hình 1.2.b
Trang 20- Tế bào nấm men được cấu tạo chủ yếu từ thành tế bào, màng nguyên sinh chất, nhân
và các cơ quan con khác Nhân được bao bọc bởi màng nhân, ngoài ra nó thuộc tế bào eucaryote ( Hình 1.2.b) nên tính ổn định đặc tính di truyền trong thời gian dài thực hiện lên men liên tục bằng có định tế bào hiệu quả hơn Kích thước tế bào nấm men cũng khác nhau và phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy, dao động trong khoảng 2,5-10 m chiều rộng và 5-50 m chiều dài Tế bào có hình dạng hình oval là chủ yếu ( Hình 1.2.a) nên đễ cố định trong chất mang Nấm men có thể sinh sản chủ yếu bằng phương pháp nẩy chồi Tế bào trưởng thành mọc ra một chồi nhỏ, một phần nhân chuyển sang chồi cùng với sự lớn của chồi thành một nhân mới Chồi lớn có vách ngăn với tế bào mẹ, rồi tách riêng thành tế bào mới, tạo ra những vết sẹo ( Hình 1.2.c và 1.2.d )
- Có hoạt tính tạo cồn cao
- Nấm men dùng trong sản xuất ethanol ngoài khả năng biến đường thành ethanol và khí
CO2 , càng triệt để càng tốt Chịu được sự biến đổi của môi trường trong điều kiện nhiệt độ,
pH, nồng độ đường, đặc biệt chịu được nồng độ ethanol cao
* Đặc điểm của quá trình lên men ethanol: Dịch đường lên men đục Nhiều cặn lơ lửng - ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm Lên men ở nhiệt độ cao Sau một chu kỳ lên men thì nấm men ít kết lắng, tỷ lệ tế bào chết nhiều, dẫn đến tốc độ thoái hoá nhanh, dịch huyền phù có nấm men kết lắng cũng không sạch Vì vậy trong sản xuất ethanol không thể tái sử dụng nấm men của mẻ trước cho lên men mẻ sau Lên men mẻ nào thì phải nhân giống cho các mẻ đấy, không tái sử dụng được – đó chính là sự bất lợi của lên men cổ điển Nó có nhiều rủi ro:
- Nếu mẻ lên men nào bị nhiễm khuẩn - cả dây chuyền bị nhiễm
- Hiệu quả thấp, tiêu tốn nhiên liệu và nhân công lao động
- Quy trình công nghệ sản xuất cồn ethanol phức tạp thêm (vì dịch nhân giống có nồng độ bao giờ cũng thấp hơn dịch đường lên men ethanol)
Chính vì vậy đi đến giải pháp cố định nấm men và nó các ưu điểm:
- Chịu được áp suất thẩm thấu, tăng tốc độ sử dụng cơ chất, rút ngắn thời gian lên men
- Tăng hiệu suất thu hồi và giảm chi phí tinh sạch
- Có khả năng tái sử dụng
1.1.4 Rỉ đường dùng sản xuất ethanol
1.1.4.1 Thành phần hóa học của rỉ đường
Thành phần rỉ đường phụ thuộc vào giống mía, đất đai trồng trọt và điều kiện canh tác cũng như công nghệ sản xuất đường Bình thường lượng chất khô trong mật rỉ chiếm 80 đến
Trang 2185%, nước chiếm 15 đến 20% Có nhà máy rửa nhiều nước sau ly tâm đường nên lượng chất khô giảm còn 70 – 75% [6]
Trong số các chất khô thì đường chiếm tới 60%, gồm 35 - 40% là saccaroza và 20 – 25%
là đường khử, ngoài ra còn chứa một lượng đường không lên men ( 3-5%) như rafinoza (0,01- 0,3%), lactoza, manoza và xyloza [6]; [11], [17]
Số chất khô còn lại gọi chung là chất phi đường và gồm 30 – 32% là hợp chất hữu cơ và 8 – 10% là chất vô cơ
Hợp chất hữu cơ gồm các chất chứa nitơ, cacbon, oxy và hydro Hợp chất hữu cơ chứa nitơ phần lớn là ở dạng amin như glutamic, lơxin, alanin v.v…Lượng nitơ trong rỉ đường mía chỉ khoảng 0,5 đến 1%, ít hơn so với rỉ đường củ cải (1,2 – 2,2%) [11], [17]
Chất hữu cơ không chứa ni tơ gồm có pectin, chất nhầy furfurol và oxymetyl furfurol, axit
v.v…Ngoài ra còn chứa các chất khử nhưng không lên men được như caramen, chất màu…
+ Các hợp chất màu: rỉ đường thường có mầu nâu sẫm hay nâu đen, chủ yếu là do hỗn
hợp các chất mầu tạo thành
+ Hợp chất caramen: tạo thành do sự mất nước của đường saccaroza dưới tác dụng
của nhiệt độ Khi pH không đổi thì cường độ mầu tỉ lệ thuận với nhiệt độ và thời gian đun nóng
+ Phức chất phenol-Fe +2: có mầu vàng xanh và không thể loại hết ở giai đoạn làm sạch nước mía và đi vào rỉ đường
+ Melannoidin: là sản phẩm ngưng tụ của đường khử với axit amin là chủ yếu là axit
asparagin
+ Mêlanin: là sản phẩm oxi hoá khử các axitamin ở dạng vòng có trong rỉ đường dưới
sự xúc tác của enzim polyphenoloxydaza khi có mặt của oxy và Cu2+, chủ yếu là tyrozin
+ Chất keo: chủ yếu là các chất pectin, chất sáp, chất nhờn Các chất này có ảnh
hưởng xấu tới nấm men vì nó tạo màng nhầy bao bọc quanh tế bào ngăn cản quá trình hấp thụ chất dinh dưỡng, làm giảm hoạt tính sinh học, ức chế quá trình lên men, hạn chế tạo sinh khối Ngoài ra còn là nguyên nhân chính tạo bọt trong quá trình nuôi cấy
vi sinh vật
Các hợp chất vô cơ: chủ yếu là các loại muối tìm thấy trong thành phần tro của rỉ đường
như muối kali, natri, canxi
Trong rỉ đường mía khá giàu biotin (vitamin H) và hàm lượng vitamin gồm : B1, B2, B3,
B6, PP [19]
Trang 22Hình 1.3 Hình ảnh rỉ đường mía
Như vậy có thể thấy rằng trong thành phần của rỉ đường có đầy đủ các loại đường có thể lên men và các yếu tố vi lượng, chất khoáng cần thiết cho quá trình lên men ethanol Ngoài ra nguồn ni tơ có trong rỉ đường thấp thì trong quá trình nuôi cấy ta sẽ phải bổ sung thêm nguồn nitơ để thúc đẩy quá trình sinh trưởng và phát triển [38], [39], [55]
1.1.4.2 Các phương pháp xử lý rỉ đường
a Phương pháp hoá học (phương pháp axit hoá)
Người ta thường sử dụng axit sunfuric 0,40,6% để kết tủa các chất keo có trong rỉ đường, đồng thời axit H2SO4 còn liên kết với các muối, đẩy các axít hữu cơ ra, tạo pH thích hợp cho lên men ethanol Lượng axit H2SO4 cho vào phụ thuộc vào phương pháp xử lý có gia nhiệt hay không gia nhiệt và phụ thuộc pH của rỉ đường Khi bổ sung axit H2SO4 vào dưới tác dụng của nhiệt thì một số axit bay hơi thoát ra làm một vài chất độc đối với nấm men cũng bị oxi hoá [12], [17]
Ví dụ:
CaSO3 + H2SO4 CaSO4 + H2O + SO2 KNO3 + H2SO4 K2SO4 + HNO3
Không những thế H2SO4 còn có tác dụng thuỷ phân một phần saccaroza thành glucoza
và fructoza Đồng thời độ thuần khiết của rỉ đường sau khi axit hoá tăng lên, giảm từ 20-30%
Trang 23các chất phi đường, 40-60% hàm lượng chất keo, giảm bớt chất tro và tạp trùng như vi khuẩn lactic, butyric, acetic
Xử lý với axit không gia nhiệt:
Phương pháp này chỉ áp dụng khi rỉ đường bị nhiễm tạp không nhiều
Tiến hành: cho rỉ đường và nước vào thiết bị làm trong theo tỷ lệ 1:1 đồng thời cho cánh khuấy hoạt động và cho từ 2 6 lít H2SO4 đậm đặc (d=1,84)/1 tấn rỉ đường tới pH=4,5 Sau
đó bổ sung amoni sunphat và supe photphat khuấy đều trong 30 phút và để lắng từ 6-12 giờ cho tới khi rỉ đường trong hoàn toàn Tách cặn lấy phần trong đem pha loãng tới nồng độ gây men và lên men
Xử lý với axit gia nhiệt:
Tiến hành: rỉ đường được pha loãng giống phương pháp xử lý bằng axit không gia nhiệt
và chỉnh tới pH = 4,5 Sau đó dùng hơi nước sục trực tiếp vào tới nhiệt độ 85-90OC giữ trong 0,5-1h sau đó để lắng từ 2-4h rồi tách cặn và đem pha loãng tới nồng độ gây men và lên men [17]
b Phương pháp xử lý rỉ đường bằng hợp chất polyme
Các chất rắn trong rỉ đường tồn tại ở trạng thái keo nên chúng nằm lơ lửng trong dịch đường Để kết lắng được các hạt keo này thì phải phá vỡ trạng thái ổn định của hệ bằng cách phá vỡ lớp điện tích bảo vệ hạt keo Khi đó các hạt keo sẽ tự kết hợp lại với nhau đến khi khối lượng tăng dần và lắng xuống
Bản chất hoá học của polyme kết lắng là các copolin của acrylamit, được chúng chia làm 3 nhóm điện tích: cationic, anionic và nonionic
Hiện nay có rất nhiều loại polyme nhưng chỉ có polyme mang diện tích dương mới có khả năng kết lắng các tạp chất trong rỉ đường Polyme mang diện tích dương thấp có khả năng kết lắng rỉ đường triệt để, thời gian kết lắng nhanh, dễ lắng cặn, không qua thiết bị lọc Ở Việt Nam hiện nay thường dùng hai loại polyme mang diện tích dương thấp là C510H và C300 của hãng ARON Nhật bản trong hai loại này thì C510H có khả năng kết lắng tốt hơn
c Phương xử lý rỉ đường bằng cơ học
Dùng phương pháp li tâm để loại bớt chất bẩn và chất keo Làm trong bằng phương pháp này rút ngắn thời gian xử lí rỉ đường, không tốn axit, không ăn mòn thiết bị, đảm bảo quá trình pha chế môi trường nhanh, liên tục nhưng độ trong không bền và tạo thành cặn trong thiết bị lên men Li tâm với tốc độ từ nhỏ đến lớn để đảm bảo tách hết cặn lớn nhỏ Tuỳ theo mục đích sử dụng và chất lượng rỉ đường người ta có thể kết hợp hoặc không kết hợp với tác dụng nhiệt Tuy nhiên có nhược điểm là năng suất máy li tâm thường là rất thấp, giá thành cao, tốn nhiều năng lượng điện nên ít được sử dụng trong sản xuất lớn [12], [17]
Trang 241.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ ethanol trên thế giới và Việt Nam 1.2.1.Tình hình sản xuất và tiêu thụ ethanol trên thế giới
Trên thế giới, việc nghiên cứu sử dụng ethanol để thay thế chất phụ gia metyl-butyl ete trong xăng dầu đã được tiến hành trong nhiều năm qua Theo “ Dự án Biomass” của Bộ năng lượng Hoa Kỳ thì chính phủ công bố cấm sử dụng metyl-butyl ete vào đầu năm 2003, do nhiều công trình nghiên cứu đã khẳng định sự ô nhiễm nguồn nước, môi trường không khí, sức khỏe con người của việc sử dụng metyl-butyl ete [3] Chương trình ethanol nhiên liệu được nhiều nước quan tâm, đầu tư xây dựng chiến lược phát triển các nhà máy sản xuất ethanol từ các loại ngũ cốc như: ngô, sắn, mía đường… nhằm đáp ứng nhu cầu cung cấp nhiên liệu tái tạo trong tương lai [29], [45], [45] Năm 2003 toàn thế giới đã sản xuất được 38,5 tỷ lít ethanol (châu Mỹ chiếm khoảng 70%, châu Á 17%, châu Âu 10%), trong đó 70% được dùng làm nhiên liệu, 30% được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm, y tế, hoá chất Đến năm 2007, lượng ethanol sản xuất đã tăng lên 56 tỷ lít, trong đó tỷ lệ sử dụng làm nhiên liệu tăng lên 75% Năm 2009, sản lượng ethanol trên thế giới đạt khoảng 66 tỷ lít [7] Theo Pilgrim C (2009) và Carlos A., Cardona, O J S (2007) thì dự báo đến năm 2021, sản lượng ethanol thế giới sẽ tăng lên 180,402 tỷ lít và tỷ lệ sử dụng làm nhiên liệu tăng lên tới 86% ( bảng 1.1 và bảng 1.2) [31], [82], [83], [92], [104], [107], [108], [109], [110],
Trên thế giới, Brazin, Mỹ và Trung Quốc là 3 quốc gia đứng đầu về sản xuất và sử dụng ethanol nhiên liệu Trong khu vực Đông Nam Á, Thái Lan là quốc gia phát triển rất nhanh về sản xuất và sử dụng xăng pha ethanol sản xuất từ phế phẩm của sắn, hạt ngô, cây ngô, đường, bã mía [7], [66]
Mỹ là quốc gia tiêu thụ hàng năm 25% năng lượng trên thế giới Năm 2004, Mỹ đã sản xuất trên 13 tỷ lít ethanol Do lệnh cấm sử dụng metyl-butyl ete đã làm tăng mạnh nhu cầu đối ethanol nhiên liệu ở Mỹ Mỹ đã vượt Braxin và là nước sản xuất ethanol lớn nhất trên thế giới hiện nay Năm 2009, sản lượng ethanol lên tới 25,9 tỷ lít [7], [29], [66], [82]
Trung Quốc là quốc gia sản xuất và sử dụng ethanol nhiên liệu lớn thứ 3 sau Braxin và
Mỹ Năm 2004, nước này đã đưa vào hoạt động nhà máy sản xuất ethanol lớn nhất thế giới với công suất 600.000 tấn/năm tại Cát Lâm (mỗi năm tiêu thụ 1,9 triệu tấn ngô làm nguyên liệu), tăng lượng cồn ethanol cả nước trên 3,5 tỷ lít Gần nước ta nhất là Thái Lan, một nước
đã có chính sách sản xuất nhiên liệu sinh học từ 10 năm nay Từ năm 2002, Thái Lan đã xây dựng thêm 4 nhà máy sản xuất ethanol nhằm giảm chi phí nhập khẩu xăng dầu Năm 2004, Thái Lan đã sản xuất trên 280.000 m3 ethanol, đầu tư thêm 20 nhà máy để năm 2015 có trên 2,5 tỷ lít ethanol dùng làm nhiên liệu [7], [99], [100], [105]
Trang 25Bảng 1.1 Sản xuất ethanol trên thế giới (tr.lít)
Nguồn: OECD/FAO Agriculture Outlook, 2012
Bảng 1.2 Tiêu thụ ethanol cho nhiên liệu của Thế giới (tr.lít)
Tiêu thụ cho nhiên liệu 77.178 155.964
Nguồn: OECD/FAO Agriculture Outlook, 2012
1.2.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ ethanol ở Việt Nam
Theo vietbao.vn/kinh tế thì thống kê năm 2007 ở Việt Nam có khoảng 328 cơ sở sản xuất rượu lớn với sản lượng 360 triệu lít/năm, 320 cơ sở sản xuất nhỏ với sản lượng dưới 1 triệu lít/năm, hộ gia đình tự sản xuất ước tính khoảng 250 triệu lít/năm [111]
Theo khảo sát của Bộ Công Thương, hết quý I-2009, rượu tăng 16% so với cùng kỳ năm 2008 Cho đến năm 2010 chính phủ vẫn định hướng chỉ đạo việc tiếp tục gia tăng sản lượng rượu bia do nhiều thành phần kinh tế tham gia sản xuất, chỉ hạn chế dần lượng rượu dân tự nấu [2]
Mỗi năm tổng công suất sản xuất ethanol trên cả nước đều tăng tập trung ở 3 nhà máy lớn có công suất từ 15.000 - 30.000 lít/ngày là nhà máy Hiệp Hoà, Lam Sơn, nhà máy Bình Tây và hàng trăm cơ sở sản xuất có quy mô nhỏ lẻ với công suất từ 3.000 - 5.000 lít/ngày Sản lượng ethanol Việt Nam hiện nay còn rất nhỏ, công suất sản xuất của mỗi nhà máy cũng nhỏ, các đơn vị sản xuất ethanol đang gặp nhiều khó khăn do nguồn nguyên liệu không ổn định
Trang 26Do nhu cầu thị trường tiêu thụ ethanol trong nước ngày càng tăng, các đơn vị sản xuất ethanol trong nước đẩy mạnh sản xuất, đồng thời mở thêm nhiều nhà máy mới Công ty Biên Hòa đầu
tư xây dựng nhà máy công suất 50.000 tấn/ năm, công ty Đồng Xuân đầu tư xây dựng nhà máy 60.000lit/ ngày, công ty CP Cồn sinh học Việt Nam đầu tư nhà máy 66.000m3/ năm tại Đắc lắc [8]; [17], [112]
Ngày 20/11/2007, Thủ tướng Chính phủ đã ban hành Quyết định số 177/QĐ-TTg phê duyệt “Đề án phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015, tầm nhìn đến 2025” Mục tiêu tổng quát của Đề án là phát triển nhiên liệu sinh học thay thế một phần nhiên liệu hóa thạch truyền thống nhằm góp phần đảm bảo an ninh năng lượng và bảo vệ môi trường [2]
1 3 Vấn đề cố định nấm men trên giá thể và các phương pháp cố định
1.3.1 Định nghĩa về cố định tế bào vi sinh vật
* Cố định xúc tác sinh học là giới hạn sự vận động của chúng trong một không gian nhất định bằng các biện pháp vật lí và hoá học Trong đó, hành động giới hạn nhân tạo (có sự tác động của con người) vào sự vận động có thể đạt được bằng nhiều cách như:
- Kết nối các chất xúc tác sinh học với nhau,
- Gắn xúc tác sinh học trên các chất mang (vô cơ hoặc hữu cơ),
- Giam giữ xúc tác sinh học trong các lưới polymer,
- Giam giữ các xúc tác sinh học giữa các màng ngăn cách
Theo các tác giả Giang Thế Bính và cộng sự (1996); Sanches E N V và cộng sự (1996) giới thiệu trong các công trình thì cố định tế bào cũng được hiểu là sự giam giữ các tế bào trong một không gian phản ứng mà vẫn giữ được tính chất xúc tác của chúng và làm cho chúng được tái sử dụng nhiều lần hoặc liên tục để sản xuất những sản phẩm theo mong muốn [4]; [26], [36], [49], [86]
*Yêu cầu đối với chất mang:
- Chất mang vi sinh vật phải chứa đựng được trong đó một lượng vi sinh vật đủ lớn
mà vẫn tiến hành được lên men không cần qua giai đoạn logarit
- Có độ bền vững khi tiếp xúc với nước, chất mang đó không vỡ ra
- Môi trường dinh dưỡng pha lỏng có thể chuyển dịch một cách dễ dàng trong chất mang đó nhưng vi sinh vật lại khó chui ra trong môi trường lên men
- Các chất mang phải được tái sử dụng nhiều lần
1.3.2 Các phương pháp cố định tế bào nấm men
1.3.2.1 Phương pháp liên kết hấp phụ
Đây là phương pháp cổ nhất và đơn giản nhất làm cho các tế bào bám vào bề mặt của các chất mang không hoà tan trong nước Quá trình hấp phụ của tế bào lên bề mặt của các
Trang 27chất mang là quá trình vật lý có sự tham gia của một số lực liên kết Đó là tác dụng qua lại của các lực liên kết dạng nước, liên kết cầu hyđro và liên kết ion khác cực Các chất hấp phụ có nhiều: hữu cơ, vô cơ và polymer tổng hợp [4],[13],[14], [37], [46], [58]
Ưu điểm của phương pháp hấp phụ là đơn giản và ít ảnh hưởng tới cấu hình của các chất xúc tác sinh học của tế bào
Nhược điểm của phương pháp là lực liên kết hấp thụ tương đối yếu Các tế bào có thể
dễ bị giải hấp khi có sự thay đổi về nhiệt độ, đặc biệt là khi có sự thay đổi về nồng độ ion hay nồng độ cơ chất Vì vậy, khi áp dụng phương pháp này cần đặc biệt chú ý đến điều kiện phản ứng
1.3.2.2 Phương pháp liên kết ion
Phương pháp này dựa trên nguyên lý của lực hút tĩnh điện giữa các nhóm tích điện ngược chiều nhau của chất mang và chất xúc tác sinh học hay tế bào Trong trường hợp này, chất mang trước hết là nhựa trao đổi ion đã được bán rộng rãi trên thị trường Nhựa âm tích điện âm trên giá cơ bản của nó Nó mang ion âm như nhóm OH- chẳng hạn và có thể trao đổi với các ion âm khác như nhóm tích điện âm của enzym Ngược lại, nhựa dương mang điện tích dương và có thể trao đổi với nhóm tích điện dương của chất xúc tác sinh học hay của tế bào
Ưu điểm của phương pháp này tương tự như phương pháp hấp thụ là ở chỗ dễ thực hiện Để thực hiện phương pháp này, người ta chỉ cần cho một chất mang vào trong dung dịch hoặc dịch huyền phù của chất xúc tác sinh học và khuấy một thời gian hoặc cho dung dịch chứa chất xúc tác sinh học chảy qua chảy lại chất mang [4],[13],[14], [37], [46], [58]
1.3.2.3 Phương pháp liên kết nguyên tử
Ở đây xuất hiện những đôi điện tử góp chung của các nguyên tử Điều đó có thể được tận dụng để tạo nên các mối nối tương đối bền giữa các chất xúc tác sinh học với nhau hoặc giữa các chất xúc tác sinh học với các chất mang Tuy thế, chỉ có sự liên kết đơn độc là không
đủ để nối các đơn vị xúc tác sinh học lớn, ví dụ các tế bào nguyên vẹn hoặc cơ quan nguyên vẹn Những chất xúc tác sinh học phức tạp như thế đòi hỏi phải có sự liên kết ở nhiều vị trí khác nhau Liên kết nguyên tử phần lớn được dùng để cố định các enzyme chứ ít dùng để cố định tế bào nguyên vẹn Nhược điểm thường thấy của phương pháp này là các chất xúc tác sinh học phải chịu một gánh nặng cơ học
Chịu trách nhiệm về việc liên kết nguyên tử có thể là các nhóm hoạt động sẵn có trong các chất xúc tác sinh học như nhóm protein, các nhóm - và - amino, cacboxyl, sunfuahydryl, hydroxyl, imidazol và phenol Một số nhóm này, ví dụ như nhóm SH và nhóm
- amino có thể trực tiếp phản ứng với các nhóm thích hợp của các chất mang Những nhóm
Trang 28khác, ví dụ nhóm OH- về nguyên tắc, trước hết phải được hoạt hoá trước khi đi vào liên kết với các nhóm của chất mang
Sự liên kết giữa chất mang và xúc tác sinh học có thể được thực hiện hoặc qua liên kết trực tiếp giữa các nhóm thành phần hoặc qua một cầu nối trung gian ít nhiều dài hơn gọi là cánh tay trung gian "Cánh tay" trung gian làm cầu nối trung gian giữa chất mang và chất xúc tác tạo ra
sự linh hoạt lớn của các chất xúc tác đã liên kết làm cho hoạt lực của chúng cao lên hơn hẳn so với các chất xúc tác ở gần chất mang (được hiểu là còn chưa liên kết) [4],[13],[14], [37], [46], [58]
Chất mang dùng cho phương pháp cố định nhờ liên kết nguyên tử
- Chất mang vô cơ
Thuỷ tinh xốp cố định papain, đất kiesele xốp cố định invectaza nấm men và thuỷ tinh borosilikat cố định Entero - bacteriae
- Chất mang polymer tự nhiên
Xenlulaza, dextran, tinh bột, thạch Trong trường hợp dùng thạch và dextran, phần lớn phải qua một khâu gọi là liên kết chéo bằng epichlorhydrin để được bền hơn Các sản phẩm
đã được liên kết chéo là sephadex và sepharoza trên cơ sở kích thước lỗ xốp nhất định và có khả năng ứng dụng rộng rãi trong kỹ thuật tạo gel Có nét chung là các chất cao phân tử tự nhiên đều chứa nhiều nhóm OH- Đương nhiên là khả năng hoạt động của các nhóm này không đủ để gây nên sự biến đổi với phần protein của enzim
- Chất mang polymer tổng hợp
Dùng chủ yếu cho cố định enzyme, và ít dùng cho cố định tế bào nhưng vẫn phải tiến hành quá trình hoạt hoá
1.3.2.4 Phương pháp liên kết chéo
Ở đây các chất xúc tác sinh học liên kết với nhau qua các nhóm hai hoặc nhiều chức năng của chất mang Qua đó xuất hiện hỗn hợp các chất không tan đặc trưng và có phân tử lượng rất cao Người ta thấy trong hỗn hợp này chứa đựng cả hai thành phần hoạt động và không hoạt động
Ưu điểm của phương pháp là dễ tiến hành, nhưng nhược điểm là các sản phẩm cố định phần lớn thường là các vật thể dẻo và kém bền Các hợp chất dùng để liên kết chéo dòng thường glutardiandehyt, thường gọi là glutarandehyt, hexamethylen disocyanat hay tolueldiisocyanat [4],[13],[14], [37], [46], [58]
1.3.2.5 Phương pháp bao trong gel
Ở đây các chất xúc tác sinh học được bọc trong các chất polime tự nhiên hay tổng hợp
có khả năng gel hóa Điều kiện tiên quyết cho sự hoạt động của các chất xúc tác sinh học đã được cố định như thế là các cơ chất và sản phẩm của phản ứng có thể đi qua màng bao Mặt
Trang 29khác các lỗ hổng của màng bao không được quá lớn, bởi vì phải giữ các chất xúc tác sinh học ở lại bên trong
Hình dáng bề ngoài của các chất xúc tác sinh học đã được cố định theo phương pháp bọc gel có thể thay đổi trong một giới hạn tuỳ theo yêu cầu, ví dụ hình cầu, hình trụ, sợi mảnh hay màng mỏng Thông thường, người ta thích dùng dạng hình cầu hoặc dạng sợi alginate, gelatin hay k - carrageenan để cố định các tế bào sống
Các phương pháp cố định tế bào theo kiểu màng bao rất thích hợp cho việc cố định các tế bào sống hay mô tế bào hoạt động của động vật Các chất sau đây thường được dùng làm chất bao bọc tế bào: alginate, k - carrageenan, pectin, thạch và gelatin Đây là các chất polymer tự nhiên không độc, dễ tạo gel và không có hại cho tế bào Các chất này không thích hợp cho việc cố định enzym, bởi vì kích thước lỗ hổng của màng gel quá lớn, không thể giữ nổi phân tử enzym ở lại bên trong [10], [20], [21], [70]
Nhược điểm khác của phương pháp là ở chỗ tính không bền vững khi có mặt các ion cạnh tranh với ion cần cho sự tạo gel Ví dụ, khi dùng Na - Alginate làm chất bao bọc thì sự tồn tại ở mức cao của ion Na+ là một trở ngại đối với sự bền vững của gel vì Na+ có thể cạnh tranh
vị trí với Ca+2 và nếu hai ion này đổi chỗ cho nhau thì gel sẽ bị hoà tan Tương tự, ion phosphat cũng có khả năng cạnh tranh với ion Ca+2 và làm ảnh hưởng tới độ bền của gel
1.3.2.6 Các phương pháp cố định vi sinh vật trên chất mang celluloza vi khuẩn
a Phương pháp hấp phụ
Theo tác giả Klibanov A.M (1983) thì sự hấp phụ tế bào lên bề mặt celluloza vi khuẩn xảy ra là do chất mang có cấu trúc xốp, nhiều mao quản [65] Phương pháp này được thực hiện bằng cách ngâm chất mang trong dung dịch huyền phù vi sinh vật Celluloza vi khuẩn sẽ trương nở dần và vi sinh vật sẽ tự động kết lắng và hấp phụ trên bề mặt chất mang [58] [
Ngoài ra theo các tác giả Yao W., Wu X., Zhu., Sun B., Zhang Y.Y., Miller C (2011) thì trong quá trình cố định, celluloza vi khuẩn sẽ trương nở hoàn toàn, tạo điều kiện hấp phụ
tế bào nấm men tốt hơn so với những chất mang celluloza thực vật [104] Hiệu suất cố định khá cao, có khả năng ứng dụng lên men ở nhiệt độ thấp Nhược điểm của phương pháp hấp phụ là thời gian cố định dài, tỷ lệ thoát tế bào cao, các nghiên cứu cho thấy mật độ tế bào bên trong cấu trúc miếng celluloza vi khuẩn nhỏ hơn rất nhiều so với mật độ tế bào hấp phụ trên
bề mặt [23],[58],[100]
b Phương pháp hấp phụ - ủ
Vi sinh vật cố định trên celluloza vi khuẩn sau thời gian hấp phụ có thể sử dụng chất dinh dưỡng đã được khuếch tán vào trong cấu trúc của chất mang để tăng sinh khối trong giai đoạn ủ Qúa trình cố định gồm giai đoạn hấp phụ như đã nói ở trên, và giai đoạn ủ, tăng mật
độ vi sinh vật trong cấu trúc celluloza vi khuẩn Phương pháp hấp phụ - ủ không những đã
Trang 30làm tăng mật độ vi sinh vật trong chất mang lên nhiều lần, mà còn ổn định mật độ vi sinh vật
cố định trên chất mang trong một thời gian dài [9]
1.3.3 Các kỹ thuật cố định tế bào
Các tác giả Giang Thế Bính, Đặng Kim Tuyến và Kluas Korner (1996); Ngô Đăng Nghĩa (1997); Gilson, C.D.,Thomas, A., (1995) giới thiệu trong các công trình thì kỹ thuật cố định tế bào được thực hiện theo các nguyên tắc sau đây [4] [14]; [15]; [19]; [47]; [106]
Hình 1.4: Các kỹ thuật cơ bản để cố định tế bào
Trang 31Bảng1.3: ứng dụng của nấm men cố định trong sản phẩm thức uống chứa ethanol
Vang nho S.cerevisiae
S.cerevisiae S.bayanus C.stellala+
S.cerevisiae S.cerevisiae S.cerevisiae S.cerevisiae S.cerevisiae S.cerevisiae S.cerevisiae
DEAE-celluloza Khoáng kissiris Ca-alginate Ca-alginate Mảnh alumina Miếng táo Celluloza vi khuẩn Hạt lúa mì
Vỏ nho, lõi bắp Ca-alginate
Lommi H.et al., 1990 [70] Bakoyianis V.et al.,1992 [27]
Busova K.et al., 1994 [30] Ferraro L.et al., 2000 [44] Loukatos P.et.al., 2000[71] Kourkoutas Y.et.al., 2001 [67]
N.T.Hương.et.al.,2008[10] Kandylis P., 2010[60] Genisheva Z., 2011 [45] Kassim H.C,2012 [62]
Vang táo S.bayanus + L.oenos Ca-alginate Nedovic V.A et.al., 2000
[97]
Bia nồng độ cao S.cerevisiae Ca-alginate Tran Q H., et al., 2008 [20]
Kỹ thuật cố định tế bào nấm men phổ biến nhất hiện nay là bao gói tế bào trong khuôn được tạo ra từ gel của một loại polymer không độc (ví dụ như: alginate, chitosan, thạch, pectin, gelatin, silicagel…) Kỹ thuật này được thực hiện sau khi tế bào nấm men phát triển trong môi trường dinh dưỡng để cho các tế bào này có thể xâm nhập và chiếm đầy trong khuôn [69]
Theo tác giả Ngô Đăng Nghĩa (2004) và tác giả Olav (1990) giới thiệu trong các công trình thì cho rằng alginate được sử dụng để cố định nhiều loại tế bào sống khác nhau như vi khuẩn, tảo, tế bào thực vật và tế bào của động vật có vú để sản xuất ra rất nhiều loại sản phẩm khác nhau từ ethanol, bia, alkaloid, insulin và interferon [13], [85] Ngoài ra theo Nedovic và cộng sự (2005) cho rằng có hơn 80% các nghiên cứu trên thế giới về cố định tế bào đã sử dụng chất mang alginate [97]
Thông thường, người ta thường sử dụng calcium để làm ion tạo gel Quá trình tạo gel của alginate được tiến hành theo phương pháp tạo gel từ bên ngoài
Cơ chế tạo gel theo phương pháp tạo gel từ bên ngoài
Đây là phương pháp tạo gel phổ biến nhất của alginate Phương pháp này có ưu điểm là tạo gel nhanh và thao tác rất đơn giản (Hình 1.5 ) [16], [21], [90], [92]
Khi nhỏ dung dịch alginate vào dung dịch có chứa cation có khả năng tạo gel (thường gặp nhất là Ca2+), bề mặt ngoài của hạt alginate sẽ lập tức bị gel hóa Tiếp theo đó, các cation tạo gel ở bên ngoài hạt alginate tiếp tục khuếch tán vào bên trong hạt làm cho các phân tử alginate
Trang 32bên trong tiếp tục bị gel hĩa Quá trình này xảy ra trên bề mặt hạt và phát triển vào bên trong [89], [90], [91].
Hạt gel Cacium Alginate
Alginate
CaCl 2
Na-Alginate Lực đẩ y
Hình 1.5: Cơ chế tạo gel của alginate theo phương pháp tạo gel từ bên ngồi
1.3.4 Chất mang Alginate
1.3.4.1 Sự phát hiện ra alginate và cơng dụng ban đầu của alginate
Những nghiên cứu khoa học đầu tiên về chiết xuất alginate từ rong biển màu nâu đã được nhà hố học người Anh tên là E C Stanford tiến hành vào cuối thế kỷ 19 Ơng phát hiện
ra rằng hợp chất chiết xuất gọi là algin cĩ những tính chất rất hữu ích Đĩ là khả năng làm đặc dung dịch, tạo màng mỏng và tạo gel Tuy thế, việc sản xuất alginate quy mơ cơng nghiệp mãi tới sau những năm 50 vẫn chưa được tiến hành [14]
Ngày nay, alginate được coi là một trong những polymer sinh học đa năng được dùng rộng rãi trong cơng nghiệp Nĩ được dùng để làm đơng đặc các dung dịch, làm bền các huyền dịch và nhũ dịch và tạo gel một phạm vi rộng các hỗn hợp và tạo màng mỏng trên nhiều bề mặt khác nhau Alginate đã được nhiều hãng của nhiều nước sản xuất trên quy mơ lớn Trong đĩ Protan là một hãng dẫn đầu thế giới Hãng này phối hợp sản xuất linh hoạt với cơ giới hố cao bằng các nguồn lực khổng lồ cả trên phương diện chất lượng lẫn số lượng [15],[ 40],[41], [42], [54]
Trang 33Pseudomonas Alginate có nhiều trong các loại tảo ở ven bờ biển Trung Quốc, Nhật, Úc, Niu
– Di - Lân, Anh, Na uy, Chi lê, Mỹ, Nam Phi và Việt Nam [14], [15]
Alginate thương phẩm được sản xuất từ các nguồn sau: Laminaria hyperborea, Macroytic pyriferia, Aspophyllum nodosum, Laminaria digitata, Laminaria japonica, Eclonia negrescens và Sargssum sp Hãng Protan thu hái Laminaria hyperborea dọc theo bờ biển phía
tây Na Uy Nơi đây, tảo nâu phát triển thành khu rừng lớn ở độ sâu từ 2 - 40m Người ta đã chế tạo ra các máy đặc biệt để thu hái chúng Việc phối hợp thu hoạch cơ học với sự điều khiển thận trọng diện tích trồng trọt đã tạo cho Protan có một nguồn cung cấp nguyên liệu thô bền vững, không hề có thảm họa thiếu nguyên liệu Tình trạng tương tự cũng xảy ra đối với
việc cung cấp loại tảo nâu khác như Ascophyllum nodosum ở bờ biển Na Uy Loại tảo này
được dùng trong sản xuất alginate tại nhà máy Na Uy và tảo thu hái ở bờ biển của Novascotia cung cấp nguyên liệu cho nhà máy ở Canada Công việc thu hoạch tảo nâu của Protan được tiến hành phù hợp với các nguyên tắc sinh học [89]
Trong nguyên liệu dùng để chế tạo alginate có rất nhiều tạp chất có hại cho sự phát triển của vi sinh vật, đó là iốt, sắt, cobalt, nickel, đồng, arsen và thuỷ ngân Trong sản xuất các alginate thương mại, người ta đã tiến hành nhiều quá trình rửa một cách kỹ lưỡng, qua đó có thể giảm đáng kể nồng độ kim loại nặng Trong ứng dụng sinh hoá học, sự có mặt của các nguyên tố kim loại nặng có thể làm giảm hoặc ức chế hoạt lực của tế bào hoặc enzym Sự độc hại của các nguyên tố và muối của chúng là một lĩnh vực rất phức tạp, và khó có thể đưa ra được những hướng dẫn riêng biệt Hợp chất tự nhiên khác như polyphenol và protein có thể là một vấn đề đối với những ứng dụng có yêu cầu cao Trong sản xuất và tiêu thụ alginate, Protan cũng như nhiều hãng khác đã thu được nhiều kinh nghiệm và nhận biết được các vấn
đề đặt ra ở trên và đã tinh chế alginate thêm một bước để dùng cho lĩnh vực cố định xúc tác sinh học Pronova là một loạt sản phẩm được thiết kế riêng cho công nghệ sinh học của Protan
để cho các nhà nghiên cứu có thể lựa chọn khi làm việc với alginate ở mọi quy mô sản xuất kể
cả các tế bào nhạy cảm Loại sản phẩm mới này tạo ra những gel có độ bền tốt và trong suốt rất ít tạp chất Đối với việc cố định các tế bào rất nhạy cảm, Protan đã thiết kế dạng sản phẩm invitro (trong ống nghiệm) Dạng này là kết quả của nhiều công việc xử lý tiếp theo Nó giữ được độ bền gel cao, nhưng có tạp chất rất thấp Ưu điểm đặc biệt của dạng sản phẩm này là nồng độ các chất không hoà tan rất thấp, thuận lợi cho việc thanh trùng theo phương pháp siêu lọc [32]
Điều đặc biệt quan trọng đối với tất cả các alginate siêu sạch dùng cho cố định xúc tác
sinh học là chúng được sản xuất từ tảo nâu Laminaria hyperborea Loài này có nồng độ
monome tạo gel cao là axit L - guluronic, có độ nhớt trong phạm vi rộng, quyết định độ bền tối đa cho gel [14], [23]
Trang 341.3.4.3 Đặc tính hoá lý của Alginate
a Cấu tạo hoá học
Alginate là một polymer tạo nên bởi hai loại monome liên kết với nhau Những monome này là mannuronat và guluronat Tỷ lệ và sự phân bổ những monome này qui định ở mức độ lớn các tính chất vật lý và hoá học của alginate Thành phần hoá học của alginate với mức độ nào đấy thì khác nhau và thay đổi giữa những loại tảo, giữa những phần khác nhau của cùng một cây và thay đổi theo mùa Tuy nhiên, nhờ lựa chọn các nguyên liệu có tính chất khác nhau, người ta có thể chế tạo nhiều loại alginate với các tính chất không đổi
Axit alginic là một copolymer mạch thẳng của axit (1- 4) - - D - mannuronic (M) và axit (1- 4) - - L - guluronic (G) Các dạng muối và ester của polysaccharid này nói chung được gọi là alginate Người ta đã biết rằng các đơn vị M và G liên kết với nhau thành từng khối và có thể có ba kiểu khác nhau của các khối đó: các polymer đồng nhất G, M và polymer không đồng nhất G – M [16], [23], [88], [89], [124]
Hình 1.6: : Cấu trúc của alginate
Đối với việc ứng dụng hoặc sự nghiên cứu khoa học nào đó, thông tin quan hệ tới thành phần hoá học chi tiết có thể là rất quan trọng và có thể nhận được nhờ máy quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR - Spectroscopy) Bằng cách này, có thể xác nhận sự có mặt của
M, G cũng như GG, MM, MG và GM Phần trăm của GG biểu thị phần trăm của tất cả các đôi monome có hai đơn vị monome guluronat liền nhau Nhờ phân tích cộng hưởng từ hạt nhân, người ta nhận được thông tin về các đơn vị kề bên nhau [13], [81]
b Độ nhớt của alginate
Khi còn nằm trong vách tế bào, alginate có độ nhớt rất cao nhưng khi tách chiết bằng phương pháp khác nhau, nó bị giảm độ nhớt Độ nhớt là một trong những chỉ tiêu quan trọng
để đánh giá chất lượng của alginate
Độ nhớt của alginate phụ thuộc vào nhiệt độ Khi nhiệt độ tăng độ nhớt giảm khoảng 2,5% cho 10C Khi làm nguội độ nhớt quay về giá trị ban đầu nhưng thấp hơn một ít Tuy nhiên, nếu duy trì ở nhiệt độ 500C trong nhiều giờ thì sẽ làm alginate bị cắt mạch và giảm độ
Trang 35nhớt Trái lại, khi hạ nhiệt độ đến khi đông đặc và sau đó rã băng sẽ không làm alginate bị giảm độ nhớt
Độ nhớt của dung dịch alginate không bị ảnh hưởng trong khoảng pH từ 5 - 11 khi pH giảm xuống khoảng 3 - 4 thì dung dịch alginate sẽ tạo thành gel [89]
c Cơ sở hoá học của tính chất vật lý
Việc quay tròn quanh những mối liên kết riêng kể cả liên kết glycoside trong alginate đôi khi gặp trở ngại, làm cho các mạch bị cứng Các dung dịch phân tử lớn bị cứng này có thể
có độ nhớt cao và ở nồng độ xác định, các mạch càng dài thì độ nhớt càng cao Người ta chỉ
ra rằng, hàm lượng các khối G nhiều hơn hàm lượng các đơn vị G có quan hệ trực tiếp tới độ bền của gel Độ bền của gel biểu thị tính chắc của gel tạo nên theo một phương pháp nhất định Việc tạo gel chứa lỗ hổng hình thành giữa những đơn vị G kề nhau rất vừa với ion hoá trị hai như Ca+2 chẳng hạn Vì thế, hai hoặc nhiều mạch có thể liên kết với nhau, cạnh kề cạnh tạo nên các cầu muối giữa các block G theo kiểu mô hình "hộp trứng" Sau đó gel tạo thành một mạng lưới gồm các "hộp trứng" nối liền nhau theo mọi hướng bởi các mạch "tự do" không phức tạp Như vậy, các thành phần dung dịch sẽ liên kết lại và trở nên đông đặc Các phần tử nước bên trong mạng lưới gel có thể chuyển động tự do Điều này rất quan trọng trong việc ứng dụng cố định tế bào Số lượng tương đối các dạng block khác nhau, độ dài và các hình thức phân bổ của chúng nội trong mỗi một phân tử cũng như chiều dài toàn mạch và
sự phân bổ độ dài mạch thì thay đổi đáng kể nội trong một mẫu [88], [89]
Do mối quan hệ phức tạp giữa thành phần hoá học và sức bền gel cũng như giữa độ dài mạch/phân bổ độ dài và độ nhớt, người ta thường đặc trưng chất lượng alginate bằng độ bền gel và
Trước kia người ta cho rằng việc tạo gel đơn giản chỉ là liên kết ion giữa các nhóm carboxyl của hai chuỗi polymer gần nhau thông qua ion tạo gel như Ca+2 Nhưng những nghiên cứu gần đây cho thấy sự liên kết phức tạp hơn, cả với nhóm hydroxyl Hiện nay mô hình tạo gel được chấp nhận rộng rãi nhất là mô hình vỉ trứng
Trang 36Hình 1.7 Mô hình tạo gel dạng vỉ trứng của alginate canxi
Do cấu trúc đặc biệt của đoạn mạch GGG, nó tạo thành dạng gấp nếp như một cái vỉ trứng, kích thước của khoảng trống này phù hợp với kích thước của ion Ca+2 Các ion có kích thước lớn hơn ion Ca+2 sẽ cho liên kết mạnh hơn còn các ion có kích thước nhỏ hơn sẽ không tạo thành gel theo mô hình này Ái lực của các ion đối với alginate theo thứ tự sau: Pb2+>Cu2+
>Cd2+ > Ba2+ > Sr2+ > Ca2+ > Co2+ [89]
Việc tạo gel chủ yếu được thực hiện ở các phân đoạn polyguluronic Do đó những alginate có tỷ lệ polyguluronic cao sẽ tạo gel tốt hơn, hạt gel cứng chắc hơn [54]
Hình 1.8 Sự liên kết của ion Ca ++ với các gốc guluronic
Alginate sẽ tạo gel với các ion Ca+2 dưới các điều kiện trung tính hoặc liên kết axit alginic/Ca - Alginate dưới điều kiện axit Việc tạo gel phải rất thận trọng và được kiểm tra bởi
sự giải phóng các ion đã cho vào dung dịch Alginate Cả hai loại gel (axit và Ca) đều không thuận nghịch khi gặp nhiệt Một gel không thuận nghịch lúc gặp nhiệt có thể được tạo nên
Trang 37dưới các điều kiện axit nhờ liên kết alginate và pectin khi vắng mặt ion can xi Tính chất đặc biệt nhất của alginate là chúng tạo nên gel bền nhiệt từ một dung dịch lạnh [54], [89], [101]
* Tạo gel dưới điều kiện trung tính
Dưới các điều kiện này, một hỗn hợp chứa alginate sẽ gel hoá nhờ nhúng sâu vào hoặc phun bằng một dung dịch muối can xi, thường là CaCl2 Các ion Ca+2 khuếch tán vào pha có chứa alginate, gây ra hiện tượng tạo gel của Ca - Alginate Quá trình này đặc biệt thích hợp đối với các vật liệu có kích thước mỏng và nhỏ, hoặc tạo ra một sự bao bọc mỏng trên bề mặt của sản phẩm Quá trình gel hoá có thể được tăng tốc nhờ nâng cao nồng độ Ca+2 trong dung
dịch [89]
b Độ bền hoá lí của Ca+2 - alginate gel
- Độ bền cơ học: của các hạt Ca - Alginate thay đổi rất nhiều theo cấu tạo của chúng Các hạt alginate có hàm lượng axit - L - guluronic cao hơn 70% và độ dài trung bình của khối G khoảng trên 15 thì có độ bền cơ học cao nhất Đối với các alginate mà phân tử polime
có trọng lượng trên giá trị cho phép, độ bền cơ học của gel được xác định chủ yếu bởi cấu trúc khối và thành phần hoá học và phụ thuộc vào trọng lượng phân tử Tuy nhiên, điều này không đúng đối với các alginate có trọng lượng phân tử thấp vốn dễ thanh trùng qua lọc do độ nhớt thấp Nếu phân tử lượng mà thấp hơn giá trị tới hạn nào đó, thì khả năng tạo gel của alginate
sẽ giảm Trọng lượng phân tử tới hạn phụ thuộc vào nồng độ của alginate
- Độ đục của alginate thường có giá trị ngược với độ bền của chúng, gel trong suốt là
do dùng alginate với hàm lượng G > 60% Alginate gel thì bền trong dung môi hữu cơ và do vậy, có tiềm năng to lớn trong cố định enzym [14]
- Độ bền hoá học: Ca - Alginate gel rất nhậy cảm với các hợp chất như phosphat, xitrat, lactat hoặc các ion dương chống lại sự gel hoá Na+ hoặc Mg+2 Tuy nhiên, có thể làm tăng độ bền của các gel alginate nhờ vào việc thay ion Ca+2 bằng các ion dương hoá trị 2 khác có ái lực cao hơn đối với alginate như: Pb>Cu>Cd>Ba>Sr>Ca>Co = Ni+Zn>Mn Độ bền cơ học của các hạt alginate gel có liên quan đến ái lực của các ion dương Người ta thấy rằng, độ cứng của alginate gel nói chung tăng theo dãy ái lực sau (trừ Cd và Ni): Pb>Cu =Ba>Cd>Ca>Ni>Zn>Co Tuy nhiên, phần lớn các ion trên đều độc đối với các tế bào sống Do vậy, chỉ có số ít ion dương trên dùng được mà thôi Đã có thông báo cho biết, độ bền của alginate gel tăng lên khi dùng
Sr+2, Ba+2, Ti+3, Al+3 và Fe+3 thay cho Ca+2 Loại Al+3 thường dùng nhất là Al(NO3)3 [89]
Một cách tiếp cận khác nhằm làm tăng độ bền của các alginate gel là liên kết nguyên
tử nhờ các kĩ thuật đặc biệt những liên kết chéo dòng trực tiếp các nhóm cacboxyl và nối các nguyên tử của alginate với các polymer tổng hợp Điều này làm cho các gel bền hơn và ổn định hơn
c Quy trình tạo hạt gel Ca – alginate
Trang 38Theo các tác giả Ngô Đăng Nghĩa (1998); Trần Quốc Hiền (2012) giới thiệu trong các công trình thì quy trình tạo hạt gel Ca- Alginate được thực hiện theo các bước sau đây [16], [21]
Ưu nhược điểm của việc cố định nấm men trong gel alginate
Hình 1.9 Quy trình tạo hạt gel Ca-alginate
nước vô khuẩn
nước vô khuẩnNấm men
Nhân giống
Ly tâm
Pha loãng thành huyền phù
Na-alginate
Tạo dung dịch
Thanh trùng
Làm nguội
Phối trộn theo tỷ lệ giữa dịch nấm men/dịch Na-Alginate
Tạo hạt trong dung dịch
Rửa – ngâm hạt
Hạt gel cố định nấm men
Trang 39* Ưu điểm:
- Quá trình cố định tế bào dễ thực hiện, điều kiện cố định ôn hòa, không phải xử lý nhiệt hay xử lý hóa chất Do đó, các tế bào cố định không bị mất hoạt tính [24], [32], [63], [64].]
- Alginate là chất mang trơ về mặt hóa học và không có độc tính, nó thích hợp cho các sản phảm thực phẩm [24] Gel alginate vẫn giữ được độ bền khi nhiệt độ lên men cao
và độ xốp của mạng gel thuận lợi cho việc khuếch tán cơ chất và sản phẩm
*Nhược điểm:
- Độ bền gel giảm theo thời gian lên men
- Không bền hóa học trong dung dịch điện phân và dung dịch có pH cao
1.3.5 Một số chất mang khác
1.3.5.1 Chất mang xanthan gum
a Sự phát hiện và công dụng của xanthan gum
Cách đây rất lâu, con người đã tìm hiểu được rằng các loài xanthomonas có thể sản
xuất ra những khối sền sệt Cuối năm 1950, xanthan đã được phát minh tại Northern Reaseach Center (NRRC), Peoria, Illinois Allene Rosalind Jeanes và cộng sự của bà ở Viện Nông Nghiệp Hoa Kỳ (United States Department of Agriculture) đã tổ chức cuộc kiểm tra các loài
vi sinh vật có khả năng sản xuất ra các loại gum tan trong nước, trong số đó xanthan là một polysaccharide tổng hợp bằng phương pháp sinh học mà có tiềm năng ứng dụng rất lớn so với các loại gum tan trong nước được sản xuất bằng phương pháp tự nhiên Đầu những năm 1960, xanthan trở thành sản phẩm thương mại bởi công ty Kelco với tên thương mại là Kelzan (theo Whistler) nhưng không thích hợp cho thương mại mãi đến năm
1964 Năm 1969, xanthan đã được tổ chức FDA (the American Food and Drug Administration) cho phép sử dụng làm phụ gia thực phẩm sau những nghiên cứu và thử nghiệm trên động vật Nó được phép sử dụng ở các nước: Hoa Kỳ, Canada, Châu Âu (1982)
Số kí hiệu là E415 Các công ty sản xuất xanthan nổi tiếng: Merck, Pfizer và Kelco của Mĩ, Rhône Poulenc và Sanofi-Elf của Pháp, Jungbunzlauer của Úc [113],[118], [121]
b Cấu tạo và tính chất của xanthan gum
- Cấu trúc cơ bản: Một mạch chính là celluloza (các phân tử glucoza liên kết β-(1,4)) và 1 mạch bên trisaccharide Mỗi đơn vị β-D-glucopyranosyl trên mạch chính được liên kết với 1 đơn vị β-D-glucopyranosyl –(1–>4)- β -D- glucuronopyranosyl – (1–>2)-6-O-acetyl- β -D-mannopyranosyl trisaccharide Khoảng ½ đơn vị β-D-glucopyranosyl tận cùng có acid pyruvic liên kết như là 4,6-cyclic acetal Mạch bên tương tác với mạch chính (nhờ lực liên kết thứ hai) để hình thành một phân tử khá cứng Mạch bên trisaccharide: 2 phân tử mannoza được tách biệt nhờ 1 phân tử glucuronic acid Phân nữa nhóm mannoza tận cùng liên kết với
Trang 40nhóm pyruvate và phân nữa còn lại có chứa nhóm acetyl Những nhóm carboxyl ở mạch bên thể hiện tính anion của phân tử gum [113],[118], [121]
- Tính chất của xanthan gum: dung dịch xanthan gum 1% có độ nhớt tương đương với 100 lần độ nhớt của gelatin với nồng độ như nhau Vì vậy, tính làm dày và độ nhớt của nó là rất lớn Đặc trưng độc đáo của lưu biến pseudoplastic là trong cùng một nhiệt độ, xanthan gum
có thể làm thay đổi đảo ngược giữa sol và gel theo những thay đổi của các nguồn cơ khí bên ngoài Vì vậy, nó là một chất ổn định nhũ hóa có hiệu quả cao Sự ổn định tốt với nhiệt độ và
độ pH là trong một phạm vi nhiệt độ lớn (-18-1200C ) và pH (2-12), xanthan gum có thể giữ
độ nhớt và hiệu suất ban đầu của nó
Hình 1.10: Cấu trúc của xanthan gum
Khả năng tương thích xanthan gum có thể hình thành một hệ thống làm dày ổn định với axit, kiềm, muối, chất bảo quản, chất làm đặc, oxy hóa, và các hóa chất khác Theo tỷ lệ thích hợp,
nó có thể sở hữu lưu biến rõ ràng khi kết hợp với locust bean gum và các loại gum khác
[113],[118], [121]
1.3.5.2 Chất mang K- carrageenan
a Sự phát hiện ra Carrageenan và công dụng ban đầu của chúng
Carrageenan bắt đầu được sử dụng từ hơn 600 năm trước đây Trên bờ biển phía nam
của Ireland, trong một làng mang tên Carragheen, người ta lấy dịch chiết từ rêu Irish moss (loài rong đỏ Chondrus crispus) nấu bánh phết mứt Tới năm 1837, người ta lấy tên làng này
đặt tên cho dịch chiết ấy Từ đó polysaccharide chiết từ rong đỏ được gọi là carrageenin, nay gọi là carrageenan Theo phân loại khoa học, carrageenan chính là polysaccharide của galactoza, được gắn thêm nhiều nhóm sulphat, gọi là galactan sulphat
Vào những năm 30 của thế kỷ XX, Irish moss được sử dụng đầu tiên trong công
nghiệp bia và hồ sợi Chiết phân đoạn của carrageenan thô được thực hiện vào những năm 50