Nghiên cứu cố định tế bào lactobacillus acidophilus giàu b galactosidase

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN THỊ HƯƠNG NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH TẾ BÀO LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS GIÀU β-GALACTOSIDASE Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số : 605402 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, tháng năm 2012 CƠNG TRÌNH ĐƢỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA–ĐHQG-HCM Cán hƣớng dẫn khoa học : TS TRẦN BÍCH LAM Cán chấm nhận xét : PGS.TS LÊ VĂN VIỆT MẪN Cán chấm nhận xét : PGS.TS NGUYỄN THÚY HƢƠNG Luận văn thạc sĩ đƣợc bảo vệ Trƣờng Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 16 tháng 08 năm 2012 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: PGS.TS ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO : Chủ tịch Hội đồng PGS.TS LÊ VĂN VIỆT MẪN : Phản biện PGS.TS NGUYỄN THÚY HƢƠNG : Phản biện TS TRẦN BÍCH LAM : Ủy viên TS LẠI QUỐC ĐẠT : Thƣ ký Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV Trƣởng Khoa quản lý chuyên ngành sau luận văn đƣợc sửa chữa CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƢỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: NGUYỄN THỊ HƢƠNG MSHV: 10110179 Ngày, tháng, năm sinh: 10/12/1987 Nơi sinh: Quảng Ngãi Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm đồ uống Mã số : 605402 I TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH TẾ BÀO LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS GIÀU β-GALACTOSIDASE II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:  Điều kiện tạo sinh khối tế bào Lactobacillus acidophilus giàu β-galactosidase  Xác định vị trí enzyme β-galactosidase tế bào  Khảo sát tính tạo thấm cho tế bào  Cố định tế bào chứa β-galactosidase đƣợc tạo thấm alginate  Xác định tính chất chế phẩm  Ứng dụng thủy phân lactose sữa III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 06/02/2012 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 30/06/2012 V CÁN BỘ HƢỚNG DẪN : TS TRẦN BÍCH LAM Tp HCM, ngày 16 tháng 08 năm 2012 CÁN BỘ HƢỚNG DẪN (Họ tên chữ ký) CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO (Họ tên chữ ký) TRƢỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC (Họ tên chữ ký) LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến TS Trần Bích Lam Cơ tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ, động viên lúc em gặp trở ngại khó khăn, tạo điều kiện tốt để em hồn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn quý Thầy Cô Bộ môn công nghệ thực phẩm truyền đạt kiến thức, nhƣ kinh nghiệm quý báu suốt năm học trƣờng Em xin thành cảm ơn Chị Phƣợng, bạn Phòng thí nghiệm Vi sinh tạo điều kiện, chia sẻ động viên thời gian thực luận văn Con xin cảm ơn ba má, anh chị yêu thƣơng chỗ dựa vững mặt sống Xin cảm ơn thành viên Lớp Cao học thực phẩm 2010, nhƣ anh chị bạn bè thân quen chia sẻ, động viên giúp đỡ học tập nhƣ sống TP Hồ Chí Minh, ngày 16 tháng 08 năm 2012 NGUYỄN THỊ HƢƠNG TÓM TẮT LUẬN VĂN Trong luận văn này, nghiên cứu việc cố định tế bào Lactobacillus acidophilus tạo thấm alginate, bƣớc đầu thủy phân lactose sữa tƣơi Kết thu đƣợc nhƣ sau: 1- Hoạt tính β-galactosidase tế bào đạt 0.8U/ml canh trƣờng bổ sung vào môi trƣờng lên men thành phần nhƣ sau: tỷ lệ phần trăm cao nấm men cao thịt 6:1, nồng độ khoáng MgSO4.7H2O 6mM NaCl 2mM Lên men thời gian 50 2- Xác định vị trí enzyme β-galactosidase tế bào L acidophilus nhận thấy enzyme khơng có vách tế bào, periplasmic có 11.18%, màng tế bào chiếm 34.89% cytoplasmic chiếm 53.93% so với tổng β-galactosidase tế bào 3- Sau tạo thấm cho tế bào ethanol hoạt tính β-galactosidase tế bào đạt 554.12U/g tế bào khơ hay 0.837U/ml xử lý tế bào với ethanol 40%(v/v), nhiệt độ xử lý 37oC thời gian 10 phút 4- Hoạt tính cịn lại tế bào cố định gel alginate đạt 1.646U/g.CP dùng 13.59mg tế bào khô cố định 10ml dung dịch alginate 2% 5- Chế phẩm có hoạt tính β-galactosidase cao bền nhiệt độ 45oC pH tối ƣu 6.5 6- Chế phẩm có khả thủy phân 70% lactose sữa với tỷ lệ chế phẩm 0.216g (khối lƣợng khô) 10ml sữa sau giờ, chu kỳ đầu không làm thay đổi hiệu suất thủy phân lactose sữa LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu luận văn cơng trình nghiên cứu thực cá nhân đƣợc thực dƣới hƣớng dẫn khoa học TS Trần Bích Lam Các số liệu, kết luận nghiên cứu luận văn trung thực không trùng lặp với đề tài khác nhƣ chƣa đƣợc công bố dƣới hình thức nào, thơng tin trích dẫn luận văn đƣợc rõ nguồn gốc Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm nghiên cứu Học viên thực hiên NGUYỄN THỊ HƢƠNG i MỤC LỤC Nội dung Trang MỤC LỤC i DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT viii Chƣơng 1: GIỚI THIỆU Chƣơng 2: TỔNG QUAN 2.1 Khái quát L acidophilus 2.1.1 Phân loại 2.1.2 Đặc điểm hình thái 2.1.3 Cấu tạo vách màng tế bào 2.1.4 Đặc điểm sinh hóa 2.1.5 Điều kiện lên men 2.1.6 Vai trò L acidophilus sản phẩm sữa lên men 2.2 Enzyme β-galactosidase (EC 3.2.1.23/108) 2.2.1 Sơ lƣợc enzyme β-galactosidase 2.2.2 Nguồn gốc 2.2.2.1 Nguồn β-galactosidase từ động thực vật 2.2.2.2 Nguồn β-galactosidase từ vi sinh vật 2.2.3 Cấu trúc enzyme β-galactosidase 13 2.2.4 Cơ chế hoạt động β-galactosidase 14 2.3 Phƣơng pháp thủy phân lactose 15 2.3.1 Thủy phân lactose acid .15 2.3.2 Thủy phân lactose enzyme β-galactosidase .15 2.3.2.1 Thủy phân lactose sữa 16 2.3.2.2 Thủy phân lactose whey 16 2.3.2.3 Tổng hợp GOS 16 2.4 Kỹ thuật tạo thấm 17 ii 2.5 Kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật 20 2.5.1 Định nghĩa 20 2.5.2 Các phƣơng pháp cố định tế bào vi sinh vật .20 2.6 Alginate 21 2.6.1 Cấu tạo alginate 21 2.6.2 Độ hòa tan 22 2.6.3 Sự hình thành gel 23 2.6.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến khả tạo gel .25 2.6.5 Đặc tính hóa học 25 2.7 Một kết nghiên cứu cố định tế bào giàu β-galactosidase 26 Chƣơng 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 28 3.1 Vật liệu hóa chất 29 3.1.1 Giống vi sinh vật 29 3.1.2 Môi trƣờng nuôi cấy 29 3.1.3 Hóa chất 30 3.1.4 Sữa 31 3.1.5 Thiết bị dụng cụ 31 3.2 Sơ đồ nghiên cứu 30 3.3 Bố trí thí nghiệm 32 3.3.1 Lên men thu nhận tế bào L acidophilus giàu β-galactosidase 33 3.3.1.1 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng nguồn nitrogen 33 3.3.1.2 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng khống chất 33 3.3.1.3 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng thời gian lên men 33 3.3.2 Khảo sát tính tạo thấm cho tế bào L acidophilus 34 3.3.2.1 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng nồng độ ethanol 34 3.3.2.2 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ xử lý ethanol 34 3.3.2.3 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng thời gian xử lý ethanol 34 3.3.3 Cố định tế bào L acidophilus tạo thấm gel alginate 34 3.3.3.1 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng nồng độ gel alginate 34 3.3.3.2 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng tế bào khơ/gel alginate 35 iii 3.3.4 Tính chất chế phẩm 35 3.3.4.1 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ .35 3.3.4.2 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng pH .35 3.3.5 Ứng dụng thủy phân lactose sữa tƣơi .35 3.3.5.1 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng tỷ lệ chế phẩm 35 3.3.5.2 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng thời gian thủy phân 35 3.3.5.3 Khả tái sử dụng chế phẩm 35 3.4 Các phƣơng pháp phân tích .35 3.4.1 Phƣơng pháp định lƣợng tế bào vi sinh vật mật độ quang 35 3.4.2 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng tế bào khô 36 3.4.3 Phƣơng pháp xác định vị trí enzyme β-galactosidase tế bào .36 3.4.4 Phƣơng pháp chụp SEM (Scanning Electron Microscope) 38 3.4.5 Phƣơng pháp xác định hoạt tính β-galactosidase .38 3.4.6 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng lactose sữa 40 3.4.7 Phƣơng pháp xử lý số liệu 41 Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 43 4.1 Lên men thu nhận tế bào giàu β-galactosidase .44 4.1.1 Ảnh hƣởng nguồn nitrogen đến trình lên men thu tế bào giàu β-galactosidase 45 4.1.2 Ảnh hƣởng của thành phần chất khống đến q trình lên men thu tế bào giàu β-galactosidase .46 4.1.3 Ảnh hƣởng thời gian lên men đến trình lên men thu tế bào giàu β-galactosidase 49 4.2 Xác định vị trí β-galactosidase tế bào L acidophilus 50 4.3 Khảo sát tính tạo thấm cho tế bào L acidophilus 52 4.3.1 Ảnh hƣởng nồng độ ethanol đến tính tạo thấm cho tế bào 53 4.3.2 Ảnh hƣởng nhiệt độ xử lý ethanol đến tính tạo thấm cho tế bào .55 4.3.3 Ảnh hƣởng thời gian xử lý ethanol đến tính tạo tính thấm cho tế bào .56 iv 4.4 Cố định tế bào L acidophilus tạo thấm có hoạt tính β-galactosidase gel alginate 59 4.4.1 Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ gel alginate đến hoạt tính β-galactosidase tế bào L acidophilus tạo thấm 59 4.4.2 Khảo sát ảnh hƣởng hàm lƣợng tế bào gel alginate đến hoạt tính β-galactosidase .60 4.5 Tính chất chế phẩm 61 4.5.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt tính β-galactosidase chế phẩm 62 4.5.2 Ảnh hƣởng pH đến hoạt tính β-galactosidase chế phẩm 65 4.6 Khảo sát khả ứng dụng chế phẩm thủy phân lactose sữa 66 4.6.1 Khảo sát ảnh hƣởng tỷ lệ chế phẩm/thể tích sữa đến hiệu suất thủy phân lactose sữa tƣơi 66 4.6.2 Khảo sát ảnh hƣởng thời gian thủy phân đến hiệu suất thủy phân lactose sữa 67 4.6.3 Khả tái sử dụng 68 Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 70 Kết luận 71 Kiến nghị 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 PHỤ LỤC 84 79 [60] Naglak, T.J and Wang, H.Y (1990), “Recovery of a foreign protein from the periplasm of Escherichia coli by chemical permeabilization”, Enzyme Microb Technol, vol 12(8), pp.603-11 [61] Najla, O.A et al (2011), “Immobilization and Properties of β-Dgalactosidase from Bacillus licheniformis E66”, Journal of Applied Sciences Research, vol.7(12), pp.2448-2454 [62] Natarajan, J et al (2012), “Isolation and Characterization of βGalactosidase Producing Bacillus sp from Dairy Effluent”, World Applied Sciences Journal, vol.17, pp.1466-1474 [63] Neri, D.F.M et al (2008), “Immobilization of β-galactosidase from Kluyveromyces lactis onto a polysiloxane–polyvinyl alcohol magnetic (mPOS–PVA) composite for lactose hydrolysis”, Catalysis Communications, vol.9, pp.2334-2339 [64] Nguyen, T.H et al (2007), “Characterization and molecular cloning of a heterodimeric β-galactosidase from the probiotic strain Lactobacillus acidophilus R22”, FEMS Microbiology Letters, vol.269, pp.136-144 [65] Nickerson, T A et al (1975), “Colorimetric Estimation of Lactose and Its Hydrolytic Products”, Journal of Dairy Science , vol.59, pp.386-390 [66] Oliveira, C (2011), “Recombinant microbial systems for improved βgalactosidase production and biotechnological applications”, Biotechnology Advances, vol.29, pp.600-609 [67] Panesar, P.S (2010), “Enzymes in Food Processing-Fundamentals & Potential Applications”, Ik International Pvt Ltd, India, pp 57-58 [68] Panesar, P.S et al (2010), “Potential Applications of Immobilized lactase in Food Processing Industries”, Enzyme Research, vol.2010, 16 pages [69] Panesar, P.S et al ( 2007), “Lactose hydrolysis in whole milk using immobilized Kluyveromyces marxianus cells”, American Journal of Food Technology, vol.2 (4), pp.288-294 80 [70] Panesar, P.S et al (2007), “Permeabilization of Yeast Cells with Organic Solvents for β-galactosidase Activity”, Research Journal of Microbilogy, vol.2(1), pp.34-41 [71] Panesar, R (2011), “Hydrolysis of milk lactose in a packed bed reactor system using immobilized yeast cells”, J ChemTechnol Biotechnol, vol.86, pp.42-46 [72] Pavani, A et al (2011), “Optimization of edium omponents and Process Parameters for the Production of β-galactosidase from a Marine Fungal Isolate A flavus”, Journal Society of Applied Sciences, vol.2, pp.23-27 [73] Pawar,S.N and Edgar, K.J (2012), “Alginate derivatization: A review of chemistry, properties and applications”, Biomaterials, vol.33, pp.32793305 [74] Puri, M et al (2009), “Cell Disruption Optimization and Covalent Immobilization of β-D-galactosidase from Kluyveromyces marxianus YW1 for Lactose Hydrolysis in Milk”, Applied Biochemistry Biotechnology, vol.160, pp.98-108 [75] Puri, M et al (2010), “Cell disruption optimization and covalent immobilization of beta-D-galactosidase from Kluyveromyces marxianus YW-1 for lactose hydrolysis in milk”, Appl Biochem Biotechnol, vol.160, pp.98-108 [76] Purich, D.L and Allison, R.D (2000), “Handbook of biochemical kinetics”, Acdemic Press, London, pp.413 [77] Quinn, Z.K and Xiao, D.C (2001), “Immobilization of β-galactosidase on graphite surface by glutaraldehyde”, Journal of Food Engineering, vol.48, pp.69-74 [78] Rehm, B.H.A (2009), Alginates: Biology and Applications, Springer [79] Roy, I and Gupta, M.N (2003), “Lactose hydrolysis by LactozymTM immobilized on cellulose beads in batch and fluidized bed modes”, Indian Institute of Technology, vol.39, pp.325-332 81 [80] Shen, Q et al (2011), “Gelatin-templated biomimetic calcification for β-galactosidase immobilization”, Process Biochemistry, vol.46, pp.15651571 [81] Simpson, B.K (2012), “Food Biochemistry and Food Processing”, Euro: John Wiley & Sons, pp.479-480 [82] Singh, A.K and Singh, K (2012), “Study on Hydrolysis of Lactose in Whey by use of Immobilized Enzyme Technology for Production of Instant Energy Drink”, Advance Journal of Food Science and Technology, vol.4(2), pp.84-90 [83] Siso, M.I.G and Doval,S.D (1994), “Kluyveromyces lactis immobilization on corn grits for milk whey lactose hydrolysis”, Enzyme Microbiology Technology, vol.16, pp.303-310 [84] Somkuti, G.A and Steinberg, D.H (1995), “Permeabilized Streptococcus thermophilus in the preparation of low-lactose milk”, Biotechnology and Applied Biochemistry, vol.21, pp.23-29 [85] Sridhar, K.R (2009), Frontiers in Fungal Ecology Diversity and Metabolites, I.K International Publishing House Pvt Ltd, p.264-267 [86] Sriphannam, W et al (2012), “Medium component improvement for βgalactosidase production by a probiotic strain Lactobacillus fermentum CM33”, African Journal of Biotechnology, vol.11(51), pp.11242-11251 [87] Sufang, S and Xiaobing, X (2011), “Immobilization of Aspergillus oryzae β-galactosidase on Newly Prepared Porous Poly (GMA-ST)”, E-Journal of Chemistry, vol.8(3), pp.1232-1237 [88] Szczodrak, J (2000), “Hydrolysis of lactose in whey permeate by immobilized β-galactosidase from Kluyveromyces fragile”, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, vol.10, pp.631-637 [89] Tampion, J and Tampion, M D (1987), Immobilized cells: principles and applications, Cambridge studies in Biotechnology 5, University Press, Cambridge, pp.7 82 [90] Tanriseven, A and Dogan, S (2002), “Anovel method for the immobilization of β-galactosidase”, Process Biochemistry, vol.38, pp.2730 [91] Tharmaraj, N and Shah, N P (2003), “Selective enumeration of Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus rhamnosus and Streptococcus thermophilus, bifidobacteria, Lactobacillus casei, Propionibacteria”, Journal of Dairy Science, vol.86, pp.2288-2296 [92] Tzortzis, G (2005), “Synthesis of prebiotic galactooligosaccharides using whole cells of a novel strain Bifidobacterium bifidum NCIMB 41171”, Applied Microbiology and Biotechnology, vol.68, pp.412-416 [93] Üstok, F.I (2007), “Characterization, cloning, expression and application of bacterial beta-galactosidase”, M.A thesis, Institute of Technology, Izmir [94] Valero, J.I.S (2009), “Production of Galacto-oligosaccharides from Lactose by immobilized β-galactosidase and Posterior Chromatographic”, Ph.D dissertation, Univ of Ohio State [95] Vuyst, L, and Degeest, B (1999), “Heteropolysaccharides from lactic acid bacteria.”, FEMS Microbiol Rev., vol 23(2), pp.153-177 [96] Wen, Z et al (2012), “Construction and Secretory Expression of βGalactosidase Gene from Lactobacillus bulgaricus in Lactococcus lactis”, Biomed Environ Sci, vol.25(2), pp.203-209 [97] Winn, W.C and Koneman, E.W, (2006), “Koneman's color atlas and textbook of diagnostic microbiology”, Lippincott Williams & Wilkins, London, pp.1454 [98] Won, K et al (2005), “Optimization of lipase entrapment in Ca-alginate gel beads”, Process Biochemistry, vol.40, pp.2149-2154 [99] Yang, S.T (2007), “Bioprocessing for Value-Added Products from Renewable Resources: New Technologies and Applications”, 1st Edition, New Technologies and Applications, Elsevier Science, pp.374 83 [100].Zhang, S et al (2010), “Immobilization of β-Galactosidase onto Magnetic Beads”, Journal Applied Biochemistry and Biotechnology, vol.160, pp.1386-1393 [101].Zhou, Q.Z.K and Xiao, D.C (2001), “Effects of temperature and pH on the catalytic activity of the immobilized β-galactosidase from Kluyveromyces lactis”, Journal Biochemical Engineering, pp.33-40 [102].Zhou, Q.Z.K and Chen, X.D (2001), “Immobilization of β-galactosidase on graphite surface by glutaraldehyde”, Journal of Food Engineering, vol.48, pp.69-74 84 PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: HĨA CHẤT 1.1 Các hóa chất phân tích  ONPG 3mM: Cân 0.905g hịa tan 1000ml đệm  ZAPT: Hòa tan 25g zinc acetate 12.5g acid phosphotungstic nƣớc, thêm 20ml acid glacial acetic định mức lên 100ml  Đệm Glycine-NaOH: Hỗn hợp 150ml dung dịch glycine gồm 2.4768g glycine 1.9359g NaCl hòa với 850ml NaOH (0.385M) điều chỉnh pH 12.7  Dung dịch Na2SO31% (w/v): 1g Na2SO3 hòa thành 100ml nƣớc cất  Dung dịch Methylamine-HCl 5%(w/v): 5g Methylamine-HCl hòa tan thành 100ml nƣớc cất, lƣu trữ 4oC  Dung dịch CaCl2 0.075M: 8.325g hòa tan thành 1000ml nƣớc cất  Dung dịch NaCl 0.85%: 8.5g hòa tan thành 1000ml nƣớc cất 1.2 Pha dung dịch đệm 1.2.1 Pha dung dịch đệm sodium phosphate 0.1M pH 6.8 NaH2PO4.2H2O: 15.6g hòa tan định mức lên 1000ml nƣớc cất Na2HPO4.12H2O: 35.8g hòa tan định mức lên 1000ml nƣớc cất Lấy 430ml NaH2PO4.2H2O 570ml Na2HPO4.12H2O 1.2.2 Pha dung dịch đệm acetate 0.1M Chuẩn bị dung dịch A dung dịch CH3COOH 0.1M: 5.75ml dung dịch CH3COOH đặc định mức đến 1000ml nƣớc cất Chuẩn bị dung dịch B dung dịch CH3COONa 0.1M: 8.2 g CH3COONa đƣợc hòa tan định mức đến 1000ml nƣớc cất Dung dịch đệm actate 0.1M có pH khác phụ thuộc vào a ml dung dịch A b ml dung dịch B 85 a 847.0 640.1 357.0 150.5 52.2 b 153.0 359.9 643.0 849.5 947.8 pH 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 1.2.3 Pha dung dịch đệm Tris-HCl Cách pha dung dịch đệm Tris-HCl pH 6.5 7.0: Cân 12.1g Tris, bổ sung nƣớc cất, sau dùng dung dịch HCl 0.1M chỉnh pH đến giá trị cần dùng, định mức lại nƣớc cất đến 1000ml 86 PHỤ LỤC 2: ĐƢỜNG CHUẨN 2.1 Đƣờng chuẩn nồng độ ONP OD khảo sát tính tạo thấm cho tế bào Bảng 2.1: Đƣờng chuẩn nồng độ ONP OD (có Na2CO3) Nồng độ ONP (µmol/ml) OD 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16 0.085 0.159 0.237 0.324 0.4 0.471 0.553 0.629 0.706 OD 0.8 y = 3.9129x + 0.0043 R² = 0.9998 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0.04 0.08 0.12 0.16 0.2 Nồng độ ONP (µmol/ml) Hình 2.1: Đường chuẩn nồng độ ONP OD (có Na2CO3) 2.2 Đƣờng chuẩn nồng độ ONP OD khảo sát cố định tế bào Bảng 2.2: Đƣờng chuẩn nồng độ ONP OD (khơng có Na2CO3) Nồng độ ONP (µmol/ml) OD 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 1.8 2.1 2.4 0.072 0.146 0.236 0.323 0.404 0.496 0.577 0.652 0.18 87 OD 0.8 y = 0.2775x - 0.0100 R² = 0.9995 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0.5 1.5 2.5 Nồng độ ONP (µmol/ml) Hình 2.2: Đường chuẩn nồng độ ONP OD (khơng có Na2CO3) 2.3 Đƣờng chuẩn nồng độ lactose OD Bảng 2.3: Đƣờng chuẩn nồng độ lactose OD Nồng độ lactose (mg/ml) OD 0.75 1.25 0.174 0.240 0.298 OD 0.45 1.5 0.367 0.421 y = 0.2427x - 0.0028 R² = 0.9993 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 0.00 0.25 0.50 1.75 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 Hàm lƣợng lactose (mg/ml) Hình 2.3: Đường chuẩn nồng độ lactose OD 88 PHỤ LỤC 3: LÊN MEN THU NHẬN TẾ BÀO GIÀU β-GALACTOSIDASE 3.1 Ảnh hƣởng tỷ lệ phần trăm cao nấm men:cao thịt môi trƣờng lên men đến mật độ tế bào hoạt tính β-galactosidase Cao nấm men: Cao thịt (%) ĐC 6:0.5 6:1.0 6:1.5 6: 2.0 OD 2.053 ± 0.054c 2.213 ± 0.043b 2.325 ± 0.049a 2.329 ± 0.060a 2.330 ± 0.041a Hoạt tính β-galactosidase (U/ml.CT) 0.442 ± 6.40E-03c 0.532 ± 7.50E-03b 0.602 ± 9.40E-03a 0.605 ± 2.10E-02a 0.608 ± 7.90E-03a 3.2 Ảnh hƣởng thời gian lên men đến mật độ tế bào hoạt tính β-galactosidase tế bào Thời gian (giờ) 10 20 30 40 50 60 OD 0.442 ± 0.062e 0.794 ± 0.110d 1.223 ± 0.143c 2.085 ± 0.166b 2.340 ± 0.130a 2.329 ± 0.112a Hoạt tính β-galactosidase (U/ml.CT) 0.182 ± 3.24E-02f 0.237 ± 1.60E-02e 0.386 ± 2.25E-02d 0.720 ± 3.45E-02c 0.800 ± 2.81E-02a 0.750 ± 3.64E-02b Các giá trị bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn mẫu độc lập Các giá trị cột kí hiệu khác biểu thị khác có nghĩa (P