PowerPoint Presentation HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH TẾ BÀO ĐẾN KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI HISTAMINE CỦA CHỦ[.]
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH TẾ BÀO ĐẾN KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI HISTAMINE CỦA CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ NƯỚC MẮM THÀNH PHẨM NỘI DUNG BÁO CÁO MỞ ĐẦU ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1.1 Đặt vấn đề Theo tiêu chuẩn Codex (2011) hàm lượng histamine ngưỡng an tồn 400mg/l MỞ ĐẦU Theo báo cáo hiệp hội nước mắm Phan Thiết (2013) hàm lượng histamine nước mắm truyền thống 10003000mg/l NGỘ ĐỘC HISTAMINE Đường hô hấp: sổ mũi, hen xuyễn… Trên da: mề đay, phát ban… Mắt: viêm đỏ kết mạc mắt… Hệ tiêu hóa: tiết độ dịch vị dày, tiêu chảy… - Hệ tim: dãn mạch, co thắt tim… - MỞ ĐẦU Cố định tế bào: Kỹ thuật bao bọc định vị tế bào nguyên vẹn lên vùng không gian định nhằm bảo vệ hoạt tính xúc tác mong muốn Chi phí thấp Tái sử dụng chế phẩm cố định Không ảnh hưởng đến chất lượng giá trị dinh dưỡng sản phẩm Các phương pháp cố định tế bào Nghiên cứu ảnh hưởng phương pháp cố định tế bào đến khả phân giải histamine chủng vi khuẩn phân lập từ nước mắm thành phẩm Phương pháp hấp phụ Phương pháp bao bọc tế bào Phương pháp liên kết chéo MỞ ĐẦU 1.2 Mục đích Nghiên cứu ảnh hưởng phương pháp cố định đến khả phân giải histamine chủng vi khuẩn phân lập từ nước mắm thành phẩm 1.3 Yêu cầu - Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả phân giải histamine cao từ chủng phân lập từ nước mắm thành phẩm - Xác định đường cong sinh trưởng chủng vi khuẩn có khả phân giải histamine cao để sản xuất thu sinh khối - Xác định ảnh hưởng phương pháp cố định tế bào đến hiệu suất cố định tế bào khả phân giải histamine ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Đối tượng 03 chủng vi khuẩn L3, N4.8, N3.3 phân lập từ nước mắm thành phẩm sử dụng để nghiên cứu ảnh hưởng phương pháp cố định tế bào đến khả phân giải histamine Chất mang sử dụng cố định tế bào: Chất mang Celite Chitosan dạng mảnh Pig bone Ca2+ alginate Agar Phương pháp cố định Hấp phụ tế bào Bao bọc tế bào Celite Chitosan Pig bone Eggshell Alginate-chitosan Alginate-crosslinking Liên kết chéo Chitosan-crosslinking Eggshell ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.2 Nội dung Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả phân giải histamine cao từ chủng phân lập từ nước mắm thành phẩm Xác định đường cong sinh trưởng chủng vi khuẩn có khả phân giải histamine cao sản xuất thu sinh khối Ảnh hưởng phương pháp hấp phụ đến hiệu suất cố định tế bào khả phân giải histamine Ảnh hưởng phương pháp bao bọc đến hiệu suất cố định tế bào khả phân giải histamine Ảnh hưởng phương pháp liên kết chéo đến hiệu suất cố định tế bào khả phân giải histamine ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.3 Phương pháp 2.3.1 Xác định khả phân giải histamine chủng Phương pháp hoạt hóa ni cấy chủng tiến hành theo Tapingkae cộng sự, năm 2010 Đánh giá khả phân giải histamine phương pháp sắc khí lỏng hiệu cao HPLC tiến hành theo Trần Thị Thu Hằng cộng sự, năm 2019 2.3.2 Xây dựng đường cong sinh trưởng thu hồi sinh khối Phương pháp xây dựng đường cong sinh trưởng tiến hành theo Nguyễn Lân Dũng, năm 1983 Phương pháp thu hồi sinh khối tiến hành theo Tapingkae cộng sự, năm 2010 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.3.3 Phương pháp cố định tế bào Phương pháp hấp phụ Chất mang celite: Được miêu tả Khare Nakajima, năm 2000: 5g 10ml celite Tris-HCl 50 mM pH 7,0; NaCl 4,3M chứa 1g sinh khối Khuấy 1h 4℃ Rửa 10ml Tris-HCl 50 mM pH 7,0; NaCl 4,3M Sấy đông khô 50℃ 48h (3 lần) L3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Chất mang chitosan dạng mảnh (chitosan flakes): Được miêu tả Pereira cộng sự, năm 2003: 5g 10ml Ngâm 60ml hexan, khuấy 100v/p 1h Làm khơ khơng khí Sấy đơng khơ -50℃ 48h Giữ 18h 4℃ Lọc, rửa sạch, làm khô Khuấy 3h 10 Tris-HCl 50 mM; pH 7,0; NaCl 4,3M chứa 1g sinh khối ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Chất mang bột xương lợn (pig bone): Được miêu tả Negishi cộng sự, năm 1989: 5g 10ml Tris-HCl 50 mM pH 7,0; NaCl 4,3M chứa 1g sinh khối Sấy đông khô -50℃ 48h 11 Khuấy 100v/p 1h 0-4℃ Lọc giấy Whatman số ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Phương pháp bao bọc Chất mang Ca2+ alginate: Được miêu tả Takeno cộng sự, năm 2005: 2,5ml Natri alginate 3% 2,5ml Tris-HCl 50 mM pH 7,0; NaCl 4,3M chứa 1g sinh khối Lắc máy votex 10 phút Để lắng 30 phút Nhỏ giọt vào 100ml CaCl2 0,5M Rửa Tris-HCl 50 mM pH 7,0; NaCl 4,3M Chất mang agar: Được miêu tả Takeno cộng sự, năm 2005: 2,5ml Đổ vào đĩa petri dày 8mm Cắt thành khối 8mm, rửa Tris-HCl Agar 4% hấp tiệt trùng 121℃ 15 phút Tris-HCl 50 mM pH 7,0; NaCl 4,3M chứa 1g sinh khối 60℃ 12 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Phương pháp liên kết chéo Chất mang alginate – chitosan: Được miêu tả Vidyasagar cộng sự, năm 2006: 2,5ml Natri alginate 3% 2,5ml Tris-HCl 50 mM; pH 7,0; NaCl 4,3M chứa 1g sinh khối Để lắng 30 phút Rửa 30ml Tris-HCl 50 mM pH 7,0; NaCl 4,3M 13 Nhỏ giọt vào hỗn hợp dung dịch (axit axetic + chitosan + CaCl2) ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Chất mang alginate – crosslinking: Được miêu tả Vidyasagar cộng sự, năm 2006: 2ml 2ml 1ml Natri alginate 3% Tris-HCl 50 mM pH 7,0; NaCl 4,3M chứa 1g sinh khối Glutaraldehyde 0,5% Để lắng 30 phút Giữ 90 phút 30℃ Rửa Tris-HCl 50 mM pH 7,0; NaCl 4,3M Nhỏ giọt chứa 100ml CaCl2 0,5M 14 ĐỐI TƯỢNG – NỘI DUNG – PHƯƠNG PHÁP Chất mang chitosan - crosslinking: Được miêu tả Carrara Rubiolo, năm 1994: 3g Hòa tan 100ml axit axetic 2%, khuấy 90 phút Lọc, nhỏ giọt vào 300ml dung dịch natritriphosphat 1,7% 5g Ngâm glutaraldehyde 1% 24h 10ml Khuấy nhẹ, để qua đêm 15 Tris-HCl 50 mM; pH 7,0; NaCl 4,3M chứa 1g sinh khối ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Chất mang vỏ trứng (eggshell): Được miêu tả Venkaiah Kumar, năm 1994: Tris-HCl 50 mM pH 7,0; NaCl 4,3M chứa 1g sinh khối Cô đặc chân không 30℃, 30 phút Thêm từ từ 2ml glutaraldehyde 6% Ủ 12h 10℃ Ly tâm thu cặn 6000v/15p 4℃ 16 Khuấy nhẹ 200 vòng/phút ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Phương pháp xác định ảnh hưởng phương pháp cố định tế bào đến khả phân giải histamine chủng vi khuẩn Thí nghiệm tiến hành theo Tapingkae cộng sự, năm 2010: Đối chứng Mẫu ml HCl 0,1N 0,1g tế bào ban đầu (hoặc tế bào cố định) 1ml chứa đệm Tris HCl 50mM, pH 7,0; NaCl 4,3M; 500µM 1-methoxy PMS, 5mM histamin dihydrochloride 1ml chứa đệm Tris HCl 50mM, pH 70; NaCl 4,3M; 500µM 1-methoxy PMS, 5mM histamin dihydrochloride Ủ 37oC, thời gian Ủ 37oC, thời gian 0,1g tế bào ban đầu (hoặc tế bào cố định) 1ml HCl 0,1N Li tâm thu dịch 17 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết xác định khả phân giải histamine chủng vi khuẩn môi trường HA 21% NaCl 30 28.16 25 20 18.69 15 9.31 10 8.85 7.02 3.71 1.07 6.17 ngày L3 ngày N4.8 1.18 ngàyN3.3 Hình 3.1 Khả phân giải histamine chủng vi khuẩn 18 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN log (CFU/ml) 3.2 Xây dựng đường cong sinh trưởng sản xuất sinh khối chủng L3 môi trường HA 21% NaCl 16 14 12 10 0 Thời gian (ngày) Hình 3.2 Đồ thị đường cong sinh trưởng chủng L3 19 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.3 Hiệu suất cố định khả phân giải histamine chủng vi khuẩn L3 Bảng 3.2 Hiệu suất cố định khả phân giải histamine Phương pháp Hấp phụ Bao bọc Liên kết chéo Tổng hoạt tính tế bào tự (unit) Hoạt tính tế bào cố định (unit/g) Tổng hoạt tính tế bào cố định (unit) Hiệu suất cố định (%) Khả phân giải histamine tế bào cố định 2h (%) Celite 28,49 3,07 16,61 58,30 12,09 Pig bone 28,49 1,65 8,88 31,17 6,15 Chitosan Ca2+ alginate 28,49 0,81 4,38 15,37 5,4 28,49 2,1 11,15 39,14 8,00 Agar 28,49 2,96 15,87 55,70 11,63 Alginate crosslinking 28,49 1,23 6,62 23,24 4,47 Chitosan crosslinking 28,49 3,30 17,56 61,64 12,53 Alginate-chitosan crosslinking 28,49 2,91 15,57 54,65 11,10 Eggshell crosslinking 28,49 2,40 12,82 45,00 9,42 Chất mang 20