ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI THUỐC TRỪ sâu CHLORPYRIFOS của một số CHỦNG VI KHUẨN PHÂN lập từ đất NÔNG NGHIỆP

Trong nông nghiệp, việc sử dụng các loại thuốc trừ sâu có nguồn gốc phospho hữu cơ như chlorpyrifos một cách thiếu kiểm soát về liều lượng sẽ gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng môi trường, sinh vật và sức khỏe con người. Trong số các phương pháp xử lý ô nhiễm chlorpyrifos hiện nay thì phân hủy sinh học sử dụng vi sinh vật có khả năng phân giải cơ chất chlorpyrifos được cho là một cách tiếp cận đầy hứa hẹn, hiệu quả cao, chi phí thấp và thân thiện với môi trường. Chlorpyrifos có thể bị phân giải bởi enzyme thủy phân gốc phosphate hữu cơ (organophosphate hydrolase) từ một số loài vi khuẩn đã nghiên cứu như Pseudomonas syringae CMZ6, Bacillus licheniformis Zhu1. Vì vậy, đề tài “Đánh giá khả năng phân giải thuốc trừ sâu Chlorpyrifos của một số chủng vi khuẩn phân lập từ đất nông nghiệp” được thực hiện với mục tiêu phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng phân giải tốt hoạt chất chlorpyrifos từ đất nông nghiệp tại một số khu vực chuyên canh ở Việt Nam. Kết quả thu được, từ các mẫu đất nông nghiệp tại Thái Bình, Hải Dương, Hải Phòng, Thái Nguyên, 6 chủng vi khuẩn (kí hiệu từ C1 đến C6) có hoạt tính phân giải chlorpyrifos đã được phân lập và tuyển chọn. Trong đó, chủng vi khuẩn C3 có khả năng phân giải tốt nhất, đến 82,52% chlorpyrifos trong môi trường MSM sau 15 ngày nuôi cấy. Chủng vi khuẩn C3 được lựa chọn để phân loại, định danh. Dựa trên các đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa, so sánh trình tự gen 16S rRNA là loài Ensifer sp. Ngoài ra, chủng Ensifer sp. C3 đã phân giải 63,46 % lượng chlorpyrifos (100 mgkg) có trong đất thử nghiệm sau 15 ngày. Kết quả này mở ra tiềm năng cho việc sử dụng chủng Ensifer sp. C3 trong xử lý đất ô nhiễm chlorpyrifos.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC  - Nguyễn Tiến Quân ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI THUỐC TRỪ SÂU CHLORPYRIFOS CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ ĐẤT NƠNG NGHIỆP Khóa luận tốt nghiệp đại học hệ quy Ngành: Cơng nghệ sinh học Chun ngành: Vi sinh vật học Khóa: QHT.2017 (Chương trình đào tạo chuẩn) Hà Nội - 2021 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC  - Nguyễn Tiến Quân ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI THUỐC TRỪ SÂU CHLORPYRIFOS CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ ĐẤT NƠNG NGHIỆP Khóa luận tốt nghiệp đại học hệ quy Ngành: Cơng nghệ sinh học Chun ngành: Vi sinh vật học Khóa: QHT.2017 (Chương trình đào tạo chuẩn) Cán hướng dẫn: TS Lê Hữu Cường TS Phạm Thanh Hiền Hà Nội - 2021 LỜI CẢM ƠN Lời em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Lê Hữu Cường (cán hướng dẫn chính), TS Trần Thị Như Hằng, T.S Hồng Kim Chi, TS Trần Thị Hồng Hà toàn thể phịng Sinh học thực nghiệm Viện hóa học hợp chất thiên nhiên - Viện hàn lâm khoa học cơng nghệ Việt Nam tận tình hướng dẫn, bảo em suốt trình thực tập, giúp em hoàn thiện kĩ kiến thức chuyên ngành Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến TS Phạm Thanh Hiền - Bộ môn Vi sinh, Khoa Sinh học, Trường đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội tận tình quan tâm giúp đỡ giải đáp vướng mắc em suốt q trình thực khóa luận tốt nghiệp Cuối em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân,bạn bè Những người định hướng, ủng hộ, tạo động lực lúc khó khăn để em tiếp tục phấn đấu học tập, theo đuổi đam mê nghiên cứu khoa học hồn thiện khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn ! Sinh viên Nguyễn Tiến Qn DANH SÁCH HÌNH Hình Công thức cấu tạo chlorpyrifos Hình Một số sản phẩm thuốc trừ sâu chứa hoạt chất chlorpyrifos sử dụng phổ biến Hình Con đường chuyển hóa tổng quát chlorpyrifos Hình Q trình chuyển hóa chlorpyrifos tác động enzyme vi sinh vật 11 Hình Một số địa điểm thu mẫu 14 Hình Hình ảnh số chủng vi khuẩn sau phân lập từ mẫu đất 20 Hình Đồ thị khảo sát độ hấp thụ chlorpyrifos bước sóng khoảng 210 – 400 nm 21 Hình Đồ thị hàm số tuyến tính nồng độ chất chuẩn chlorpyrifos giá trị đo OD bước sóng 294 nm 22 Hình Độ hấp thụ quang bước sóng 294nm chlorpyrifos chiết từ mẫu dịch ni vi khuẩn mẫu đối chứng qua 15 ngày nuôi lắc 23 Hình 10 Khả phân giải chlorpyrifos chủng vi khuẩn phân lập 24 Hình 11 Khả sinh trưởng chủng vi khuẩn C3 mơi MSM có bổ sung 100 μg/mL chlorpyrifos 25 Hình 12 Ảnh điện di sản phẩm sau khuếch đại gen 16S rRNA vi khuẩn C3 27 Hình 13 Cây phân loại chủng C3 dựa trình tự 16S rRNA gene, sử dụng phần mềm MEGA7, phương pháp Neighbor Joining Tree, giá trị bootstrap 100 28 DANH SÁCH BẢNG Bảng Mơ tả hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn phân lập 20 Bảng Dư lượng chlorpyrifos mẫu đối chứng mẫu thí nghiệm 23 Bảng Hình ảnh khuẩn lạc tế bào chủng vi khuẩn C3 26 Bảng Đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn C3 28 Bảng Giá trị hàm lượng chlorpyrifos cịn lại đất sau 15 ngày có bổ sung chủng C3 xác định phương pháp GC/MS 29 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt OP Tên tiếng Anh Organo phosphate BVTV Tên tiếng Việt Thuốc trừ sâu nhóm phospho hữu Thuốc bảo vệ thực vật UV UltraViolet Tia cực tím / tia tử ngoại LD50 Lethal concentration 50 Liều lượng gây chết 50% WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới ADI Acceptable Daily Intake Lượng ăn vào hàng ngày chấp nhận tính theo mg/kg khối lượng thể EC Emulsifiable Concentrate Dạng nhũ tương đậm đặc US.EPA United States Environmental Protection Agency Cục bảo vệ môi trường Hoa kỳ GC-MS Gas Chromatography-Mass Spectrometry Sắc ký khí ghép khối phổ OD Optical Density Mật độ quang MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu thuốc trừ sâu phospho hữu 1.2 Các phương pháp xử lý ô nhiễm thuốc trừ sâu phospho hữu 1.3 Giới thiệu hoạt chất thuốc trừ sâu chlorpyrifos 1.3.1 Lịch sử đời hoạt chất chlorpyrifos 1.3.2 Đặc điểm & tính chất chlorpyrifos 1.3.3 Tình hình sử dụng thuốc trừ sâu chlorpyrifos 1.3.4 Tác động chlorpyrifos đến môi trường sức khỏe người 1.3.4.1 Ảnh hưởng chlorpyrifos môi trường 1.3.4.2 Ảnh hưởng chlorpyrifos đến sức khỏe người 1.3.5 Sự phân hủy chuyển hóa chlorpyrifos đất 1.4 Một số kết nghiên cứu loài vi khuẩn có khả phân hủy chlorpyrifos tiềm ứng dụng xử lý ô nhiễm thuốc trừ sâu 10 1.4.1 Các nghiên cứu giới 10 1.4.2 Các nghiên cứu Việt Nam 10 1.5 Enzyme phân giải chlorpyrifos vi khuẩn 11 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Đối tượng nghiên cứu 13 2.2 Dụng cụ, thiết bị hóa chất sử dụng thí nghiệm 13 2.2.1 Dụng cụ 13 2.2.2 Thiết bị 13 2.2.3 Hóa chất 13 2.3 Phương pháp nghiên cứu 14 2.3.1 Thu mẫu đất 14 2.3.2 Phân lập vi khuẩn có khả phân giải chlorpyrifos từ mẫu đất thu thập 14 2.3.3 Đánh giá khả phân hủy chlorpyrifos vi khuẩn mơi trường khống tối thiểu 15 2.3.4 Đánh giá khả sinh trưởng vi khuẩn C3 mơi trường MSM có bổ sung chlorpyrifos 16 2.3.5 Phân loại định danh vi khuẩn dựa đặc điểm hình thái so sánh trình tự gen 16S rRNA 17 2.3.5.1 Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn phân lập 17 2.3.5.2 Khảo sát đặc tính sinh lý sinh hóa chủng vi khuẩn phân lập 17 2.3.5.3 Định danh vi khuẩn dựa trình tự gen mã hóa 16S rRNA 17 2.3.6 Đánh giá khả khả phân giải chlorpyrifos vi khuẩn đất 19 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 3.1 Kết phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn từ mẫu đất ô nhiễm chlorpyrifos 20 3.2 Kết khả phân hủy chlorpyrifos chủng vi khuẩn mơi trường khống tối thiểu 21 3.3 Kết khả sinh trưởng chủng vi khuẩn môi trường MSM chứa chlorpyrifos 24 3.4 Phân loại định danh chủng vi khuẩn C3 26 3.4.1 Đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn C3 26 3.4.2 Định danh chủng vi khuẩn C3 dựa trình tự gen 16S rRNA 27 3.4.3 Một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn C3 28 3.5 Hiệu phân giải chlorpyrifos chủng vi khuẩn C3 đất 29 KẾT LUẬN 31 KIẾN NGHỊ 31 PHỤ LỤC 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO: 34 MỞ ĐẦU Các hóa chất thuốc BVTV nhân tố thiếu q trình sản xuất nơng nghiệp nhằm ổn định suất, nâng cao chất lượng trồng Tại Việt Nam, theo thông tư Bộ NN&PTNT, năm 2016, có 165/775 loại thuốc BVTV đăng ký chứa thành phần chứa hoạt chất chlorpyrifos Do giá thành rẻ, phổ tác dụng rộng nên sản phẩm chứa chlorpyrifos sử dụng rộng rãi nhằm tiêu diệt côn trùng gây hại ngành nông nghiệp phi nông nghiệp Hậu việc sử dụng liên tục mức dẫn đến tình trạng tồn dư hóa chất chlorpyrifos đất, nước sản phẩm nông nghiệp, đe dọa nghiêm trọng tới môi trường, hệ sinh vật sức khỏe người Việc loại bỏ tồn dư chlorpyrifos khỏi khu vực ô nghiễm điều cần thiết Trong số phương pháp nghiên cứu để khắc phục tình trạng nhiễm này, xử lý sinh học sử dụng vi sinh vật có khả phân giải chlorpyrifos cho cách tiếp cận đầy hứa hẹn, chi phí thấp thân thiện với môi trường Một số vi khuẩn Bacillus licheniformis Zhu1 [28], Pseudomonas syringae CM-Z6 [29], Achromobacter xylosoxidans JCp4…[1] nghiên cứu cho thấy hiệu cao, làm giảm đến 99% dư lượng chlorpyrifos đất chứng tỏ tiềm vi khuẩn xử lý ô nhiễm thuốc trừ sâu chlorpyrifos Do đó, đề tài “Đánh giá khả phân giải thuốc trừ sâu chlorpyrifos số chủng vi khuẩn phân lập từ đất nông nghiệp” thực với mục tiêu: ➢ Phân lập chủng vi khuẩn phân hủy thuốc trừ sâu chứa hoạt chất chlorpyrifos từ đất canh tác nông nghiệp số tỉnh thành: Thái Bình, Hải Dương, Thái Nguyên, Hải Phòng ➢ Đánh giá hiệu phân giải thuốc trừ sâu chlorpyrifos chủng vi khuẩn phân lập 100 Dư lượng chlorpyrifos (μg/mL) 90 80 70 60 50 ngày 40 Sau ngày 30 Sau 15 ngày 20 10 Đối chứng Chủng C1 Chủng C2 Chủng C3 Chủng C4 Chủng C5 Chủng C6 Các chủng vi khuẩn Hình 10 Khả phân giải chlorpyrifos chủng vi khuẩn phân lập Kết cho thấy nồng độ chlorpyrifos dung dịch mẫu đối chứng mặt vi khuẩn giảm 12,6% sau 15 ngày, cịn lại 87.32 μg/mL Trong nồng độ chlorpyrifos cịn lại mẫu thí nghiệm có bổ sung chủng vi khuẩn từ C1 đến C6 có giảm rõ rệt so với nồng độ ban đầu (100 µg/mL) Khả phân giải chủng thí nghiệm nằm khoảng từ 30,59% (chủng C1) đến 50% (chủng C3 C5) Đặc biệt nồng độ chlorpyrifos mẫu có bổ sung vi khuẩn C3 giảm 80,52%, từ 99.97 μg/mL xuống cịn 19.34 μg/mL, sau 15 ngày ni cấy Tại điều kiện ni cấy (120 vịng/phút 28 ⁰C 15 ngày) thành phần môi trường (dung dịch MSM chứa 100 μg/mL) thấy chủng vi khuẩn C3 có khả phân giải phân giải chlorpyrifos tốt số chủng phân lập Vì vậy, chủng C3 lựa chọn cho nghiên cứu 3.3 Kết khả sinh trưởng chủng vi khuẩn C3 môi trường MSM chứa chlorpyrifos Nghiên cứu sinh trưởng chủng C3 cách đo độ đục tế bào bước sóng 600nm, kết hợp với đếm khuẩn lạc (CFU) cách trải dịch tế bào 24 lên đĩa thạch môi trường, theo khoảng thời gian khác Kết thể hình 10 Hình 11 Khả sinh trưởng chủng vi khuẩn C3 mơi MSM có bổ sung 100 μg/mL chlorpyrifos (ĐC (-): Mẫu đối chứng âm môi trường MSM chứa chlorpyrifos; ĐC (+): Mẫu đối chứng dương dịch vi khuẩn C3 môi trường MSM khơng có chlorpyrifos) Theo kết đo độ đục bước sóng 600nm, thấy từ thời điểm bắt đầu nuôi cấy, mẫu đối chứng dương, mật độ tế bào tăng lên không đáng đến thời điểm 72h sau giảm dần theo thời gian Ngược lại, mật độ tế bào vi khuẩn C3 môi trường chứa chlorpyrifos tăng lên rõ rệt Cụ thể từ sau 24h trở đi, mật độ vi khuẩn dung dịch tăng tỉ lệ thuận theo thời gian kéo dài đến sau 144h Dựa vào kết so sánh thấy, vi khuẩn C3 có khả sinh trưởng phát triển ổn định môi trường MSM chứa chlorpyrifos nồng độ 100 μg/mL 25 3.4 Phân loại định danh chủng vi khuẩn C3 Ngoài việc xác định hoạt tính phân giải chlorpyrifos chủng vi khuẩn phân lập việc định danh vi khuẩn quan trọng, góp phần bổ sung thêm thơng tin phân loại, đặc tính sinh lý, sinh hóa, hay điều kiện nuôi cấy tối ưu (pH, nhiệt độ) đối tượng nghiên cứu 3.4.1 Đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn C3 Bảng Hình ảnh khuẩn lạc tế bào chủng vi khuẩn C3 Hình ảnh Mơ tả Hình thái khuẩn lạc Khuẩn lạc màu trắng đục, trịn nhỏ đặn, đường kính 1-1,5 mm, bề mặt trơn bóng, khơng sinh sắc tố tiết mơi trường Hình dạng tế bào Tế bào hình que, kích thước 1,0 x 1,5 µm (Ảnh chụp tế bào vi khuẩn C3 soi kính hiển vi điện tử, vật kính 10000X) Kết nhuộm gram Vi khuẩn Gram âm, tế bào hình que, xếp rời rạc (Ảnh chụp nhuộm Gram tế bào vi khuẩn C3 soi kính hiển vi quang học, vật kính 100X) 26 3.4.2 Định danh chủng vi khuẩn C3 dựa trình tự gen 16S rRNA Vi khuẩn C3 tách DNA tổng số khuếch đại sản phẩm gen 16S rRNA phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 27F/1492R Kết khuếch đại gen thể hình sau: Hình 12 Ảnh điện di sản phẩm sau khuếch đại gen 16S rRNA vi khuẩn C3 (Đường chạy M: marker DNA; đường chạy 1: sản phẩm gen 16S rRNA) Sau tách chiết DNA tổng số, gen 16S rRNA khuếch đại phản ứng PCR sử dụng với cặp mồi 27F/1492R Theo tính tốn, cặp mồi nhân gen 16S rRNA vi khuẩn với kích thước gene trung bình khoảng 1500 bp Từ kết điện di sản phẩm PCR qua tinh kết luận phản ứng nhân gen đặc hiệu, đường xuất băng DNA (mũi tên trắng) với kích thước khoảng 1500 bp qua đối chiếu với marker Gen 16S rRNA thu sau tinh kiểm tra điện di tiến hành giải trình tự Kết trình tự gen 16S rRNA trình bày Phụ lục 3: Trình tự đoạn gen sau so sánh ngân hàng gen (Genebank) sử dụng cơng cụ so sánh trình tự BLAST Gen 16S rRNA chủng C3 có độ tương đồng đến 98,11% với loài Ensifer adhaerens (Accession number:AB681163.1), tương đồng đến 98,21% với loài Ensifer adhaerens NBRC 100388 (Accession number: NR113893.1) nhiều lồi thuộc chi Ensifer Các trình tự tương đồng với trình tự gen 16S rRNA 27 chủng C3 số trình 16S rRNA khác sử dụng để xây dựng phát sinh chủng loại phần mềm tin sinh MEGA Kết xây dựng phân loại lồi C3 trình bày sau: Hình 13 Cây phân loại chủng C3 dựa trình tự 16S rRNA gene, sử dụng phần mềm MEGA7, phương pháp Neighbor Joining Tree, giá trị bootstrap 100 3.4.3 Một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn C3 Để có thêm sở cho việc phân loại định danh chủng vi khuẩn C3, số đặc điểm sinh lý, sinh hóa kiểm tra bao gồm khả di động vi khuẩn, khả sử dụng nguồn cacbon, sinh H2S, hoạt tính urease, phép thử catalyse Kết trình bày bảng Bảng Đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn C3 TT Đặc điểm Đặc điểm Acid hóa nguồn 10 sucrose Acid hóa nguồn 11 Galactose Acid hóa nguồn 12 xylose C3 Hiếu khí + Vi hiếu khí - Khả di động - TT 28 C3 + + + Acid hóa nguồn glucose Khả sử dụng aesculin Phép thử catalase + 13 Phép thử oxidase + 14 - 15 Tạo H2S - + 16 Hoạt tính urease + - 17 Nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng 28 ÷ 37oC 18 pH cho sinh trưởng 6,0 ÷7,0 19 Gram Khả đồng hóa tinh bột Acid hóa nguồn L7 Arabinose Acid hóa nguồn Ribose Acid hóa nguồn D9 Fructose - + - - (-) âm tính, (+) dương tính Từ kết so sánh trình tự, đặc tính sinh lý, sinh hóa (Bảng 4) đặc điểm hình thái khuẩn lạc tế bào vi khuẩn đưa nhận định chủng vi khuẩn C3 thuộc chi Ensifer (syn Sinorhizobium) 3.5 Hiệu phân giải chlorpyrifos chủng vi khuẩn C3 đất Ngoài việc đánh giá khả phân giải chlorpyrifos môi trường lỏng MSM, đề tài hướng đến đánh giá hiệu phân giải chlorpyrifos chủng vi khuẩn C3 môi trường đất Vi khuẩn C3 bổ sung vào đất bị ô nhiễm 100 mg/kg chlorpyrifos Sau 15 ngày ủ đất điều kiện tối, mẫu đất thí nghiệm đối chứng (khơng có vi khuẩn C3) đem tách chiết đo lượng chlorpyrifos tồn dư lại Bảng Giá trị hàm lượng chlorpyrifos cịn lại đất sau 15 ngày có bổ sung chủng C3 xác định phương pháp GC/MS STT Đơn vị Ký hiệu Hàm lượng chlorpyrifos lại Ngày 29 Sau 15 ngày Mẫu đất nhiễm chlorpyrifos mg/kg 100 87,84 mg/kg 100 37,50 không bổ sung chủng C3 Mẫu đất nhiễm chlorpyrifos có bổ sung chủng C3 Kết phân tích dư lương chlorpyrifos mẫu đất đối chứng thí nghiệm trình bày bảng Nồng độ chlorpyrifos mẫu đất có bổ sung chủng vi khuẩn C3 giảm 62,5% sau 15 ngày thí nghiệm, từ 100mg/kg xuống cịn 37,5mg/kg Trong đó, mẫu đối chứng nồng độ chlorpyrifos mẫu đất giảm 12,16% sau 15 ngày ủ điều kiện tối nhiệt độ 25⁰C, từ 100mg/kg xuống 87,84mg/kg Từ kết kết luận chủng vi khuẩn C3 khả phân giải mạnh chlorpyrifos đất Thêm vào đó, cho thấy tiềm để nghiên cứu, phát triển ứng dụng chủng vi khuẩn C3 để xử lý đất ô nhiễm với chlorpyrifos 30 KẾT LUẬN Từ 11 mẫu đất nông nghiệp Thái Bình, Hải Dương, Hải Phịng, Thái Ngun, chủng vi khuẩn (kí hiệu từ C1 đến C6) có hoạt tính phân giải chlorpyrifos phân lập tuyển chọn Cả chủng vi khuẩn phân lập có khả phân giải chlorpyrifos nồng độ 100 µg/mL mơi trường MSM Trong đó, C3 chủng có khả phân giải tốt nhất, đến 82,52% chloripyfos sau 15 ngày nuôi cấy Chủng vi khuẩn C3 lựa chọn để phân loại, định danh Dựa đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa, so sánh trình tự gen 16S rRNA lồi Ensifer sp Trong thí nghiệm đánh giá khả phân giải chlorpyrifos đất, chủng C3 phân giải 63,46 % lượng chlorpyrifos (100 mg/kg) có đất thử nghiệm sau 15 ngày Kết mở tiềm cho việc sử dụng chủng C3 xử lý đất ô nhiễm chlorpyrifos KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng yếu tố vật lý lên trình phân giải chlorpyrifos chủng vi khuẩn Ensifer sp C3 nhằm tìm điều kiện tối ưu giúp phân hủy thuốc trừ sâu chlorpyrifos nhanh hiệu Tinh sạch, đánh giá hoạt tính enzyme phân giải chlorpyrifos từ chủng vi khuẩn C3 31 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Protocol dung dịch thí nghiệm nhuộm gram Dung dịch Thành phần Dung dịch tím Gentian g crystal violet pha 20 mL dung dịch ethanol 95%; 0,8 g ammonium oxalat monohydrate pha 80 mL nước cất Dung dịch Lugol 1g iodine g potassium iodide pha 300 mL nước cất Dung dịch tẩy 50 mL dung dịch acetone; 50 mL dung dịch ethanol 95% Dung dịch đỏ Fuchsin 0,3 g basic fuchsin pha 10 mL dung dịch ethanol 95%, mL phenol (dạng tinh thể nóng chảy) pha lỗng 95 mL nước cất; 5,5 mL dung dịch phenol Phụ lục 2: Protocol môi trường phân lập, nuôi cấy vi sinh vật sử dụng thí nghiệm Mơi trường Mơi trường MSM (Minimal Salt Medium) pH Dung dịch TES (Trace Element Solution) pH Môi trường LB (Lysogeny Broth) pH - 7.5 Thành phần KH2 PO4 K HPO4 (NH4 )2 SO4 MgSO4 7H2 O NaCl CaCl2 2H2 O FeSO4 7H2 O TES (Trace Element Solution)* Khối lượng (g) 0,2 0,5 1,0 0,2 0,2 0,05 0,005 1000 μL H3 BO3 MnSO4 ZnSO4 CuSO4 Na2 MoO4 0,5 0,18 0,02 0,025 0,025 Peptone NaCl 10 32 Cao nấm men (Yeast Extract Powder) 2,5 Phụ lục 3: Trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA GGTGAGTAACGCGTGGGATCTACCCTTTTCTACGGAATAACGCAGGGAAACTTGTGGTAATACCG TATGAGCCCTTCGGGGGAAAGATTTATCGGGAAATGATGAGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGGT GGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACATTGGG ACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAG CCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCACCGGTGAA GATAATGACGGTAACCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGA AGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGACATTTAAGTCAGG GGTGAAATCCCGGGGCTCAACCCCGGAACTGCCTTTGATACTGGGTGTCTAGAGTATGGAAGAG GTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAG GCGGCTCACTGGTCCATTACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATA CCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGTTAGCCGTCGGGCAGTTTACTGTTCGGTGGCGC AGCTAACGCATTAAACATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGAC GGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAG CCCTTGACATCCCGATCGCGGATTACAGAGATGTTTTTCCTTCAGTTCGGCTGGATCGGGAGACA GGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGGTTTAAAGTCCCGCAACGAAG CCGCAACCCCTTCGCCCCTTTAGTTTGCCCAGCAATTTGGGTTTGGGG 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO: Tiếng Việt: Chau N.T.T., Thien L.V., Thu V.T., et al (2017), "Nghiên cứu đặc tính khả phân hủy chlopyrifos hỗn hợp sinh học hệ thống đệm sinh học", Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Các Khoa học Trái đất Môi trường, 33(1S), 136–140 Dung N.L and Hop D.V (2007), "Giới thiệu số kỹ thuật bảo quản vi sinh vật" 11 Linh C.T (2016), "Điều tra, đánh giá mức độ ô nhiễm đề xuất phương pháp xử lý thuốc bảo vệ thực vật ddt xã định trung, thành phố vĩnh yên, tỉnh Vĩnh Phúc" 13 Ngan P.B and Thang D.X (2006), "Ảnh hưởng thuốc trừ sâu tới sức khỏe người phun thuốc", Science & Technology Development, 9(2), 72–78 14 Oánh N.T (2007), "Giáo trình sử dụng thuốc bảo vệ thực vật" 21 Thắm Đ.T.M., Hiếu T.T., and Ngân L.T.M (2017), "Phân lập vi khuẩn phân giải chlorpyrifos từ đất nơng nghiệp", Tạp Chí Khoa Học, 14(12), 127 22 Tham L.T., Dat N.T., Tham N.T.H., et al (2020), "Khảo sát khả phân hủy chlorpyrifos dịng vi khuẩn hiếu khí phân lập Đà Lạt", Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Đại học Duy Tân, 06(43), 35–45 25 "Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 7538-6:2010 (ISO 10381-6:2009) Chất lượng đất - Lấy mẫu - Phần 6: Hướng dẫn thu thập, xử lí bảo quản mẫu đất điều kiện hiếu khí để đánh giá q trình hoạt động, sinh khối tính đa dạng vi sinh vật phịng thí nghiệm" 34 (2020), "Hoạt chất thuốc BVTV, hoạt chất thuốc trừ sâu, nhóm lân hữu (chlorpyrifos ethyl)", BVTV-VietNam, https://bvtv-vietnam.com/blog/2020/10/28/chlorpyrifos-ethyl/ 34 35 (2020), "Thực trạng tăng trưởng xanh nông nghiệp Việt Nam", https://tapchitaichinh.vn/su-kien-noi-bat/thuc-trang-tang-truong-xanh-trongnong-nghiep-cua-viet-nam-329774.html 36 "2019_02_12_Quyet dinh so 501.QD.BNN.BVTV.pdf", https://www.ppd.gov.vn/Thuoc%20BVTV/2019_02_12_Quyet%20dinh%20 so%20501.QD.BNN.BVTV 38 “03_2016_TT-BNNPTNT.pdf” http://vanban.chinhphu.vn/portal/page/portal/chinhphu/hethongvanban?class _id=1&mode=detail&document_id=185303 Tiếng Anh: Akbar S and Sultan S (2016), "Soil bacteria showing a potential of chlorpyrifos degradation and plant growth enhancement", Braz J Microbiol, 47(3), 563–570 Anwar S., Liaquat F., Khan Q.M., et al (2009), "Biodegradation of chlorpyrifos and its hydrolysis product 3,5,6-trichloro-2-pyridinol by Bacillus pumilus strain C2A1", J Hazard Mater, 168(1), 400–405 Chawla N., Sunita S., Kamlesh K., et al (2013), "Bioremediation: An emerging technology for remediation of pesticides", Res J Chem Environ, 17, 88–105 Cox C (1995), "Chlorpyrifos: human exposure (part 2)", Journal of pesticide reform/spring Eaton D.L., Daroff R.B., Autrup H., et al (2008),"Review of the Toxicology of Chlorpyrifos With an Emphasis on Human Exposure and Neurodevelopment", Crit Rev Toxicol, 38(sup2), 1–125 El-sayed G.M., Abosereih N.A., Ibrahim S.A., et al (2019), "Cloning of the Organophosphorus Hydrolase (oph) Gene and Enhancement of Chlorpyrifos Degradation in the Achromobacter xylosoxidans Strain GH9OP via Mutation Induction", 12(3), 35 Gilani R.A., Rafique M., Rehman A., et al (2016), "Biodegradation of chlorpyrifos by bacterial genus Pseudomonas", J Basic Microbiol, 56(2), 105– 119 10 Kapoor M and Rajagopal R (2011), "Enzymatic bioremediation of organophosphorus insecticides by recombinant organophosphorous hydrolase", Int Biodeterior Biodegrad, 65(6), 896–901 12 Makino Y., Oshita S., Murayama Y., et al (2009), "Nondestructive Analysis of Chlorpyrifos on Apple Skin Using UV Reflectance", Trans ASABE Am Soc Agric Biol Eng, 52, 1955–1960 15 Phung D (2012), "Assessing and Reducing Risk Due to Chlorpyrifos Use among Rice Farmers in Vietnam: From Probabilistic Risk Assessment to Safety Strategy Development", undefined 16 Racke K.D (1993), "Environmental fate of chlorpyrifos", Rev Environ Contam Toxicol, 131, 1–150 17 Rani M., Lakshmi K., Devi P.S., et al (2008), "Isolation and characterization of a chlorpyrifos- degrading bacterium from agricultural soil and its growth response", African Journal of Microbiology, 2(2), 26–31 18 Sh Z., Mh W., and A B (1997), "Pesticides and cancer", Occup Med Phila Pa, 12(2), 269–289 19 Shi T., Fang L., Qin H., et al (2019), "Rapid Biodegradation of the Organophosphorus Insecticide Chlorpyrifos by Cupriavidus nantongensis X1T", Int J Environ Res Public Health, 16(23) 20 Singh B.K and Walker A (2006), "Microbial degradation of organophosphorus compounds", FEMS Microbiol Rev, 30(3), 428–471 23 US EPA (2008), "Problem Formulation for the Environmental Fate and Ecological Risk, Endangered Species and Drinking Water Assessments in Support of the Registration Review of Chlorpyrifos." 36 24 US EPA (2014), "Revised Human Health Risk Assessment on Chlorpyrifos" 26 Xu G., Zheng W., Li Y., et al (2008), "Biodegradation of chlorpyrifos and 3,5,6-trichloro-2-pyridinol by a newly isolated Paracoccus sp strain TRP", Int Biodeterior Biodegrad, 62(1), 51–56 27 Yang L., Zhao Y., Zhang B., et al (2005), "Isolation and characterization of a chlorpyrifos and 3,5,6-trichloro-2-pyridinol degrading bacterium", FEMS Microbiol Lett, 251(1), 67–73 28 Zhu J., Zhao Y., and Qiu J (2010), "Isolation and application of a chlorpyrifosdegrading Bacillus licheniformis ZHU-1", Afr J Microbiol Res, 4, 2410–2413 29 Zhu J., Zhao Y., and Ruan H (2019), "Comparative study on the biodegradation of chlorpyrifos-methyl by Bacillus megaterium CM-Z19 and Pseudomonas syringae CM-Z6", An Acad Bras Cienc, 91(3) 30 "chlorpyrifos (CHEBI:34631)", 31 "Chlorpyrifos (Pubchem)", Pubchem, 32 "Chlorpyrifos | Toxicological Profile | ATSDR", , 33 "Chlorpyrifos: Target Pests", 37 "Gram Stain Protocols", ASM.org, 37 38 ... lượng chlorpyrifos đất chứng tỏ tiềm vi khuẩn xử lý ô nhiễm thuốc trừ sâu chlorpyrifos Do đó, đề tài ? ?Đánh giá khả phân giải thuốc trừ sâu chlorpyrifos số chủng vi khuẩn phân lập từ đất nông nghiệp? ??... Hình Một số địa điểm thu mẫu 2.3.2 Phân lập vi khuẩn có khả phân giải chlorpyrifos từ mẫu đất thu thập Phương pháp làm giàu phân lập vi khuẩn phân giải chlorpyrifos từ đất nông nghiệp tham khảo... Quân ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI THUỐC TRỪ SÂU CHLORPYRIFOS CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ ĐẤT NƠNG NGHIỆP Khóa luận tốt nghiệp đại học hệ quy Ngành: Cơng nghệ sinh học Chun ngành: Vi sinh